CN1380081A - 含有仙茅与淫羊藿的中药制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药制剂技术领域。本发明公开了一种含有仙茅与淫羊藿的中药制剂(二仙颗粒)。该制剂主要由仙茅与淫羊藿等六味中药组成。本发明的制剂能用于治疗妇女更年期综合征,具有疗效好和副作用小的特点,并且服用方便,质量稳定,便于临床推广应用。本发明提供了制备方法。

Description

含有仙茅与淫羊藿的中药制剂及制备方法

技术领域

本发明属中药制剂技术领域。具体涉及一种含有仙茅与淫羊藿的中药制剂及制备方法。

背景技术

妇女的高发病，据统计有80％的妇女会罹患此病，其中30％的患者还严重影响到其生活和工作。随着人类社会老龄化的趋势，妇女约有三分之一的生命时间会在绝经期后渡过，更年期综合征还会波及老年期，引起诸多的老年病。对治疗该病，尤其是天然中药制剂有着极大的需求。二仙汤作为新中国上海中医方剂学发展的成就，几十年来，在国内外临床上得到广泛应用，报道近百篇，成为国内外中医界公认的治疗妇女更年期综合征的代表方。面临着我国老龄化社会的趋势，由于长期西药激素替代治疗会产生一定的副作用，以致临床上许多患者畏惧和拒绝激素替代疗法，给本研究展现出良好的前景和广阔的市场。因此，以纯天然中药制剂的二仙颗粒具有其独特的优势。

中医理论把更年期综合征的发病机制归结为肾精不足，冲任不调，相火偏旺。由上海著名中医专家张伯讷发明的二仙汤，补不足、泻有余，采用温肾益精养血的仙茅、淫羊藿(仙灵脾)、巴戟天、当归和滋阴泻相火的黄柏、知母等6味中药，具有补肾益精、调理冲任、滋阴泻火等作用。切中更年期综合征的基本病机，因而被国内外广泛用来治疗更年期综合征，并被收入全国统编教材，成为临床上治疗更年期综合征的代表方。

由于中药所固有的质量控制难题、煎煮中药的不便、具体药效途径不明朗，给二仙汤的普遍应用带来困难。

40多年来二仙汤的临床报道频繁，主要集中在更年期综合征(包括男性更年期综合征)，国外也有以二仙汤治愈更年期综合征的报道。其它如更年期高血压、更年期水肿、骨质疏松症、不孕、不育、阳萎、前列腺增生、癃闭、崩漏、乳腺增生、闭经、高泌乳素血征等，此外，涉及的病种还有颈椎病、腰脊椎增生、骨质增生、白细胞减少、再生性障碍性贫血、血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、关节炎、皮肤病、肾病综合征、甲状腺疾病、抑郁征等19种疾病和病症。

其特点是以内分泌系统紊乱为核心，旁及精神神经系统、免疫系统、骨代谢等等。这些病证集中代表了中医肾精亏虚证及其兼证和变证，也充分体现了中医辩证论治的特点和二仙汤组成配伍的独到优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是研制一种质量稳定，疗效好的治疗更年期综合症的中药制剂。

本发明提供了一种含有仙茅与淫羊藿的中药制剂(二仙颗粒)，该制剂是由仙茅、淫羊藿、八戟天、当归、知母六味药组成的活性成分与药用辅料组成的，其中药用辅料糊精的用量比例为活性成份的1∶1，甜菊糖为活性成份的1/1000。

本发明的制剂经动物实验研究情况如下：

(1)综合采用先进的生化、病理、电镜、放射性配基分析、高效液相等技术研究表明，基于更年期综合征是妇女在自然绝经前后卵巢功能紊乱和丧失所引起的症候群，项目组在以往实验的基础上采用20月龄雌、雄老年大鼠(相当于人类的更年期)和5月龄雌、雄去势大鼠为动物模型，采用病理、组织化学、电镜、生化(包括高效液相、受体放射配基测定)等技术，观察了二仙汤及其寒(滋阴泻相火药黄柏、知母)、温(温肾益精养血药仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归)两个拆方对下丘脑、垂体、性腺(去势大鼠为肾上腺)、性腺主要效应器官、血浆性激素和促性腺激素水平、24小时尿儿茶酚胺等的作用。研究结果表明：

①在大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的自然衰老过程中，下丘脑、垂体、性腺三个层次同时发生着衰老，其中，性腺的衰老，性激素水平的下降，增加了老年大鼠下丘脑、垂体的代偿、影响到下丘脑、垂体的功能，从而加速了下丘脑、垂体的紊乱和衰老。

②20月龄老年大鼠性腺衰老十分明显，性激素合成细胞的有关细胞器减少、退化，有关酶活性减弱；性腺的主要效应器官子宫、前列腺亦明显衰老。垂体GTH细胞减少，雄性大鼠还可见大量的印环细胞及含有印环的退化了的GTH细胞。下丘脑弓状核、视上核、室旁核亦出现退化。二仙汤及其拆方有不同的延缓下丘脑-垂体-性腺轴衰老的作用和增进该轴功能的双重药效，作用覆盖到该轴的各个层次。

③拆方的结果表明，滋阴泻火药延缓下丘脑-垂体性腺轴衰老的作用突出，而温肾益精药增强下丘脑-垂体-性腺轴的功能突出；对于雌性大鼠，滋阴泻火药有苦寒伤阳的倾向，而对于雄性大鼠，温肾益精药有助火生热、耗气伤阴的副作用。这一结果还初步揭示了温补、寒补的作用差异。

④二仙汤及其拆方具有改善去势大鼠下丘脑、腺垂体的代偿作用；使肾上腺网状带增厚，有关性激素合成酶活性增加，增进去势大鼠肾上腺网状带性激素的合成作用，其中以温肾益精药的作用最强。

