CN1381728A

CN1381728A - 淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备

Info

Publication number: CN1381728A
Application number: CN 01110759
Authority: CN
Inventors: 舍英; 陈必珍; 阎美容; 侯金凤
Original assignee: TONGRI REAGENT CO Ltd HUHEHAOTE
Current assignee: TONGRI REAGENT CO Ltd HUHEHAOTE
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2002-11-27

Abstract

本发明公开了一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备,属于酶学领域。其是将配制试剂分装于安瓿内,便于保存,性能稳定,重复性好,减轻了劳动强度,改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异,从而使操作规范化,使酶的检测及质量控制达到统一的标准,同时使用试剂盒简化了操作过程,省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便使用,为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。

Description

淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备

本发明涉及一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，属于酶学领域。

近年来，酶学在临床诊断与治疗中的应用发展非常迅速，现已分别发展为医学中的两个新领域，即诊断酶学和治疗酶学。目前已有上百种酶试验可用于临床诊断。临床酶学的这一发展，部分是由于测定技术的发展，使许多酶的测定已日益精确和简便，可用于常规测定。部分是由于认识到某些疾病发展过程中酶活力必然发生改变这一客观事实，特别是在疾病的早期，用X光片、CT还未能发现病灶时，而体内的酶活性已开始发生变化。如果能定期查体，可做到对疾病的早期发现。值得一提的是，目前临床上诊断酶学的应用多数是对酶的总活性的测定，并且市场上已有相应试剂盒销售，其缺点是缺乏器官特异性。目前有关酶活性测定的试剂盒约有20～30种，同工酶检测试剂盒约有3～5种，但多数用的是化学抑制法或免疫抑制法。而同工酶是指酶蛋白结构不同而具有相同的催化特性的一类酶，不同的同工酶来自不同的组织和细胞。当某一组织或器官发生病变时，由于组织受损或细胞膜通透性的变化，引起细胞内酶大量释入血液而引起血清酶活性的改变。通过同工酶的检测可确定患病部位，从而提高酶学诊断的特异性和敏感性，还可判断预后。目前由于自行配制酶显示液，因所用试剂品种繁多，规格不一，致使酶显示结果不稳定，结果判定不统一，且同工酶检测操作较繁琐，费时等等，特别是大型生化分析仪的应用，使临床生化检测的操作更简便，省时、省力，但其是对总酶活性的测定，缺乏组织特异性，相比较，同工酶的检测使病变早期定性和定位就精确的多了。

本发明的目的在于提供一种质量优良、性能稳定、重复性能好，同时大大简化了检测的操作过程且使用该试剂盒可使同工酶的检测操作规范化，从而使酶活性的检测及质量控制达到统一标准的淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备。

本发明的目的由如下技术方案实施：做醋纤膜电泳，其包括有：

(1)、配制浓度为0.02～0.2mol/L电极液，pH为7.5-9.0；

(2)、配制浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；

(3)、将碘液做为显色液，分装安瓿C；

(4)内装冰乙酸做为固定液，分装安瓿D；

(5)配制底物显色板：将琼脂糖或琼脂和做为底物的淀粉、缓冲液分装安瓿B，所述缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L，按重量百分比，其中所述淀粉和琼脂糖或琼脂分别为9.1％～70.6％，29.4％～91.0％，加入80～120ml缓冲液，加热溶解，分装安瓿B。所述安瓿B内的缓冲液为磷酸缓冲液，也可用Tris系列的缓冲液或顺丁烯二酸-NaoH缓冲液。

做琼脂糖凝胶电泳，其包括有：(1)配制浓度为0.02～0.2mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)将碘液做为显色液，分装安瓿C；(3)内装冰乙酸做为固定液，分装安瓿D；(4)将淀粉、琼脂糖或琼脂按重量百分比，分别为9.1％～70.6％∶29.4％～91.0％，再加入80～120ml浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜的缓冲液中，加热溶解，制备为安瓿A。所述安瓿A中还可加入蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮，按重量百分比，蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂糖或琼脂分别为1.3％～31.6％，6.0％～31.2％，41.7％～89.5％，1.2％～18.7％，加入80～120ml浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜的缓冲液中，加热溶解，趁热分装为安瓿A。所述电极液可以用巴比妥缓冲液，也可以用巴比妥-HCL缓冲液，也可用硼酸-NaoH缓冲液或阴极槽电极液用巴比妥缓冲液，阳极槽电极液用Tris-EDTA-硼酸缓冲液。所述泡醋纤膜缓冲液可以为二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液，也可以为三羟甲基氨基甲烷系列的缓冲液。

