CN1401659B - 植物源性醇溶蛋白基质制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种包括小麦、大麦、裸麦、燕麦或玉米在内的植物源性醇溶蛋白基质的制备方法。系由所述的植物源性醇溶蛋白，用醇溶解，并进一步在醇溶液中形成微粒子；或者将上述醇溶解液，在板上干燥后成微粒子或膜。本发明的原料来源广、价格低廉、工艺要求低，所述的植物源性醇溶蛋白基质薄膜可用于细胞生长的医用材料和细胞因子载体，是一种新的可降解，低免疫原性，抗菌性，具有适当机械强度生物材料。
Description
技术领域
本发明涉及利用植物源成份的醇溶蛋白制备基质的方法。基质呈现微粒子和膜的形状，该醇溶蛋白基质为生物材料，可应用于组织工程。
背景技术
醇溶蛋白为谷物中储存蛋白。该蛋白及其树脂具有韧性，疏水性，可降解性，抗菌性等。目前，玉米醇溶蛋白已得到了商业化应用。在医疗上，有Coleman(2185110，2298548)生产的黏合剂，包扎工具；Cuca(WO94/121578)和Meyer et al(5609909)发明的口服药物的掩味剂；化妆品方面，有Avalle(EP 882443)创制的化装粉，食品上如Glasser(EP 90559)和Wasa et al(WO 99/14076)研制的食品包装材料；科研领域，有Mathiowitz et al设计成功的微球体等。另外，玉米醇溶蛋白的应用还涉及口香糖Campbell et al(5 164 210)、油漆Reiners et al(3840515)、打印油墨Leckley(2570353)、胶卷Wang et al(EP 886177)、可降解性塑料(Lai et al，1997)染发剂Morawsky et al(5518717)、光纤Freeman(WO 95/01728)和纺织品(Cuq et al，1999)等诸多方面。
目前，有机合成材料用于组织工程领域，但它们或是机械性能差；或是吸收速度不合适；或是不容易降解；或是降解后，其产物容易引起机体产生不良反应。如：PLGA，其酸性降解物引起了机体的炎症反应[Hollinger et al.，1996]；PLA和PGA植入人体后也有迟发性炎症反应[Bergsma et al.，1995]；HA，在生物体内很难被吸收。而一些天然生物性材料多数不具有良好的机械强度，也不能同时为移植细胞提供良好的环境[Hubbell，1995]。目前这类材料如胶原(Nakahara et al.1989)、纤维蛋白(Kawamura et al.，1988)、明胶和甲壳素等作为生物材料，特别是在组织的修复和再生方面的应用已被广泛研究[Grzesiaket al.，1997；sofia et al.，2001；Pamela et al.，2002；Coombes et al.，2002]，但它们自身多数机械强度差，往往须经修饰或同其它材料形成复合物，来增加机械强度和生物稳定性，但这同时又不期引起了机体的免疫反应。如用戊二醛修饰后的胶原，在动物机体内引起了心脏瓣膜的钙化[Schoen et al.，1984]。
玉米醇溶蛋白具有极好的机械强度，用120℃高温处理3小时后，经圆二相色散和电泳分析得其组成没有发生变化，证明了玉米醇溶蛋白具有良好的热稳定性，可以承受苛刻的加工工艺。此外，玉米醇溶蛋白经过修饰、加工形成可降解的薄膜，要比直接应用具有更强的韧性[Padgett et al.，1998]。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物源性醇溶蛋白基质的制备方法。
本发明的植物源性醇溶蛋白基质主要形态是不同粒径的微粒子，也可以是由微粒子连成的薄膜。
所述的微粒子为50-500nm的微粒子，所述的薄膜为50-2000nm的微粒子连成一片的薄膜。
所述的植物源性醇溶蛋白是米、小麦、大麦、裸麦、燕麦或玉米的醇溶性蛋白。
所述的醇是C1-4的脂肪醇，推荐乙醇。
本发明的植物源性醇溶蛋白基质制备方法，是由所述的植物源性醇溶蛋白用醇溶解，并进一步在醇溶液中形成微粒子或者将醇溶解液，在板上干燥后成微粒子或膜。
本发明的植物源性醇溶蛋白基质制备方法中，最好将上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液用超声波处理，可以获得均匀大小颗粒的微粒子，或者获得由均匀大小颗粒联成一片的膜。也可以采用离心的方法，除去上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液中较大的颗粒，使获得均匀大小颗粒的微粒子。
本发明的植物源性醇溶蛋白基质制备方法可以采用一次加醇或多次加醇的方法分别制得：
将植物源性醇溶蛋白中加入20-60％醇的水溶液，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，最好是每毫升溶液中含有0.5-5mg的植物源性醇溶蛋白，该溶液在板或片上，经干燥，形成微粒子。或者将植物源性醇溶蛋白溶解在40-100％的醇溶液中，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，再加1-100倍10-40％的醇，最好加入2-10倍10-40％的醇，形成50-500nm的微粒子。
或者将植物源性醇溶蛋白溶解在50-90％的乙醇(0.5-100mg/ml)中，再加2-5倍50-90％的乙醇。超声波室温处理2-10分钟。离心2-10分钟，干燥形成微粒子连成一片的膜，是一种由50-2000nm的微粒子连成一片的膜。
所述的离心机为100-800rpm。
所述的板可以是玻璃板、陶瓷板、不锈钢板等，也可以是生物技术所用的培养板，如24孔培养板，50-300μl/孔。
附图说明
图1、本发明的植物源性玉米醇溶蛋白的颗粒型基质和颗粒型膜基质扫描电镜照片。
图2、L-02肝细胞在本发明的不同基质上3小时的贴壁率。
图3、L-02肝细胞在本发明的不同基质上活力：(A)3天，(B)6天。
附图1中，采用含有不同浓度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液形成基质后，在放大15000倍扫描电子显微镜下进行分析的结果。其中1-1～1-4是颗粒型基质扫描电镜照片，1-5～1-8是颗粒型膜基质扫描电镜照片，它们的浓度分别如下：1-1：0.2％(w/v)，1-2：0.4％(w/v)，1-3：0.8％(w/v)，1-4：1。6％(w/v)，1-5：02％(w/v)，1-6：0.4％(w/v)，1-7：0.8％(w/v)，1-8：1.6％(w/v)。
