CN1377423A - 筛选用纤维素膜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有微原纤维化纤维素的纤维素膜及其在筛选生物化合物中的应用。本发明还涉及一种筛选编码生物化合物的核酸的纤维素膜。

Description

筛选用纤维素膜
技术领域
本发明涉及纤维素膜和将它们用于鉴定或筛选活性物质例如生物化合物或编码该生物化合物的核酸序列的方法。本发明还涉及这些方法发现或鉴定的生物化合物和制备鉴定的生物化合物的方法。
背景技术
在未知样品或组合物例如酶中鉴定有用的生物化合物的现有技术包括例如WO99/34011的公开内容，该专利公开了使用纺织测试布样(textile test swatch)鉴定酶。EP454046B1公开了用于检测微生物、它们的酶和代谢物存在的试验方法。JP49060289A公开了一种用于检测消化道中酶活性的酶活性试验方法。
细菌纤维素公开在例如US4,863,565；WO93/11182和US4,861,427中。
JP10-95803公开了例如用于纸的细菌纤维素涂层。
附图的描述
图1表示H.insolens complex对细菌纤维素I和纤维素IIII的降解。
图2表示EG V(A)和EG V(B)对细菌纤维素I和纤维素IIII的降解。
图3表示由于H.insolens complex对标记的细菌纤维素I的消化而释放出的DTAF是接枝条件的函数。
图4表示由于H.insolens complex对标记的细菌纤维素I的消化而释放出的DTAF是使用30mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图5表示由于EG VI对标记的细菌纤维素I的消化而释放出的DTAF是使用30mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图6表示由于H.insolens complex对标记的细菌纤维素I的消化而释放出的DTAF是使用60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图7表示由于EG VI对标记的细菌纤维素I的消化而释放出的DTAF是使用60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图8表示由于H.insolens complex对标记的细菌纤维素IIII的消化而释放出的DTAF是使用60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图9表示由于EG VI对标记的细菌纤维素IIII的消化而释放出的DTAF是使用60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图10表示由于活性EG VI和非活性EG VI突变体对标记的细菌纤维素IIII的消化而释放出的DTAF是孵育时间的函数。
图11表示由于EG V对标记的棉纤维素I的消化而释放出的DTAF是60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
图12表示由于EG VI对标记的棉纤维素I的消化而释放出的DTAF是60mg DTAF(在0.2N NaOH中)的接枝步骤的函数。
发明概述
本发明涉及使用含有微原纤维化纤维素的纤维素膜筛选活性物质例如生物化合物或编码生物化合物的核酸序列的方法。具体地说，本发明涉及一种筛选或鉴定活性物质优选生物化合物的方法，包括将含有活性物质的样品与含有微原纤维化纤维素的纤维素膜接触，并检测纤维素膜和活性物质之间的相互作用。
本发明还涉及适用于筛选方法的纤维素膜及其制备方法。具体地说，本发明涉及一种含有微原纤维化纤维素的纤维素膜，其中该膜还含有一种连接到微原纤维化纤维素上的物质。
本发明还涉及适用于进行筛选方法的含有纤维素膜的测试容器及其制造方法。具体地说，本发明提供一种优选容积小于10ml的容器，其至少一个面上覆盖有纤维素膜。
此外，本发明还涉及一种用筛选方法鉴定的活性物质，优选生物化合物，及其制造方法。具体地说，本发明提供一种用筛选方法鉴定的活性物质，优选生物化合物和/或编码生物化合物的核酸序列。
发明的详细描述
本发明的一个目的是提供寻找新的清洁物质例如酶的改进方法。在寻找适用于清洁例如含纤维素的织物的新物质时，人们有可能通过在真正的织物上试验新物质来确定它们是否具有清洁性能。然而，由于该方法慢并且能力有限，因此该试验方法是不理想的。因此，本发明的另一个目的是提供能够以较快的速度试验大量潜在候选物的改进方法。本发明又一个目的是提供能够在小样品上进行并且易于自动化的方法。
定义
本文中使用的术语“微原纤维化纤维素”应当理解为从一个来源中以保持原始的纤维素长丝结构的方法回收的分离和纯化的纤维素纤维。下文中微原纤维化纤维素表示为“MFC”。该术语还包括在分离和纯化后进行化学处理来改变内部结构和/或纤维排列的纤维素纤维。因此，术语“微原纤维化纤维素”包括从微生物例如细菌纤维素(下文中表示为“BC”)中纯化和分离的纤维素。
在本发明中，术语“核酸源”应当理解为任何DNA、RNA或cDNA物质或含有DNA、RNA或cDNA的物质。
在本发明中，术语“表达系统”应当理解为能够转录核酸序列并翻译成相应合成的生物化合物的系统。表达系统可以是细胞或者是体外系统。
在本发明中，术语“基因库”应当理解为衍生自核酸源的DNA或cDNA片段。
在本发明中，术语“宿主细胞”应当理解为可以宿留并表达来自基因库的DNA或cDNA插入片段的细胞。