⑤二仙汤，尤其是温肾益精药，有增进子宫、前列腺性激素受体的核向迁移作用，增加组织对性激素的利用。项目组推测这可能即是长期以来国内外学者观察到淫羊藿等中药具有类性激素样作用的机制所在。

⑥根据有关文献和项目组的实验结果，推测尿去甲肾上腺素与多巴胺的比值能较客观地反映中医火的本质，而不是以往所指的去甲肾上腺素或儿茶酚胺。

⑦本项目的研究为中医基础理论肾的精气、阴阳、天癸、相火的本质研究提供了丰富的实验数据。

(2)二仙汤及其拆方具有改善去势大鼠下丘脑、腺垂体的代偿作用；使肾上腺网状带增厚，有关性激素合成酶活性增加，增进去势大鼠肾上腺网状带性激素的合成作用，其中以温肾益精药的作用最强。其研究成果获1993年国家中医药管理局科技进步一等奖。

(3)二仙汤及其拆方对24月龄雌、雄老年大鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)基因转录与表达的作用

基于近年来我们对二仙汤及其寒温两个拆方对性腺轴不同环节的作用进行了一系列实验研究，显示出二仙汤及其寒温两个拆方有明显改善老年大鼠和去势大鼠血浆性激素(SH)和促性腺激素(GTH)水平，以及改善下丘脑、垂体等组织形态的老年性变化，我们推测二仙汤及其拆方对下丘脑GnRH基因转录与表达可能具有一定的调节作用。研究方法和实验结果如下：

采用SD大鼠，由上海中医药大学实验动物中心提供，随机分作8组：雌、雄老年对照组；雌、雄老年二仙汤组，饲以二仙汤全方；雌、雄老年温肾组，饲以仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归；雌、雄老年泻火组，饲以知母、黄柏。以上中药制成水煎剂，含单味中药8％，兑入自来水中自由饮用。雄鼠每只12ml/日，雌鼠每只8ml/日，剂量约为成人公斤体重的10倍。用药组自18月龄开始用药至24月龄。另设5月龄雌、雄青年对照组。

届时雌、雄大鼠均于上午9：00-11：00断头处死，各组交替进行。迅速开颅取脑，切取下丘脑，范围为：吻侧至前连合，尾侧至乳头体后部，外侧为下丘脑外侧沟，背侧至前连合水平高度。所取组织包括下丘脑底侧区，下丘脑前区和视前区。称重后置液氮中备用。迅速取出垂体，置于生理盐水中煮沸5min，去除后叶后称重，置于内有1ml 1mol盐酸的离心管中，用内切式匀浆器以1.8万r/min匀浆30s，然后3000r/min离心30min，取上清用0.1mol NaOH溶液中和，分装后置-40℃冰箱中待测。血清用于检测性激素和促性腺激素水平。

Northern杂交和定量分析。GnRH cDNA(462bp)由R.Steiner教授赠送，探针标记采用Promega公司核糖探针系统II试剂盒及其所附方法。一步法制备下丘脑总RNA，电泳，常规Northern blot杂交，显影后的X光片采用Phamarcia-LKB Ultroscan激光扫描光密度仪定量分析。

垂体GnRH含量的测定。GnRH RIA试剂盒，购自中国科学院动物研究所。测定方法按试剂盒所附说明。

结果表明，雌、雄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA水平较青年大鼠明显降低(P＜0.001)。雌性泻火组和全方组GnRH mRNA水平明显升高(P＜0.05)，温肾组有升高倾向。雄性各用药组GnRH mRNA水平有不同程度的升高(P＜0.05-0.01)，其中以全方组作用最大(P＜0.01)。对照肝组织RNA中没有检测到GnRH mRNA。详见表1。表1  各组雌、雄下丘脑GnRH mRNA含量(吸收率，Noethern杂交)比较(M±S)组  别  例数(雌)  GnRH mRNA     例数(雄)  GnRH mRNA青年组    10     11.97±2.71^***   10    10.28±4.15^***老年组    9      5.98±2.14        9     4.07±1.82全方组    9      8.04±1.82^*      9     8.24±3.52^**泻火组    8      9.71±3.65^*      8     6.55±2.69^*温肾组    9      6.98±2.64        9     7.19±2.73^*

与老年组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

雌鼠各组腺垂体GnRH总含量无明显变化。老年组腺垂体GnRH单位含量明显低于青年组(P＜0.02)，泻火组与全方组腺垂体GnRH单位含量显著升高(P＜0.05)，温肾组有升高倾向。详见表2。表2各组雌性大鼠腺垂体GnRH含量及单位含量比较(M±S)组  别   例数   GnRH(pg/只)     GnRH(pg/mg)青年组    14    75.73±50.36    5.54±3.56^**老年组    11    59.45±43.92    2.45±1.02全方组    12    78.84±44.01    3.98±1.88^*泻火组    8     83.62±38.11    4.05±2.04^*温肾组    10    106.93±77.69   3.30±1.08

与老年组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.02。

雄鼠各组腺垂体GnRH总含量无明显变化。老年组腺垂体GnRH单位含量明显低于青年组(P＜0.02)，各用药组均能显著升高腺垂体GnRH单位含量，作用大小依次为全方组(P＜0.02)，泻火组和温肾组(P＜0.05)。详见表3。表3  各组雄性大鼠腺垂体GnRH含量及单位含量比较(M±S)组  别   例数    GnRH(pg/只)    GnRH(pg/mg)青年组    13    72.63±35.21    6.73±2.97^**老年组    13    55.62±33.48    3.98±2.02全方组    12    89.34±40.37^*  7.13±3.60^**泻火组    8     74.43±38.79    6.11±2.71^*温肾组    10    72.76±31.65    5.42±1.11^*

