CN1404373A - 分析物的透皮取样法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种对个体身体内的分析物进行透皮提取和测量的方法，它包括在含有负电荷脂类的脂质体存在时用电穿孔法使皮肤通透，以及用吸液的方法通过通透皮肤提取胞外液。提取的胞外液中的分析物可以定量。

Description

分析物的透皮取样法
本申请要求已在2000年2月25日提交的美国临时申请(申请号为60/184,919)的优先权，在此全文并入以供参考。
发明领域
本发明一般涉及分析物的透皮提取与取样领域。具体地说，本发明提供了一种在脂质体存在时用电穿孔法提取并取样检验分析物的方法。
相关技术的讨论
对于控制疾病而言，精确测量诸如血液中的葡萄糖等分析物是十分重要的。例如，在注射胰岛素前后适当监控血糖水平可以使糖尿病得到早期控制。
通常，监控血液分析物需要抽取血样。然而，频繁采血所带来的疼痛和不便会使病人逃避监控程序。为克服这种侵入性技术带来的问题，已经提出了几种改进方案，其中就包括透皮提取分析物。
哺乳动物的皮肤是由两层构成的，即表皮和真皮。表皮是由层状鳞片角质化形成的上皮。表皮的最外层叫做角质层(SC)，它由大约20层扁平的、无细胞核的、充满角质素的角质细胞构成，外面包围着平均约8层脂双层薄层。脂双层主要含有胆固醇、游离的脂肪酸和神经酰胺。SC总的厚度大约为10微米至40微米，平均厚度为20微米(Chizmadzhev等，1995，Biophysical Journal，68：749-765；Bouwstra等，1995，Pharmaceutical Research 11(12)：1809-1814；Swartzendruber等，1989，Journal of Investigative Dermatology，92：251-257)。SC层构成了皮肤的主要电阻(Rosendahl，1945，Acta Physiol.Scan.9：39)，同时它也是物质传递的主要屏障。因此，透皮提取的方法主要包括提高SC层通透性的技术。这类技术的实例有离子电渗技术、超声波技术和真空技术。
离子电渗法要求使用含有氧化-还原物质的电极，同时还要使电流通过皮肤。直流电场被用来运送分子经附属物或细胞间隙通过SC。然而，SC的不可通透性以及与离子电渗相关的副作用(如不可避免的皮肤损伤)限制了离子电渗法在透皮取样中的应用。
真空技术已被用于透皮抽取流体以供取样检验(美国专利第6,009,343号)。然而，角质层的不可通透性限制了这项技术的应用。
超声波技术被认为能破坏角质层中角质形成细胞间的脂质层，因此它能改善皮肤的通透性。包括超声波技术在内的方法在美国专利第4,767,402号；4,780,212号和5,115,805号中已有记录。
另一种使皮肤暂时通透的方法是使用单一或复合的短时持续脉冲。这会穿过非导电性的SC建立一个穿过皮肤的占优势的电压梯度。如果电压梯度超过了屏障击穿电位，就会形成孔洞，根据所使用的脉冲电场和脉冲时间这些孔洞会重新封闭。(Hui，1995，Methods in Molecular Biology，第48卷Animal cell Electroporationand Electrofusion Protocols，J.A.Nickoloff，编辑Humana Press，第29-40页)。在孔洞形成时，物质就可以穿过这一屏障进行输递(Powell等，1989，BiophysicalJournal 56：1163-1171；Prausnitz等，1993，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA90：10504-10508)。电穿孔法已被用于物质的输递，然而迄今为止它还没有被用来提取与取样检验像葡萄糖这类的身体分析物。