在本发明中，术语“转化体”或“转化的宿主细胞”应当理解为插入来自基因库的DNA或cDNA片段的宿主细胞。
在本发明说明书中，术语“克隆”应当理解为细胞或转化的宿主细胞的复制。
本文中使用的术语“活性物质”应当理解为对纤维素膜和/或混入纤维素膜或与纤维素膜有关的任何物质具有可测量的相互作用的任何化合物或化合物的混合物。
微原纤维化纤维素
本发明的纤维素膜包括MFC。我们发现，这种纤维素膜令人惊奇地好地模拟包含纤维素的织物，并且当筛选与织物表面上存在的与织物纤维素或物质相互作用的活性物质，优选生物化合物时，可以有利地取代这种织物。这一点是重要的，因为当寻找新的清洁剂(例如生物化合物，例如酶)并测试它们对模拟真正的织物的纤维素膜的效果时，更有可能发现候选物也与真正的织物作用。然而当选择更人工的测试条件时发现，筛选中产生大量假候选物，即可能发现人工条件下很好的相互作用，而在真正的织物上作用差的酶。
MFC还具有增强的与例如纤维素酶的可接近性，与没有微原纤维化的纤维素相比该纤维素酶更易于与MFC作用。MFC的增强的可接近性还指，MFC更易于透过水。增强的可接近性还指，MFC更易于被MFC上的反应性化合物通过例如支化、醚化、磺化、磷酸化和/或羧基化改性。
因此，本发明的纤维素膜可以用于鉴定具有好的清洁性能的清洁剂例如酶。
此外，本发明纤维素膜的一个重要特征在于，这种纤维素膜可以在非常小的容器中制备，例如常规小平板。特别是那些包含非常小的加样孔例如96、384或1536加样孔板，其对应的孔体积分别为320μl，160μl，和14μl，在其中使用真正织物的样条是非常困难的。
MFC是膨胀的大体积纤维素，其中的纤维素纤维张开并散开露出更小的原纤维和微原纤维。本发明膜中，MFC的原纤维的平均长度大约至少为10μm，优选大约至少50μm，最优选大约至少100μm。然而，原纤维的优选平均长度小于大约500μm，更优选小于大约300μm，最优选小于大约200μm。原纤维的平均宽度大约为50-200nm，优选大约75-150nm，最优选大约80-120nm。每个原纤维由一束微原纤维组成。原纤维中微原纤维的平均厚度大约为2-20nm，优选大约5nm，并且每个原纤维含有一束大约50-100微原纤维。分离的并且纯化的原纤维惊奇地长。在微原纤维中，优选保留天然纤维素I的内部结构，以使组成每个纤维素链的葡萄糖单体的聚合链彼此平行排列。然而，通过现有方法对原始结构的化学改性得到的内部结构也是优选的，例如纤维素链彼此反向排列的纤维素II结构，和在纤维素I结构中的氢键被改变的纤维素III结构或纤维素IV结构。
纤维素的来源
本发明膜中含有的MFC可以来自任何合适的来源。例如微生物制成的纤维素或来自植物例如木材(例如软木或制浆软木)、棉、稻草、黄麻、草、洋石竹(tunicate)、或谷类例如麸皮。然而，优选的来源是其中纤维素能够以使MFC以保持长的原纤维或微原纤维的方式分离和纯化的方式得到。因此，优选的纤维素来源是微生物和棉。优选的微生物纤维素是细菌纤维素。细菌纤维素含有非常长的纤维素链和/或纤维并且具有非常好的成膜性。这种细菌纤维素也可是例如从Nata de Coco产品(日本Fujico Company，Kobe)的椰奶的发酵产品。该产品含有发酵过程中产生的细菌纤维素。制备细菌纤维素的方法也公开在JP10-95803中。
分离、纯化和微原纤维化纤维素
由软木浆制备MFC的实例公开在Franklin W.等人的微原纤维化纤维素：形态学和可接近性(Microfibrillated Cellulose：Morphologyand Accessibility)；应用聚合物科学杂志(Journal of appliedPolymer Science)；1983，应用聚合物专题论文集37(Applied Polymersymposium 37)，第797-813页，John Wiley&Sons Inc。制备方法公开在第798页的“微原纤维化纤维素的制备”小节中(在此引用作参考)，还公开在第803页的“微原纤维化纤维素的制备”小节的“讨论/中(也引用在本文中作参考)。EP726356也公开了MFC的制备方法。
然而，当对用于制备适用于取代和/或模拟筛选方法中含有纤维素的织物的膜的纤维素进行分离、纯化和微原纤维化时，优选使用能够得到长的纤维素原纤维结构的方法和来源，即避免组成纤维素的葡萄糖链的断裂和在葡萄糖链中基本上保持原始的葡萄糖单元数量。该方法应当对纤维素纤维施加力，优选仅露出原纤维和微原纤维。本发明中，术语“基本上”是指，葡萄糖链的DP(聚合度)应当通过微原纤维化方法由原始链降低不超过500个葡萄糖单元，优选不超过350，更优选不超过250，最优选不超过150个葡萄糖单元。
优选的纤维素是细菌纤维素，它是优异的微原纤维化的纤维素原料。由细菌制备纤维素的方法是公知的，例如来自公开在US4,863,565的实施例VI和VII中的醋杆菌属(Acetobacter)菌株，在此引用在本文中作参考。
细菌纤维素例如“nata de coco”产品的微原纤维化是这样实现的：用大量水洗涤纤维素，除去水可溶杂质，用碱液例如NaOH处理水洗的纤维素并中和和捣碎碱处理的纤维素，得到MFC悬浮液。
纤维素膜