与老年组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.02。

以上结果提示：

①24月龄雌、雄老年大鼠下丘脑GnRH基因转录与表达水平下降，垂体GnRH含量有下降倾向，GnRH单位含量下降。说明该龄大鼠下丘脑GnRH神经元的活动能力已经下降，加重了生殖系统的衰退。这符合我们以往作出20月龄大鼠下丘脑出现失代偿的推测，随着大鼠月龄进一步地增长，下丘脑GnRH神经原合成GnRH的能力进一步下降。

②青年和老年雌性大鼠下丘脑GnRH mRNA水平均略高于同龄雄性大鼠，这与Jakubowski等人的报道相似。

③二仙汤的寒、温两个拆方均有提高雌、雄老年大鼠下丘脑GnRH基因转录与表达水平，证实了古代文献有关这两类药物具有提高生殖机能作用的记载，但鉴于这两类药物的药性不同，其可能存在的药理差异有待进一步的研究给予证实。

④二仙汤及其拆方有提高雌、雄老年大鼠下丘脑GnRH基因的转录水平，提高腺垂体GnRH的单位含量，再次证实了我们以往的推测，即二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与该方延缓下丘脑衰老，提高其GnRH转录与表达水平有关。

(4)二仙汤对18月龄大鼠下丘脑内阿片肽基因转录与表达调控的研究

现代研究表明，更年期综合征的性激素水平变化、精神神经症状、植物神经症状与内源性阿片肽的代谢改变有关。鉴此，我们对18月龄大鼠下丘脑内阿片肽含量及其mRNA转录水平进行检测，同时观察了不同剂量二仙汤的作用异同。研究方法和结果如下：

采用雌性SD大鼠80只，随机分作4组，每组1 0只用于基因转录水平检测，另10只用于其它指标测定。分组为青年对照组(5月龄)，正常饮水；老年前期对照组(18月龄)，正常饮水；二仙汤10倍用药组(18月龄)，饲以二仙汤，剂量为成人公斤体重的10倍；二仙汤30倍用药组(18月龄)，饲以二仙汤，剂量为成人公斤体重的30倍。各用药组大鼠饲养至15月龄开始用药，共计3个月，至18月龄时，断头处死，取血、下丘脑、垂体备用。

主要指标和方法如下：

下丘脑β-内啡肽前体POMC基因mRNA水平。探针POMC-pSP65-1由Watson SJ教授提供，POMC基因片段为923bp，插入位点为EcoR I/Hind III。采用Northern Blot法。

下丘脑脑啡肽前体Proenkephalin基因mRNA水平。探针3’-GGGCACCTCGGTCTTCTTCTCCGGTTACCT-5’，合成于上海生化所。采用Northem Blot法。

下丘脑、垂体、血浆β-内啡肽、强啡肽、脑啡肽含量采用放免法。试剂盒购于第二军医大学，方法参试剂盒所附方法。

下丘脑、垂体、血浆GnRH含量测定采用中科院动物所试剂盒及其所附方法。

血清LH、FSH含量测定采用卫生部上海生物制品研究所试剂盒及其所附方法。血清E₂含量测定采用天津DPC公司进口放免试剂盒及其所附方法。

结果表明，老年前期组(以下简称老前组)大鼠下丘脑和血浆GnRH含量明显升高，GnRH含量降低，与青年组相比差异显著(P＜0.05)。两个剂量的中药组GnRH含量恢复到青年组水平，小剂量组垂体GnRH含量升至青年组水平。各用药组血浆GnRH含量均下降，作用以小剂量组为突出(P＜0.05)，接近青年组。表4  二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑、垂体和血浆GnRH含量的作用(M±S)

组  别        下丘脑(pg/mg组织)    垂体(pg/mg组织)    血浆(pg/ml)

青年组        48.99±19.93(8)^*    0.70±0.17(7)^**   3.69±0.75(19)^*

老前组        58.59±14.10(7)^Δ   0.25±0.08(7)^Δ   6.15±1.62(9)^Δ

二仙汤10倍组  46.89±14.07(10)^**  0.76±0.16(9)^**   4.78±1.03(9)^*

二仙汤30倍组  48.49±3.95(9)^*     0.16±0.01(8)^ΔΔ  5.76±1.04(9)^Δ与老年组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；  与青年组比较^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01；()内数字为实际动物例数；下表同。

老前组大鼠血清FSH、LH含量明显升高(P＜0.05)。两个剂量的中药组含量下降(P＜0.05)，接近青年组。表5二仙汤对18月龄雌性大鼠血清LH和FSH含量的作用(M±S)

组  别              LH             FSH

青年组          2.28±0.63^*    2.11±0.45

老前组          3.23±0.54^Δ   3.86±0.61^Δ

二仙汤10倍组    2.66±0.69^*    1.83±0.28^*

二仙汤30倍组    2.70±0.22^*    1.71±0.25^**

老前组大鼠E₂含量明显低于青年组(P＜0.05)。两个用药组E₂水平明显上升(P＜0.05)。老前组血清T含量上升(P＜0.05)，用药组下降，但无统计意义。表6  二仙汤对18月龄雌性大鼠E₂、T含量的作用(M±S)

组  别                E₂               T

青年组          245.24±20.74^*    94.69±19.54^*

老前组          106.33±38.80^Δ   137.73±84.65^Δ

二仙汤10倍组    171.40±79.57^*    100.65±25.86

二仙汤30倍组    139.77±68.49^*    109.65±26.21

老前组大鼠下丘脑POMC和Proenkephalin mRNA转录水平明显低于青年组(P＜0.05)，两个用药组水平升高(P＜0.01，P＜0.05)，达到青年组水平。表7  二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑POMC和Proenkephalin mRNA转录的作

