CN1421521A - 产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明系利用微生物发酵合成需要化合物范畴，尤其是产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺。其特征是将子囊菌纲Ascomycetes肉座菌科Hypocreaceeac寄生菌属真菌Hypomyces AL018，采用搅拌下通气液体深层发酵工艺。工艺参数：23～30℃，pH4～9，通气量1.0～2.0L/min，搅速120～250r/min，2～7天。原料廉，工序简，能耗低，周期短，苝醌类化合物含量约为菌丝体干重的3～5％，可代替天然竹红菌用于竹红菌素生物农药的生产。有利于保护天然竹红菌资源和保护环境，具有显著的经济效益和社会效益。
Description
所属技术领域
利用微生物发酵合成所需要的化合物范畴，尤其是使用真菌的液体发酵工艺。
背景技术
竹红菌(又名竹小肉座菌、竹砂仁、竹果、竹花(云南)。Hypocrella bambusae(Bet Br)·Sace)是寄生在云南西南部高原剑竹上的一种真菌，含有4％-5％的天然色素，称为竹红菌素(Hypocrellin)。近年来，围绕竹红菌素的光敏作用进行了大量研究，发现它是一种性能优良的光敏剂，而且研制了以竹红菌素为有效成分的生物农药“龙弗特”0.55％HA水剂，经过三年三省五地的大田实验，证明该生物农药具有高效低毒的特点，已于1996年通过中国科学院组织的鉴定，评价为国内外首创。现已申请两项国家发明专利：含竹红菌甲素的新型生物农药杀虫剂原药的制法(申请号：96120600.4)；含竹红菌甲素的新型生物农药杀虫剂及其制法(申请号：96120599.7)。
由于农药是一个巨大的产业，市场需求极大。因此，以竹红菌素为有效成分的生物农药有着广阔的市场前景。但天然竹红菌的产量有限，而且采集、运输成本较高，这促使人们用发酵方法人工培养竹红菌。已知的竹红菌发酵培养方法都是固体发酵[参考文献：1.刘为忠等.《苝醌类化合物产生菌固态发酵工艺研究》，
云南 大学学报，2000，22(5)：389-391.2.李聪等.《一株产苝醌光敏化合物的真菌成分分析》，
菌物系统，2000，19(1)：122-127.]，用这种方法，竹红菌素的产率只有1％，很难应用于工业化规模。
发明内容
本发明的目的是以液体发酵方法培养、生产Hypomyces AL018菌，解决天然苝醌类化合物原料不足和固体发酵产率过低的问题。
本发明的技术方案是：研制一种产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是将子囊菌纲(Ascomycetes)肉座菌科(Hypocreaceeac)寄生菌属真菌(Hypomyces(Fr.)Tul.sp)菌种采集号为18，即Hypomyces AL018，采用搅拌下通气液体深层发酵工艺。其工艺参数是发酵温度控制23～30℃，PH控制4～9，通气量为1.0～2.0L/min，搅拌速度为120～250r/min，发酵的时间为2～7天；其最佳发酵温度控制26～28℃，PH控制6～7；其最佳通气量为1.1～1.5L/min；其最佳发酵时间为3～5天；其最佳搅拌速度为160～180r/min；其营养盐的碳源可以从淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中选择，氮源可以从硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨中选择，其它盐可以从磷酸盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐中选择。
本发明的有益效果是：该技术所用原料便宜，工序简单，能耗低，发酵周期短，苝醌类化合物的含量约为菌丝体干重的3～5％，可代替天然竹红菌用于竹红菌素生物农药的生产，因此该发明具有显著的经济效益。同时，用发酵培养方法生产竹红菌也将保护天然竹红菌资源，有利于保护环境，因此该发明还具有一定的社会效益。
具体实施方式
实施例1 菌株采用子囊菌纲(Ascomycetes)肉座菌科(Hypocreaceeac)寄生菌属真菌(Hypomyces(Fr.)Tul.sp)菌种采集号为18，即Hypomyces AL018。工艺步骤：1.斜面培养 培养基：将200g去皮马铃薯放于1升水中，煮20分钟，四层纱布过滤，滤液加水至1升，然后添加20g葡萄糖，20g琼脂，2g KH2PO4，1.0g MgSO4O·7H2O，121℃灭菌30分钟，冷却凝固后备用。
将保存菌种转接至斜面培养基上，26～28℃培养3～5天。
