CN1385534A - 一种鱼类电脉冲精子转基因方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化的鱼类电脉冲精子转基因方法,该方法基于电脉冲处理将使外源基因和精子外膜结合更紧密的原理,将电脉冲转基因法和精子介导转基因法相结合,对混有外源基因,并保存在保存液中的精子进行电脉冲处理,再与卵子受精,可使转基因的成功率达到19.6%~46.8%。对5月龄的草鱼尾鳍通过此法,经PCR检测得知,有35.7%的个体中含有外源基因。本方法具有简便、易行、高效、便宜和适用范围广等优点,对于卵膜不易去除,或卵很脆弱的鱼类,尤其适用。
Description
本发明涉及基因转移领域,尤其涉及鱼类的转基因方法。
基因转移可以用于基因表达、物种改良,也可以用于研究基因的功能,开发生物反应器等。用简单易行的方法获得大量转基因个体则是其前提和基础。目前,显微注射法、电脉冲基因转移法、精子介导法、磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、基因鸟铳法等转基因方法相继建立,在这些方法中,显微注射法因其直观、准确、有效而成为常用的方法之一,但由于它存在操作过程烦琐,技巧要求高,以及容易使受体细胞损伤等不足,因此在许多物种上难以应用。磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、脂质体介导法和基因鸟铳法,则存在设备昂贵,操作复杂等缺点,难以推广应用。与上述方法相比,精子介导或电脉冲介导的基因转移方法,其操作较为简单,但这两种方法存在着基因转移效率低,很不稳定,且电脉冲对卵的损伤较大等缺陷。因上述各种方法均存在着各自的不足,大大限制了对动物的转基因研究和开发。
本发明的目的是提供一种改进的鱼类转基因方法,该方法将电脉冲法和精子介导法有机地结合起来,进行参数的优化,用简易的设备,方便的操作,即可高效、快速地获得大量的转基因个体。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
基于电脉冲处理将使外源基因和精子外膜结合更紧密的原理,将电脉冲法和精子介导法结合起来,对混有外源基因的精子悬浮液进行电脉冲处理,再用处理过的精子与卵子受精。这样,外源基因即可进入卵子。为了使卵子时能及时得到受精,可提前取得并电脉冲处理精子,其在4℃下的保存液中可保存7天,并用超出常规量10~50倍的精子进行授精以突破卵子质量方面的瓶颈。
本发明和现有技术相比,具有以下优点和效果:优化后的电脉冲精子转基因法可以使转基因的成功率达到19.6%~46.8%;对采用电脉冲精子转基因法得到的5月龄草鱼尾鳍进行PCR检测得知,有35.7%的个体中含有外源基因;而仅采用精子介导法得到的转基因鱼在总数中占的比例为2.2%~4.3%。与以前的转基因方法相比,此方法的成功率可提高4~10倍。谢岳峰等人在1989年对泥鳅进行电脉冲介导的转基因,阳性率为10%(谢岳峰,刘东,邹钧等,1989,泥鳅受精卵的电脉冲基因转移,水生生物学报,13(4):387-389)。Inoue等人在1990年报道,90%青鳉受精卵经受电脉冲休克后,只有25%的受精卵最后孵化出苗,孵化鱼苗携带外源基因的占4%(Inoue,K.,S.Yamashita,J-i.Hata,S.Kabeno,S.Sada,E.Nagahisa &T.Fujita,1990.Electroporation as a new technique for producingtransgene ifsh.Cell Diff.Devel.29:123-128)。Lu等人在1992年的实验中,有70%的受精卵孵化出苗,其中20%的鱼苗携带外源基因(Lu,J-K.,T.T.Chen,C.L.Chrisman,O.M.Andrisani & J.E.Dixon,1992.Integration,expression,and germ-line transmission of foreign growthhormone genes in medaka(Oryzias latipes).Mol.Mar.Biol.Biotech.1:366-375)。1994年于建康等用精子介导法用于金鱼的转基因,成功率为6.7%(于建康,阎维,张玉廉等.1994.精子介导鱼类基因转移和聚合酶链反应检测技术.动物学报,40(1):96-99)。1999年Jung-Ha Kang等用电脉冲-精子法得到的阳性率是20%(Jung-Ha Kang,Goro Yoshizaki,Osamu Homma.et al.1999.Effect of an osmoticdifferential on the efficiency of gene transfer by eletroporation of fishspermatozoa.Aquaculture,vol.173,297-307)。
与显微注射法、磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、脂质体介导法、基因鸟铳法等转基因方法相比,电脉冲精子转基因法具有简便、易行、高效、便宜和适用范围广等优点。对于卵膜不易去除,或卵很脆弱的鱼类,具有很高的实用价值。另外,受精卵所需要的外源基因要远比精子所需要的多,因此,要获得大量的转基因鱼,此法对于外源基因的消耗也是很少的。
本发明采用下列步骤:
1、构建外源基因重组质粒,用DNA内切酶将其线性化,溶解成浓度为1~10μg/μl的溶液。
2、获取精卵:采用人工催青方法获得成熟的鱼类精子和卵子,将精子保存在4℃的等体积精子保存液(葡萄糖29g/L,柠檬酸三钠10g/L,碳酸氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L,牛血清白蛋白30g/L,溶剂为水)中备用。
