CN1385534A - 一种鱼类电脉冲精子转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种优化的鱼类电脉冲精子转基因方法,该方法基于电脉冲处理将使外源基因和精子外膜结合更紧密的原理,将电脉冲转基因法和精子介导转基因法相结合,对混有外源基因,并保存在保存液中的精子进行电脉冲处理,再与卵子受精,可使转基因的成功率达到19.6%～46.8%。对5月龄的草鱼尾鳍通过此法,经PCR检测得知,有35.7%的个体中含有外源基因。本方法具有简便、易行、高效、便宜和适用范围广等优点,对于卵膜不易去除,或卵很脆弱的鱼类,尤其适用。

Description

一种鱼类电脉冲精子转基因方法
本发明涉及基因转移领域，尤其涉及鱼类的转基因方法。
基因转移可以用于基因表达、物种改良，也可以用于研究基因的功能，开发生物反应器等。用简单易行的方法获得大量转基因个体则是其前提和基础。目前，显微注射法、电脉冲基因转移法、精子介导法、磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、基因鸟铳法等转基因方法相继建立，在这些方法中，显微注射法因其直观、准确、有效而成为常用的方法之一，但由于它存在操作过程烦琐，技巧要求高，以及容易使受体细胞损伤等不足，因此在许多物种上难以应用。磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、脂质体介导法和基因鸟铳法，则存在设备昂贵，操作复杂等缺点，难以推广应用。与上述方法相比，精子介导或电脉冲介导的基因转移方法，其操作较为简单，但这两种方法存在着基因转移效率低，很不稳定，且电脉冲对卵的损伤较大等缺陷。因上述各种方法均存在着各自的不足，大大限制了对动物的转基因研究和开发。
本发明的目的是提供一种改进的鱼类转基因方法，该方法将电脉冲法和精子介导法有机地结合起来，进行参数的优化，用简易的设备，方便的操作，即可高效、快速地获得大量的转基因个体。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于电脉冲处理将使外源基因和精子外膜结合更紧密的原理，将电脉冲法和精子介导法结合起来，对混有外源基因的精子悬浮液进行电脉冲处理，再用处理过的精子与卵子受精。这样，外源基因即可进入卵子。为了使卵子时能及时得到受精，可提前取得并电脉冲处理精子，其在4℃下的保存液中可保存7天，并用超出常规量10～50倍的精子进行授精以突破卵子质量方面的瓶颈。
本发明和现有技术相比，具有以下优点和效果：优化后的电脉冲精子转基因法可以使转基因的成功率达到19.6％～46.8％；对采用电脉冲精子转基因法得到的5月龄草鱼尾鳍进行PCR检测得知，有35.7％的个体中含有外源基因；而仅采用精子介导法得到的转基因鱼在总数中占的比例为2.2％～4.3％。与以前的转基因方法相比，此方法的成功率可提高4～10倍。谢岳峰等人在1989年对泥鳅进行电脉冲介导的转基因，阳性率为10％(谢岳峰，刘东，邹钧等，1989，泥鳅受精卵的电脉冲基因转移，水生生物学报，13(4)：387-389)。Inoue等人在1990年报道，90％青鳉受精卵经受电脉冲休克后，只有25％的受精卵最后孵化出苗，孵化鱼苗携带外源基因的占4％(Inoue，K.，S.Yamashita，J-i.Hata，S.Kabeno，S.Sada，E.Nagahisa &T.Fujita，1990.Electroporation as a new technique for producingtransgene ifsh.Cell Diff.Devel.29：123-128)。Lu等人在1992年的实验中，有70％的受精卵孵化出苗，其中20％的鱼苗携带外源基因(Lu，J-K.，T.T.Chen，C.L.Chrisman，O.M.Andrisani & J.E.Dixon，1992.Integration，expression，and germ-line transmission of foreign growthhormone genes in medaka(Oryzias latipes).Mol.Mar.Biol.Biotech.1：366-375)。1994年于建康等用精子介导法用于金鱼的转基因，成功率为6.7％(于建康，阎维，张玉廉等.1994.精子介导鱼类基因转移和聚合酶链反应检测技术.动物学报，40(1)：96-99)。1999年Jung-Ha Kang等用电脉冲-精子法得到的阳性率是20％(Jung-Ha Kang，Goro Yoshizaki，Osamu Homma.et al.1999.Effect of an osmoticdifferential on the efficiency of gene transfer by eletroporation of fishspermatozoa.Aquaculture，vol.173，297-307)。
与显微注射法、磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、脂质体介导法、基因鸟铳法等转基因方法相比，电脉冲精子转基因法具有简便、易行、高效、便宜和适用范围广等优点。对于卵膜不易去除，或卵很脆弱的鱼类，具有很高的实用价值。另外，受精卵所需要的外源基因要远比精子所需要的多，因此，要获得大量的转基因鱼，此法对于外源基因的消耗也是很少的。
本发明采用下列步骤：
1、构建外源基因重组质粒，用DNA内切酶将其线性化，溶解成浓度为1～10μg/μl的溶液。
2、获取精卵：采用人工催青方法获得成熟的鱼类精子和卵子，将精子保存在4℃的等体积精子保存液(葡萄糖29g/L，柠檬酸三钠10g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钾0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L，溶剂为水)中备用。
3、电脉冲处理精子：取90μl精子悬液加入电脉冲样品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混匀，用电脉冲仪处理，设置参数为：电压10kV、脉冲数210、脉冲周期0.4秒、循环数12。调节电脉冲正极使其刚好接触精子悬液液面，激发电脉冲，待12个循环结束后，再次激发电脉冲，如此反复4次。精子可以提前进行处理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化：取成熟的卵子迅速与电脉冲处理过的精子混和，进行人工干法受精、孵化。
5、取孵化后3～5天的各实验组鱼苗，每尾分别置于灭菌的1.5ml的离心管，加入50μl新配制的组织匀浆缓冲液(Tris0.05M；NaCl0.02M；SDS0.1％；pK1mg/ml)；55℃下消化1小时，轻轻振荡离心管，再在55℃下温育2～16小时；1000转/分离心30秒，加入150μl去离子水，混和均匀后在95～100℃水浴下热休克处理6～7分钟。取1μl鱼苗匀浆物加入到终体积为25μl的PCR反应体系，其中含有：1×PCR Buffer，0.2mMdNTPs，0.04pmol/μl引物，0.02U/μl的Taq，1.5mM的MgSO4。PCR程序包括：94℃预变性4分钟；30个循环扩增反应，每个循环94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃引物延伸1分钟。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，UVP成像系统分析。
实施例：
1、外源基因重组质粒的构建
外源基因重组质粒含启动子部分和编码序列，启动子为鲤鱼的β-肌动蛋白基因启动子(CA)，先采用高保真PCR产生具有匹配的酶切位点的编码序列，与启动子部分CA连接成重组质粒成重组质粒，再转化入大肠杆菌，在LB液中大量培养、扩增，收获重组质粒。用DNA内切酶将外源基因重组质粒线性化，溶解为浓度为2μg/μl的溶液。
2、草鱼精卵的获取
采用人工催青方法获得成熟的草鱼精子和卵子，将精子保存在4℃的等体积精子保存液(葡萄糖29g/L，柠檬酸三钠10g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钾0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L，溶剂为水)中备用。
3、电脉冲处理精子
取90μl精子悬液加入电脉冲仪样品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混匀。设置好电脉冲参数，其中电压参数为10kV，脉冲数为210，脉冲周期为0.4sec，循环数为12。调节电脉冲正极使正电极距离旋钮读数为200，此时电极刚好接触精子悬液液面，按“激发电脉冲”键，待12个循环结束后，再次按“激发电脉冲”键，如此共4次，进行电脉冲处理，精子可以提前进行处理并可在4℃下的保存液中保存7天。
4、受精、孵化
取成熟的卵子迅速与电脉冲处理过的精子混和，进行人工干法受精、孵化。
5、用PCR检测草鱼苗的转基因阳性率
组织匀浆处理：取2～5日龄的各实验组鱼苗，置于灭菌的1.5ml的离心管，加入5μl新配制的组织匀浆缓冲液(Tris0.05M；NaCl0.02M；SDS0.1％的溶液pK1mg/ml)；55℃下消化1小时，轻轻振荡离心管，勿旋转，再在55℃下温育2～16小时；1000转/分钟离心30秒，加入150μl去离子水，混和均匀后在95℃～100℃水浴下热休克处理6～7分钟。
PCR：25μl PCR反应体系含1μl组织匀浆液，1×PCRBuffer，0.2mmol/LdNTPs，0.04pmol/μl引物溶液，0.02U/μl的Taq，1.5mM的MgSO4，进行PCR反应。PCR程序为：94℃预变性4分钟；30循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃引物延伸1分钟；4℃保持。引物P1：5＇-TGGCGTGATGAATGTCG-3＇，位于CA上，引物P2：5＇-CTGTTTTCCGCAATGGC-3＇，位于编码序列上。两个引物在模板NDA间的距离为550bp，PCR产生用0.8％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，UVP成像系统分析。

