CN1411376A - 新的能结合幽门螺杆菌的物质及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了包含Galβ3GlcNAc和Galβ3GalNAc的能结合幽门螺杆菌的物质，以及它们在药用组合物和食物材料中的应用，和用于治疗因幽门螺杆菌存在所致的疾病的方法。也描述了该物质用于鉴定细菌粘附，用于产生针对幽门螺杆菌的疫苗，用于诊断幽门螺杆菌感染，用于幽门螺杆菌分型，用于鉴定能结合幽门螺杆菌的物质和用于抑制幽门螺杆菌结合的用途。

Description

新的能结合幽门螺杆菌的物质及其用途
                         发明领域
本发明涉及新的能结合幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的物质及其在例如药用组合物中的用途和用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的方法。
                         发明背景
微生物的粘附被认为是感染发病机理的第一步，其中感染因子的粘附素特异性，和宿主靶器官上皮细胞表达的受体结构是决定病原体的宿主范围和组织向性的主要因素(1)。
人类胃的致病幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是慢性浅表性胃炎病因学因子(2)，并且也与十二指肠溃疡，胃溃疡和胃腺癌的发生有关(3-7)。此微生物具有非常独特的宿主范围和组织向性，即它的定居需要人胃型上皮的存在(8)。在人类胃中发现多数这种细菌在粘膜层中，但也显示该细菌对表层粘膜细胞的选择性附着(8，9)。
以前曾证明幽门螺杆菌的几种不同结合特异性。因此已有报道该细菌对多种化合物的结合如磷脂酰乙醇胺和神经节四糖基酰基鞘氨醇(gangliotetraosylceramide)(10，11)，Leb血型决定簇(12)，硫酸类肝素(13)，GM3神经节苷脂(14)，硫苷脂(14，15)，和乳糖基酰基鞘氨醇(lactosylceramide)(16)的结合。已有资料显示幽门螺杆菌与人类红细胞，粒细胞和胎盘上的大分子复合物糖鞘脂(多聚糖基酰基鞘氨醇)以唾液酸依赖性方式结合(17，18)。
除了与胃肠疾病有关外，幽门螺杆菌也与侵犯除胃肠道以外的其他器官的多种疾病有关(74)。例如已经表明其与心脏病尤其是动脉粥样硬化(75)，肝脏疾病包括肝腺癌(76，77)，皮肤疾病(78)，和婴儿猝死综合征(79，美国专利第6083756号)有关。
                         发明概述
本发明的主要目的是提供治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的新方法。
本发明以在人类胃上皮细胞中发现特殊的幽门螺杆菌受体为基础。在许多情况下受体是糖脂，乳糖基酰基鞘氨醇，仅在人类胃肠道中发现，并且在研究工作期间发现最小的结合表位是Galβ3GlcNAc或相似结构Galβ3GalNAc。
因此本发明涉及包括该结合表位的能结合幽门螺杆菌的物质，或它们的类似物或衍生物。
本发明的目的之一是提供用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的药用组合物。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质在生产用于治疗因幽门螺杆菌存在所致疾病的药用组合物中的用途。
本发明的另一目的是提供用于治疗由幽门螺杆菌存在引起的疾病的方法。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质在鉴定细菌粘附素中的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质为治疗目的和如体外测定等非医疗目的而用于抑制幽门螺杆菌结合的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质作为鉴定其他能结合幽门螺杆菌的物质的引导(lead)化合物的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质在食物材料中/或作为营养添加剂的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质或上述细菌粘附素用于生产抗幽门螺杆菌疫苗的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质在诊断幽门螺杆菌感染中的用途。
本发明的另一目的是上述能结合幽门螺杆菌的物质在幽门螺杆菌分型中的用途。
                         发明详述
如上述本发明涉及特殊的能结合幽门螺杆菌的物质。在形成本发明的工作中将一系列大量的不同幽门螺杆菌菌株用35S-甲硫氨酸代谢性标记并检测时薄层板上分离的一组不同的天然糖鞘脂的结合。将两种明显不同的结合特异性用放射自显影重复检测。如前面详细描述的，幽门螺杆菌结合乳糖苷酰基鞘氨醇，神经节三糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇(16)。最初在人类物质中检测到的唯一结合活性是对人类胎粪中非-酸性级的四糖基酰基鞘氨醇区中化合物的结合。
人类胃上皮细胞的糖鞘脂组成目前仍不十分清楚。但是，在最近对人类胃肠道的粘膜细胞和粘膜下组织的糖鞘脂的研究中(55)，报道了胃底和胃窦粘膜富含硫苷脂。在薄层板上迁移的主要非-酸性糖鞘脂为半乳糖苷酰基鞘氨醇，乳糖苷酰基鞘氨醇，酰基鞘氨醇三己糖(globotrraosylceramide)和红细胞糖苷脂，而迁移的主要神经节苷脂为GM3，GM1和GD3。带有植物鞘氨醇和羟基脂肪酸的幽门螺杆菌结合型乳糖苷酰基鞘氨醇在人类胃上皮细胞中也已鉴定出(16)。
此外，血型Cad-激活的神经节苷脂(GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)已经在人胃底部鉴定出(56)，而在幽门区尚未发现(57)，表明人胃的不同区域糖鞘脂的差异表达。
由于对人类胃组织接触受限，本发明者开始集中精力于人胎粪中检测到的结合幽门螺杆菌的糖鞘脂，胎粪是新生儿初次的无菌粪便且主要由正在发育的胃肠道排出的粘膜细胞组成。分离后，将此结合幽门螺杆菌的糖鞘脂用质谱法，质子NMR波谱和甲基化分析鉴定为Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基酰基鞘氨醇)。乳四糖基酰基鞘氨醇的组织分布是非常局限的。直至最近仅在人的胎粪中(45)，在已事先切除了的一个ad modum BillrothII的小肠中(46)，在正常人胃粘膜和人胃癌组织中鉴定出的乳四糖基酰基鞘氨醇(58)。但是，“正常的”粘膜，在最新报道的5例中4例是从由于十二指肠溃疡或胃溃疡而行窦切除术获得的。使用单克隆抗体K-21经免疫组织化学研究证明，Galβ3GlcNAc-序列在非分泌个体的胃粘膜浅表层(有小凹的上皮)选择性表达(59)，与组织切片幽门螺杆菌结合的定位一致(8，9)。利用结合Galβ3GlcNAc-序列的多克隆抗体经免疫组织化学研究显示，乳四糖基酰基鞘氨醇存在于Ole(a-b-)血型的非分泌个体的人类空肠和回肠刷状缘细胞中，也存在于一例Ole(a+b+)血型的非分泌个体中(60)。
在研究中分析的66个幽门螺杆菌分离物中，发现57个菌株(86％)表达乳四糖基酰基鞘氨醇结合特异性，而9个菌株是阴性的。在幽门螺杆菌分离物中观察到的乳四糖基酰基鞘氨醇结合特征的高度流行证明它是这种胃致病菌的保守特性，并且可以因此代表重要的毒力因素。
将乳四糖基酰基鞘氨醇结合特异性的生物学关系进一步用幽门螺杆菌对从人类胃靶上皮细胞上分离的非-酸性糖鞘脂的四糖基酰基鞘氨醇区域的结合证明。通过对酰基鞘氨醇聚糖酶水解获得的过甲基化的四糖进行质子NMR波谱，和气相色谱-质谱分析，证明结合活性级分包含乳四糖基酰基鞘氨醇。具有结合活性的乳四糖基酰基鞘氨醇仅发现于被分析的7例个体中的一例，此事实意味着尽管感染幽门螺杆菌并且相关的慢性胃炎是非常普遍的，但是那些感染者仅有一个小级分发展成任何进一步的后果例如消化性溃疡或胃腺癌(7)。因此理论推测乳四糖基酰基鞘氨醇在胃上皮细胞中的存在是感染发展成严重后果如消化性溃疡或胃癌，所必需的辅助因子之一。
从人胎粪中分离的有结合活性的乳四糖基酰基鞘氨醇部分既含有羟化的也含有非羟化的酰基鞘氨醇。理论上，结合可因此被限制于羟化的酰基鞘氨醇类，如对乳糖基酰基鞘氨醇的结合特异性的描述(16)。但是，从兔胸腺分离的乳四糖基酰基鞘氨醇，一种仅由鞘氨醇和非-羟化的16：0和24：0脂肪酸构成的酰基鞘氨醇(B.Lanne et al.待发表)，与从人胎粪中分离的乳四糖基酰基鞘氨醇(未显示)具有相同活性，证明对乳四糖基酰基鞘氨醇的结合不依赖于酰基鞘氨醇组分。
用125I-标记的细菌表面蛋白获得的结合模式与用35S-标记的完整细菌细胞获得的是相同的，说明这些表面蛋白制剂可以用于结合碳水化合物的粘附素的分离和鉴定。
概括地，幽门螺杆菌对人胃粘膜细胞的粘附可能是一种多成分系统，其中几种细菌粘附素识别并结合靶组织中的不同受体。本研究还鉴定了另一种结合活性化合物，即，乳四糖基酰基鞘氨醇，是通过对薄层板上糖鞘脂的结合来检测。此糖鞘脂的分布是局限的，并且迄今为止仅发现于人胃肠道中。在其他人类组织中乳四糖基酰基鞘氨醇被岩藻糖或唾液酸取代，因此在本文使用的测定条件下不结合。
对这种结合幽门螺杆菌的糖鞘脂的分离和结构鉴定，以及对人类胃粘膜细胞中相同化合物的鉴定，导致对最小结合表位，即Galβ3GlcNAc的鉴定。Galβ3GalNAc表位与Galβ3GlcNAc表位在结构和功能上是非常相似的，并且因此它们可以互相替代。
因此本发明涉及包括至少一种具有通式1的化合物的能结合幽门螺杆菌的物质：通式1
其中：
R1和R2是H或OH，规定当R1是H时R2是OH，当R1是OH时R2是H；
X是单糖或寡糖残基，优选X是乳糖基-，半乳糖基-，多聚-N-乙酰乳糖胺基，或形成O-聚糖或N-聚糖部分的寡糖序列的一部分；
Y不存在，或者Y是间隔基团或末端结合物，象酰基鞘氨醇的脂类组分或连接到Z的键(-O-)；
Z是低价或多价的载体或者-H；
n是0或1；
m是等于或大于1的整数，可根据所述物质使m大到数千或数百万，
或从幽门螺杆菌方面考虑具有与通式1的化合物相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
当通式1中R1是OH且R2是H时得到通式2的化合物，当R1是H且R2是OH时，得到通式3的化合物。通式2通式3
本发明也包括按照通式1，2和3的物质，其中-O-X被-S-X，-N-X，或-C-X取代，因为本领域的技术人员知道它们是可以互换的。
本发明也涉及能结合幽门螺杆菌的物质，其包括或由下列组成：Galβ3GlcNAc(对应于通式1，其中R1＝OH和R2＝H)或Galβ3GalNAc(对应于通式，1其中R1＝H和R2＝OH)，或者从幽门螺杆菌方面考虑与Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc具有相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