本发明涉及含有MFC的纤维素膜。本发明的膜优选含有至少50％w/wMFC，更优选至少75％w/w，更优选至少95％w/w，最优选该膜基本上由纯MFC组成。术语“基本上”是指膜中可以含有少量来自来源的杂质或来自纯化或微原纤维化过程中的杂质，但是没有刻意或故意向膜中加入物质。优选的膜含有基本上具有天然纤维素I结构的MFC，是指大部分纤维素具有纤维素I结构。另一种优选的膜含有基本上具有纤维素II结构的MFC，还优选的膜含有基本上具有纤维素III结构或纤维素IV结构的MFC。纤维素结构的改变是本领域公知的。举例说明，纤维素I与纤维素III的转变公开在Chanzy等人的Structural changes ofcellulose crystals during the reversible transformationcellulose I to cellulose III(纤维素I与纤维素III的可逆转变过程中纤维素晶体的结构变化)，Volonia Holzforschung，第40页以及第25-30页。据发现，MFC与例如不同内切葡聚醣酶之间的相互作用强烈地依赖于纤维素结构。
膜的干平均厚度优选大约为10μm-100μm，更优选大约20μm-70μm，最优选大约30μm-60μm。
改性的纤维素膜
由于纤维素膜含有MFC，因此纤维素的可接近性提高了。因此，膜中纤维素在成膜之前或之后与一种或多种化合物或物质反应和/或连接和/或掺合/混合。因此，在优选实施方式中，纤维素膜还含有成膜之前或之后与MFC反应或连接或混合的化合物或物质。优选的物质或化合物在成膜之后到反应到和/或连接到膜表面上。化合物或物质可以通过共价键或离子键或氢键，例如通过化合物或物质与MFC之间的疏水性反应连接到MFC上，或者可以在成膜之前与MFC混合，结果物质或化合物被嵌入到MFC基质中。可以连接到MFC上的优选化合物是具有旋光性或放射性的化合物(通常称作标记试剂)或者当释放或连接到膜上时具有旋光性或者可以与旋光性检测指示剂反应的化合物。具有旋光性或获得旋光性的化合物可以是反射剂或吸收剂，例如反射或吸收多种波长光的颜料颗粒，或更优选的是染料例如荧光染料或光吸收染料，该染料在离散的波长处发射或吸收光。反射剂的实例是靛蓝、不透明剂、炭黑和/或二氧化钛颜料。染料通常是共轭有机分子，其中共轭体系优选被改变，并且该分子当与膜反应或从膜中释放时获得了或失去了荧光性或吸光性。然而，共轭体系没有改变的染料也可以使用。优选荧光染料例如DTAF、荧光素、荧光素-异硫氰酸盐-异构体I或荧光素-5-氨基硫脲。
在适合标记纤维素的染料中，氰尿酰氯(cyanur chloride)衍生物是优选的，这是由于业已发现它可能与纤维素反应。在用氰尿酰氯衍生物标记纤维素的方法中，还发现反应介质的pH值对得到满意的标记是关键的。因此我们开发了一种标记纤维素的方法，包括在pH值为9-10之间将氰尿酰氯衍生物反应到纤维素上。
另一种将染料连接到多糖上的方法在本领域是公知的，可以在例如W099/45143中找到，该专利在此引用作参考。
放射性化合物包括含有放射性同位素例如S35、P32、H3和/或I125的所有化合物。
在优选实施方式中，该化合物是用于非纤维素分解酶的非纤维素底物或者是非MFC底物，优选含有上述具有旋光性或放射性的部分。非纤维素分解酶底物优选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物的聚合物、低聚物或单体、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酸的醇酯和脂肪酸的甘油三酯。因此，该底物可以是多糖例如淀粉和/或蛋白质和/或脂类。
适合标记酸基的染料中，旋光性氨基硫脲(semithiocarbazid)衍生物是优选的。
在适合标记氨基的染料中，旋光性异硫氰酸盐衍生物是优选的。
这些底物的组合也包括在本发明中。因此，一种有用的组合是用一种染料标记的一种纤维素膜与用另一种染料标记的基本上为无定形纤维素例如CMC或PASC相混合的组合。术语“基本上”是指大部分纤维素是无定形的。当将这种膜与未知的纤维素分解酶接触时，如果该酶可以主要与无定形纤维素或结晶MFC反应，通过检测膜释放的染料进行鉴定。
该化合物也可以是着色物质，即纤维素膜可以用一种优选含有蛋白质或脂类、脂肪酸或多糖或天然染料或它们的组合物的物质染色。举例说明，着色剂可以由番茄酱、草、咖啡、茶或动物油制成。
纤维素膜的制备
本发明还涉及一种含有MFC的纤维素膜的制备方法，包括制备MFC悬浮液并以膜的形式将MFC沉淀在一表面上。
该表面可以是基本上不透过MFC的任何表面，即该表面不透过大部分MFC。该表面可以是任何合适的材料例如不锈钢合金、塑料/合成聚合物、橡胶、板、玻璃、木材、纸、织物、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料，任选地这些材料可以被例如油漆、瓷釉、聚合物等涂覆。然而，该表面也可以是生物学来源的例如粘膜、皮肤、牙齿、毛发、指甲等。
在优选实施方式中，该膜是这样制备的，在容器中制备MFC悬浮液并将MFC沉淀在容器的至少一个内表面上，优选容器的底表面。容器的底表面优选由合成聚合物例如塑料制成，并且任选地可以是半透明的。因此在最优选的实施方式中，该容器是微量滴定板中的加样孔，优选该微量滴定板含有96个加样孔或更多例如384个或1536个。因此，该容器的容积优选小于10ml，更优选小于1ml，更优选小于500μl，更优选小于300μl，更优选小于50μl，最优选小于15μl。通过使用这种小容器，可以制备适用于筛选方法的小直径膜。为了使基本上具有纤维素I结构的MFC从悬浮液中沉淀在表面上，水悬浮液中MFC的浓度应当小于10mg/ml悬浮液，优选小于2mg/ml，更优选小于1mg/ml，最优选小于0.7mg/ml。对于其它的纤维素结构，该浓度可以更高，例如两倍。该膜优选粘结或粘附在表面上，因此当在直径相当于96孔微量滴定板的加样孔的容器中制备膜时，沉淀并干燥在底表面的MFC的总量不超过250μg，优选不超过200μg，最优选不超过150μg。在这种容器中，最好的膜是使用大约100μl MFC浓度为1mg/ml或更少的悬浮液得到的。本发明的一个重要特征在于，本发明的纤维素膜可以在大量相同的容器例如微量滴定板的加样孔中简单地复制。