用(M±S)

组  别       例数       POMC         Proenkephalin

青年组        10    25.62±2.29^*    25.43±2.77^*

老前组        10    15.75±3.10^Δ   18.10±3.76^Δ

二仙汤10倍组  10    35.31±6.96^**Δ 30.91±1.73^**

二仙汤30倍组  10    23.32±3.48^*    25.56±2.46^*

与青年组比较，老前组大鼠下丘脑、垂体和血浆β-EP、L-ENK和DynA_1～13含量明显降低，垂体β-EP、L-ENK含量升高，DynA_1～13含量下降。二仙汤两个用药组下丘脑和血浆β-EP、L-ENK含量上升，垂体β-EP含量下降，L-ENK含量上升；下丘脑DynA_1～13含量降低，垂体和血浆DynA_1～13增加。详见表8-10。表8  二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑和血浆β-EP含量的作用(M±S)

组  别         下丘脑(pg/mg组织)    垂体(ng/mg组织)     血浆(pg/ml)

青年组          64.1±18.0(9)^*      20.3±1.9(9)^*   351.6±37.2(9)^*

老前组          34.9±10.7(8)^Δ     60.9±5.2(9)^Δ  233.2±18.0(8)^Δ

二仙汤10倍组    106.1±18.7(9)^**Δ  27.1±1.4(9)^*   253.3±9.3(8)^Δ

二仙汤30倍组    99.8±21.9(9)^**Δ   27.5±3.5(9)^*   174.3±17.2(7)^Δ表9  二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑、垂体和血浆L-ENK含量的作用(M±S)

组  别         下丘脑(pg/mg组织)    垂体(pg/mg组织)      血浆(ng/ml)

青年组          262.6±74.0(9)^*    234.6±17.2(8)^*    10.1±0.7(7)^*

老前组          166.0±19.6(8)^Δ   324.2±87.5(8)^Δ   2.5±0.2(8)^ΔΔ

二仙汤10倍组    324.2±26.2(9)^**   341.6±24.5(8)^Δ   4.4±0.7(8)^*Δ

二仙汤30倍组    185.5±45.2(9)      390.1±23.0(8)^Δ   1.1±0.1(8)^*ΔΔ表10  二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑、垂体和血浆DynA_1～13含量的作用

(M±S)

组  别     下丘脑(pg/mg组织)   垂体(pg/mg组织)    血浆(pg/ml)青年组          42.2±13.0(8)^*    185.7±30.0(9)^*   400.0±38.9(9)^*老前组          19.4±2.4(9)^Δ    63.6±18.8(9)^Δ   294.4±38.1(7)^ΔΔ二仙汤10倍组    8.8±2.9(9)^*ΔΔ  183.4±40.7(9)^**  437.2±54.0(8)^*二仙汤30倍组    10.5±4.9(9)^*Δ   113.4±14.0(8)^*   326.3±21.0(8)

以上结果提示：

①18月龄大鼠下丘脑内源性阿片肽阿黑皮素原(POMC)和脑啡肽原(PEN)基因转录水平下降，其表达产物β-内啡肽(β-EP)及亮氨酸脑啡肽(L-ENK)亦下降。与同龄大鼠下丘脑、血浆GnRH含量升高不一致，但与垂体GnRH含量下降一致。其中可能蕴涵着复杂的性激素对下丘脑内源性阿片肽、GnRH的转录、表达的复杂的反馈调控作用，对下丘脑GnRH合成与频率性释放的复杂的反馈与调控。

②二仙汤对18月龄大鼠下丘脑POMC、PEN基因转录水平及其表达产物β-EP、L-ENK的下降有回升作用，并纠正了同龄大鼠下丘脑、血浆GnRH含量改变，向青年组靠拢。

③本项目首次阐明了二仙汤10倍中药剂量优于30倍剂量，表明二仙汤在治疗更年期综合症时，其使用剂量有着严格的要求。

(5)二仙汤及其拆方对老年大鼠部分抗氧化酶活性及其基因转录作用的研究

多种抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性随增龄而降低，以致清除自由基的能力下降，成为细胞、组织功能减退、衰老的重要因素。我们以往的研究表明，二仙汤具有延长果蝇的寿命和提高老年大鼠抗氧化酶活性的作用，推测与二仙汤的药效有一定的关系，而且可能与二仙汤直接调节老年大鼠抗氧化酶基因转录与表达作用有关。鉴此，我们对24月龄大鼠肝脏SOD、CAT含量及其mRNA转录水平进行检测，同时观察了肝脏过氧化脂质(LPO)的含量。

采用雌、雄SD大鼠，随机分作8组，雌、雄老年对照组(20只)、雌、雄老年二仙汤全方组(18只)、雌、雄老年滋阴泻火组(20只)、雌、雄老年温肾益精组(20只)。老年对照组(24月龄)，正常饮水；雌、雄老年二仙汤全方组，饲以二仙汤；雌、雄老年滋阴泻火组，饲以知母、黄柏；雌、雄老年温肾益精组，饲以仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归。中药水煎剂，剂量为成人公斤体重的10倍。从18月龄用药至24月龄。届时断头处死，取肝脏备用。另设青年对照组(22只)，正常饮水，至6月龄一并处死。

主要指标和方法如下：

肝组织匀浆SOD活性，参照杨竞平(1987)、周之辉(1991)等人的方法。

肝组织匀浆CAT活性，参照姜招峰(1989)等人的方法，并略加改进。

肝组织匀浆LPO含量，参照大石诚子(1978)等人的方法。

肝组织SOD、CAT mRNA转录水平的测定，参照Piotr(1987)等人的方法制备总RNA，采用Northern blot法，SOD和CAT探针购自美国ATCC公司。放射自显影结果采用激光光密度计扫描定量。