按照本发明可使用Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc本身，或与幽门螺杆菌具有相同或更好结合活性的它们的任何天然或合成生产的类似物或衍生物。也有可能使用物质例如：乳四糖，乳四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)或神经节四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer)，包括结合位点Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc，或从幽门螺杆菌方面考虑具有相同或更好结合活性的它们的任何天然或合成生产的类似物或衍生物。可以优选使该最小结合表位，或它们的类似物或衍生物位于该物质的非还原末端。
优选使用乳四糖或神经节四糖，或者单独或者以多价形式。
本发明能结合幽门螺杆菌的物质也可以由载体组成或者包括载体其中一或多种上述物质已经被附着于载体上。
本发明能结合幽门螺杆菌的物质也可以由微团组成或者包括微团其中含有一或多种上述物质。此类微团的例子之一是含有例如数种乳四糖分子的脂质体。
也可以将本发明能结合幽门螺杆菌的物质偶联至多糖上，例如多聚乳糖胺链或其偶联物，或偶联至抗生素，优选具有抗幽门螺杆菌作用的抗生素。
本发明的物质因此可以是糖链的部分或糖结合物或含有其它已知幽门螺杆菌结合表位的糖基化合物的混合物，具有不同的糖序列和构象，象Lewisb[Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc]或NeuNAcα3Galβ4Glc/GlcNAc。同时使用几种结合物质可能对治疗有利。
可以将本发明的物质偶联至抗生素，优选青霉素类抗生素。本发明的物质将抗生素定靶在幽门螺杆菌上。这类偶联是有利于治疗的，因为抗幽门螺杆菌治疗需要的抗生素量更少，这导致抗生素的副作用更低。偶联物的抗生素部分目标是杀灭或减弱细菌，但是偶联物也可具有下述抗粘附作用。
已知幽门螺杆菌能结合几种寡糖序列。由特定菌株进行的结合中的一部分可以代表许多不会导致癌症或严重疾病的共生作用。关于与癌症-型糖表位的结合的现有数据表明本发明的物质能防止更多的病理性相互作用，在此过程中，可能使一些致病性较小的幽门螺杆菌结合其他受体结构。因此在预防涉及幽门螺杆菌的疾病时对细菌总的去除可能不是必需的。在预防多种幽门螺杆菌致病菌株时致病性较小的细菌甚至具有微生态调节作用。
也认识到幽门螺杆菌在其表面含有Galβ3GlcNAc-序列，其至少在某些菌株中是可被本发明描述的细菌结合的非-岩藻糖基化形式。本发明的物质也可以防止幽门螺杆菌相互结合并以此方式在例如建群过程中抑制细菌。
本发明能结合幽门螺杆菌的物质可以是例如，糖脂，糖蛋白或新糖蛋白。它也可以是包括至少两个寡糖链的寡聚分子。
为治疗由于患者胃肠道中存在幽门螺杆菌引起的疾病，可使用本发明的物质抗-粘附，即抑制幽门螺杆菌与患者胃上皮上的受体结合。当给予本发明的物质或药用组合物时，它将与该受体竞争结合细菌，并且胃肠道中的全部或部分细菌然后将结合本发明的物质而不是胃上皮表面的受体。然后细菌通过肠道并附着于本发明的物质上排出患者体外，导致细菌对患者健康的影响减弱。优选地使用的物质是包括结合位点Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc的可溶性化合物，例如乳四糖，乳四糖基酰基鞘氨醇，神经节四糖或神经节四糖基酰基鞘氨醇的可溶性类似物。也可能，并经常优选地，也可能将本发明的物质附着在载体上。当使用载体时，可以将本发明的物质的几种分子附着于同一载体上，以此改进抑制效果。
按照本发明也可能治疗由于幽门螺杆菌存在引起的其它疾病，例如肝脏疾病，心脏病或婴儿猝死综合征。
按照本发明，有可能将本发明所述物质，任选与载体一起，掺入适于治疗因患者胃肠道存在幽门螺杆菌所致疾病的药用组合物中，或将本发明的物质用于治疗这类疾病的方法中。可根据本发明进行治疗的疾病有慢性浅表性胃炎，十二指肠溃疡，胃溃疡，和胃腺癌。
本发明的药用组合物还可以包括其他物质，例如惰性赋形剂，或可药用的佐剂，载体，防腐剂等等，这些是在本领域的技术人员熟知的。
进而，可以将本发明的物质与其他药物，如用于治愈胃病的药物包括质子泵抑制剂或胃pH调节药物(奥美拉唑(omeprazole)，兰索拉唑(lansoprazole)，雷尼替丁(ranitidine)等)和用于抗幽门螺杆菌的抗生素一起给药。
本发明的物质或药用组合物可以以任何合适的方式给药，但优选使用口服给药。
本文使用的术语“治疗”既涉及为治愈或减轻疾病进行的治疗，也涉及为预防疾病发展而进行的治疗。治疗可以以急性方式或者慢性方式进行。
本文使用的术语“患者”，涉及任何按照本发明需要治疗的人类或非人类哺乳动物。
此外，通过筛选与本发明的物质结合的序列，可用本发明的物质鉴定一种或多种粘附素。该序列可以是例如，蛋白质或糖类。结合糖类的蛋白质可以是凝集素或结合糖类的酶。筛选可通过例如亲和层析或亲和交联方法进行。
而且，可使用特异结合人组织中Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc的物质并因此防止幽门螺杆菌的结合。这种物质的例子包括特异于Galβ3GlcNAc的单克隆抗体K-21，和其他抗体或结合该结构的凝集素，或能够裂解β3连接的半乳糖的β-半乳糖苷酶或乳-N-糖苷酶，可从寡糖链末端释放Galβ3GlcNAc的内糖苷酶。而且，结合Galβ3GlcNAc的粘附素或尤其是其结合部分可被用于抑制幽门螺杆菌与受体Galβ3GlcNAc的结合。当用于人体时，该结合物质应适合于这样的使用，例如人源化的抗体或来源于人的重组糖苷酶，其是非-免疫原性的并能够裂解本发明所述物质末端的一或多个单糖残基。但在胃肠道中，对源于例如食物的多种天然凝集素和糖苷酶是耐受的。
而且，在可能将本发明的物质作为模板用来生产适合于幽门螺杆菌预防接种的疫苗，例如上述情况。
而且，本发明的物质可用于诊断幽门螺杆菌感染所致疾病。
而且，本发明所述物质可为非医疗目的而用于抑制幽门螺杆菌的结合，如在体外分析系统中，如可用于鉴定其它能结合幽门螺杆菌的物质。
而且，可能在鉴定其他能结合幽门螺杆菌的物质时使用本发明的物质作为引导化合物。
而且，可用本发明的物质进行幽门螺杆菌分型。
最后，也可能在用于人类和动物的食物材料或营养组合物中使用本发明的物质，例如在食物，牛奶，酸乳，或其它奶制品，饮料组合物和婴儿配方食物中。本文描述的营养组合物或食物材料并非天然人乳。优选将本发明的物质用作功能性或实用性(functional)食物的一部分，该功能性食物有利于人或动物的健康，因为它们抑制或阻断幽门螺杆菌与靶细胞或组织结合。本发明的物质可以特定食物或功能性食物组合物的一部分。功能性食物可以含有其它可被控制食物的权威如美国食品和药品管理局接受的已知食物成分。也可将本发明的物质用作营养添加剂，优选作为食物或饮料添加剂来生产功能性食物或功能性饮料。食物或食物添加剂还可通过使奶牛或其他动物在其乳汁中大量天然产生本发明的物质来产生。这可通过使动物在其乳汁中过表达合适的糖基转移酶来完成。可选择并饲养特殊种系或种属的家养动物以获得更大产量的本发明的物质。本发明的物质和尤其用于营养组合物或营养添加剂的本发明物质也可通过微生物如细菌或酵母来生产。
本发明的物质尤其可作为婴幼儿食物或营养组合物的一部分使用，优选作为婴儿配方食物的一部分。“婴儿配方食物”本文也指特定的婴儿配方食物如蛋白质水解型配方，用于低出生体重婴儿的配方或随后的配方。许多婴儿是用特殊的配方代替天然人乳来喂养。配方可能缺乏的人乳中特定的以乳糖为基础的寡糖，尤其是延长类型如乳-N-四糖，Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc，和其衍生物。婴儿配方可以是干粉并用水重建成可被婴幼儿食用的最终食物。在优选实施方案中，婴儿食物旨在使用与天然人乳中乳-N-四糖的浓度(约0.05-5g/L，更优选0.1-0.5g/L)相似的浓度。
已知乳-N-新四糖和对-乳-N-己糖Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc来自人乳并因此认为是婴儿食物的安全添加剂或成分。幽门螺杆菌尤其易感染婴儿或幼儿，并考虑到其随后导致的疾病而预防其感染是明智的。也已知幽门螺杆菌可引起婴儿猝死综合征，但用于根治细菌的强抗生素治疗可能对婴幼儿极为不适合。
当将本发明的物质用于诊断或分型时，例如可以将它包括在例如探针或测试棒中，任选构成试剂盒的组成部分。当将此探针或测试棒与包含幽门螺杆菌的标本接触时，细菌将与探针或测试棒结合并且因此能从标本上分离以进一步分析。
糖鞘脂命名法遵循IUPAC-IUB Commission在生化命名法(BiochemicalNomenclature)中的建议(CBN for Lipids：Eur.J.Biochem.(1977)79，1121，J.Biol.Chem.(1982)257，3347-3351，and J.Biol.Chem.(1987)262，13-18)。
设想Gal，Glc，GlcNAc，GalNAc，NeuNAc和NeuGc是D-构型，Fuc为L-构型，并且所有的糖以吡喃糖形式存在。
而且，乳四糖，Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc也已知为乳-N-四糖。
在用于脂肪酸和碱的shorthand命名法中，冒号前的数字指碳链长度，且冒号后的数字指分子中双键的总数。带有2-羟基的脂肪酸命名为缩写前加前缀h，例如h16：0。对长链碱而言，d指二羟基，t指三羟基。因此d18：1指鞘氨醇(1，3-二羟基-2-氨基十八烯)，t18：0植物鞘氨醇(1，3，4-三羟基-2-氨基十八烯)。
尽管说明书，实施例和权利要求书中仅提及幽门螺杆菌，但是其他非常相似的螺杆菌种类也包括在本发明的范围内。
本发明用以下实施例进一步详述，但决不打算用其限制本发明的范围。
                         附图简述
在下面的实施例中，参考了附图，它们是：
图1显示35S-标记的幽门螺杆菌与薄层色谱分离的糖鞘脂的结合。图1(A)显示用茴香醛试剂检测到的糖鞘脂。图1(B)和图1(C)显示与放射性标记的幽门螺杆菌菌株17875结合后用放射自显影检测到的糖鞘脂。泳道1＝人A型血红细胞的非-酸性糖鞘脂，泳道2＝狗小肠的非-酸性糖鞘脂，泳道3＝豚鼠小肠的非-酸性糖鞘脂，泳道4＝小鼠粪便的非-酸性糖鞘脂，泳道5＝黑-白大鼠小肠上皮细胞的非-酸性糖鞘脂，泳道6＝人胎粪的非-酸性糖鞘脂，泳道7＝人O型血红细胞的酸性糖鞘脂，泳道8＝兔胸腺的酸性糖鞘脂，泳道9＝小牛脑的神经节苷脂，泳道10＝人肾上腺样瘤的酸性糖鞘脂。(A)左测的标示指链中糖残基的数目。
图2显示从人胎粪中分离的过甲基化幽门螺杆菌结合型糖鞘脂的质谱图。质谱上方是代表酰基鞘氨醇类型的简化化学式，其中鞘氨醇和羟基24：0脂肪酸。
图3显示人胎粪中糖鞘脂的质子NMR谱的差向异构区。在探测温度30℃时收集4000次扫描。在5.04ppm处的大分散样信号是仪器假象，在4.93ppm处也有未鉴定的不纯物。
图4显示幽门螺杆菌与在薄层板上分离的纯的糖鞘脂的结合。泳道1＝乳三糖基酰基鞘氨醇，泳道2＝乳四糖基酰基鞘氨醇，泳道3＝H51型糖鞘脂，泳道4＝Lea-5糖鞘脂，泳道5＝Leb-6糖鞘脂，泳道6＝X-5糖鞘脂，泳道7＝Y-6糖鞘脂，泳道8＝B61型糖鞘脂。图4A表示用茴香醛进行的化学检测，图4B表示通过结合35S-标记的幽门螺杆菌获得的放射自显影照片。