纤维素膜的应用
本发明还涉及使用本发明的纤维素膜筛选活性物质，优选生物活性化合物例如酶。由于该膜能够复制并用于大量非常小的容器并模拟含有纤维素的织物，因此它非常适用于检测与纤维素或连接其上的化合物或物质反应的活性物质例如酶。
筛选/鉴定活性物质
通常，筛选感兴趣的活性物质要求将活性物质与通过与活性物质反应和/或相互作用而发生可测量变化的物质接触。对于活性物质例如酶，本领域技术人员通常知道大量可选择的这种物质，但是需要选择那些在类似于真正的工业应用中酶将与之反应的物质。对于酶，在筛选方法中选择一种对感兴趣酶具有高的专一性的真正类型的物质，优点之一在于，筛选过程中发现的新酶也非常有可能在希望的工业应用中很好地作用。但是，选择例如低专一性的低分子量合成底物，将在筛选中产生大量假阳性信息，即可能发现与合成底物反应好而在希望的工业应用中对真正的底物作用差的酶。使用本发明的纤维素膜，模拟了真正生活中的应用，并且使用本发明纤维素膜筛选方法中发现的酶可能以所需的方式与真正的织物纤维素相互作用。
因此，本发明提供一种筛选活性物质优选生物化合物的方法，包括优选在水性介质中将含有活性物质的样品与含有MFC的纤维素膜接触，并检测纤维素膜与活性物质之间的相互作用。
在优选实施方式中，该方法包括如下步骤：
(a)将本发明的纤维素膜沉积在容积小于10ml的容器的至少一个内表面上，优选容器的底表面上，
(b)将溶解或分散在优选水、液体中的活性物质加入到膜中，
(c)孵育带有活性物质的膜，并且
(d)检测生物化合物与纤维素膜之间的相互作用，优选检测由于相互作用而从膜中释放的化合物。
根据本发明释放的化合物可以是染料、优选荧光染料，或者是放射性化合物，或者优选是用与生物化合物反应的染料或放射性化合物标记的底物的产物。
活性物质优先选自生物化合物例如酶和有机和无机清洁化合物。有关的清洁化合物可以是酶稳定剂、抑制剂、增强剂、协同因子、成膜剂(builder)、成膜剂系统、漂白系统、漂白活化剂、含金属漂白催化剂、光亮剂、非离子-、阴离子-、阳离子-、两性离子-和两性-表面活性剂、织物柔软剂、软化粘土、粘土絮凝剂、染料迁移抑制剂、聚合去污剂、粘土去污剂、防尘污再沉淀剂、聚合的分散系统、螯合剂、烷氧化聚羧酸酯、载体系统、染料和颜料、织物护理剂、颜色护理剂等。
优选的活性物质是酶。该酶可以是直接与膜中的纤维素相互作用的纤维素降解酶或合成酶，这种酶的存在可以通过测试由膜释放的葡萄糖低聚物或单体而检测，或者通过测试由于相互作用在介质中消耗的葡萄糖低聚物或单体而检测。检测葡萄糖低聚物或单体的方法在本领域是公知的，例如Kidby D.K.和Dayidson d.J.；A convenient ferricyanideestimation of reducing sugar in the nanomole range(纳摩尔范围内还原糖的常规铁氰化物评估方法)；Analytical Biochemistry(分析生物化学)；1973；55；第321-325页。这种酶可以是内切葡聚糖酶或纤维素酶例如属于内切-1，4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)或内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)的那些。
采用的酶分类以Recommendations(1992)of the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(生物化学和分子生物学国际命名联合会的推荐(1992))，Academic Press，Inc.1992为依据。
该酶同样优选与连接到膜上的物质相互作用或异构化纤维素的非纤维素降解酶。应当理解的是，酶变体(举例说明，通过重组技术制备的)也包括在术语“酶”中。
因此，适合被筛选的酶的种类包括氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂合酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
本发明中优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)。
优选的转移酶是下面亚类中的转移酶：
a)转移一个碳基的转移酶(EC 2.1)；
b)转移醛或酮残基的转移酶(EC 2.2)；酰基转移酶(EC 2.3)；
c)糖基转移酶(EC 2.4)；
d)转移甲基之外的烷基或芳基的转移酶(EC 2.5)；和
e)转移含氮基团的转移酶(EC 2.6)。
本发明说明书中最优选的转移酶的类型是转谷酰胺酶(蛋白质-谷酰胺γ-谷氨酰基转移酶；EC2.3.2.13)。
本发明中优选的水解酶是羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)例如脂肪酶(EC 3.1.1.3)；肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.-)例如3-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8)和6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26)；糖甙酶(EC 3.2，本文中该酶落在“糖酶”的范围内)例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、肽酶(EC3.4，也称作蛋白酶)；和其它的羰基水解酶。