结果表明：与青年组相比，雌、雄老年组大鼠肝脏SOD、CAT活性均见下降(P＜0.01)，而LPO含量明显升高(P＜0.01)。饲以二仙汤及其拆方后SOD、CAT的活性均见上升，其中除雄性温肾组无统计意义外，其余各组P值在0.05-0.01之间，其中以二仙汤作用最强。与此相应，LPO含量，雌、雄老年组与青年组相比显著升高(P＜0.01)，各用药组均见下降，其中仍以二仙汤全方作用最好。表11  二仙汤及其拆方对老龄雌性大鼠肝脏SOD、CAT活性和LPO含量的作用

(M±S)

组  别   例数   SOD活性(u/mg)      CAT活性(u/mg)      LPO含量(uM/g)

青年组    11    612.09±54.13^**   71.72±7.67^**     1.09±0.16^**

老年组    10    496.20±43.19^ΔΔ 48.20±10.81^ΔΔ  1.42±0.16^ΔΔ

全方组    9     585.40±63.16^**   66.31±5.33^**     1.14±0.15^**

泻火组    10    566.53±42.14^**   61.95±6.77^Δ**   1.21±0.16^*

温肾组    10    544.70±43.92^**   58.27±77.31^ΔΔ**1.22±0.18^**与老年组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与青年组比较^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01；下表同。表12  二仙汤及其拆方对老龄雄性大鼠肝脏SOD、CAT活性和LPO含量的作用

(M±S)

组  别   例数   SOD活性(u/mg)      CAT活性(u/mg)       LPO含量(uM/g)

青年组    11    626.66±54.97^**   73.66±8.40^**      1.05±0.18^**

老年组    10    487.31±57.97^ΔΔ 50.09±10.14^ΔΔ   1.41±0.14^ΔΔ

全方组    9     570.00±56.39^Δ** 67.48±6.03^**      1.12±0.17^**

泻火组    10    551.10±47.96^ΔΔ*63.06±7.37^Δ**    1.19±0.17^*

温肾组    10    535.83±52.63^ΔΔ 60.31±6.17^Δ**    1.24±0.17^*

Northern blot的结果表明，老年大鼠肝脏SOD、CAT mRNA转录水平下降，与青年组相比差异显著(P＜0.01)。饲以二仙汤及其拆方后，老年大鼠肝脏SOD、CAT mRNA转录水平均见升高(P＜0.05-0.01)，三个用药组中仍以二仙汤全方的作用最强。

比较SOD、CAT的活性及其基因转录水平，两者呈一致性，提示用药组SOD、CAT活性的上升与其基因转录水平水平上升有关。表13  二仙汤及其拆方对老龄大鼠肝脏SOD、CAT mRNA转录水平的作用

(M±S)组  别 例数    SOD mRNA       例数   CAT mRNA青年组  7    2.51±0.38^**     8    2.14±0.37^**老年组  7    1.29±0.51^ΔΔ   8    0.84±0.26^ΔΔ全方组  7    2.12±0.17^**     8    1.77±0.44^**泻火组  7    1.86±0.40^Δ*    8    1.62±0.47^Δ*温肾组  7    1.83±0.47^Δ*    8    1.43±0.47^ΔΔ**

以上结果提示：

①24月龄雌、雄老年大鼠肝脏SOD、CAT基因转录与表达水平下降。说明该龄大鼠肝脏功能已经下降，与生殖系统的衰退的现象一致。

②二仙汤的寒、温两个拆方均有提高雌、雄老年大鼠肝脏SOD、CAT基因转录与表达水平，与二仙汤及其拆方提高生殖机能作用的现象一致。

③二仙汤拆方的结果，似以滋阴泻火药为佳，但两者差别不大。鉴于两个拆方的药性存在很大差异，其作用途径和机制的差异有待进一步研究。

本发明的制剂二仙汤由温肾益精养血药仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归和滋阴泻相火药知母、黄柏等两个部分，6味药组成，具有补肾益精、调理冲任、滋阴泻火等作用。由于该方以仙茅、淫羊藿(淫羊藿)为君，故以二仙汤定其名。

本发明制剂的功能：

温肾阳、补肾精、泻相火、调冲任。

主治：

更年期综合征见有肾精不足(可见腰酸、膝软、尿频、头晕、目眩、耳鸣、神萎、脉沉细)和相火旺(可见烘热、汗出、五心烦热、烦燥易怒、口干、便艰、失眠多梦、舌红、虚火上炎)。

病因病机：

更年期综合征发生于妇女年龄七七前后，此时病因病机的基本特点为肾精不足，冲任不调，相火偏旺。

治法：

补不足、泻有余。即补肾益精、滋阴泻火、调理冲任。

方解：

根据中医药理论，二仙颗粒剂的配伍参合如下：

仙茅，辛平微温，气味具厚，阴中之阳药，直入命门，补肝肾之不足，温壮元阳；淫阳藿，辛寒味甘，阴中之阳药，直入命门，补肝肾之阴精不足。此二药，一温壮元阳，一补益阴精，为本方之君药。巴戟天，臣，辛甘微温，直入肾经血分，温养肝肾之精血，辅助仙茅、淫阳藿，为本方之臣药。

黄柏、知母，具为苦寒之品，气味具厚，沉而下降之药，直入下焦，滋养真水，泻相火而不使虚阳上亢，与仙茅、淫阳藿等同用，可以抑制其上升的作用，令其阳强而潜密，取其大补真阴，使阴涵阳，为本方之佐药。