图5显示幽门螺杆菌与寡糖乳糖和乳四糖预共保温的效果。图5A是用茴香醛染色的薄层色谱图，图5B显示与乳糖共保温的幽门螺杆菌的结合，图5C显示与乳四糖共保温的幽门螺杆菌的结合。泳道1＝神经节四糖基酰基鞘氨醇，泳道2＝乳四糖基酰基鞘氨醇，泳道3＝新乳四糖基酰基鞘氨醇。
图6显示用茴香醛检测的分离的糖鞘脂的薄层色谱(图6A)和用35S-标记的幽门螺杆菌菌株002结合获得的放射自显影照片(图6B)。泳道1＝人胎粪的乳四糖基酰基鞘氨醇，泳道2＝人胎粪的非酸性糖鞘脂，泳道3＝A(Rh+)p血型个体的人胃非酸性糖鞘脂，泳道4＝A(Rh+)p血型个体的人胃非酸性糖鞘脂。带中糖残基的数示于左侧。
图7显示幽门螺杆菌与人胃上皮细胞上非酸性糖鞘脂的结合。泳道1＝狗小肠的参考非酸性糖鞘脂，泳道2＝小鼠粪便参考非酸性糖鞘脂，泳道3＝人胎粪的非酸性参考糖鞘脂，泳道4-8＝五例人胃中(表III中1-5例)上皮细胞的非酸性糖鞘脂(80μg/泳道)。图7A显示用茴香醛进行的化学检测，图7B表示通过35S-标记的幽门螺杆菌的结合获得的放射自显影照片。带中糖残基的数示于左侧。
图8是薄层色谱图，显示从表III中例4和例5的胃上皮细胞获得的含四糖基酰基鞘氨醇的级分(A)，4-II(B)和5-II(C)级分的500MHz质子NMR波谱中的差向异构区。泳道1＝例4的胃上皮中总的非酸性糖鞘脂，泳道2＝例4的4-I级分，泳道3＝例4的4-II级分，泳道4＝例5的胃上皮中总的非酸性糖鞘脂，泳道5＝例5的5-I级分，泳道6＝例5的5-II级分。带中糖残基数示于左侧。
图9表示过甲基化寡糖经酰基鞘氨醇聚糖酶水解后重构的离子色谱图。Run A＝红细胞糖苷脂，乳四糖基酰基鞘氨醇和乳新四糖基酰基鞘氨醇的参考混合物，run B＝表III例4的胃上皮的四糖基酰基鞘氨醇，run C＝表III例5的胃上皮的四糖基酰基鞘氨醇。参考混合物(runA)的寡糖已明示。
图10表示用高温气相色谱-EI质谱仪获得的下列物质的质谱图：从参考糖鞘脂经酰基鞘氨醇聚糖酶水解出的过甲基化寡糖(I和II)，来自表III例4的胃上皮的四糖基酰基鞘氨醇级分(III)，和来自表III例5的胃上皮的四糖基酰基鞘氨醇级分(IV)。
图11表示乳四糖基酰基鞘氨醇既被结合唾液酸的幽门螺杆菌菌株CCUF17874识别(B)也被缺乏唾液酸结合能力的菌株CCUG17875识别(C)。
图12表示结合幽门螺杆菌(图12A)，和结合型Lea-5糖鞘脂(B)，Leb-6的糖鞘脂(C)和去岩藻糖基化的B61型糖鞘脂(D)的乳四糖基酰基鞘氨醇的最低能量构象异构体。
图13表示乳四糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇的最低能量构象异构体的分子模型，其显示通过仅改变Glcβ1Cer双面夹角可出现相同的末端二糖。在乳四糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇中产生跨Glcβ1Cer键(φ，ψ和θ)具有不同双面夹角的所有可能的最低能量构象，随后成对比较每种构象异构体，表明获得了两对异构体，其中这两种糖鞘脂的末端二糖具有相同的方向。在第一对中，乳四糖基酰基鞘氨醇(A)跨Glcβ1Cer键的双面夹角是51，-179和67，而对神经节四糖基酰基鞘氨醇而言(B)同样的角是51，180和177。该构象在(A)中通过Glc的2-OH和长链碱的3-O间的分子内氢键来稳定，而该构象在(B)中指延长部分。在第二对中，乳四糖基酰基鞘氨醇(C)跨Glcβ1Cer键的双面夹角是13，-90和-59，而对神经节四糖基酰基鞘氨醇而言(D)同样的角是53，-173和-64。乳四糖基酰基鞘氨醇中Glc的2-OH与脂肪酸的2-OH和长链碱的NH之间形成氢键，而神经节四糖基酰基鞘氨醇具有与Galβ1Cer晶体结构中发现的同样的Glcβ1Cer构象。GlcNAc/GalNAc中乙酰氨基的甲基碳原子用黑色显示。
                         实施例
实施例中使用的缩写如下：
CFU＝集落形成单位；
Hex＝己糖；
HexN＝N-乙酰己糖胺
EI＝电离作用。
在实施例中，幽门螺杆菌与糖鞘脂的结合用在薄层色谱(Chromatogram)中35S-标记的细菌与糖鞘脂的结合来检测。经常检测到两种不同的结合特异性；一方面幽门螺杆菌与乳糖酰基鞘氨醇，神经节三糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇结合，另一方面，与人胎粪中非酸性四糖基酰基鞘氨醇选择性结合。分离后者一种结合幽门螺杆菌的糖鞘脂，并根据质谱分析，质子NMR波谱分析，和降解研究鉴定为Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基酰基鞘氨醇)。从7例人类个体的一例获得幽门螺杆菌与胃上皮细胞非酸性糖鞘脂部分的四糖基酰基鞘氨醇区域的结合，在此部分中存在乳四糖基酰基鞘氨醇通过对酰基鞘氨醇聚糖酶处理产生的过甲基化四糖进行质子NMR波谱和气相色谱-EI质谱分析来确认。在66个幽门螺杆菌分离物中57个(86％)检测出乳四糖基酰基鞘氨醇结合特性的表达。
材料与方法
细菌菌株，培养条件和标记-使用的细菌，及其来源，在说明书最后部分的表I中描述。在大多数实验中使用四种菌株，17857型菌株(从CultureCollection，University of Goteborg，(CCUG)，Sweden获得)，和临床分离物002，032和306，均做平行试验。
将菌株贮存在-80℃含有15％甘油(按体积)的胰蛋白酶大豆肉汤中，并首先在GAB-CAMP琼脂(19)上以潮湿的(98％)微需氧空气(5-7％O2，8-10％CO2，85％N2)于37℃培养48-72小时。为进行标记，将菌落接种于GAB-CAMP，或Brucella，琼脂平板上并且向平板上喷洒用0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的pH7.3的50μCi[35]S-甲硫氨酸(Amersham，UK)。在微需氧条件下于37℃培养12-36小时后将细胞刮下，用PBS洗涤三次，并在PBS中重悬成1×108CFU/ml。
或者，将菌落接种(1×105CFU/ml)于添加了热灭活的胎牛血清(Seralab，Goteborgs Termometerfabrik，Sweden)和50μCi[35]S-甲硫氨酸的Ham’s F12培养基(Gibco BRL，UK)中。将培养瓶在37℃微需氧条件下振摇保温24小时。检测培养瓶等份试样中尿素酶-，氧化酶-，和过氧化氢酶-活性并经相差显微镜检测以确保球菌形式含量很低。经离心收获细菌，用PBS洗涤两次后，将细胞在PBS中重悬至1×108CFU/ml。
两种标记方法得到每100个幽门螺杆菌大约1cpm比活性的悬液。
细菌表面蛋白的提取—提取步骤前，将幽门螺杆菌菌株(表I中带*所示)在5％马血琼脂中于37℃微需氧条件下培养2-3天，收获并用PBS洗涤一次。将细菌细胞用1M LiCI的PBS溶液于45℃保温2小时以便制备粗提物(20)。离心后，将上清用PBS透析过夜。用考马斯亮蓝G-250染料的酸性溶液(Bio-Rad，Richmond，UK)判定提取物的蛋白质浓度为300-1500μg/ml。从每个提取物中取出大约100μg蛋白质的等分试样，并用[125]I经Iodogen方法(21)标记，使比活性为2-5×103cpm/μg。
薄层色谱-在玻璃-或铝支持的硅胶60HPTLC板(Merck，Darmstadt，Germany)上，用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)或含0.02％CaCl2的氯仿/甲醇/水(体积比60∶40∶9)作为溶剂系统进行薄层色谱。用茴香醛(22)或间苯二酚试剂(23)完成化学检测。
色谱结合分析—如(24)所描述的进行色谱结合分析。将糖鞘脂(20-80μg/泳道)混合物或纯化合物(1-4μg/泳道)在铝支持的硅胶60HPTLC板上分离。将干燥的色谱浸入含0.5％(w/v)多聚异丁基异丁烯酸酯的二乙醚/正己烷(按体积1∶5)(Aldrich Chem.Comp.Inc.，Milwaukee，WI)中1分钟。干燥后，为封闭非特异结合位点将色谱包被。先试验不同的包被条件，例如1％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)的PBS(溶液1)，2％明胶(w/v)的PBS(溶液2)，2％牛血清白蛋白(w/v)的PBS(溶液3)，2％牛血清白蛋白(w/v)和0.1％(w/v)Tween20的PBS(溶液4)，或2％牛血清白蛋白(w/v)和0.2％(w/v)脱氧胆酸的PBS(溶液5)。用溶液4获得了最一致的结果，随后将其用作标准条件。包被在室温下进行2小时。此后将35S-标记的细菌(用PBS稀释成1×10g CFU/ml和1-5×106cpm/ml)或125I-标记的细菌表面蛋白(用溶液4稀释成大约2×106cpm/ml)悬液轻轻喷洒在色谱上并于室温保温2小时。用PBS洗涤6次，干燥后，使用XAR-5x-线胶片(Eastman Kodak，Rochester，NY)，将薄层板在室温下或在-70℃进行放射自显影3-120小时。
糖鞘脂制制剂
参考糖鞘脂—从本说明书最后部分的表II中提供的来源，用标准方法获得酸性和非酸性糖鞘脂部分(25)。使总糖鞘脂级分乙酰化并且在硅酸柱上重复进行色谱而将各个糖鞘脂分离。纯化的糖鞘脂用质谱法(26)，质子NMR波谱(27-30)，和降解研究(31，32)鉴定。
如(16)中所描述，用无水肼处理Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(表II中编号2)产生Galβ3GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer(表II中编号3)。
人胎粪—将在Obstetric Clinic，Sahlgrenska University Hospital，Goteborg出生的17个足月新生儿胎粪混合。仅收集出生后24小时内排出的第一次粪便，冻干后，贮存在-70℃。如(25)描述的从混合物(干重23.3g)中分离非酸性糖鞘脂。简言之，将冻干物在Soxhlet装置上分两步用氯仿和甲醇(按体积分别2∶1，和1∶9)提取。将混合的提取物进行弱碱甲醇分解和透析，随后用硅酸柱(Mallinckrodt Chem.Work，St.Louis)分离。在DEAE-纤维素柱(DE-23，Whatman)上层析获得酸性和非酸性糖脂部分。为从非酸性糖脂中除去碱-稳定的磷脂，将此部分乙酰化(24)并在第二硅酸柱上分离，随后去乙酰化和透析。最后在DEAE-纤维素-和硅酸柱上纯化后获得262mg非酸性糖鞘脂。