本发明中，术语“糖酶”不但表示能够断裂非纤维素糖链(例如淀粉)特别是五和六元环结构(即糖苷酶，EC 3.2)，而且表示能够异构化糖类的酶例如将六元环结构例如D-葡萄糖异构化为五元环结构例如D-果糖。
相关糖酶如下(EC数在圆括号中)：
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)、壳多糖酶(EC 3.2.1.14)、聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、淀粉-1，6-葡糖苷酶9EC 3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)、α-糊精内切-1，6-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.48)、葡聚糖内切-1，3-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.59)、葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.74)、葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)、阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)、乳糖酶(EC3.2.1.108)、脱乙酰壳多糖(EC 3.2.1.132)和木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。
本发明还涉及用本发明方法鉴定的生物化合物。
要筛选的样品可以含有原料形式或纯化形成的活性物质，或者当活性物质是生物化合物时它可以含有生成或已经生成生物化合物的细胞或体外偶联的转录和翻译系统。该细胞可以是细菌细胞、古细胞(archaeal cells)和/或真核细胞。
在优选实施方式中，洗涤组合物中活性物质是酶。酶的性能例如活性和稳定性可能由于洗涤剂的存在而改变或失活，这一点对本领域是公知的。因此，有利的是在洗涤剂存在下筛选酶，这是由于洗涤剂组合物中酶将被更有效地鉴定。因此，本发明筛选方法将有利地取代现有技术中公知的筛选方法，例如WO99/34011中公开的方法。
筛选核酸序列
正如本发明方法筛选和检测的生物化合物可以用包括在细胞或体外系统中的核酸序列编码的细胞或体外系统表达，因此编码生物化合物的核酸序列也可以被筛选、鉴定和分离。
因此，本发明还提供一种编码生物化合物的核酸序列的筛选方法，其中该方法包括：
(a)在表达系统中表达核酸序列，以制成生物化合物，
(b)将生物化合物与优选含有MFC的纤维素膜接触，
(c)测试生物化合物和纤维素膜之间的相互作用，和
(d)选择发生可检测的相互作用的表达系统并恢复核酸序列。
核酸序列来源
核酸序列源自某一来源。在本发明优选实施方式中，被筛选的核酸的来源是细胞例如原核细胞、古细胞或真核细胞。该细胞还可以通过基因工程改变。优选的细菌细胞是芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，而优选的真核细胞是哺乳动物细胞例如人体细胞、植物细胞例如鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)或真菌例如Meribipilusgigantus。
在另一个优选实施方式中，核酸来源是细胞的混合群体。如下所述，细胞的DNA或RNA还可以直接从任何有生命的样品或无生命样品例如土壤样品、水样品、或癌胃样品直接提取。优选的核酸来源还有嗜极菌原核细胞例如嗜热细胞。
核酸来源还包括经过典型的诱变的细胞，例如Eisenstadt E.，Carlton B.C.和Broun B.J.，Gene mutation，Methods for generaland molecular bacteriology，第297-316页，编者：Gerhardt P.，Murray R.G.E.，Wood W.A.和Krieg N.R.，ASM，1994所公开的用UV照射细胞或用化学诱变剂处理细胞。
核酸来源还可以是按照WO97/07205中所公开的方法体外基因改组进行基因改变的细胞群体。
另一个优选的实施方式中，核酸来源是由DNA、RNA、cDNA序列体外制成的，或者是通过例如基因改组(例如Stemmer，Nature，370，第389-391页，1994或Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91第10747-10751页，1994或WO95/17413所述)、随机诱变(例如Eisenstadt E.，Carlton B.C.和Brown B.J.，Gene mutation，Methodsfor general and molecular bacteriology，第297-316页，编者：Gerhardt P.，Murray R.G.E.，Wood W.A.和Krieg N.R.，ASM，1994所述)、或通过使用PCR技术构造(例如，Poulsen L.K.，Refn A.，MolinS.and Andersson P.，Toppgraphic analysis of the toxic Gef proteinfrom Escherichia coli，Molecular Microbiology，5(7)，第1627-1637页，1991)的人工基因。
