CN1387043A - 可溶性血小板t细胞活化抗原1(cd226)的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)双mAb夹心ELISA定量检测方法。首先制备了多株可识别CD226/PTA1分子胞膜外区的不同表位的mAb,并通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配,然后对工作条件进行了优化,具体步骤是:用缓冲液稀释包被mAb LeoA1,保湿,4℃放置24h。用洗涤液洗板,加入工作浓度标准品CD226/Fc融合蛋白和待测标本,37℃孵育45min。洗板,加入工作浓度的HRP－FMU3,37℃孵育45min。洗板,以TMB底物显色,2.5mol/LH2SO4终止。于波长450nm测定光吸收(A)值。以标准品的A值和相应浓度作标准曲线,将待测标本的A值与标准曲线相比,计算待测标本的sCD226/PTA1水平。本发明提高了检测sCD226/PTA1的敏感性和特异性,有良好的稳定性和再现性,缩短了操作时间,降低了成本。
Description
一、所属领域
本发明涉及可溶性免疫细胞膜分子的一种免疫学检测方法，特别涉及可溶性血小板T细胞活化抗原1(PTA1，CD226)的一种定量检测方法。
二、背景技术
2000年，第四军医大学基础部免疫学教研室用单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)和兔多抗血清搭配建立了检测可溶性CD226/PTA1(sCD226/PTA1)的夹心ELISA方法，并首次发现在正常人血清或T细胞培养上清中存在sCD226/PTA1，某些肿瘤患者以及器官移植患者血清sCD226/PTA1升高。
此方法的包被mAb为LeoA1，工作浓度为5mg/L。夹心抗体为兔多抗血清，工作浓度为20mg/L。操作流程：用包被mAb包被ELISA板，保湿，4℃放置24h；洗板后加入标准品CD226/Fc融合蛋白，37℃孵育1h；洗板后加兔多抗血清，37℃孵育1h；洗板后加辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔抗体，37℃孵育1h；洗板后以ABTS底物显色，于波长405nm测定光吸收值。检测敏感性为100ng/L
根据申请人所进行的资料检索，国内外尚无其他有关检测sCD226/PTA1夹心ELISA方法的报道。
CD226是2000年在第7届人类白细胞分化抗原国际协作组会议和专题讨论会上被命名的新的CD分子，是金伯泉研究小组主要参与申请并为我国首次获准的新的CD分子，被评为我国2000年十大科技新闻之一。CD226原名血小板T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)，表达于活化T细胞、NK细胞、血小板和活化内皮细胞。CD226/PTA1参与调节CTL分化以及CTL和NK细胞的杀伤，参与细胞之间的黏附以及血小板的活化与凝集，并可能参与信号转导。CD226/PTA1在血清中存在着可溶性形式(sCD226/PTA1)。以往研究发现，CD226/PTA1与多种自身免疫性疾病、病毒感染性疾病和血小板功能异常性疾病相关，正常人血清中存在sCD226/PTA1，某些病毒感染性疾病以及自身免疫病患者血清sCD226/PTA1升高。因此，建立检测sCD226/PTA1 ELISA试剂盒在科研和临床上都具有应用价值。
多抗血清用于夹心ELISA，主要不足之处是：兔多抗血清效价个体间差异较大，给检测方法的标准化带来一定困难；此外，检测步骤较多，操作时间较长。
三、发明内容
本发明的目的在于，提供一种快捷、敏感、稳定的可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)定量检测方法。
为实现此目的，本发明所采取的技术方案是：用两株针对CD226/PTA1胞膜外区不同表位的mAb替代一株mAb与兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗体的结合反应；制备了多株可识别CD226/PTA1分子胞膜外区的不同表位的mAb，并通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配，然后对工作条件进行了优化，通过简化的实施步骤测得标本的sCD226/PTA1水平。
本发明的其他一些特点是，包被mAb为LeoA1，夹心抗体为HRP标记的mAbFMU3，即HRP-FMU3。
优化的工作条件是：
①包被mAb的工作浓度为2.5mg/L；
②标准品抗原为CD226/Fc融合蛋白，标准品稀释液为0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；标准品最高工作浓度约为1.8μg/L，倍比稀释7个梯度作标准曲线；
③HRP-FMU3的稀释液为3％PEG-PBS，最佳工作浓度为1.36mg/L(按mAbFMU3的量计算)。
所述简化的实施步骤为：
①用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被mAb LeoA1，加入96孔板，100μl/孔，保湿，4℃放置24h；
②用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品CD226/Fc融合蛋白和待测标本，100μl/孔，37℃孵育45min；
③洗板3次，加入工作浓度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min；洗板3次，以TMB底物显色，2.5mol/L H2SO4终止；
④于波长450nm测定光吸收(A)值；
⑤以标准品的A值和相应浓度作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比，计算待测标本的sCD226/PTA1水平。
本发明提高了检测sCD226/PTA1的敏感性和特异性，有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本。