尽管脂质体已被用于局部透皮给药用来改变药效，但其机理仍然有争议(Mezei，1988，Liposomes as drug carriers，Gregoriadis G.编辑，Wiley，NewYork)。有报道说，当对组织培养的小鼠皮肤表面用中性脂质体时，它会聚集在毛囊通道中(Li等，1992，In Vitro Cell Dev.Biol.28A：679-681；Li等，1993，In VitroCell Dev.Biol.29A：258-260)。基于以上几点，脂质体在分析物的提取与取样检验中的作用仍不清楚。而且，对于血液分析物的提取与分析还没有什么快速有效的方法。因此，对分析物的提取与取样检验仍要继续研究以便找到监控与控制疾病症状的方法。
发明概述
本发明提供了一种分析物透皮取样检验的方法。本方法包括，使皮肤与含有负电荷脂类的脂质体接触以形成局部通透的皮肤区域，再在通透的皮肤上施加电脉冲。然后在通透区域进行吸液，收集胞外液。所收集的液体可以用来检测所需分析物的存在情况。
带负电荷的脂类可以和其它的带负电或不带电的脂类混合以形成对本发明有用的脂质体组合物。因此，在一个优选的实施方案中，脂质体是由带负电荷的磷脂二油酰磷脂酰甘油(DOPG)与不带电荷的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)形成的。
附图简述
图1显示了施加10、20、30分钟负脉冲进行电穿孔以及10分钟没有脉冲以后通过猪SC的葡萄糖的迁移量。SC分别经DOPG：DOPC脂质体处理(■)和不处理(●)。
图2显示了穿过猪SC的葡萄糖的提取物。SC分别经DOPG：DOPC脂质体处理(■)和不处理(●)。在施加10、20、30分钟脉冲后及脉冲停止10分钟后分别测量葡萄糖的迁移量。
图3显示了施加1次(◆)、2次(■)、60次(●)和180次(▲)100V、持续时间为1毫秒的脉冲后小鼠皮肤的电阻恢复情况。
图4显示了施加1次(◆)、2次(■)、60次(●)和180次(▲)100V、持续时间为1毫秒的脉冲后小鼠皮肤的电阻恢复情况。其中，脂质体被添加到面对皮肤外表面的室中。
图5显示了施加15次200V、持续施加为1毫秒的脉冲进行电穿孔后，穿过小鼠皮肤提取到的总的葡萄糖。
图6是提取的葡萄糖与血糖之间关系的图示。提取的葡萄糖是在脂质体存在并施加电脉冲后收集于负极的液体中测得的。
发明详述
本发明提供了一种分析物的透皮提取并取样检验方法。这个方法包括通过使用脂质体和电穿孔法以使皮肤的某一区域通透。再通过通透区域吸取胞外液，此胞外液可用于所需分析物的检测及定量。
尽管从通透的皮肤中提取的任何分析物都可定量，但葡萄糖是一种有特别的临床和治疗价值的分析物。其它的分析物包括(但不局限于)：电解质，比如钠、钾、钙；毒素；治疗及药理学药剂；滥用药；氨基酸；血内气体；脂类，比如胆固醇；激素，比如胰岛素；酶；抗体；细胞因子以及其它生物相关分子。提取之后，可用任何标准的化学、物理、酶学和/或光学方法对提取物进行检测与定量。
本发明的方法包括施加一次或多次电脉冲并使皮肤与脂质体接触以使其通透，然后进行吸液以收集胞外液。对本发明有用的脂质体含有带负电荷的脂类。这些脂类的合适的例子包括：磷脂酰甘油(包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG))、磷脂酰丝氨酸、二磷脂酰甘油(心磷脂)以及游离脂肪酸。与其它带负电的脂类或中性脂类混合的带负电荷的脂类可以单独使用。在一个实施方案中，带有负电荷的脂类DOPG与不带电荷的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)混合形成脂质体。
脂质体与皮肤的某一区域接触。需要时，可以削薄皮肤以更好的进行电接触。为提高电接触还可以使用导电凝胶。为使脂质体与皮肤接触，可将其加进电极的贮液槽中，或者也可以不依赖电极而直接与皮肤接触。比较合适的带有贮液槽的电极是标准皮肤电极。合适的皮肤电极系统是银/氯化银系统。市场上有皮肤电极，例如来自IVM公司(Healdsburg，CA)。然后进行电穿孔。一个正电极和一个贮液槽中含有脂质体组合物的负电极被安置到皮肤的合适区域上。可用任何一种市场上存在的标准脉冲发生装置在电极间产生电势。优选的穿过每个皮肤通路电势降为约30V-约180V，最好是约80V-约100V。这里使用的“皮肤通路”一词是指电极下的区域，通过这一区域，在施加电脉冲时电流可以在电极与其下的组织之间通过。电脉冲可以是单个或多个，透化过程可以持续1秒钟到几分钟。脉冲的持续时间优选1毫秒，但可以持续10微秒到10毫秒。精通这一技术领域的人员将意识到，在施加电脉冲时脂质体不必与皮肤接触。脂质体可先施加在皮肤上一段时间，接着在同一区域加电脉冲。