结合幽门螺杆菌的糖鞘脂的分离用两步法进行。首先，将240mg非酸性糖鞘脂级分在2.2×30cm硅柱(YMC SH-044-10，10μm微粒；SkandinaviskaGenetec，Kungsbacka，Sweden)上经HPLC分离。将柱在氯仿/甲醇/水(按体积65∶25∶4)(溶剂A)中平衡并用溶剂A中氯仿/甲醇/水(按体积40∶40∶12，溶剂B)的线性梯度洗脱。将柱首先用溶剂A洗脱2分钟，然后在5分钟内将溶剂B在溶剂A中的百分比从0％升至50％，从50％至80％用140分钟，从80％至100％用10分钟，在100％保持23分钟。取2ml级分用薄层色谱分析，并且对茴香醛染色阳性级分进一步用色谱结合分析检测幽门螺杆菌的结合。将结合幽门螺杆菌的级分收集入试管78-88，将这些部分混合后获得14.2mg。
将此物质乙酰化，进一步在YMC SH-044-10柱上进行HPLC分离。将在氯仿中平衡的柱在氯仿中氯仿/甲醇(按体积95∶5)(溶剂C)的线性梯度用流速2ml/min洗脱。在氯仿中溶剂C的百分比从0％升至20％用10分钟，从20％至100％用70分钟，在100％保持10分钟。去乙酰化后，将每1ml的级分用薄层色谱上茴香醛染色分析，并且检测含糖鞘脂的级分结合幽门螺杆菌的活性。将大多数结合幽门螺杆菌的糖鞘脂收集入试管62，并将此级分(2.4mg)用于结构分析。
人胃上皮细胞—从因肥胖症而进行选择性外科手术的患者胃底区获得胃组织(10×10cm小块)。用0.9％NaCl(w/v)洗涤后，将粘膜细胞轻轻刮下，保存在-70℃。将物质冻干，如(25)所述分离酸性和非酸性糖鞘脂。有两例从非粘膜物上也分离到糖鞘脂。患者的血型，从每个组织标本上分离的糖鞘脂的量列于说明书最后部分表III中。
将表III例4的非酸性糖鞘脂(2.9mg)在1.0×25cm硅胶柱(Kromasil-Sil，10μm微粒，Skandinaviska Genetec)上用氯仿/甲醇/水(按体积65∶25∶4至40∶40∶12)的梯度在180分钟内，以流速2ml/min用HPLC分离。将每个级分的等分试验用茴香醛作为染色剂进行薄层色谱分析。将四糖基酰基鞘氨醇收集入试管12-17。试管12-14也含有在薄层色谱上在三糖基酰基鞘氨醇迁移率区域的化合物，将这三个级分混合后得到0.2mg物质(指4-I级分)。将试管15-17中的部分分别汇总得到0.5mg四糖基酰基鞘氨醇(指4-II级分)。
例5的10.0mg非酸性糖基酰基鞘氨醇部分的分离用与上述相同的系统，使用氯仿/甲醇/水(按体积60∶35∶8至40∶40∶12)的梯度分离。试管11中所收集的部分(指5-I部分)含有三糖基酰基鞘氨醇和四糖基酰基鞘氨醇(0.1mg)，而在试管12和13中仅获得四糖基酰基鞘氨醇。后两部分混合得到0.3mg(指5-II部分)。
EI质谱法—质谱法之前，如(33)描述的用固体NaOH在二甲基亚砜和碘甲烷中将糖鞘脂过甲基化。使用光束(beam)技术(34)，将从人胎粪中分离的四糖基酰基鞘氨醇在VG ZAB 2F/I-IF质谱仪(VG Analytical，Manchester，UK)上分析。分析的条件列于复现光谱的插图说明中。将从人胃粘膜细胞来源的四糖基酰基鞘氨醇用同样技术在JEOL SX102A质谱仪(JEOL，Tokyo，Japan)上分析。分析条件为：电子能量70eV，俘获电流300μA，加速电压10kV。温度以15℃/min上升，起始温度为150℃。
降解研究—将人胎粪中过甲基化的糖鞘脂水解，还原并乙酰化(31，32)，将获得的部分过甲基化的糖醇-和氨基己糖醇乙酸酯在Trio-2四极(quadrupole)质谱仪(VG Masslab，Altrincham，UK)上进行气相色谱-EI质谱分析。Hewlett Packed 5890A气相色谱仪上装有进样柱注射器(on-columninjector)和15m×0.25mm熔化的硅毛细管柱，DB-5(J&W Scientific，RancoCordova，CA)，膜厚0.25μm。将样品在70℃(1min)注入进样柱(on-column)内并将柱内温度以50℃/min速度从70℃升至170℃，以8℃/min速度从170℃升至260℃。质谱条件为：电子能量40eV，俘获电流200μA。通过对比停留时间和对比从参考糖鞘脂获得的部分过甲基化的醛糖醇乙酰酯的质谱鉴定成分。
质子NMR波谱—在Varian VXR 300(Varian，Palo Alto，CA)上于7.05T(300MHz)和JEOL Alpha-500(JEOL，Tokyo，Japan)上于11.75T(500MHz)获得质子NMR波谱。数据用NMR1(NMRi，Syracuse，NY)脱机处理。将氘交换的糖鞘脂部分溶解于二甲基亚砜-d6/D2O(按体积98∶2)中，在30℃用0.4Hz的数字分辨记录波谱。给出相对于四甲基硅的化学位移(shift)。
可溶性寡糖的抑制—为检测可溶性糖可能的结合抑制，将35S-标记的幽门螺杆菌菌株002和032用不同浓度(0.05mg/ml，0.1mg/ml和0.2mg/ml)的乳四糖(Accurate Chem.&Sci.Corp.，Westbury，NY)PBS或乳糖(J.T. baker Chem.Co.，Phillipsburg，NJ)PBS在室温下保温1小时。此后如上所述进行色谱结合分析，分别使用神经节四糖基酰基鞘氨醇，乳四糖基酰基鞘氨醇和参考糖鞘脂进行色谱。
构建分子模型—列于表II中的各种糖鞘脂的最低能量构象用Biograf分子成模程序(Molecular Simulations Inc.，Waltham，MA)在SiliconGraphics4D/3STG工作站上使用Deriding-II分子力场(force field)(35)计算。用电荷(charge)平衡方法(36)产生电荷并且将距离依赖的介电常数ε＝3.5r用于Coulomb相互作用。此外使用特殊的氢原子成键其中Dhb设置为-4kcal/mol(35)。
人胃上皮中四糖基酰基鞘氨醇的酰基鞘氨醇聚糖酶处理-使用Hansson等(37)的方法进行酶解。简言之，将例4的4-II部分，例5的5-II部分，人红细胞的参考红细胞糖苷脂(38)，人胎粪的参考乳四糖酰基鞘氨醇，和参考乳新四糖基酰基鞘氨醇(将人红细胞的唾液基-乳新四糖基酰基鞘氨醇用唾液酶处理获得，参考39)100μg溶解在100μl含有120μg胆酸钠的0.05M醋酸钠缓冲液，pH5.0中，并经短暂超声处理。此后，加入1mU水蛭(Macrobdella decora)酰基鞘氨醇聚糖酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)并将混合物于37℃保温24小时。加入氯仿/甲醇/水至终比例8∶4∶3(按体积)来终止反应。将因此得到的含有寡糖的上相与酰基鞘氨醇和去污剂在Sep-Pak C18柱(cartridge)(Waters，Milford，MA)上分离。含有寡糖的洗脱物在氮气和真空下干燥，此后如(33)描述的过甲基化。
过甲基化寡糖的高温气相色谱和气相色谱-EI质谱分析—分析条件基本同于(40)描述的。毛细管气相色谱在Hewlett-Packard 5890A气相色谱仪上进行，使用0.03μm交联PS264(Fluka，Buchs，Switzerland)包被的熔凝氧化硅柱(10m×0.25mmi.d.)，用氢气作为载气。将过甲基化的寡糖溶解于乙酸乙酯中，于70℃(1min)将1μl样品注入进样柱中。使用两步温度程序；70℃至200℃以50℃/min升温，随后以10℃/min升至350℃。
气相色谱-EI质谱法在连于JEOL SX-102A质谱仪的Hewlett-Packard5890-II气相色谱仪上进行。色谱条件和毛细管柱同于气相色谱分析，质谱条件为：界面温度350℃，离子源温度330℃，电子能70eV，俘获电流300μA，加速电压10kV，扫描的质子范围100-1600，总循环时间1.4秒，分辨率1000，离子源区的压力10-5Pa。
结果
与参考糖鞘脂混合物的结合—用薄层色谱分离多种已知的糖鞘脂混合物，它们代表各种不同的糖序列。
结果如图1所示，其显示35S-标记的幽门螺杆菌或125I标记的细菌表面蛋白与薄层色谱分离的糖鞘脂的结合。图1(A)显示用茴香醛试剂检测到的糖鞘脂。如图1(B)和图1(C)所示，放射性标记的幽门螺杆菌菌株17875结合后用放射自显影仅见到少量选择性结合带。用放射性标记的细菌表面蛋白得到同样的结合模式(未显示)。将糖鞘脂在铝支持的硅胶60HPTLC板上，使用氯仿/甲醇/水(按体积60∶35∶8)作溶剂系统分离，如“材料与方法”中描述的进行结合分析。图1B中的放射自显影是用2％BSA和0.1％Tween20的PBS包被薄层色谱后获得的，而图1C中的放射自显影是包被缓冲液只含有2％BSA的PBS时获得的。所示泳道含有下列糖鞘脂：人A型血红细胞的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道1)；狗小肠的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道2)；豚鼠小肠的非-酸性糖鞘脂，20μg(泳道3)；小鼠粪便的非-酸性糖鞘脂，20μg(泳道4)；黑-白大鼠小肠上皮细胞的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道5)；人胎粪的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道6)；人O型血红细胞的酸性糖鞘脂，40μg(泳道7)；兔胸腺的酸性糖鞘脂，20μg(泳道8)；小牛脑的神经节苷脂，40μg(泳道9)；人肾上腺样瘤的酸性糖鞘脂，40μg(泳道10)。放射自显影12小时。
在泳道2(乳四糖酰基鞘氨醇)，泳道3(神经节三糖基酰基鞘氨醇)和泳道4(神经节四糖基酰基鞘氨醇)中的结合经判定对应于前面(16)中详细描述的幽门螺杆菌的“乳糖基酰基鞘氨醇结合特异性”和“神经节结合特异性”。
此外，检测幽门螺杆菌与在人胎粪非酸性糖鞘脂部分中四糖基酰基鞘氨醇区域内能发生迁移的成分的选择性结合(图1B，泳道6)。后一种结合活性仅在包被缓冲液含有去污剂(Tween20或脱氧胆酸)时检测，如图1所示。随后使用溶液4(20％牛血清白蛋白和0.1％Tween20的PBS)作为标准包被方法。有结合活性的人胎粪的四糖基酰基鞘氨醇用HPLC分离，并在降解后用质谱分析，质子NMR波谱分析，和气相色谱-EI质谱分析来鉴定，如下：
人胎粪中结合幽门螺杆菌的糖鞘脂的化学结构—从240mg总的非酸性糖鞘脂中分离有结合活性的四糖基酰基鞘氨醇。天然糖鞘脂混合物经HPLC得到14.2mg四糖基酰基鞘氨醇。此四糖基酰基鞘氨醇部分是复合的混合物，除结合幽门螺杆菌的化合物外它包含至少三种其他糖鞘脂。将此四糖基酰基鞘氨醇部分乙酰化并进一步用HPLC分离，产生2.4mg纯的有结合活性的糖鞘脂。在制备过程中每一步都用薄层色谱上放射标记的幽门螺杆菌的结合监测。
EI质谱分析—也研究了人胎粪中过甲基化的有结合活性的糖鞘脂的质谱，以及用于说明的简化的通式，其代表具有d18：1-h24：0酰基鞘氨醇的种类。结果如图2所示。质谱上方是用于说明的代表具有鞘氨醇和羟基24：0脂肪酸的酰基鞘氨醇类型的简化通式。分析条件为：样品量16μg，电子能45eV，俘获电流500μA和加速电压8kV。起始温度250℃，温度以6℃/min上升。产生的质谱在300℃记录。
过甲基化糖鞘脂的质谱由氧鎓离子主导，由于诱发酰基鞘氨醇的断裂产生糖序列，离子碎片(fragmention)。除了immonium离子外其他离子碎片丰度非常低，并且在由于碱的α-断裂使植物鞘氨醇作为长链碱离子时才出现。
