CN1388245A - 提高南方红豆杉紫杉醇产率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高紫杉醇产率的方法,以南方红豆杉芽为外植体,去除少部分外鳞后接入添加有2,4－D0.5－2.0mg/L和/或NAA0.5－3.0mg/L的改良MS培养基,23－25℃黑暗培养35－40天后,选取疏松、浅绿色或白色的愈伤组织;转入添加有2,4－D0.5－2.0mg/L、NAA0.5－3.0mg/L和KT0.2－1.0mg/L或其中的任意两种的改良B5培养基,23－25℃黑暗培养35－40天。本方法培养所得愈伤组织的紫杉醇含量可达到0.013%,比以南方红豆杉茎段和叶片为外植体诱导形成的愈伤组织中紫杉醇的含量提高了62.5%。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用特定的培养基提高南方红豆杉植物紫杉醇产率的方法。
背景技术
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物中提取的一种萜类化合物，是当今公认的最有效的抗癌制剂之一。自1967年被首次分离以来，已证明其对白血病、转移性乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑癌、颈癌和肺癌均有疗效，对睾丸癌、膀胱癌和食道癌的治疗也有一定帮助。被美国国立癌症研究所誉为过去十五年内开发的“最好的抗癌制剂”，预计全球每年需要紫杉醇200-300Kg。然而，紫杉醇主要是从红豆杉类植物的树皮中制备，它在原植物中的含量非常之低，一般仅为干重的0.005％-0.07％；另外，红豆杉类植物多属珍稀物种，全世界现存红豆杉属植物的数量很少，加之其生长又十分缓慢，这就造成紫杉醇生产的原料供应极度匮乏。由于供不应求，目前紫杉醇的价格非常昂贵，售价高达4000美元/g。因此，建立新的获取紫杉醇的方法已成为受到高度重视的研究领域，也是当今各国在植物生物技术领域争夺的一个焦点。
南方红豆杉是分布在广东的阳春、乳源和连山的珍贵裸子植物。目前红豆杉属植物通过组织培养的方法提高紫杉醇的含量通常是以1-2年生的枝条、叶、幼嫩茎段为外植体，进行愈伤组织的诱导和培养，但效果不是特别理想.一方面是愈伤组织中紫杉醇的含量较原材料提高的比例不是太大，例如，以南方红豆杉茎段和叶片为外植体诱导形成的愈伤组织的生长，并且愈伤组织中紫杉醇的含量为提取后干重的0.008％。另一方面，红豆杉属植物组织细胞培养时，细胞在脱分化或分化过程中，经常会分泌一些红褐色色素或酚类物质到培养基中，造成整个培养基褐变，另外由于紫杉醇是次生代谢物，次生代谢途径与植物褐变反应的一部分途径相重叠，从而进一步加重褐变的程度，因而严重影响紫杉醇生物合成的稳定性。所以，选择合适的外植体和适当的培养条件是克服褐变最重要的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高南方红豆杉紫杉醇产率的方法。该方法通过选择合适的培养基，并以南方红豆杉芽为外植体进行培养，使其紫杉醇的产率明显提高。
本发明的方法是：以南方红豆杉芽为外植体，去除少部分外鳞后接入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L和/或NAA 0.5-3.0mg/L的改良MS培养基，23-25℃黑暗培养35-40天后，选取疏松、浅绿色或白色的愈伤组织；转入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-3.0mg/L和KT 0.2-1.0mg/L或其中的任意两种的改良B5培养基，23-25℃黑暗培养35-40天。即可收集愈伤组织，供提取紫杉醇。
上述方法中，最好先将作为外植体的南方红豆杉芽用70％乙醇浸泡3-10秒，再用无菌水冲洗5-6次后，再接入改良MS培养基培养。所用的改良MS培养基为MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L。所用改良B5培养基为B5+2，4-D 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L，或B5+NAA 0.5mg/L+KT 1.0 mg/L。
本发明以南方红豆杉芽为外植体，经过改良的MS和B5培养基的诱导、增殖和驯化，紫杉醇含量最大能达到0.013％，比以南方红豆杉茎段和叶片为外植体诱导形成的愈伤组织中紫杉醇的含量提高了62.5％。并且污染率低、褐变率低，有利于紫杉醇含量的积累。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