本发明的一个实施方案中，在皮肤表面的暴露区域使用电极装置可对特殊的分子进行透皮取样和提取。此电极装置可以含有一个装脂类制剂的贮液槽、施加电脉冲的电极、以及一个为通过皮肤提取自全身液体的分子准备的收集室。可以用面-点脉冲发生器(bench-tip pulse generator)或小型便携发生器使电极装置产生电脉冲。为检测/定量提取分子的数量，可以用一个独立的装置，也可与取样检验电极装置集成使用。检测装置可用已被精通这一领域的人员所知的标准技术来校正。
在脂质体存在时施加电脉冲使一皮肤区域可通透后，就可在通透区域进行吸液了。通透化作用后为获得胞外液而进行吸液时，可简单地用与收集室相连的标准移液管。也可使用标准吸液泵。约50-约250毫米汞柱的压力对提取液体来说是足够的。在一个实施方案中，负电极自身可以和取液装置连结。吸液可以通过一个小的真空泵进行。也可以在负电极的贮液槽中放一吸收物来吸液。从贮液槽中取出吸收物，然后就可以检测吸收物中存在的分析物了。通过一系列的标准对原始数据进行校准就可以估计出血液或组织中分析物的水平了。
任何吸收物都可用于本发明。合适的物质有(但不局限于)棉花、滤纸、吸收凝胶以及任何可以保存含水液体的物质。
本发明将由以下的实施例来证明，这些实施例只是为了阐述这一发明而不是对本发明进行限制。
实施例1
这一实施例说明了本发明中所用的脂类制剂和脂质体的制备方法。任何带有负电荷的脂类都可以用来制备脂质体。这些带负电的脂类可与其它带负电或不带电的脂类混合。将溶于氯仿的脂类按所需比例混合。氮气下干燥溶液并将溶液置于真空中以除去残留的溶剂。然后通过漩涡使干的脂类分散在合适的缓冲液中。在这一实施例中，带有负电的二油酰磷脂酰甘油与不带电的二油酰磷脂酰胆碱以约1∶1的摩尔比例混合，并用强漩涡让它们分散在缓冲液中，这样就可以形成脂质体。
实施例2
这一实施例说明用本发明的方法可以使葡萄糖分析物穿过角质层。角质层是用以下方法热处理猪皮获得的：将新鲜的猪皮用铝箔包裹并放在60℃的水浴中。大约5分钟后，就可以用手将SC从其它的皮肤组织中轻轻剥离。分离的SC可以用在垂直扩散室中(如购自Crown Glass公司，Sommerville，NJ生产的产品)。这种简单的装置被广泛接受作为皮肤的模型系统。上室被当做皮肤的外表面而下室被看成是紧贴着SC的皮肤。将铂丝作为电极，一个放在上室，另一个放在下室。通过脉冲发生器可以在SC上产生电脉冲。
实施例1中制得的脂类制剂被置于上室(受体室)，并施加10分钟的负脉冲(375V，脉冲时间为1毫秒，脉冲重复频率为1Hz)。然后将溶于缓冲液中的葡萄糖加到下室(供体室)中。在紧接着的10分钟内不施加脉冲。从上室取出一份缓冲液。然后再施加10、20和30分钟的脉冲，并在第10、20、30分钟的时候从上室取出同样量的缓冲液以测定移动至上室的葡萄糖的量。脉冲结束10分钟后再从上室取出一份缓冲液。在对照试验中，在仅有缓冲液(没有脂类)时先在SC上施加10分钟脉冲，再将葡萄糖加到下室中并施加三次脉冲，每次均为10分钟。
在不同时刻测量取出液中迁移至上室的葡萄糖的量。用葡糖计可以测量葡萄糖的水平。结果显示在图1中。当用脂类制剂处理SC后葡萄糖的迁移量有明显的提高。由于葡萄糖不带电荷，实验和对照测量中葡萄糖的迁移都是在施加脉冲时以及脉冲后由通过SC的扩散产生的。
这一实施方案的另一图例中，在葡萄糖被加到SC供体侧的同时用脂类制剂处理SC的受体侧。结果显示在图2中。同样，当用脂类处理SC后从供体室到受体室的葡萄糖的迁移量较之只使用缓冲液时也有提高。因此，当用脂类制剂处理SC后葡萄糖分子的迁移量有明显的提高。