表达系统
本发明方法中，要筛选的核酸序列在表达系统中被表达。表达系统是能够转录核酸序列和翻译成合成相应的生物化合物的系统。表达系统可以是细胞系统或体外系统。体外偶联的转录和翻译的描述在：Ohuchi，S.等人.；In vitro method for generation of protein libraries usingPCR amplification of a single DNA molecule and coupledtranscription/translation；Nucleic Acid research，1998，第26卷第19期，第4339-4346页或Ellman J.，Mendel D.，AnthonyCahillS.J.，Noren C.J.and Schultz P.G.，Methods in Enzymol 1991；第202卷，第301-337页，能够表达核酸序列，例如来自于核酸源的基因库。对于细胞表达系统，细胞可以自身是核酸序列源，例如从自然界中分离的野生类细胞，或者它可以是来自转化的宿主细胞群或其克隆的细胞，包括根据本领域公知方法(例如上面描述的方法)制成的核酸源的基因库。
宿主细胞
根据定义的宿主细胞可以是能够宿留和表达得自基因库的核酸片段的任何细胞。
优选的宿主细胞本身不能含有或表达编码生物化合物的核酸序列(即未转化的宿主细胞不能有效表达生物化合物)，如果这样将干扰筛选方法。这种细胞的特征是细胞的天然属性或者如下面文献所述通过该系列得到的，文献如Christiansen L.C.，Schou S.，Nygaard P.andSaxild H.H.，Xanthine metabolism in Bacillus subtilis：Characterization of the xpt-pbuX operon and evidence for purineand nitrogen controlled expression of genes involved in xanthinesalvage and catabolism，Journal of Bacteriology，179(8)，第2540-2550页，1997或Stoss O.，Mogk A.and Schumann W.，Integrativevector for constructing single copy translational fusionsbetween regulatory regions of Bacillus subtilis and the bgaBreporter gene encoding a heat stable beta-galactosidase，FEMSMicrobiology Letters，150(1)，第49-54页，1997。
在本发明另一个优选实施方式中，宿主细胞是细菌细胞和真核细胞。此外，细菌细胞优选是ElectroMAX DHl0B(GibcoBRL/Lifetechnologies，UK)细胞，或者是大肠杆菌(E.coli)，例如Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sj豩olm，C.，揅loning of aldB，which encodes alpha-acetolactatedecarboxylase，an exoenzyme from Bacillus brevis”，J.Bacteriol.，172，第4315-4321页，1990中的大肠杆菌SJ2。其它优选的宿主细胞可以是芽孢杆菌(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或芽孢杆菌属的种。优选的真核细胞是酵母菌例如酿酒酵母(S.cerevisae)。
基因库的制备
基因库的制备可以通过公知方法得到。
举例说明，从纤维素核酸中提取DNA的方法和基因库的制备公开在Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.，“Rapid extraction ofbacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate”(用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA)，Lett.Appl.Microbiol.，8，第151-156页，1989或Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.，”A reliable method for the recovery of DNA fragments fromagarose and acrylamide gels”(从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的有效方法)，Anal.Biochem.，112，第295-298页，1981或WO94/19454或上述Diderichsen等。
由体外制成的合成核酸源制备基因库的方法可以参见，例如上面Stemmer所述或WO95/17413所述内容。
将基因库插入宿主细胞