在m/z1298和1326时发现由丢失长链碱基部分形成的immonium离子。这些离子给出的关于糖和脂肪酸组分的数目和类型的信息，并在本例中证明了存在与h22：0和h24：0脂肪酸结合的一个N-乙酰己糖胺，三个己糖。
在m/z219和187(219减去32)，464，668和872时看到的糖序列离子证明糖鞘脂是带有Hex-HexN-Hex-Hex糖序列的四糖基酰基鞘氨醇。在m/z945(944+1)时的离子碎片支持此观点，此碎片由整个糖链和部分脂肪酸组成。1型链(Hexβ-3HexN)用m/z182时离子碎片的缺失显示，此碎片在4-取代基HexN时是主导离子(41，42)。在m/z 228时密集的离子碎片是来自HexN内部的二级碎片，因为在m/z260处没有发现末端HexN。
分子区域是微弱的。但是，分别在m/z1548，1550和1578处发现相当于d18：1-24：0，d18：1-h22：0和d18：1-h24：0酰基鞘氨醇的[M-H]+离子。也看到分子离子上糖链末端部分的丢失也已显示(解释在d18：1-h24：0酰基鞘氨醇类别下方)。在m/z1342和1370处的离子可能是分别由于t18：0长链碱，t18：0-h 22：0和t18：0-h24：0酰基鞘氨醇中两个羟基间断裂引起。
关于酰基鞘氨醇组分的进一步的信息通过m/z548-722处一系列离子碎片提供，表明混合物种类范围从d18：1-16：0至t18：0-h24：0。从相关的酰基鞘氨醇离子，immonium离子，和分子离子判断，主导酰基鞘氨醇种类为d18：1-24：0，d18：1-h24：0，t18：0-h22：0和t18：0-h24：0。
因此，过甲基化的糖鞘脂的质谱证明糖链带有Hex-HexN-Hex-Hex序列，和既结合羟基又结合非羟基脂肪酸的d18：1和t18：0长链碱，大体上含22和24个碳原子。
降解研究—通过降解过甲基化的四糖基酰基鞘氨醇获得糖残基间的结合位点，即将样品进行酸水解，随后还原和乙酰化。通过气相色谱-EI质谱法对得到的部分甲基化的醛糖醇乙酸酯进行分析。因此获得的重构离子色谱具有四个糖峰(未显示)。2，3，4，6四甲基-半乳糖醇的乙酸酯鉴定出一个末端半乳糖，而4，6二甲基-2-N-甲基-乙酰氨基-山梨醇(3-取代的-N-乙酰葡糖胺)的存在指示有一条1型链。另两个峰，2，4，6-三甲基-半乳糖醇乙酸酯和2，3，6-三甲基山梨醇乙酸酯被分别鉴定为3-取代的半乳糖和4-取代的葡萄糖。
结合质谱分析的数据，可推断出带有Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4Glc1序列的糖链。
质子NMR波谱检查—此后对人胎粪的糖鞘脂进行300MHz质子NMR波谱研究，结果如图3所示。在探测温度30℃时收集4000次扫描。在5.04ppm处信号的大分散是仪器假象，在4.93ppm处也有未鉴定的不纯物。
质子NMR波谱的差向异构区含有5个大的3-双重峰(doublet)(J1，2≈8Hz)。经常是，由于酰基鞘氨醇头部基团不同，葡萄糖差向异构质子信号(4.20ppm，J1，2＝7.2Hz)被分成两个信号。在4.28ppm(J1，2＝7.2Hz)出现Gal(i4差向异构质子，其表示3-位取代基。在4.79ppm(J1，2＝8.0Hz)处观察到内部的GlcNAcβ差向异构其N-乙酰氨基甲基质子在1.82ppm共振。最后，在4.15ppm(J1，2＝6.6Hz)发现表示1与3键合的末端Gal(3信号。因此所有的差向异构化学位移与已发表的乳四糖基酰基鞘氨醇的结果是相同的(45)。除主要化合物外，在4.67和4.47ppm处用β-双重峰表示少量不纯物，似乎符合在未分化的鼠白血病细胞乳神经节四糖基酰基鞘氨醇杂合体结构(44)。
综合所有数据，人胎粪中结合幽门螺杆菌的糖鞘脂的结构被确定为Galβ3GlcNACβ3Galβ4Glcβ1Cer，即乳四糖基酰基鞘氨醇，以前从同样来源的以前已经被鉴定过(45)。以前仅发现羟基脂肪酸，在本例中主要的酰基鞘氨醇类别(d18：1-24：0，d18：1-h24：0，t18：0-h22：0和t18：0-h24：0)与之不同于。
在薄层色谱上与异受体(isoreceptor)的对比—用薄层色谱结合分析检测结构与乳四糖基酰基鞘氨醇有关的大量纯糖鞘脂的幽门螺杆菌结合活性。结果总结于表II和图4。图4中的泳道是下列物质：GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳三糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道1)；Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道2)；FucαGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(H51型糖鞘脂)，4μg(泳道3)；Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Lea-5糖鞘脂)，4μg(泳道4)；Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Leb-6糖鞘脂)，4μg(泳道5)；Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(X-5糖鞘脂)，4μg(泳道6)；Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Y-6糖鞘脂)，4μg(泳道7)；Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(B61型糖鞘脂)，4μg(泳道8)。
图4A表示用茴香醛进行的化学检测，图4B表示通过35S-标记的幽门螺杆菌菌株032结合获得的放射自显影照片。将糖鞘脂在铝支持的硅胶60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)作为溶剂系统进行分离，如“材料与方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作为包被缓冲液进行结合分析。放射自显影12小时。
唯—有结合活性的糖鞘脂是乳四糖基酰基鞘氨醇(编号2)，而实验的所有置换反应都使该结合性丧失。因此，不能耐受末端半乳糖2-位上添加α-岩藻糖(表II的编号4)，3位上添加α-N-乙醇酰神经氨酸(编号11)或α-半乳糖(编号8)，或N-乙酰葡糖胺4位上添加α-岩藻糖(编号5)。没有获得与GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer糖鞘脂(编号1)的结合，说明Galβ3GlcNAcβ-部分的重要性。主要由N-乙酰葡糖胺次末端的2位乙酰氨基参与相互作用，因为去除此部分(编号3)则完全丧失结合力。
对薄层色谱上结合的抑制—通过在对悬液的色谱结合分析前将放射标记的幽门螺杆菌菌株17875与游离的乳四糖(0.1mg/ml)PBS或乳糖(0.2mg/ml)PBS在室温下保温1小时，可检测可溶性寡糖干扰薄层板上幽门螺杆菌与糖鞘脂结合的能力。结果如图5所示，图5A是用茴香醛染色的薄层色谱图，图5B显示与乳糖保温的幽门螺杆菌的结合，图5C显示与乳四糖保温的幽门螺杆菌的结合。泳道是：Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer(神经节四糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道1)；Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道2)：Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(新乳四糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道3)。将糖鞘脂在铝支持的硅胶60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)作为溶剂系统进行分离，如“材料与方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作为包被缓冲液进行结合分析。放射自显影12小时。
因此，与乳四糖(0.1mg/ml)保温可抑制幽门螺杆菌与乳四糖基酰基鞘氨醇的结合，而与乳糖保温没有抑制作用。
幽门螺杆菌与人胃的糖鞘脂的结合
完整人类胃壁的非酸性糖鞘脂—为检测靶组织中对细菌有结合活性的糖鞘脂的表达，研究幽门螺杆菌与从人整个胃壁上分离的糖鞘脂结合，结果如图6所示，其显示用茴香醛检测的分离的糖鞘脂的薄层色谱(图6A)和用35S-标记的幽门螺杆菌菌株002的结合获得的放射自显影照片(图6B)。各泳道是：人胎粪的乳四糖基酰基鞘氨醇，4μg(泳道1)；人胎粪的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道2)；血型A(Rh+)p个体人胃的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道3)；血型A(Rh+)p个体人胃的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道4)。将糖鞘脂在铝支持的硅胶60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)作为溶剂系统进行分离，如“材料与方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作为包被缓冲液进行结合分析。放射自显影5小时。带中糖残基数示于左侧。
这些非酸性部分的四糖基酰基鞘氨醇区域主要是红细胞糖苷脂(例如图6A泳道4)，至少在人小肠(46)和大肠(47)，红细胞糖苷脂是从非上皮基质衍生而来。未获得与这些部分的结合(例如图6B，泳道4)。但是，当使用从血型A(Rh+)p个体胃中分离的非酸性糖鞘脂部分时(48)，其缺乏使乳糖基酰基鞘氨醇向红细胞三糖基酰基鞘氨醇转变的半乳糖基转移酶(49)，因而缺乏红细胞糖苷脂(图6A，泳道3)，此时检测到幽门螺杆菌在四糖基酰基鞘氨醇区域的结合(图6B，泳道3)。此例中的组织在消化性溃疡疾病外科手术后获得。由于有限的可获得量，不可能分析此有结合活性的四糖基酰基鞘氨醇的化学特征。
人胃上皮细胞的糖鞘脂—接下来发明者检测了幽门螺杆菌与从人胃上皮细胞分离的糖鞘脂的结合。因为在正常外科手术中很少切下非恶性幽门组织，所以糖鞘脂从因肥胖而进行外科手术的患者胃底区标本分离，尽管胃此区组织学不同于经常发现幽门螺杆菌的幽门区(50，51)。
总体上，从7个个体粘膜刮取物分离糖鞘脂，并且在两例中也从非粘膜残余物中分离到糖鞘脂。由于材料量有限，仅测试了幽门螺杆菌菌株002和032与这些部分的结合。
在薄层色谱上迁移的酸性糖鞘脂部分中主要化合物为硫苷脂和GM3。获得幽门螺杆菌未与这些主要酸性糖鞘脂结合(未显示)。观察到细菌未与非上皮基质的糖鞘脂结合。