附图2表示L-02肝细胞在本发明的不同基质上的相对贴壁率，其中；纵坐标-相对贴壁率，横坐标-0.康尼细胞培养板(CK)，基质准备过程中，植物源性醇溶蛋白在乙醇中的浓度分别为：1.200ul 0.2％(w/v)；2.200ul 0.4％(w/v)；3.200ul 0.8％(w/v)；4.200ul1.6％(w/v)。
附图3中采用含有不同浓度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液形成基质后，L-02肝细胞在本发明的不同基质上3天(3-1)和6天(3-2)后的活力。其中纵坐标-相对活性，横坐标不同浓度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液-1.200ul 0.2％(w/v)；2.200ul 0.4％(w/v)；3.200ul 0.8％(w/v)；4.200ul；0.1.6％(w/v)。
附图2和3中，小颗粒表示颗粒型基质，大颗粒表示颗粒型薄膜基质。
本发明不仅制备方法简便，而且本发明的植物源性醇溶蛋白基质是一种适合细胞生长需要的可降解的生物相容性材料。具体地说，利用体外培养技术鉴定植物源性醇溶蛋白的生物相容性，提供一种利于细胞贴附，增殖和分化的新型植物源的生物相容性的生物医用材料。该材料的原料来源广、价格低廉、工艺要求低。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：
玉米醇溶蛋白膜制备及细胞黏附
将玉米蛋白溶解在80％的乙醇中配制浓度成2、4、8、16mg/ml，加4倍体积20％的乙醇，室温超声波处理5分钟，加入24孔培养板(200ul/孔供细胞培养用)或盖玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm离心5分钟，室温干燥，形成小颗粒型基质。
将玉米蛋白溶解在70％的乙醇中配制浓度成2、4、8、16mg/ml，加三倍体积70％的乙醇，室温超声波处理5分钟，加入24孔培养板(200ul/孔供细胞培养用)或盖玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm离心5分钟，室温干燥，形成大颗粒型基质膜。
载有玉米醇溶蛋白膜的盖玻片置于扫描电子显微镜样品分析柱上，喷金3分钟，在4-5KeV条件下、放大15000倍进行分析(小颗粒型基质见图1-1，1-2，1-3，1-4；大颗粒型基质膜见图1-5，1-6，1-7，1-8)。
用含10％FBS，100g/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养肝细胞。将培养至满瓶的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分钟，收集细胞，活细胞染色和记数：将1滴细胞悬液与2滴台盼蓝混合，滴到记数板上，2分钟后记数。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。用RPMI-1640调细胞密度至2.5×105个细胞/ml。1ml/孔的细胞悬液接种到含有上述玉米醇溶蛋白的24孔板中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。于3小时MTT法测定细胞活力，计算黏附率(结果见图2)。
实施例2
玉米醇溶蛋白膜制备及细胞生长
将玉米蛋白溶解在80％的乙醇中配制成2、4、8、16mg/ml，加4倍体积20％的乙醇，室温超声波处理5分钟，加入24孔培养板(200ul/孔供细胞培养用)或盖玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm离心5分钟，室温干燥，形成小颗粒型基质。
将玉米蛋白溶解在70％的乙醇中配制成2、4、8、16mg/ml，加三倍体积70％的乙醇，室温超声波处理5分钟，加入24孔培养板(200ul/孔供细胞培养用)或盖玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm离心5分钟，室温干燥，形成大颗粒型基质膜。
用含10％FBS，100g/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养肝细胞。将培养至满瓶的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分钟，收集细胞，活细胞染色和记数：将1滴细胞悬液与2滴台盼蓝混合，滴到记数板上，2分钟后记数。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。用RPMI-1640调细胞密度至2.5×105个细胞/ml。1ml/孔的细胞悬液接种到含有上述玉米醇溶蛋白的24孔板中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养.于3天、6天用MTT法测定细胞活力(结果见图3).
Claims (2)
1.一种植物源性醇溶蛋白基质制备方法，其特征在于由所述的植物源性醇溶蛋白用醇溶解，并多次加醇的方法在醇溶液中形成微粒子或者将上述醇溶解液，在板上干燥后成膜；所述的多次加醇的方法如下：
1)将植物源性醇溶蛋白溶解在80％的醇溶液中，每毫升溶液中含有2-16mg的植物源性醇溶蛋白，再加4倍20％的醇，形成50-500nm的微粒子；
2)或者将植物源性醇溶蛋白溶解在70％的乙醇中，每毫升溶液中含有2-16mg的植物源性醇溶蛋白，再加3倍70％的乙醇；超声波室温处理2-10分钟，离心2-10分钟，干燥形成50-2000nm的微粒子连成一片的膜；
上述的植物源性醇溶蛋白是玉米醇溶性蛋白。
2.根据权利要求1所述的植物源性蛋白基质的制备方法，其特征在于所述的板是玻璃板、陶瓷板、不锈钢板或生物技术所用的培养板。
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