当归，辛甘苦温，为活血、养血之要药，尤为调理冲任的要药。能统领诸血各归其经。为本方之使药。

总之，二仙汤的主要性能是补肝肾之精气不足，温养肾阳真火，而使火涵水中，弗与上炎，泻有余的肝阳相火，纳无根之火下潜，而达到治疗目的。

本发明制剂的药效学研究结果如下：

依据更年期综合征源于卵巢功能的减退与紊乱，主要观察了二仙颗粒剂对性腺轴的作用。结果表明：

对于雌性大鼠，二仙颗粒能延缓卵巢衰老，使大鼠血浆E2增多。其中以二仙颗粒10倍、20倍组效果最显著。二仙颗粒各用药组均使血浆LH含量下降，其中以5倍、10倍组结果最显著。

形态学研究表明，二仙颗粒不同剂量组子宫重与卵巢重比值，各治疗组均大于老年组与治对组，则提示18月龄大鼠在饲以二仙颗粒后卵巢合成性激素的能力得到加强。二仙颗粒不同剂量均有增加子宫重量、子宫内膜上皮细胞高度，和子宫腺体数的作用。其中以5倍剂量组和10倍剂量组作用尤为突出。

对于雄性大鼠，二仙颗粒剂能延缓老年大鼠间质细胞衰老和增强其功能，使血浆T含量升高。二仙颗粒10倍组能抑制老年大鼠垂体代偿性增加引起的LH分泌增多。

老年大鼠，E2含量下降而Tch含量上升，并且HDL-ch含量及HDL-ch/Tch比值下降，二仙颗粒不同剂量组对老年雌性大鼠的这些变化均有不同程度的纠正作用，其中以10倍组最为明显。说明：二仙颗粒在治疗更年期综合征的同时，还有纠正脂代谢紊乱，防止冠心病发作的作用。

通过与镇静药安定比较表明，二仙颗粒治疗更年期综合征的作用，不是通过类似安定样的镇静而起作用的。

本发明制剂的毒理学研究结果如下：

急性毒性试验：

采用与临床相同的给药途径，小鼠口服二仙颗粒剂最大给药量为128.8g生药/kg，相当于人临床用量的107倍，未见明显毒副反应。

长期毒性试验：

用二仙颗粒剂给大鼠灌胃给药，在相当于临床剂量50、25、10倍三个剂量组连续给药四个月的情况下，动物体重、进食量、血液学、血液生化学和病理学检查均未发现与给药有关的明显异常，动物外观健康活泼，未见与药物明显相关的毒性作用。

本发明制剂的临床研究结果如下：

病历选择标准

①诊断标准

a.中医诊断标准(根据《中医方剂临床手册》二仙汤条)：

肾虚相火旺：月经不调，时而烘热汗出，烦燥易怒，头晕耳鸣，腰酸乏力，舌苔薄，脉细。

b.西医诊断标准：

a)绝经期妇女。

b)自然绝经一年以上至绝经后3年以内，不得超过5年。

c)有更年期症状者。

c.中医辨证

a)符合西医诊断标准。

b)肾虚：腰酸，膝软，尿频，头晕，目眩，耳鸣，神萎肢冷，脉沉细。

c)相火旺：烘热，汗出，五心烦热，烦燥易怒，口干，便艰，失眠多梦，舌红。

②试验病例标准

a.纳入病例标准：同上。

b.排除病例标准：

a)3个月内服用甾体激素类药物者；

b)3个月服用钙剂，维生素D及影响脂代谢的药物者；

c)其它器官急慢性疾病，尤其乳房恶性肿瘤者；

d)B超检查子宫肌瘤大于2cm，以及子宫卵巢切除者；

e)有血栓史。

观察指标：

①安全性观察

a.一般体检项目：

体重，血压，心、肺、肝、脾检查，妇科检查，乳房检查。

b.B超(包括子宫和卵巢大小、子宫内膜厚度、宫腔内有无病变)。

c.心电图。

②疗效性观察

a.症状：烘热、汗出、心烦、易怒、失眠、头晕、耳鸣、皮肤虫咬感、口干、口苦、大便干结、腰酸、四肢酸痛、舌苔、脉象。

b.血浆性激素FSH，LH，E₂。

c.脂代谢：总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)——测定前三天服素食。

以上在治疗前后均进行各项指标的测定及症状评分。其中症状每一个月比较一次，实验室检查作治疗前后对照。

疗效判定标准

①临床控制：症状完全消失，脂代谢，激素测定等接近正常范围。

②显效：症状消失2/3，各项评分平均减少1分，脂代谢、激素测定与正常值统计学无差异。

③有效：症状消失1/2，各项评分平均减少1-2分。

④无效。

临床试验及疗程

病例选择：

参照以上标准二仙颗粒用药组30例，西药对照组30例。

用药组：

二仙颗粒1袋(7克)，每日二次，2个月为一个疗程(上海中医药大学附属医院协定处方)。

西药对照：

倍美力0.625g，顿服，2个月为一个疗程。取效后减为维持量。

统计学处理采用t检验比较。

研究结果

①资料齐全有效的病例记录39份。其中45岁以下者5例，45-50岁者16例，50以上者18例。疗效中西药接近，具体见表14。表14  疗效统计统计结果         中药组n＝19             西药组n＝20

        治疗1月后  治疗2月后    治疗1月后    治疗2月后显效        41.18％    94.12％       47.36％      73.68％有效        47.06％    5.88％        52.63％      26.32％无效        11.76％    0             0            0

②治疗后总体症状评分。见表15，可见用药一个月以后和两个月以后，与患者治疗前比较症状均有所改善，差异具有显著性(P＜0.01)，服药两个月与一个月比较差异也均有显著性(P＜0.01)。表15  中西药总体症状比较(M±SD)