然后研究幽门螺杆菌与从7例中5例人胃的上皮细胞分离的非酸性糖鞘脂部分的结合，结果如图7A所示，其显示用茴香醛进行的化学检测。在7例中之一检测到四糖基酰基鞘氨醇区域幽门螺杆菌的结合，如图7B所示。图中泳道1-3是下列组织的参考非酸性糖鞘脂：狗小肠的，40μg(泳道1)；小鼠粪便的，20μg(泳道2)；人胎粪的，40μg(泳道3)，泳道4-8是五例人胃中(表III中1-5例)上皮细胞的非酸性糖鞘脂(80μg/泳道)。图7A显示用茴香醛的化学检测，(B)表示通过35S-标记的幽门螺杆菌菌株032结合获得的放射自显影照片。将糖鞘脂在铝支持的硅胶60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)作为溶剂系统进行分离，如“材料与方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作为包被缓冲液进行结合分析。放射自显影12小时。带中糖残基数示于左侧。
此外，如先前报道描述的(16)，在一例中发现在二糖基酰基鞘氨醇区域发生迁移的有结合活性的化合物。将含有有结合活性的四糖基酰基鞘氨醇(例4)部分，和一个未结合部分(例5)用HPLC分离，并将从每例中分离的四糖基酰基鞘氨醇用酰基鞘氨醇聚糖酶水解获得的过甲基化四糖，然后进行1H-NMR波谱，EI质谱法，和气相色谱-EI质谱分析鉴定。结果如图8所示，其为薄层色谱图，显示从表III中例4和例5胃上皮细胞获得的含四糖基酰基鞘氨醇的级分(A)，以及4-II(B)和5-II(C)级分的500MHz质子NMR波谱的差向异构区。薄层色谱上各泳道是：例4的胃上皮总的非酸性糖鞘脂，80μg(泳道1)；例4的4-I部分，4μg(泳道2)；例4的4-4-II部分，4μg(泳道3)；例5的胃上皮总的非酸性糖鞘脂，80μg(泳道4)；例5的5-I部分，4μg(泳道5)；例5的5-II部分，4μg(泳道6)。将糖鞘脂在玻璃支持的硅胶60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(体积比60∶35∶8)作为溶剂系统进行分离，并用茴香醛染色。带中糖残基数示于左侧。对于质子NMR波谱，在探测温度30℃时，分别从0.5mg(4-II)和0.3mg(5-II)样品收集4000次扫描。
人胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇部分的质子NMR波谱—从例4分离的4-II部分的质子NMR波谱(图8B)主要为红细胞糖苷脂，其差向异构信号出现在4.81ppm(Galα)，4.52ppm(GalNAcβ)，4.26ppm(Galβ)和4.20/4.27ppm(Glcβ)。但是在GalαH1信号基础上的小峰说明在此部分中也存在另一种糖鞘脂。此信号与乳四糖酰基鞘氨醇的GlcNAcβ H-1是一致的，其他潜在的信号淹没在红细胞糖苷脂共振谱中。但是，红细胞三糖基酰基鞘氨醇的GalαH-1也具有非常相似的化学位移。准确的化学位移随温度和其他因素而改变。为解决此问题发明者对比了在相同条件下400MHz时乳四糖基-，红细胞四糖基-，和红细胞三糖基酰基鞘氨醇的参考波谱。也制备了乳四糖基酰基鞘氨醇和红细胞四糖基酰基鞘氨醇的参考混合物并在500MHz时分析。这些对比清晰显示，在4.79ppm处的信号属于来自乳四糖基酰基鞘氨醇的N-乙酰葡糖胺的β-差向异构质子。当分析例4中更早期洗脱的含四糖基酰基鞘氨醇的级分(4-I)时证实了这一点。这里发现半乳糖有两个不重叠的α-差向异构信号，一个对应于红细胞四糖基酰基鞘氨醇内部GalαH1(4.81ppm)，另一个对应于红细胞三糖基酰基鞘氨醇末端GalαH1(4.78ppm)(未显示)。
与红细胞三糖基-和红细胞四糖基酰基鞘氨醇的N-乙酰氨基半乳糖相比，乳四糖酰基鞘氨醇的存在也会使N-乙酰氨基葡萄糖产生不同的甲基信号(52)。乳四糖酰基鞘氨醇中GalNAc的甲基信号在1.85ppm处，GlcNAc的甲基信号在1.82ppm处，这与我们的参考波谱相同并且与(53)中报道的值非常一致。从甲基信号的强度估计4-II部分含有大约5％乳四糖酰基鞘氨醇。
例5早期洗脱的含有四糖基酰基鞘氨醇的级分(5-I)既含有红细胞三糖基酰基鞘氨醇也含有红细胞四糖基酰基鞘氨醇，如分别在4.81和4.78ppm处的α-差向异构信号所示(未显示)。更晚洗脱的含有四糖基酰基鞘氨醇的级分(5-II)(如图8C所示)，在4.65ppm处也含有对应于乳新四糖酰基鞘氨醇的GlcNAcβ的β-双重峰(53)。此糖鞘脂的N-乙酰氨基葡萄糖在1.82ppm处有甲基信号，与以前的乳新四糖基酰基鞘氨醇的数据一致(52)。
人胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇部分的EI质谱分析—分别从例4和例5中4-II和5-II部分的过甲基化衍生物进行EI质谱分析获得的质谱(未显示)非常相似。在两个质谱中，在m/z260和228(260减去32)的离子是显著的，证明是末端HexN，在m/z219没发现表示末端Hex的离子。末端HexN-Hex以m/z464处的离子表示。在m/z945(944+1)处的离子碎片，含有整个糖链和部分脂肪酸，证明是HexN-HexHex-Hex糖序列。
从酰基鞘氨醇部分，immonium离子，和分子离子的相对离子碎片强度，证明4-II部分中主要的酰基鞘氨醇种类是d18：1-16：0，d18：1-h24：0和d18：1-h24：1，而在5-II部分中主要有d18：1-16：0，d18：1-22：0，d18：1-24：0，d18：1-24：1，和d18：1-h24：0酰基鞘氨醇。
因此，用质谱法仅鉴定了这两种样品中主要的化合物，即红细胞糖苷脂，但不能分辨用质子NMR实验显示的这些级分中的次要化合物。但是，通过将色谱方法与质谱法组合获得的高分辨率允许对这些次要化合物进行鉴定，如下面部分所述。
人胃上皮细胞的过甲基化四糖的高温气相色谱-EI质谱分析—将例4的4-II部分和例5的5-II部分用酰基鞘氨醇聚糖酶水解，并将释放的四糖过甲基化并用气相色谱和气相色谱-EI质谱法分析。结果总结于图9和10。每个色谱峰分解为α-和β-构象异构体。
图9表示用酰基鞘氨醇聚糖酶水解释放的过甲基化寡糖重构的离子色谱图。Run A是红细胞糖苷脂，乳四糖基酰基鞘氨醇和乳新四糖基酰基鞘氨醇的参考混合物，run B是从表III例4来源的胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇，run C是从表III例5来源的胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇。分析条件如“材料与方法”部分所描述。参考混合物(run A)的寡糖已经被标记。
图10表示用高温气相色谱-EI质谱分析获得的下列物质的质谱图：酰基鞘氨醇聚糖酶从参考糖鞘脂释放的过甲基化寡糖(I和II)，表III例4的胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇部分(III)，和表III例5的胃上皮细胞的四糖基酰基鞘氨醇部分(IV)。分析条件参看“材料与方法”。标示RunA-C指图10所示总离子色谱的各部分。通式解释与参考图谱一同显示。
例4中结合幽门螺杆菌的胃上皮细胞的四糖被分成两个峰，如图9，runB所示。主峰以与参考红细胞糖苷脂的糖组分相同的保留时间洗脱，而小峰以参考乳四糖基酰基鞘氨醇的糖组分的保留时间洗脱。
例5中未结合的胃上皮细胞的四糖(图9，run C)也被分成两个峰，主峰以与参考红细胞糖苷脂相同的糖组分的保留时间洗脱。而此例中小峰以参考乳新四糖基酰基鞘氨醇的糖组分的保留时间洗脱。
为进一步证实例4中结合幽门螺杆菌的和例5中未结合的四糖基酰基鞘氨醇部分的差异，获得过甲基化寡糖的质谱(图10)。两例的主峰质谱与标准红细胞糖苷脂一致(未显示)。但是，例4结合幽门螺杆菌的次要四糖的谱(图10，III)，和例5未结合者(图10，IV)显示出某些相异性。
在两个图谱中m/z187(219减去32)，219，432(464减去32)，464和668处观察到能证实末端Hex-HexN-Hex糖序列的离子碎片。但是，在例5晚期洗脱峰质谱中在m/z182处离子碎片明显，而在例4晚期洗脱峰质谱中缺乏此离子。在m/z182处的离子碎片是2型糖链Galβ4GlcNAcβ特有的(41，42)，但最近证实它仅发现于离子源温度设置为超过280℃时(54)。
如在参考乳新四糖基酰基鞘氨醇的质谱中一样(图10，II)，例5中糖的质谱中在m/z432(464减去32)处离子碎片也很明显，表明从Galβ4GlcNAcβ-链中比从Galβ3GlcNAcβ链中去除甲醇更容易，最可能从C2-C3去除。
例4中的糖在m/z228处产生强离子碎片。此离子在乳四糖酰基鞘氨醇参考物的质谱中也是明显的(图10，I)，并可能产生于内部的GlcNAc，因为在m/z260处未观察到离子。
结论是，通过例4和例5的四糖基酰基鞘氨醇中过甲基化寡糖的气相色谱和气相色谱-EI质谱分析确认了这些部分的质子NMR谱结果。这两部分的主要化合物被鉴定为红细胞四糖，而次要成分是不同的。在例4结合幽门螺杆菌的情况下，此次要成分被鉴定为乳四糖，而例5的未结合者为新乳四糖。
在幽门螺杆菌分离物中乳四糖酰基鞘氨醇结合的频率—乳四糖基酰基鞘氨醇结合特性的表达频率通过分析表I中所列的66种幽门螺杆菌分离物与薄层色谱上糖鞘脂的结合来估计。为进行结合分析，从贮存培养物培养细菌，并用色谱结合分析来检测与人胎粪中乳四糖基酰基鞘氨醇的结合。阳性结合表示与图1B中泳道6所观察到的模式相同。将未能结合的菌株从贮存状态再培养两次，用色谱结合试验再分析，即连续三次检测到菌株未结合才认为是不结合。用这些标准，分析的66个分离物中的9个(表I中菌株15，65，176，198，239，269，271，272和BH000334)不结合，而57个分离物(86％)表达乳四糖基酰基鞘氨醇结合能力。
讨论
用红细胞和唾液进行血清学分型证明例4的血型为Ale(a+b-)非分泌型，与此个体胃粘膜中结合幽门螺杆菌的未取代型乳四糖基酰基鞘氨醇的存在是一致的。但是，通过与针对Leb决定簇的单克隆抗体的结合，在此个体中分离的非酸性糖鞘脂部分以及其他的人胃标本中非酸性部分发现大量Leb-6糖鞘脂(未显示)。这表明，人胃粘膜中Lewis血型抗原的表达与红细胞或唾液中Lewis抗原的表达是无关的，正如以前在其他的人组织，例如泌尿道上皮组织(61，62)和大肠(47，63)中证明的那样。
由于非分泌者中十二指肠溃疡的发病率逐渐增高，而此个体为非分泌型，这变得十分有趣(64-66)。最近一项研究(67)证实，不分泌与对幽门螺杆菌感染的易感性的增高无关。但是，分泌者的状态可以决定建群的结果，即，非分泌者发生消化性溃疡的倾向增加可能是由于这些个体胃上皮细胞表面能结合幽门螺杆菌的乳四糖酰基鞘氨醇的存在。
在本研究的实验条件下，在人胃上皮细胞分离的酸性级分中，幽门螺杆菌识别乳四糖基酰基鞘氨醇，但不结合被暂时鉴定为硫苷脂的糖鞘脂和GM3神经节苷脂。幽门螺杆菌与乳四糖基酰基鞘氨醇的结合不受生长条件改变的影响，因为细菌在琼脂上和肉汤中生长时都获得了结合。而且，将细菌培养12小时和120小时都检测到与乳四糖基酰基鞘氨醇的结合。
与乳四糖基酰基鞘氨醇的结合也出现在babA1A2突变株中，该菌株中编码Leb-结合粘附素的基因已失活(数据未显示；参考68)。因此，幽门螺杆菌与Leb决定簇和乳四糖基酰基鞘氨醇的结合代表两种不同的结合特异性。