四、具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。
按照本发明的技术方案，可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)的定量检测方法，用两株针对CD226/PTA1胞膜外区不同表位的mAb替代一株mAb与兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗体的结合反应。
1.首先制备了多株可识别CD226/PTA1分子胞膜外区的不同表位的mAb，并通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配：包被mAb为LeoA1，夹心抗体为HRP标记的mAb FMU3，即HRP-FMU3。
2.然后对本发明的工作条件进行了优化：
①包被mAb的工作浓度为2.5mg/L；
②标准品抗原为CD226/Fc融合蛋白，标准品稀释液为0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；标准品最高工作浓度约为1.8μg/L，倍比稀释7个梯度作标准曲线；
③HRP-FMU3的稀释液为3％PEG-PBS，最佳工作浓度为1.36mg/L(按mAbFMU3的量计算)。
3.本发明的具体实施步骤：用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被mAbLeoA1，加入96孔板(Nunc.公司Maxisorp)，100μl/孔，保湿，4℃放置24h。用洗涤液(0.1％ Tween20-PBS，下同)洗板3次，加入工作浓度标准品CD226/Fc融合蛋白和待测标本，100μl/孔，37℃孵育45min。洗板3次，加入工作浓度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min。洗板3次，以TMB底物显色(100μl/孔，37℃约5□10min)，2.5mol/L H2SO4终止。于波长450nm测定光吸收(A)值。以标准品的A值和相应浓度作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比，计算待测标本的sCD226/PTA1水平。
以下是发明人按本发明的技术方案所完成的实施例：
1.银屑病患者30例，正常人15例。结果 银屑病患者血清中sCD226/PTA1水平(823.9±569.9ng/L)显著高于正常人(120.5±58.4ng/L)，t＝4.41，p＜0.001。活动期患者血清中sCD226/PTA1水平(1036.1±599.0ng/L)明显高于静止期患者(546.4±399.3ng/L)。患者治疗后血清水平(263.2±207.3ng/L)显著低于治疗前血清水平(751.5±648.1ng/L)，t＝3.425，p＜0.005。
2.肾综合征出血热患者69例，正常人52例。结果正常人血清sCD226/PTA1的平均水平为143□55ng/L，肾综合征出血热患者血清sCD226/PTA1的水平明显升高，平均为317□223ng/L，为正常人水平的2.2倍(P＜0.01)。
综上所述，本发明提高了检测sCD226/PTA1的敏感性和特异性，有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本。
Claims (4)
1.可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)的定量检测方法，其特征在于：用两株针对CD226/PTA1胞膜外区不同表位的mAb替代一株mAb与兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗体的结合反应，制备了多株可识别CD226/PTA1分子胞膜外区的不同表位的mAb，并通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配，然后对工作条件进行了优化，通过简化的实施步骤后测得标本的sCD226/PTA1水平。
2.根据权利要求1所述的可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)的定量检测方法，其特征在于：所述夹心ELISA的最佳搭配：包被mAb为LeoA1，夹心抗体为HRP标记的mAb FMU3，即HRP-FMU3。
3.根据权利要求1所述的可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)的定量检测方法，其特征在于：所述优化的工作条件是：
①包被mAb的工作浓度为2.5mg/L；
②标准品为CD226/Fc融合蛋白，标准品稀释液为：0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；标准品最高工作浓度约为1.8μg/L，倍比稀释7个梯度作标准曲线；
③HRP-FMU3的稀释液为3％PEG-PBS，最佳工作浓度为1.36mg/L(按mAbFMU3的量计算)。
4.根据权利要求1所述的可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)的定量检测方法，其特征在于：所述简化的实施步骤为：
①用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被mAb LeoA1，加入96孔板，100μl/孔，保湿，4℃放置24h；
②洗板，加入工作浓度标准品和待测标本，100μl/孔，37℃孵育45min；
③洗板，加入工作浓度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min；洗板，以TMB底物显色，2.5mol/L H2SO4终止；
④于波长450nm测定光吸收(A)值；
⑤以标准品的A值和相应浓度作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比，计算待测标本的sCD226/PTA1水平。
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