淀粉酶同工酶(Amy EC 3.2.11)。Amy分为胰型(P型)和唾液型(S型)两种同工酶。P型主要存在于胰腺，S型来自腮腺、唾液腺、水解食物中的淀粉。当急性胰腺炎时，P型淀粉酶活性增高；肺癌、卵巢癌时，S型Amy增强，可用于上述疾病的诊断和鉴别诊断。本发明的优点是：将试剂分装于安瓿内，便于保存，性能稳定，重复性好，减轻了劳动强度，改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异，从而使操作规范化，使酶的检测及质量控制达到统一的标准，同时使用试剂盒简化了操作过程，省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用，为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。

实施例：

实施例1、做醋纤膜电泳，其包括有：

(1)、配制的电极液浓度为0.2mol/L的巴比妥缓冲液，pH为8.6；

(2)、配制浓度为0.05mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；

(3)、配制1N的碘液做为显色液，分装安瓿C；

(4)、将冰乙酸做为固定液分装安瓿D；

(5)、将1g淀粉、0.5g琼脂糖，加入100ml浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液，加热助溶，分装安瓿B。

应用：

首先泡膜：打开安瓿A加水至20ml，将醋纤膜泡在该液内20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色：取一玻璃板，将安瓿B加热溶解，趁热均匀倒在玻璃板上，冷却后即为显色胶板。将电泳后的醋纤膜点样面贴在显色胶板上，注意不要有气泡，然后放入37℃温育40分钟，取出。打开安瓿C，加水至10ml，将胶板放入该液内一分钟后，取出胶板，即可见同工酶区带。打开安瓿D加水100ml，在该液中固定5～10分钟。

结果：电泳分离淀粉酶同工酶，由阴极至阳极依次为P1、P2、P3、S1、S2、S3等同工酶，正常人以S1和P2为主带。胰腺疾患时P型淀粉酶同工酶活性增强，出现P3，是急性胰腺炎的特异带。肺癌、卵巢癌时，S型淀粉酶增强。实施例2、做醋纤膜电泳，其包括有：(1)、配制的电极液阴极槽电极液，浓度为0.03mol/L的巴比妥缓冲液，pH为8.4；阳极槽电极液浓度为0.26mol/LTEB，pH为8.4；(2)、配制浓度为0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、配制0.5N的碘液做为显色液，分装安瓿C；(4)、冰乙酸做为固定液分装安瓿D：(5)、将0.6g淀粉，1g琼脂糖，加入100ml浓度为0.06mol/L顺丁烯二酸-NaoH缓冲液，加热助溶，分装安瓿B。

其应用方法如实施例1所述，结果也相同。

实施例3、做醋纤膜电泳，其包括有：(1)、配制的电极液是浓度为0.06mol/L巴比妥-HCL缓冲液，PH为8.0；(2)、配制浓度为0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液做为泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A；(3)、配制0.5N的碘液做为显色液，分装安瓿C；(4)、冰乙酸做为固定液分装安瓿D；(5)、将0.2g淀粉，0.5g琼脂糖，加入80ml浓度为0.15mol/L顺丁烯二酸-NaoH缓冲液，加热助溶，分装安装瓿B。其应用方法如实施例1所述，结果也相同。

实施例4、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有：

(1)、配制的电极液是浓度为0.07mol/L的巴比妥冲液，PH为8.6；(2)、配制1N的碘液做为显色液，分装安瓿C；(3)、冰乙酸做为固定液分装安瓿D；(4)、将1g淀粉、0.8g琼脂再加入100ml浓度为0.08mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液中，加热溶解，趁热分装为安瓿A。