通过插入含有来自基因库的DNA或cDNA质粒来转化宿主细胞的方法在本领域是公知的，例如Sambrook等人，“Molecular cloning：Alaboratory manual”，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY.；1989或Ausubel，F.M.等(编者)Current protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，1995和Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编者)，”Molecular Biological Methods for Bacillus”，JohnWiley and Sons，1990。
在本发明优选实施方式中，插入宿主细胞的质粒还含有核酸序列(表示为抗菌标记)，这可以抗抗菌剂或抗真菌剂例如抗生素的变体。优选抗氯霉素、四环素、卡那霉素、氨苄青霉素、红霉素或zeocin。
在本发明另一个优选实施方式中，WO94/19454和上面Diderichsen等(1991)的psJl678质粒DNA(能够抗氯霉素)可以用于转化大肠杆菌SJ2宿主细胞。另外，也可以使用pZEro-2质粒(Invitrogen，CA，USA)。
筛选方法
当体外表达系统作为本发明具体实施方式时，筛选方法优选包括：
a)制备得自核酸源的基因库，
b)将基因库中的基因片段分离在单个容器中，
c)扩增分离的基因片段，
d)进行扩增基因片段的体外偶联转录/翻译以表达生物化合物，
e)将每个独立容器中的生物化合物或其次级样品与本发明的纤维素膜接触，
f)孵育纤维素膜上的生物化合物，
g)检测纤维素膜和生物化合物之间的相互作用，
h)回收发生了相互作用的容器中的基因片段。
步骤a-h可以适当地使用市售标准设备例如移液管或自动移液装置、烧瓶、微量滴定板、摇动器、恒温培养器等完成。
生物化合物和纤维素膜之间的相互作用仅仅发生在含有和表达编码生物化合物的基因片段或核酸序列的容器中。
基因库中基因片段的分离可以这样实现，稀释基因库到能够取样含有基因片段的等分试样，优选每个样品中平均一个基因片段，然后将样品转移到独立的容器即微量滴定板中。分离的基因片段的扩增可以通过常规PCR技术以及对扩增的基因片段的体外偶联转录/翻译实现(见上面Ohuchi等人(1998)，第4340页或上面Ellman等人(1991))，上述文献被引用在本文中作参考。
当细胞表达系统作为本发明具体实施方式时，筛选方法优选包括：
a)预先繁殖和稀释含有核酸序列的细胞，
b)将该细胞分离在独立的容器中，
c)繁殖分离的细胞来增加每个独立的容器中每个细胞的克隆数目，
d)将每个独立容器中的细胞与本发明纤维素接触，
e)孵育纤维素膜上的生物化合物，
f)检测纤维素膜和生物化合物之间的相互作用，并且
g)回收发生了相互作用的容器中的基因片段。
步骤a-g可以适当地通过使用市售标准设备例如移液管或自动移液装置、烧瓶、微量滴定板、摇动器、恒温培养器等完成。
在本发明一个实施方式中，细胞的预先繁殖和稀释可以设计成单位体积的细胞浓度，该浓度适合于取样含有要分离的最佳数目细胞的等分试样。每个等分试样中合适的细胞平均数目可以是0.3-10，优选0.3-5例如0.3-1。
在优选的水介质中，细胞的预先繁殖优选使细胞克隆数目增加2-5倍。合适的培养温度可以为10-60℃，优选30-50℃例如37℃，而pH值可以为4-10，优选6-8。调整培养时间优选15-60分钟例如40分钟，以满足理想的转化体和克隆浓度的要求。
当表达系统是宿主细胞的培养物，其中转化体含有来自核酸源的基因库时，也可以进行预先繁殖来保证抗生素标记的表达，该抗生素标记可以包含在插入在转化的宿主细胞的质粒中，能够对抗培养基中的抗生素。因此，宿主培养物的预先培养可以通过在有利于选择的抗菌标记种类的表达以及保证转化体生存的条件下培养。
稀释可以通过加入培养基来进行，以保证所有细胞和其克隆生存在稀释液中。
细胞可以通过将设定的具体体积的等分试样转移到独立容器中，例如市售微量滴定板的加样孔。
繁殖分离的细胞来增加每个容器中克隆数目，优选107-108克隆/ml。如果使用微量滴定板，这些板可以表示为“主平板”。对于筛选细菌基因库，通常需要使用50-100个每个带有96个加样孔的主平板。使用主平板的优点之一是能够筛选细胞为活性样品，结果即使随后的筛选条件造成筛选细胞的死亡，也可以追踪筛选细胞活样品时的筛选结果。
在另一个优选实施方式中，合适的培养温度可以为10-60℃，优选30-50℃例如37℃，而pH值可以为4-10，优选6-8。培养基应当满足细胞和克隆的营养条件以确保充分的生长。
当表达系统是宿主细胞的培养物，其中转化体含有得自核酸来源和抗生素标记的基因库时，培养基应当选择为能够杀死或抑制非转化的宿主细胞。
培养时间应调整为确保培养产生足以适合取含有适当量筛选克隆的等分试样的细胞/克隆数目，在主平板中留下大量有生命克隆。根据微生物宿主细胞的类型和繁殖条件，优选的繁殖时间为40-90小时，例如48小时。
当表达系统是含有基因库的宿主细胞的培养物，其中抗生素标记包含在转化的宿主细胞中时，在本发明优选实施方式中，预先繁殖、稀释和/或繁殖在能够选择性杀死或抑制非转化宿主细胞生长的培养基中进行。举例说明，优选以对非转化宿主细胞有效量向培养基中加入抗生素，其中转化体或克隆抗该抗生素。
细胞的等分试样通过例如移液管被转移到含有本发明纤维素膜的微量滴定板中。生物化合物和纤维素膜通过细胞外的培养基而发生接触。当生物化合物被限制在细胞内部时，细胞被溶解或其整体分解以将生物化合物释放到培养基中。