2.摇瓶培养 培养基：每升马铃薯汁(制备方法同上)中添加10g玉米粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，2g KH2PO4，1.0g MgSO4·7H2O，10mg ZnSO4·7H2O，15mg FeCl3·6H2O，0.1g CaCl2·2H2O，2mg CuSO4·5H2O。
在500ml锥型瓶中装入120～130ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后将斜面菌种接入，26～28℃下，120r/min摇瓶培养3～5天。
3.大罐深层发酵 发酵罐采用容积20L的发酵罐；发酵培养基采用：每升马铃薯汁(制备方法同上)中添加10g玉米粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，2g KH2PO4，1.0g MgSO4·7H2O，10mg ZnSO4·7H2O，15mg FeCl3·6H2O，0.1g CaCl2·2H2O，2mg CuSO4·5H2O。装液量为12～13L，121℃灭菌30分钟，冷却后接入5～10瓶(500ml锥型瓶)菌种，26～28℃，通气量为1.3L/min，180r/min机械搅拌，培养3～5天。发酵终点控制的方法是红色菌丝体长满容器，或用分光光度法测定菌丝体中苝醌类化合物的含量即发酵毕，滤集菌丝体，于60℃下烘干，丙酮作溶剂，提至菌丝体几乎无色，用分光光度法测定苝醌类化合物(Perylenequinonoid derivatives，简称PQD)的含量(参考文献：刘为忠等《苝醌类化合物总量的测定》(J)
云南化工，2000，27(2)：35)为菌丝体干重的3～5％，具有工业化前景。
其中含有约4％的竹红菌甲素，竹红菌甲素(Hypocrelin A)，系4，9-二羟基-3，10-苝醌衍生物，其分子式为C30H26O10，分子量546；还含有约1％的竹红菌乙素，竹红菌乙素(Hypocrellin B)系4，9-二羟基-3，10-苝醌衍生物，其分子式为C30H24O9，分子量528；还含有少量的菌生素，菌生素(Hypomycin B)系3-羟基-4，9-苝醌衍生物，其分子式为C30H22O10，分子量542。[其中含竹红菌甲素(1％)，竹红菌乙素(少量)，竹红菌丙素(1％)，痂囊腔菌素A(1％)、B(0.3％)、C(0.2％)，菌生素A(0.1％)、B(少量)。]
实施例2大罐条件：发酵温度23～24℃，PH4～5，通气量1L/min，搅拌速度120r/min，培养2～4天；营养盐的碳源为淀粉或葡萄糖；氮源为硝酸钠或硝酸铵；其它盐为磷酸盐、镁盐、锌盐；苝醌类化合物为3.5％，其余同实施例1。
实施例3大罐条件：发酵温度25～26℃，PH4～5，通气量1.5L/min，搅拌速度120r/min，培养2～3天；营养盐的碳源为蔗糖或麦芽糖；氮源为尿素或硝酸铵；其它盐为磷酸盐、镁盐、钙盐；苝醌类化合物为4.0％，其余同实施例1。
实施例4大罐条件：发酵温度23～24℃，PH8～9，通气量1.2L/min，搅拌速度130r/min，培养3～4天；营养盐的碳源为淀粉或葡萄糖；氮源为硝酸钠或氯化铵；其它盐为磷酸盐、镁盐、铁盐；苝醌类化合物为4.4％，其余同实施例1。
实施例5大罐条件：发酵温度26～27℃，PH6～7，通气量.2L/min，搅拌速度140r/min，培养时间5～6天；营养盐的碳源为蔗糖或乳糖；氮源为蛋白胨；其它盐为磷酸盐、钾盐、锌盐；苝醌类化合物为4.9％，其余同实施例1。
实施例6大罐条件：发酵温度25～27℃，PH7～8，通气量1～1.6L/min，搅拌速度150r/min，培养时间6～7天；营养盐的碳源为淀粉或葡萄糖；氮源为尿素；其它盐为磷酸盐、钙盐、锌盐；苝醌类化合物为4.2％，其余同实施例1。
实施例7大罐条件：发酵温度23～25℃，PH4～5，通气量1.8L/min，搅拌速度160r/min，培养时间2～4天；营养盐的碳源为乳糖或葡萄糖；氮源为硝酸铵；其它盐为磷酸盐、铁盐、锌盐；苝醌类化合物为4.5％，其余同实施例1。
实施例8大罐条件：发酵温度26～27℃，PH5～6，通气量1.5L/min，搅拌速度120-250r/min，培养时间3～5天；营养盐的碳源为淀粉或麦芽糖；氮源为氯化铵；其它盐为磷酸盐、钾盐、锌盐；苝醌类化合物为4.4％，其余同实施例1。
实施例9大罐条件：发酵温度24～25℃，PH4～6，通气量1.7L/min，搅拌速度170r/min，培养4～6天；营养盐的碳源为淀粉或蔗糖；氮源为硝酸钠或蛋白胨；其它盐为磷酸盐、钾盐、锌盐；苝醌类化合物为4.5％，其余同实施例1。
实施例10大罐条件：发酵温度23～24℃，PH8～9，通气量.2L/min，搅拌速度180r/min，培养时间2～4天；营养盐的碳源为淀粉或葡萄糖；氮源为硝酸钠；其它盐为磷酸盐、铁盐、钙盐；苝醌类化合物为4.1％，其余同实施例1。