实施例3
这一实施方案证明，电脉冲时脂质体的存在可以提高整个皮肤的通透性。为证明这一实施方案，以新切的、完整的、薄的小鼠皮肤为模型，研究当脂质体存在与不存在时，施加可变数目的电脉冲后通透性的变化。测量皮肤电阻值以作为皮肤通透性的指标。测量施加电脉冲时皮肤电阻的下降以及脉冲结束后电阻的恢复。皮肤的电阻值持续低于基值(施加脉冲前的值)的这段时间被看做是由于施加电脉冲而使皮肤保持通透的时间。
使用垂直扩散室并用前述的方法施加电脉冲。将切下的完整的薄的小鼠皮肤放在两个含水室之间作为屏障。两室都充满了缓冲液(10mM Tris，100mM NaCl，1mMEDTA，pH＝8.0)。为研究添加的脂质体的作用，在面对皮肤外表面的室中加入脂质体组合物。在皮肤两侧的室中都放入铂丝电极。用标准脉冲发生器(AVTECH，AVK-G1-RPCIC1型)产生电脉冲。用交流脉冲发生器测量电阻，并测量通过皮肤以及通过和皮肤串联排列的已知电阻的电压降。
结果显示在图3中。例如，未加脂质体时，对照小鼠皮肤在1或2个脉冲后约5分钟内恢复基础阻值。若对皮肤施加60至180个脉冲其阻值只会部分恢复。60次脉冲以后皮肤恢复了约40％的初始电阻，而180次脉冲后电阻在20分钟内没有恢复。
当在面对皮肤外表面的缓冲液中添加脂质体时(图4)，即便只施加了一次脉冲皮肤也没有恢复到它的初始电阻值(80％恢复)。两次脉冲后皮肤恢复到约50％初始电阻值。60和180次脉冲后电阻的恢复与对照皮肤(没有脂质体)的情况类似。这一结果证明脂质体的添加可以降低施加电脉冲时的电阻。
实施例4
这一实施方案证明，用本发明的方法可以提高所有动物的葡萄糖的提取量。用一对市场上可买到的电极在实验小鼠(CD-1品系，Charles River提供)裸露的背部皮肤上施加电脉冲，并测量其全身的葡萄糖水平。此电极装置含有一位于小贮液杯(直径1cm，深5mm)内的Ag/AgCl电极。杯中装满了被单独的缓冲液或加了脂质体的缓冲液浸透的棉絮。通过这一浸透了缓冲液的棉絮可以在电极和皮肤之间建立电接触。小鼠被麻醉并将其背部的毛去除以暴露其裸露的皮肤。在整个实验中小鼠保持麻醉状态。将电极装置放在动物的背部并用胶布粘牢。其中的一个电极保持接地电势，在另一个电极上用脉冲发生器(Velonex，345型)施加负脉冲(200V交流，脉冲时间1毫秒)。这相当于通过每一个皮肤通路有100V的电压降。在电极上每隔1毫秒施加一次脉冲，总共施加15次。第三个电极(这个电极没有与脉冲发生器相连)被放在靠近前两个电极的地方，用来测量通过完整皮肤的葡萄糖的被动扩散。施加脉冲后，将这个电极移去并换上充满干棉絮且有一定真空度的吸杯。施加脉冲后让吸杯在皮肤上保留10分钟。取出来自于电极和吸杯的棉絮并用葡糖测定试剂(Trinder试剂，Sigma Diagnostics)分析其中的葡萄糖。根据每一种动物的血糖测量值标准化葡糖测量值。
将电极和吸杯中的棉絮取出并将它们放在测定试剂中，这样就可以测得从负电极、收集电极和接地电极下的皮肤中以及与它们相对应的吸杯中提取的葡萄糖的总量。用分光光度法，将实验样品的吸收值与用已知量的葡萄糖获得的标准曲线进行比较就可以算出葡萄糖的含量。
如图5所示，没有脂质体时，从三种电极(收集、接地和负电极)下的皮肤中提取的葡萄糖的量基本相同。当脂质体存在时，从负电极下提取的葡萄糖量大约是收集电极和接地电极的两倍。这些结果证明，本发明的方法可以用来提取和定量测定身体分析物。
这一实施方案的另一图例中，确定了提取的葡萄糖与血糖水平的关系。提取的葡萄糖是在上述负电极位点处获得的液体中测得的。同时收集血液样品并用标准方法测量血糖。如图6所示，提取的葡萄糖与血糖水平之间有一线性关系(相关系数是0.996)。这些结果证明，本发明的方法可以用来确定个体身体中分析物的水平。
前面所描述的特定的实施方案只是为了阐述而不是用来限定。从本发明的教导中，那些精通这一技术的人员应该认识到，这些方法在不背离本发明精神的条件下是可以修改的。

Claims (22)