Leb决定簇(Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ)是基于1型二糖单位，该单位是乳四糖基酰基鞘氨醇的末端部分。但是幽门螺杆菌与Leb的相互作用取决于岩藻糖，其中至少要求在末端半乳糖的2位上为α-岩藻糖，并且通过取代N-乙酰葡糖胺4位上的α-岩藻糖而促进相互作用(9)。相比之下，与乳四糖基酰基鞘氨醇的结合需要未取代的糖链，因为对基本受体序列的所有取代经测试都丧失相互作用。
图12表示乳四糖基酰基鞘氨醇的最低能量分子模型(表II中编号2，图12A)，与Leb-6的糖鞘脂(表II中编号6，图12C)以及两个未结合化合物，即Lea-5的糖鞘脂(表II中编号5，图12B)和去岩藻糖基化的B61型糖鞘脂(表II中编号8，图12D)的对比。上图显示相同结构的俯视图。GlcβCer键在延长的构象中显示。在(B)-(D)中基本乳四糖基酰基鞘氨醇结构的取代是圆点，岩藻糖的和GlcNAc中乙酰氨基的甲基碳原子用黑色表示。为弄清组成乳四糖基酰基鞘氨醇的结合表位的重要部分，根据乳三糖基酰基鞘氨醇(编号1)和乳四糖基酰基鞘氨醇(编号3)(其中乙酰氨基组份已经被还原成胺)的不结合这两个事实，表明末端二糖Galβ3GlcNAcβ3构成所述表位。后一结构(编号3)的不结合进一步说明，发生结合或构象改变必需有完整的乙酰氨基，因为胺不再能与内部Galβ4的2-OH基发生氢键相互作用。这两种效应的组合也是可能的。而且，乳四糖基酰基鞘氨醇末端Gal被Galα3(编号8)或Fucα2(编号4)延长，或GlcNAc次末端被Fucα4(编号5)取代产生无活性的结构，说明末端二糖Galβ3GlcNAcβ3的主要部分是直接参与与负责结合的粘附素的相互作用。
已报道幽门螺杆菌与带有唾液酸(神经节苷脂)的糖鞘脂结合(80)。然而，乳四糖基酰基鞘氨醇可被不能结合唾液酸的菌株(如菌株CCUG17875)和以唾液依赖方式结合的菌株(如菌株CCUG17874)识别(见图11)。而且，乳四糖基酰基鞘氨醇的末端Gal被α3连接的唾液酸取代则丧失与幽门螺杆菌的结合，如表II，编号11。因此，乳四糖基酰基鞘氨醇结合幽门螺杆菌能力与神经节苷脂的识别作用无关。
在Leb结构中，GlcNAcβ3残基是不可接近的，次末端Galβ3是部分不可接近的，因为它们被两个岩藻糖分子覆盖，如图12C左侧的俯视图所示。而且，由于幽门螺杆菌与Leb的结合受异结构Ley抑制(9)，Leb的GlcNAcβ3残基对于与此化合物的结合不是必需的。对Leb-6和Ley-6末端四糖部分的最低能量结构的对比排列表明唯一差别是GlcNAcβ3残基的约180°翻转，因此证明在Leb结构中GlcNAcβ3残基的乙酰氨基组份(或者甚至更可能整个残基)不是必需的，而在乳四糖基酰基鞘氨醇中刚好相反。还应注意：由于两个附加的岩藻糖单位引起的拥挤，乳四糖基酰基鞘氨醇中末端Galβ3环面与Leb结构中相应平面间的角度接近40°，提供了关于为什么这些结构应被认为是幽门螺杆菌不同受体的另一理由。
图11表示乳四糖基酰基鞘氨醇既被结合唾液酸的幽门螺杆菌菌株CCUF17874识别(B)也被缺乏唾液酸结合能力的菌株CCUG17875识别(C)。(A)中色谱用茴香醛染色。泳道1＝人红细胞的红细胞糖苷脂(GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer)，泳道2＝人胎粪的乳四糖酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)，泳道3＝GM3神经节苷脂(NeuAcα3Galβ4Glcβ1Cer)，泳道4＝人粒细胞的神经节苷脂。这两种菌株都可识别乳四糖酰基鞘氨醇(泳道2)，而菌株CCUG17874经证实通过与人粒细胞神经节苷脂结合而具有结合唾液酸的能力(泳道4)。
分子成模实验—乳四糖酰基鞘氨醇与神经节四糖基酰基鞘氨醇结构的 交联
最近证明，幽门螺杆菌特异性结合乳三糖基酰基鞘氨醇的末端二糖。这暗示对神经节四糖基酰基鞘氨醇结合表位的解释，因为这两种结构(主要不同在于糖残基2和3间的键)以相同的二糖序列为末端，不必考虑GalNAc(GlcNAc)的4位上有差异。结合观察到神经节三糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇的去-N-乙酰化种类的不结合连同从前一个到后一个糖鞘脂亲和性的戏剧性增加(16)，强烈说明神经节四糖基酰基鞘氨醇的末端二糖也构成结合表位。对这些乳四糖基酰基鞘氨醇和神经节四糖基酰基鞘氨醇结构的所有可能最低能量构象异构体的产生和成对对比显示，至少两对构象异构体导致各自末端二糖结合表位的同样表现，说明同样的细菌粘附素可能参与这两种糖鞘脂的结合。通过观察幽门螺杆菌只有当薄层色谱分析(图1)中使用其他脂类或胆酸盐，例如Tween20或脱氧胆盐时才结合乳四糖基酰基鞘氨醇，而这些加入对神经节四糖基酰基鞘氨醇的结合仅有有限的影响，这进一步表明Glcβ1Cer键构象的不同(图13)。因此，在缺乏其他脂类或胆酸盐时乳四糖基酰基鞘氨醇很可能具有不同于图13所示的Glcβ1Cer键构象，图13中者结合表位对于与幽门螺杆菌的结合而言是不正确存在的。最近已经综述了其他脂类对糖鞘脂构象的类似影响(73)。而且，上文已经证实乳四糖能阻断幽门螺杆菌与神经节四糖基酰基鞘氨醇的结合(图5)，这更支持了这条理由。
可以因此得出结论，幽门螺杆菌与神经节四糖基酰基鞘氨醇的Galβ3GlcNAcβ4表位的结合应被视为乳四糖基酰基鞘氨醇的特异性，且其允许内部Gal的4-取代和GlcNAcβ3残基在4位的轴向取向。
类似物实例
将四糖Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(Isosep，Tullinge，Sweden)和麦芽庚糖(Sigma，Saint Louis，USA)通过氰硼氢化物(Halina Miller-Podraza，将发表)用4-十六烷基苯胺(缩写HDA，来自Aldrich，Stockholm，Sweden)还原胺化。用质谱法鉴定产物并确定为Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA和麦芽庚糖(red)-HDA[其中“(red)-”意思是从糖的末端还原性葡萄糖和4-十六烷基苯胺(HDA)的胺基还原胺化形成的胺键结构]。在上面描述的TLC-重叠(overlay)分析中化合物Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HAD与幽门螺杆菌的结合活性与乳四糖基酰基鞘氨醇糖鞘脂的相似，而对照结合物麦芽庚糖(red)-HDA是完全失活的。此例显示序列Galβ3GlcNAc的一种合成衍生物。它也表明三糖Galβ3GlcNAcβ3Gal是结合幽门螺杆菌的结构并且在还原末端的葡萄糖对结合不是必需的(还原破坏了还原性末端Glc的吡喃环结构)。
                                           表I
                 细菌菌株                来源
4，15，17，48，51，54，56，62，65，69，73，77，78，80，81，88，133，176，185，188，191，198，214，215，225，239，244，263，266，269，271，272，275，287，306，BH00031，BH000324，BH000325，BH000331，BH000332，BH000334  Department of Medical Mi-crobiology，University ofLund，Sweden
002，005，032，F6，10，C7050  Department of Medical Mi-crobiology and Immunology，rebro Medical Centre，Swe-den
32，66*，95*，915*，1139*，15816，17135，17874*，17875*，18430，18943，20649  Culture Collection Univer-sity of Gteborg(CCUG)，Sweden
1，177，480，604，608，609  Department of Microbiology，Medical University of Wro-claw，Poland
*从标有*的菌株的细胞提取表面蛋白并用于结合分析，如上文“材料和方法”章节所述
                                                       表II
  编号    俗名   糖鞘脂结构a    结合b   来源    文献
   1    乳三糖   GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   恶性黑素瘤    (c)
   2    乳四糖   Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcβlCer     +   人胎粪    (45)
   3   Galβ3GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer     -   人胎粪    (d)
   4    H5-1   Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   人胎粪    (69)
   5    Lea-5   Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   人小肠    (70)
   6    Leb-6   Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   人小肠    (71)
   7    B6-1   Galα3(Fucα2)Galβ3Gl cNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   猴肠    (e)
   8   Galα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer     -   猴肠    (f)
                                          表II(续)
  9   B7-1 Galα3(Fucα2)Galβ(Fucα4)3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer - 猴肠   (e)
  10   A6-1 GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer - 人胎粪   (69)
  11 NeuGcα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer - 兔胸腺   (81)
a)Galβ3GlcNAc部分有下划线
b)+表示用2ug上样薄层板所得放射自显影图谱中黑色显著加深之处-表示黑色没有加深
c)B.E.Samuelsson和K.-A.Karlsson，未公开的结果。
d)通过用无水肼处理从编号为2的人胎粪的Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ31Cer产生的3号糖鞘脂(另作报道)