实施例11大罐条件：发酵温度24～26℃，PH5～7，通气量1L/min，搅拌速度200r/min，培养时间3～5天；营养盐的碳源为淀粉或葡萄糖；氮源为硝酸铵；其它盐为磷酸盐、镁盐、铁盐；苝醌类化合物为4.3％，其余同实施例1。
实施例12大罐条件：发酵温度25～27℃，PH6～8，通气量1.8L/min，搅拌速度190r/min，培养时间5～7天；营养盐的碳源为乳粉或麦芽糖；氮源为尿素；其它盐为磷酸盐、钾盐、锌盐；苝醌类化合物为4.8％，其余同实施例1。
实施例13大罐条件：发酵温度24～26℃，PH4～6，通气量1.6L/min，搅拌速度250r/min，培养时间4～6天；营养盐的碳源为葡萄糖；氮源为硝酸钠；其它盐为磷酸盐、钾盐、铁盐；苝醌类化合物为4.0％，其余同实施例1。
实施例14大罐条件：发酵温度23～25℃，PH7～9，通气量.2L/min，搅拌速度230r/min，培养时间3～5天；营养盐的碳源为淀粉；氮源为硝酸钠或硝酸铵；其它盐为磷酸盐、镁盐、锌盐；苝醌类化合物为4.4％，其余同实施例1。
Claims (7)
1.一种产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是将子囊菌纲(Ascomycetes)肉座菌科(Hypocreaceeac)寄生菌属真菌(Hypomyces(Fr.)Tul.sp)菌种采集号为18，即Hypomyces AL018，采用搅拌下通气液体深层发酵工艺。
2.按照权利要求1所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是发酵的工艺参数是发酵温度控制23～30℃，PH控制4～9，通气量为1.0～2.0L/min，搅拌速度为120～250r/min，发酵的时间为2～7天。
3.按照权利要求1或2所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是最佳发酵温度控制26～28℃，PH控制6～7。
4.按照权利要求1或2所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是最佳通气量为1.1～1.5L/min。
5.按照权利要求1或2所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是最佳发酵时间为3～5天。
6.按照权利要求1或2所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是最佳搅拌速度为160～180r/min。
7.按照权利要求1或2所述的产苝醌类化合物真菌的液体发酵工艺，其特征是营养盐的碳源可以从淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中选择，氮源可以从硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨中选择，其它盐可以从磷酸盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐中选择。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN1295341C (zh) * | 2005-01-17 | 2007-01-17 | 云南大学 | 苝醌化合物的生物合成方法 |
| CN101186932B (zh) * | 2007-11-11 | 2012-01-04 | 温州大学 | 一种液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的方法 |
| CN108640825A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-10-12 | 南京师范大学 | 一种从竹黄固态发酵料中同时提取竹红菌甲素和痂囊腔菌素a的方法 |
| CN112980912A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-06-18 | 华南理工大学 | 一种提高竹黄发酵生产苝醌类次生代谢物产量的方法 |
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2001
- 2001-11-28 CN CN 01135155 patent/CN1421521A/zh active Pending
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