       例数      初诊           服药一月         服药二月倍美力      20    17.47±6.48    10.05±5.22^**   5.10±3.99^**##二仙颗粒    19    19.11±4.22    10.58±5.16^**   4.76±3.17^**##

^**  与初诊比较P＜0.01    ##与服药一月比较P＜0.01。

③治疗后各症状评分。见表16，17。可见二仙颗粒剂对更年期综合征各症状均有所改善，优于倍美力组，除皮肤虫咬感一症状外，其它症状差异具有显著性(P＜0.01)且治疗两个月后较一个月具有显著性差异(P＜0.01)。表16  倍美力组各症状改善情况(M±SD)症状     例数   治疗前      治疗后一个月     治疗后二个月烘热        20  2.78±0.41    1.42±0.76^**   0.57±0.76^**##汗出        20  2.52±0.96    1.16±0.83^**   0.53±0.77^**#心烦易怒    20  2.31±0.88    1.36±0.83^**   0.68±0.74^**#失眠        20  1.73±1.24    1±0.94^*       0.42±0.60^**#头晕耳鸣    20  1.52±1.07    1±0.94         0.52±0.77^**皮肤虫咬感  20  0.42±0.83    0.26±0.56      0.11±0.31口干口苦    20  1.84±1.11    1.10±0.99^*    0.47±0.69^**#大便干结    20  1±1.24       0.84±1.16      0.57±1.01腰酸        20  1.84±1.01    0.89±0.87^**   0.57±0.69^**四肢酸痛    20  1.84±1.11    1.05±0.91^*    0.53±0.77^**

^*与治疗前比较P＜0.05，^**与治疗前比较P＜0.01，

#与服药一月比较P＜0.05，##与服药一月比较P＜0.01。表17  二仙颗粒组各症状改善情况(M±SD)症状     例数    治疗前     治疗后一个月    治疗后二个月烘热        19  2.78±0.41    1.42±0.76^**   0.57±0.76^**##汗出        19  2.29±1.10    1.23±0.90^**   0.59±0.62^**#心烦易怒    19  2.59±0.71    1.59±0.87^**   0.52±0.51^**##失眠        19  2.17±0.80    1.17±0.80^**   0.47±0.62^**##头晕耳鸣    19  1.47±1.17    0.64±0.78^*    0.29±0.58^**皮肤虫咬感  19  0.94±1.02    0.52±0.71      0.23±0.43^*口干口苦    19  2.05±0.89    1.17±0.88^**   0.64±0.70^**大便干结    19  1.41±1.22    0.64±0.93^*    0.35±0.60^**腰酸        19  1.76±1.09    1.11±1.16      0.52±0.71^**四肢酸痛    19  1.88±1.05    1.05±0.82      0.47±0.62^**#^*与治疗前比较P＜0.05，^**与治疗前比较P＜0.01，#与服药一月比较P＜0.05，##与服药一月比较P＜0.01。

④血浆性激素测定，除西药组E₂外(P＜0.05)，中西药对其它激素作用无统计意义。同样中西药对脂代谢作用无统计意义。见表18、表19：

 表18  倍美力指标测定(M±SD)指标名称    例数     治疗前          治疗后FSH          20    58.85±30.92   40.30±30.84LH           20    41.2±21.54    28.47±21.79E2           20    33.10±34.19   64.36±52.58*TC           20    5.48±1.67     4.88±1.01TG           20    0.9±0.91      0.73±0.86HDL          20    1.60±0.75     1.98±2.58LDL          20    2.37±1.14     2.32±1.56

*与治疗前比较P＜0.05。表19  二仙颗粒指标测定(M±SD)指标名称    例数      治疗前          治疗后FSH          19    64.40±29.50    59.84±31.15LH           19    43.66±26.30    40.91±22.48E2           19    20.42±27.60    41.65±54.54TC           19    4.78±1.69      5.09±1.43TG           19    1.45±0.63      1.20±0.69HDL          19    1.47±0.64      1.45±1.78LDL          19    2.79±1.12      2.92±1.28

以上研究表明，中药二仙颗粒剂具有显著改善更年期综合征的症状。经与西药对照发现：中药组，治疗1月后，显效占41.18％，有效占47.06％，无效占11.76％；治疗2月后，显效占94.12％，有效占5.88％，无效者为0。相比之下，两个月的疗效较西药显效73.68％，有效26.32％为佳。提示中药二仙颗粒剂对于改善临床症状优势突出。关于激素水平。更年期综合征源于卵巢功能的减退与紊乱，二仙颗粒能延缓卵巢衰老，使血浆E₂含量增加。鉴于妇女更年期个体差异较大，血浆E₂含量离散度大，没有统计意义，但是其提高的幅度与西药倍美力接近。其余激素指标也有类似的变化。提示二仙颗粒的疗效发挥与该颗粒改善激素水平有关。

本发明的另一目的是提供了上述含有仙茅与淫羊藿的中药制剂的制备方法，该方法是将仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煮沸1小时，第二次加6倍量水，煎煮30分钟，合并煎出液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.125～1.30(50℃～60℃)。冷却至室温，加入乙醇使含醇量达60％搅匀，静置48小时，取上清液，减压回收乙醇(温度：65℃，蒸汽压力0.1kg，真空0.08Mpa)，浓缩得清膏[相对密度1.35～1.40(50℃～62℃)]。取清膏一份、糊精一份及甜菊糖适量，制成颗粒，干燥，即得。

质量标准：

[规格]每袋7克。

[性状]本品为黄棕色颗粒，味甜，微苦。

[鉴别]仙茅苷、巴戟天药材、菝葜皂苷元、阿魏酸、小檗碱。

[检查]应符合中国药典2000版(附录IC)中颗粒剂(冲剂)