应用：将安瓿A隔水加热溶解，趁热浇在一玻璃板上，冷却后在距膜一端约2cm处放0.3×1cm的滤纸。约10分钟后取下滤纸，在该处加样8微升，放置5分钟。然后将凝胶板放在加好电极液的电泳槽架上，两端用4层纱布搭桥，电压100v，电泳30分钟，关闭电源。将胶板取出放在37℃温箱里温育40分钟，打开安瓿C，加水至100ml。将胶板在该液内放置1分钟后取出即可见同工酶显色带。

结果：电泳分离淀粉酶同工酶，由阴极至阳极依次为P1、P2、P3、S1、S2、S3等同功酶，正常人以S1和P2为主带。胰腺疾患时P型淀粉酶同工酶活性增强，出现P3，是急性胰腺炎的特异带。肺癌、卵巢癌时，S型淀粉酶增强。

实施例5、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有：(1)、配制的电极液是浓度为0.03mol/L的巴比妥-HCL缓冲液，PH为8.6；(2)、配制1N的碘液做为显色液，分装安瓿C；(3)、冰乙酸做为固定液分装安瓿D；(4)、将0.7g淀粉、0.6g琼脂加入80ml浓度为0.08mol/L顺丁烯二酸-NaoH缓冲液中，加热溶解，趁热分装为安瓿A。

应用同实施例4所述，结果也与实施例4相同。

实施例6、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有：(1)、配制的电极液是浓度为0.08mol/L的巴比妥-Hcl冲液，PH为8.6；(2)、配制1N的碘液做为显色液，分装安瓿C；(3)、冰乙酸做为固定液分装安瓿D；(4)、将0.3g淀粉、0.5g琼脂糖、0.5g聚乙烯吡咯烷酮、2g蔗糖加入90ml浓度为0.08mol/L顺丁烯二酸-NaoH缓冲液中，加热溶解，趁热分装为安瓿A。

应用同实施例4所述，结果也与实施例4相同。

Claims

1、一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，做醋纤膜电泳，其包括有：(1)、配制浓度为0.02～0.2mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)、配制浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液；(3)、将碘液做为显色液；(4)内装冰乙酸做为固定液，其特征在于：如(2)所述泡醋纤膜缓冲液分装安瓿A；如(3)所述显色液分装安瓿C；如(4)所述固定液分装安瓿D；(5)配制底物显色板：将琼脂糖或琼脂和做为底物的淀粉、缓冲液分装安瓿B，所述缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L，按重量百分比，其中所述淀粉和琼脂糖或琼脂分别为9.1％～70.6％，29.4％～91.0％，加入80～120ml缓冲液，加热溶解，分装安瓿B。

2、一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，做琼脂糖凝胶电泳，其包括有：(1)配制浓度为0.02～0.2mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)将碘液做为显色液；(3)内装冰乙酸做为固定液，其特征在于：如(2)所述的显色液分装安瓿C；如(3)所述的固定液分装安瓿D；(4)将淀粉、琼脂糖或琼脂按重量百分比，分别为9.1％～70.6％∶29.4％～91.0％，再加入60～100ml浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜的缓冲液中，加热溶解，制备为安瓿A。

3、根据权利要求(2)所述的一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿A中还可加入蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮，按重量百分比，蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂糖或琼脂分别为1.3％～31.6％，6.0％～31.2％，41.7％～89.5％，1.2％～18.7％，加入60～100ml浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜的缓冲液中，加热溶解，趁热分装为安瓿A。

4、根据权利要求(1)或(2)所述的一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述电极液可以用巴比妥缓冲液，也可以用巴比妥-HCL缓冲液，也可用硼酸-NaoH缓冲液或阴极槽电极液用巴比妥缓冲液，阳极槽电极液用Tris-EDTA-硼酸缓冲液。

5、根据权利要求(1)或(2)所述的一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述泡醋纤膜缓冲液可以为二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液，也可以为三羟甲基氨基甲烷系列的缓冲液。

6、根据权利要求(1)所述的一种淀粉酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿B内的缓冲液为磷酸缓冲液，也可用Tris系列的缓冲液或顺丁烯二酸-NaoH缓冲液。