表1是本发明实施例1至4所用培养基及愈伤组织诱导率和紫杉醇产率。表中所示的2，4-D2.0，NAA0.5，KT0.2等的下标数字分别表示该成分在培养基中的浓度(mg/L)。
各实施例的方法如下：
1.材料
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的芽。
2.培养方法
取南方红豆杉的芽用70％乙醇浸泡约3秒，无菌水冲洗5次；去除少部分外鳞后接入改良的MS培养基，25℃黑暗培养40天；选取疏松、浅绿色或白色的愈伤组织在改良的B5培养基上23-25℃黑暗继代培养40天。收集愈伤组织，计算南方红豆杉芽的紫杉醇含量。结果列于表1中。从表1可知，本发明方法中南方红豆杉的芽愈伤组织的出愈时间为5-9天，诱导率可达100％；经本发明改良的B5培养基培养后的南方红豆杉的芽愈伤组织中紫杉醇含量达到0.0084-0.013％。以实施例2的MS(培养基)添加2，4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L诱导率最高，出愈时间最早。以实施例3的B5(培养基)添加2，4-D 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L，紫杉醇含量最大，达到0.013％。
表1各实施例所用培养基及愈伤组织诱导率和紫杉醇产率
| 改良MS培养基(激素浓度mg/L) | 出愈时间(d) | 诱导率(％) | 改良B5培养基(激素浓度mg/L) | 紫杉醇含量(％) | |
| 实施例1 | MS+2，4-D2.0 | 7 | 97.6 | B5+2，4-D2.0+NAA0.5+KT0.2 | 0.0084 |
| 实施例2 | MS+2，4-D2.0+NAA0.5 | 5 | 100 | B5+2，4-D0.5+NAA1.5+KT0.2 | 0.0098 |
| 实施例3 | MS+NAA3.0 | 8 | 100 | B5+2，4-D0.5+NAA1.0+KT0.5 | 0.013 |
| 实施例4 | MS+NAA3.0+2，4-D0.5 | 9 | 100 | B5+NAA0.5+KT1.0 | 0.012 |
3.诱导率的计算及紫杉醇含量的测定
诱导率的计算：诱导率＝愈伤组织的块数/接种的芽个数
紫杉醇提取：愈伤组织培养物在40℃干燥至恒重，研碎后，精确称重，150ml氯仿80℃索氏提取4小时。回收氯仿，用甲醇定容至10ml，滤膜(孔径0.45um)过滤备用。
标准品：紫杉醇标准品(taxol)购自Sigma公司。
采用表2中HPLC条件定量分析紫杉醇产量。
表2紫杉醇的定量分析条件
| 仪器 | HPLC(HP1100) |
| 柱 | RPC18(4.6x25nm) |
| 柱温 | 40℃ |
| 流动相 | 甲醇∶水(64∶40) |
| 流速 | 1.00ml/min |
| 进样体积 | 20ul |
| 检测器 | UV(225nm) |
Claims (4)
1.一种提高南方红豆杉紫杉醇产率的方法，以南方红豆杉芽为外植体，去除少部分外鳞后接入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L和/或NAA 0.5-3.0mg/L的改良MS培养基，23-25℃黑暗培养35-40天后，选取疏松、浅绿色或白色的愈伤组织；转入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-3.0mg/L和KT0.2-1.0mg/L或其中的任意两种的改良B5培养基，23-25℃黑暗培养35-40天。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是先将作为外植体的南方红豆杉芽用70％乙醇浸泡3-10秒，再用无菌水冲洗5-6次后，再接入改良MS培养基培养。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是所用的改良MS培养基为MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA0.5mg/L。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是所用改良B5培养基为B5+2，4-D 0.5mg/L+NAA1.0mg/L+KT 0.5mg/L，或B5+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L。
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