e)N.Strmberg和K.-A.Karlsson，未公开的结果。
f)将编号为7的猴肠与0.05M HCl在80℃保温2小时而从Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer产生的编号为8的糖鞘脂
                          表III
 病例编号  血型 组织 非酸性糖鞘脂 酸性糖鞘脂
 1  ORh- 粘膜细胞非粘膜物 7.0a(11.9)b2.7(6.0) 8.5a(14.4)b22.0(48.8)
 2  ARh+ 粘膜细胞 3.6(18.0) 10.7(53.5)
 3  ARh+ 粘膜细胞 6.4(14.5) 2.9(6.6)
 4  ARh+ 粘膜细胞 6.0(24.0) 4.8(19.2)
 5  ARh+ 粘膜细胞 23.0(38.0) .5(9.2)
 6  ARh- 粘膜细胞 4.9(18.1) 8.2(30.4)
 7  未知 粘膜细胞非粘膜物 2.5(15.6)4.3(8.7) 7.5(46.8)7.6(15.5)
a重量以mg为单位
b表示为mg/g组织干重
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Claims (72)

1.一种能结合幽门螺杆菌的物质，包括至少一种具有通式1的化合物：
Figure A0081729200021
通式1
其中：
R1是H或OH且R2是H或OH，规定当R2是OH时R1是H，当R2是H时R1是OH；
X是单糖或寡糖残基；
Y不存在，或者Y是间隔基团或末端结合物；
Z是低价或多价的载体或者-H；
n是0或1；
m是等于或大于1的整数，
或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与通式1的化合物相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
2.一种能结合幽门螺杆菌的物质，包括至少一种具有通式2的化合物：通式2
其中：
X是单糖或寡糖残基；
Y不存在，或者Y是间隔基团或末端结合物；
Z是低价或多价的载体或者-H；
n是0或1；
m是等于或大于1的整数，
或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与通式1的化合物相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
3.一种能结合幽门螺杆菌的物质，包括至少一种具有通式3的化合物：通式3
其中：
X是单糖或寡糖残基；
Y不存在，或者Y是间隔基团或末端结合物；
Z是低价或多价的载体或者-H；
n是0或1；
m是等于或大于1的整数，
或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与通式1的化合物相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
4.一种能结合幽门螺杆菌的物质，其包括Ga1β3GlcNAc或从幽门螺杆菌方面考虑具有与Galβ3GlcNAc相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
5.权利要求4的能结合幽门螺杆菌的物质，其中该Galβ3GlcNAc，或其类似物或衍生物位于该物质的非还原末端。
6.权利要求4的能结合幽门螺杆菌的物质，其由Galβ3GlcNAc，或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与Galβ3GlcNAc相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物组成。
7.一种能结合幽门螺杆菌的物质，其含有Galβ3GalNAc，或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与Galβ3GlcNAc相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物。
8.权利要求7的能结合幽门螺杆菌的物质，其中该Galβ3GalNAc，或其类似物或衍生物位于该物质的非还原末端。
9.权利要求7的能结合幽门螺杆菌的物质，其由Galβ3GalNAc，或者从幽门螺杆菌方面考虑具有与Galβ3GlcNAc相同或更好结合活性的它们的类似物或衍生物组成。
10.包括乳四糖的权利要求4或5的能结合幽门螺杆菌的物质。
11.由乳四糖组成的权利要求4或5的能结合幽门螺杆菌的物质。
12.权利要求4或5的能结合幽门螺杆菌的物质，其包括乳四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)。
13.权利要求4或5的能结合幽门螺杆菌的物质，其由乳四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)组成。
14.权利要求7或8的能结合幽门螺杆菌的物质，其包括神经节四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer)。
15.由载体组成的能结合幽门螺杆菌的物质，其中权利要求1-14所述一种或多种物质已附着于该载体上。
16.由包含一种或多种权利要求1-15所述物质的微团组成的能结合幽门螺杆菌的物质。
17.一种能结合幽门螺杆菌的物质，其包括与一种或多种多糖结合的权利要求1-16所述物质。
18.权利要求17的能结合幽门螺杆菌的物质，其中该多糖是多乳糖胺链或其结合物。
19.权利要求1-14中任一项的能结合幽门螺杆菌的物质，该物质是糖脂。
20.权利要求1-14中任一项的能结合幽门螺杆菌的物质，该物质是糖蛋白或新糖蛋白。
21.权利要求1-14中任一项的能结合幽门螺杆菌的物质，该物质是包括至少两个寡糖链的寡聚分子。
22.权利要求1-14中任一项的能结合幽门螺杆菌的物质，该物质是包括至少三个寡糖链的寡聚分子。
23.一种能结合幽门螺杆菌的物质，其包括与一种或多种有效针对幽门螺杆菌的抗生素共价结合的权利要求1-22所述物质。
24.包括权利要求1-23中任一项的物质的药用组合物。
25.权利要求24的药用组合物，其用于治疗幽门螺杆菌的存在所引起的疾病。
26.权利要求24或25的药用组合物，其用于治疗患者胃肠道中幽门螺杆菌的存在所引起的疾病。
27.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗慢性浅表性胃炎。
28.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗十二指肠溃疡。
29.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗胃溃疡。
30.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗胃腺癌。
31.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤。
32.权利要求24或25的药用组合物，其用于治疗肝脏疾病。
33.权利要求24或25的药用组合物，其用于治疗心脏疾病。
34.权利要求24-26任一项的药用组合物，其用于治疗婴儿猝死综合征。
35.权利要求1-23中任一项的物质在制备用于治疗因幽门螺杆菌存在所致疾病的药用组合物中的应用。
36.权利要求1-23中任一项的物质在制备用于治疗患者胃肠道中幽门螺杆菌的存在所致疾病的药用组合物中的应用。
37.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗慢性浅表性胃炎。
38.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗十二指肠溃疡。
39.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗胃溃疡。
40.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗胃腺癌。
41.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤。
42.权利要求35的应用，其中所述药用组合物用于治疗肝脏疾病。
43.权利要求35的应用，其中所述药用组合物用于治疗心脏疾病。
44.权利要求35或36的应用，其中所述药用组合物用于治疗婴儿猝死综合征。
45.权利要求1-23中任一项的物质在抑制幽门螺杆菌的结合中的应用。
46.权利要求45的物质为非医疗目的而抑制幽门螺杆菌的结合的应用。
47.权利要求46在分析系统中的应用。
48.权利要求47的应用，其中该分析系统用于鉴定其他能结合幽门螺杆菌的物质。
49.权利要求1-23中任一项的物质在鉴定其他能结合幽门螺杆菌的物质时作为引导化合物的应用。
50.包括权利要求1-23中任一项的物质的食物材料。
51.包括权利要求1-23中任一项的物质的营养添加剂。
52.权利要求50的食物材料或权利要求51的营养添加剂，其中所述物质是Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc。
53.权利要求52的食物材料，其为婴儿配方食品的形式。
54.权利要求53的食物材料，其中所述Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc以其0.1-0.5g/l的浓度使用。
55.权利要求54的食物材料，其中所述浓度是0.05-5g/l。
56.权利要求50-55中任一项的食物材料或营养添加剂在抑制幽门螺杆菌结合中的应用。
57.治疗由于患者体内存在幽门螺杆菌而引起的疾病的方法，其中给予患者药学有效量的权利要求1-23中任一项的物质。
58.治疗由于患者体内存在幽门螺杆菌而引起的疾病的方法，其中给予患者权利要求50-55中任一项的食物材料。
59.权利要求57或58的方法，其中所述疾病是该患者胃肠道中存在幽门螺杆菌所致。
60.用于治疗慢性浅表性胃炎的权利要求57或58的方法。
61.用于治疗十二指肠溃疡的权利要求57或58的方法。
62.用于治疗胃溃疡的权利要求57或58的方法。
63.用于治疗胃腺癌的权利要求57或58的方法。
64.用于治疗人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤的权利要求57或58的方法。
65.用于治疗肝脏疾病的权利要求57或58的方法。
66.用于治疗心脏疾病的权利要求57或58的方法。
67.用于治疗婴儿猝死综合征的权利要求57或58的方法。
68.权利要求2，4-6，或10-13中任一项的物质用于细菌粘附素鉴定的应用。
69.权利要求1-23中任一项的物质或根据权利要求68鉴定的物质用于制备抗幽门螺杆菌疫苗的用途。
70.通过使用权利要求1-23中任一项的物质或根据权利要求68鉴定的物质生产的抗幽门螺杆菌感染的疫苗。
71.权利要求1-23中任一项的物质在诊断由于幽门螺杆菌感染引起疾病中的用途。
72.权利要求1-23中任一项的物质在幽门螺杆菌分型中的用途。
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