1.一种测量个体内分析物的方法，它包括以下步骤：
a.将个体的皮肤区域与含有负电荷脂类的脂质体组合物接触；
b.在已和脂质体组合物接触的皮肤区域上使用至少一次电脉冲；
c.在已施加电脉冲的所述皮肤区域中进行吸液，提取来自个体的液体；
d.测量提取液中的分析物，同时
e.使提取液中的分析物水平与个体身体中分析物的水平相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中脂质体组合物含有二油酰磷脂酰甘油。
3.根据权利要求2所述的方法，其中脂质体组合物还含有二油酰磷脂酰胆碱。
4.根据权利要求3所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油与二油酰磷脂酰胆碱的比例约为1∶1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中分析物是葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其中电脉冲的脉冲时间约为10微秒至10毫秒，通过每一个皮肤通路的电压降约为30至180V。
7.一种测量个体身体中分析物的方法，它包括以下步骤：
(a)在脂质体组合物存在时对个体的皮肤区域使用至少一次电脉冲，其中脂质体组合物含有带负电荷的脂类。
(b)在所述皮肤区域进行吸液，提取来自个体的液体；
(c)测量提取液中的分析物，同时
(d)使提取液中的分析物水平与个体身体中分析物的水平相关。
8.根据权利要求7所述的方法，其中脂质体组合物含有二油酰磷脂酰甘油。
9.根据权利要求8所述的方法，其中脂质体组合物还含有二油酰磷脂酰胆碱。
10.根据权利要求9所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油与二油酰磷脂酰胆碱的比例约为1∶1。
11.根据权利要求7所述的方法，其中分析物是葡萄糖。
12.根据权利要求7所述的方法，其中电脉冲的脉冲时间约为10微秒至10毫秒，通过每一个皮肤通路的电压降约为30至180V。
13.一种通过个体皮肤提取胞外液的方法，它包括以下步骤：
(a)在皮肤上放置一个负电极和一个正电极，其中负电极含有一个贮液槽，其中贮液槽中含有带负电荷脂类的脂质体组合物；
(b)通过电极施加至少一次电脉冲；
(c)在已施加电脉冲的皮肤区域进行吸液，提取来自个体的液体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中脂质体组合物含有二油酰磷脂酰甘油。
15.根据权利要求14所述的方法，其中脂质体组合物还含有二油酰磷脂酰胆碱。
16.根据权利要求15所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油与二油酰磷脂酰胆碱的比例约为1∶1。
17.根据权利要求13所述的方法，其中电脉冲的脉冲时间约为10微秒至10毫秒，通过每一个皮肤通路的电压降约为30至180V。
18.一种检测个体身体中分析物存在情况的方法，它包括以下步骤：
a.使个体的皮肤区域与含有负电荷脂类的脂质体组合物接触；
b.在已和脂质体组合物接触的皮肤区域内至少使用一次电脉冲；
c.在已施加电脉冲的上述皮肤区域进行吸液，提取来自个体的液体；
d.检测提取液中分析物的存在情况，其中提取液中分析物的存在是个体中存在分析物的指示。
19.根据权利要求18所述的方法，其中脂质体组合物含有二油酰磷脂酰甘油。
20.根据权利要求19所述的方法，其中脂质体组合物还含有二油酰磷脂酰胆碱。
21.根据权利要求20所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油与二油酰磷脂酰胆碱的比例约为1∶1。
22.根据权利要求18所述的方法，其中电脉冲的脉冲时间约为10微秒至10毫秒，通过每一个皮肤通路的电压降约为30至180V。
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