      下各项规定。

[含量测定]照高效液相色谱法(中国药典2000版附录)测定。

本品每克含淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)不得少于1.2mg。

药品稳定性实验：通过3个月的检测，二仙颗粒的性状；仙茅、巴戟天、知母、当归、黄柏等鉴别(TLC)同质量标准；淫羊霍苷同质量标准，无明显减少；粒度、水分、溶化性、装量差异同质量标准；卫生学检查：细菌、霉菌、致病菌、活螨同质量标准。

由于本发明的制剂来源于天然植物药物，没有激素那种明显的副作用，因而有着明显的优势。该颗粒剂继承了二仙汤在治疗妇女更年期综合征方面疗效好和副作用小的优点，同时剂型改良后具有饮用方便、质量稳定的特性，便于临床推广应用。

附图说明

图1  青年大鼠卵巢(光镜)

可见各不同发育阶段的卵泡，黄体体积大而密。

图2  老年大鼠卵巢(光镜)

卵泡罕见，黄体体积小而少。

图3  二仙汤大鼠卵巢(光镜)

与老年卵巢比较，各不同发育阶段的卵泡增加，黄体数量增加，体积增大。

图4  青年大鼠卵巢间质细胞(电镜)

细胞核核仁明显，细胞核不规则椭圆形，由散在的染色质。细胞浆内可以见到丰富的滑面内质网，线粒体丰富。

图5  老年大鼠卵巢间质细胞(电镜)

核仁不明显，胞浆内出现大量的脂滴，线粒体数量减少和变性，滑面内质网减少。

图6  二仙汤大鼠卵巢间质细胞(电镜)

与老年卵巢比较，线粒体数量增加，结构完好，滑面内质网增加。

图7  青年大鼠卵巢(光镜)

可见大量的黄体，3β-类固醇脱氢酶活性强(组织化学染色呈深蓝色颗粒)。

图8  老年大鼠卵巢(光镜)

黄体萎缩，3β-类固醇脱氢酶活性减弱。

图9  二仙汤大鼠卵巢(光镜)

与老年卵巢比较，黄体数量增加，3β-类固醇脱氢酶活性增强。

图10  青年大鼠子宫(光镜)

肌层饱满丰厚，子宫内膜丰厚，充满内膜腺体，内膜上皮呈高柱状。

图11  老年大鼠子宫(光镜)

肌层变薄，子宫内膜呈玻璃样变，内膜腺体基本消失，内膜上皮萎缩，出现鲮状上皮样变。

图12  二仙汤大鼠子宫(光镜)

与老年卵巢比较，肌层增厚，子宫内膜细胞数量增加，可见内膜腺体，内膜上皮呈柱状，未见鲮状上皮样变。

图13  青年大鼠子宫(光镜)

内膜上皮呈高柱状。

图14  老年大鼠子宫(光镜)

内膜上皮萎缩，出现鲮状上皮样变。

图15  二仙汤大鼠子宫(光镜)

与老年卵巢比较，内膜上皮呈柱状，未见鲮状上皮样变。

图16  青年大鼠子宫内膜(光镜)

内膜上皮呈高柱状，内膜上皮下部含有丰富的糖原，PAS染色呈红色。

图17  老年大鼠子宫内膜(光镜)

内膜上皮萎缩，内膜上皮下部糖原消失。

图18  二仙汤大鼠子宫内膜(光镜)

与老年卵巢比较，内膜上皮呈柱状，内膜上皮下部含有部分糖原，PAS染色呈红色。

具体实施方式

将仙茅、淫羊藿等药物10000克，加水煎煮两次，第一次加100000ml水，煮沸1小时，第二次加60000ml水，煎煮30分钟，合并煎出液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.125～1.30(50℃～60℃)。冷却至室温，测得总容积，再加入乙醇使含醇量达60％搅匀，静置48小时，取上清液，减压回收乙醇(温度：65℃，蒸汽压力0.1kg，真空0.08Mpa)，浓缩得清膏，测得相对密度约为1.35～1.40(50℃～62℃)。取清膏一份、糊精一份及甜菊糖适量，制成颗粒，干燥。

Claims (2)

1.一种含有仙茅与淫羊藿的中药制剂，其特征在于该中药制剂是由仙茅、淫羊藿、八戟天、当归、知母六味药组成的活性成分与药用辅料组成的，其中药用辅料糊精的用量比例为活性成份的1∶1，甜菊糖为活性成份的1/1000。

2.一种如权利要求1所述的一种含有仙茅与淫羊藿的中药制剂的制备方法，其特征在于该方法是将仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煮沸1小时，第二次加6倍量水，煎煮30分钟，合并煎出液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.125～1.30，50℃～60℃，冷却至室温，加入乙醇使含醇量达60％搅匀，静置48小时，取上清液，减压回收乙醇，温度：65℃，蒸汽压力0.1kg，真空0.08Mpa，浓缩得清膏，相对密度1.35～1.40，50℃～62℃，取清膏一份、糊精一份及甜菊糖适量，制成颗粒，干燥，即得；

质量标准：

规格：每袋7克

性状：本品为黄棕色颗粒，味甜，微苦

鉴别：仙茅苷、巴戟天药材、菝葜皂苷元、阿魏酸、小檗碱

检查：应符合中国药典2000版附录IC中颗粒剂——冲剂

      下各项规定

含量测定：中国药典2000版附录，照高效液相色谱法测定

本品每克含淫羊藿苷C₃₃H₄₀O₁₅不得少于1.2mg；

药品稳定性实验：通过3个月的检测，二仙颗粒的性状；仙茅、巴戟天、知母、当归、黄柏等鉴别TLC同质量标准；淫羊霍苷同质量标准，无明显减少；粒度、水分、溶化性、装量差异同质量标准；卫生学检查：细菌、霉菌、致病菌、活螨同质量标准。

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