3、电脉冲处理精子:取90μl精子悬液加入电脉冲样品杯,再加入10μl外源基因溶液,吹打混匀,用电脉冲仪处理,设置参数为:电压10kV、脉冲数210、脉冲周期0.4秒、循环数12。调节电脉冲正极使其刚好接触精子悬液液面,激发电脉冲,待12个循环结束后,再次激发电脉冲,如此反复4次。精子可以提前进行处理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化:取成熟的卵子迅速与电脉冲处理过的精子混和,进行人工干法受精、孵化。
5、取孵化后3~5天的各实验组鱼苗,每尾分别置于灭菌的1.5ml的离心管,加入50μl新配制的组织匀浆缓冲液(Tris0.05M;NaCl0.02M;SDS0.1%;pK1mg/ml);55℃下消化1小时,轻轻振荡离心管,再在55℃下温育2~16小时;1000转/分离心30秒,加入150μl去离子水,混和均匀后在95~100℃水浴下热休克处理6~7分钟。取1μl鱼苗匀浆物加入到终体积为25μl的PCR反应体系,其中含有:1×PCR Buffer,0.2mMdNTPs,0.04pmol/μl引物,0.02U/μl的Taq,1.5mM的MgSO4。PCR程序包括:94℃预变性4分钟;30个循环扩增反应,每个循环94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃引物延伸1分钟。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,UVP成像系统分析。
实施例:
1、外源基因重组质粒的构建
外源基因重组质粒含启动子部分和编码序列,启动子为鲤鱼的β-肌动蛋白基因启动子(CA),先采用高保真PCR产生具有匹配的酶切位点的编码序列,与启动子部分CA连接成重组质粒成重组质粒,再转化入大肠杆菌,在LB液中大量培养、扩增,收获重组质粒。用DNA内切酶将外源基因重组质粒线性化,溶解为浓度为2μg/μl的溶液。
2、草鱼精卵的获取
采用人工催青方法获得成熟的草鱼精子和卵子,将精子保存在4℃的等体积精子保存液(葡萄糖29g/L,柠檬酸三钠10g/L,碳酸氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L,牛血清白蛋白30g/L,溶剂为水)中备用。
3、电脉冲处理精子
取90μl精子悬液加入电脉冲仪样品杯,再加入10μl外源基因溶液,吹打混匀。设置好电脉冲参数,其中电压参数为10kV,脉冲数为210,脉冲周期为0.4sec,循环数为12。调节电脉冲正极使正电极距离旋钮读数为200,此时电极刚好接触精子悬液液面,按“激发电脉冲”键,待12个循环结束后,再次按“激发电脉冲”键,如此共4次,进行电脉冲处理,精子可以提前进行处理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化
取成熟的卵子迅速与电脉冲处理过的精子混和,进行人工干法受精、孵化。
5、用PCR检测草鱼苗的转基因阳性率
组织匀浆处理:取2~5日龄的各实验组鱼苗,置于灭菌的1.5ml的离心管,加入5μl新配制的组织匀浆缓冲液(Tris0.05M;NaCl0.02M;SDS0.1%的溶液pK1mg/ml);55℃下消化1小时,轻轻振荡离心管,勿旋转,再在55℃下温育2~16小时;1000转/分钟离心30秒,加入150μl去离子水,混和均匀后在95℃~100℃水浴下热休克处理6~7分钟。
PCR:25μl PCR反应体系含1μl组织匀浆液,1×PCRBuffer,0.2mmol/LdNTPs,0.04pmol/μl引物溶液,0.02U/μl的Taq,1.5mM的MgSO4,进行PCR反应。PCR程序为:94℃预变性4分钟;30循环:94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃引物延伸1分钟;4℃保持。引物P1:5'-TGGCGTGATGAATGTCG-3',位于CA上,引物P2:5'-CTGTTTTCCGCAATGGC-3',位于编码序列上。两个引物在模板NDA间的距离为550bp,PCR产生用0.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,UVP成像系统分析。
Claims (4)
1、一种鱼类电脉冲精子转基因方法,其特征在于,可采用贮藏精子,提前处理精子,超量使用精子,对混有外源基因的精子悬浮液进行电脉冲处理,再用处理过的精子使卵子受精,具体方法包含下列步骤:
a、构建外源基因重组质粒,用脱氧核糖核酸内切酶将外源基因重组质粒线性化,溶解为浓度为1~10μg/μl的溶液;
b、采用人工催青方法获得成熟的鱼类精子和卵子,将精子保存在4℃下等体积的精子保存液中备用;
c、取90μl精子悬液加入电脉冲样品杯,再加入10μl外源基因溶液,吹打混匀,用电脉冲仪进行处理,在4℃下的保存液中可保存7天;
d、将电脉冲处理过的精子迅速与卵子混和,进行人工干法授精、孵化。
2、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法,其特征在于,用精子保存液保存精子并作为脉冲电场的介质,所述的精子保存液采用:葡萄糖29g/L,柠檬酸三钠10g/L,碳酸氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L,牛血清白蛋白30g/L。
3、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法,其特征在于,用电脉冲仪处理时,按如下方法进行:调节电脉冲正极使其刚好接触精子悬液液面;电脉冲仪的参数设置为:电压7.5~10kV、脉冲数29~211、脉冲周期0.2~0.8秒、循环数8~16;激发电脉冲,循环结束后,再次激发电脉冲,如此反复2~6次。
4、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法,其特征在于,所述的超量使用精子是对每万个卵子使用0.2~1.0ml的精子。
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