Claims (4)

1、一种鱼类电脉冲精子转基因方法，其特征在于，可采用贮藏精子，提前处理精子，超量使用精子，对混有外源基因的精子悬浮液进行电脉冲处理，再用处理过的精子使卵子受精，具体方法包含下列步骤：
a、构建外源基因重组质粒，用脱氧核糖核酸内切酶将外源基因重组质粒线性化，溶解为浓度为1～10μg/μl的溶液；
b、采用人工催青方法获得成熟的鱼类精子和卵子，将精子保存在4℃下等体积的精子保存液中备用；
c、取90μl精子悬液加入电脉冲样品杯，再加入10μl外源基因溶液，吹打混匀，用电脉冲仪进行处理，在4℃下的保存液中可保存7天；
d、将电脉冲处理过的精子迅速与卵子混和，进行人工干法授精、孵化。
2、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法，其特征在于，用精子保存液保存精子并作为脉冲电场的介质，所述的精子保存液采用：葡萄糖29g/L，柠檬酸三钠10g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钾0.3g/L，牛血清白蛋白30g/L。
3、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法，其特征在于，用电脉冲仪处理时，按如下方法进行：调节电脉冲正极使其刚好接触精子悬液液面；电脉冲仪的参数设置为：电压7.5～10kV、脉冲数29～211、脉冲周期0.2～0.8秒、循环数8～16；激发电脉冲，循环结束后，再次激发电脉冲，如此反复2～6次。
4、根据权利要求1所述的一种鱼类电脉冲精子转基因方法，其特征在于，所述的超量使用精子是对每万个卵子使用0.2～1.0ml的精子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103518705A (zh) * 2013-10-17 2014-01-22 南京市水产科学研究所 一种黄颡鱼精液保存液及其制备方法
CN109874712A (zh) * 2019-03-07 2019-06-14 广西壮族自治区水产科学研究院 一种凡纳滨对虾的体外授精方法

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