孵育可以在有利生物化合物和纤维素膜反应的条件下进行。在优选实施方式中，荧光物质和生物化合物之间的反应通过pH值和温度而优化。根据要检测的生物化合物，孵育也可以在引起细胞死亡的极端条件(例如非常低的温度例如低于30℃或低于20℃，或高温例如高于60℃或高于70℃，低pH例如低于5或低于4，或高pH值例如高于9或高于10，低或高离子强度，存在敌对化合物例如洗涤剂)下进行。举例说明，如果要发现的生物化合物是耐热化合物，培养可以在高温下进行，假设条件是只有高温下有活性的生物化合物与本发明的纤维素膜反应。
因此，从细胞核酸源或得自核酸源的基因库中并且在体外表达系统或通过转化到宿主细胞表达系统而表达的核酸序列中可以筛选出编码与本发明纤维素膜反应的生物化合物的核酸序列。
本发明还涉及编码通过使用本发明筛选方法发现的生物化合物的核酸序列和制备该生物化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在细胞群或体外表达系统中，通过将细胞群与本发明的纤维素膜接触，鉴定表达生物化合物的细胞或系统，
b)选择制备生物化合物的细胞或系统，
c)鉴定编码生物化合物的核酸序列，
d)培养含有编码生物化合物的核酸序列的细胞以制备生物化合物，并且
e)回收生物化合物。
本发明通过下面的实施例进行说明，这些实施例绝对不想限制本发明的范围。
实施例
实施例1
由日本食品“nata de coco”(日本Fujico Company Kobe)制备不纯形式的细菌纤维素微原纤维。通过将该制品悬浮在大约4L自来水中，将350g该制品中的纤维素纯化。每天两次用新鲜水更换该水，更换4天。然后，用1％NaOH(w/v)代替水并将该制品再次悬浮在碱液中，每天两次共4天。用蒸馏水洗涤纯化的纤维素来进行中和直到制品表面的pH值为中性。纤维素是微原纤维化的，通过将纯化的纤维素微原纤维在韦林氏搅切器中均化30分钟，得到单个细菌纤维素微原纤维的悬浮液。将该悬浮液透析通过多孔膜/蒸馏水再次纯化该纤维素微原纤维，并将分离并纯化的纤维素微原纤维保存在4℃的悬浮液中。将稀释的细菌纤维素悬浮液沉积在涂碳的电子显微镜栅极上，并用Pillips CM 200Cryo透射电子显微镜(TEM)记录分离的纤维素微原纤维的结构。其结果表明，单个细菌纤维素微原纤维具有带状形态。这些微原纤维的宽度大约为100nm，由微原纤维的缠结估计出的厚度平均为5nm。
实施例2
实施例1的制备方法需要一周多时间来得到分离并纯化的细菌纤维素微原纤维的悬浮液。因此开发了另一种制备方法，该方法仅需要两天而不改变细菌纤维素微原纤维的性能。将350g“nata de coco”中的纤维素用自来水仔细冲洗以除去多余杂质例如甜味剂和香料。分离部分纯化的纤维素，然后通过使用韦林氏搅切器在水中均化10分钟再次悬浮并微原纤维化。将该纤维素微原纤维悬浮液分离并通过离心在1％NaOH中再次悬浮两次并在碱液中室温下搅拌一整夜。将该纯化的纤维素微原纤维悬浮液通过至少三次离心中和并将样品再次分散在水中。将得到的纯化并分离的纤维素微原纤维用漂白液70℃下处理1-2小时，所述漂白液由1体积份1.7％NaClO2水溶液、1体积份乙酸盐缓冲液(pH＝4.9)和3体积份蒸馏水组成。最后，将通过几次离心从漂白液中得到的细菌纤维素微原纤维用蒸馏水洗涤。用韦林氏搅切器将纯化并分离的纤维素微原纤维在蒸馏水悬浮液中均化并在4℃下保存。
实施例3
根据Chanzy等人的Structural changes of cellulose crystalsduring the reversible transformation cellulose I to cellulose III(在纤维素I与纤维素III的可逆转化过程中，纤维素晶体的结构变化)；Vlaonia Holzforschung；40；suppl.25-30所述方法，将实施例1和2中得到的具有纤维素I结构的细菌MFC转变为纤维素IIII。将实施例1得到的细菌纤维素的微原纤维悬浮在纯甲醇中，并在离心之后转移到无水乙二胺中。该混合物在室温下保持在乙二胺中过夜，而后再次在纯甲醇中悬浮几小时。将整个处理重复六次，直到纤维素I向纤维素IIII完成转变。用X射线衍射和傅里叶转化红外光谱记录这种转化。将干燥的纤维素I微原纤维和纤维素IIII微原纤维用30kV和20mA下工作的X射线分析，该X射线带有安装在发射Ni过滤CuKa射线的Philips PWl720X射线产生器上的Warhus平膜相机。当天然纤维素与纤维素IIII没有完成转变时，观察到中间图案。
对于傅里叶转变红外(FT-IR)光谱，将纤维素悬浮液的液滴在50℃下干燥在聚乙烯帽上。小心收集该膜并在傅里叶转变红外PerkinElmer 1720X光谱分析之前安装在样品支架上。该光谱在4600-400cm-1范围内用4cm-1分辨率的透射方式进行记录。天然纤维素向纤维素IIII的转变引起光谱的明显改变。最明显的转变是纤维素I在710cm-1和750cm-1处特征峰的消失以及纤维素IIII在3480cm-1处强的陡峰的出现。
实施例4
将1989年生长在Texax Tech University(Lubbock)温室中并在4℃下保存在含有叠氮化钠的水中的棉荚作为原料。将覆盖了纤维素纤维的种子在水下从荚中取出。仍然在水下，将纤维素用镊子从种子上分离，并用剪刀剪成小段。将长纤维素纤维剪短并用韦林氏搅切器均化直到大的纤维素聚集体消失。然后，用APV Gaulin均化器在水中将纤维素样品微原纤维化，每小时进行两次。将MFC在搅拌下再次悬浮在1NNaOH中一整夜。随后用实施例2中的漂白液70℃下处理1小时来纯化纤维素微原纤维。通过离心用蒸馏水仔细洗涤纤维素微原纤维之后，将悬浮液中分离的棉微原纤维4℃下保存。同实施例1一样，用透射电子显微镜测试纤维素微原纤维的结构，表明原来的棉纤维分裂成微原纤维和微原纤维束。对棉纤维进行的机械处理引起纤维素分层为100-500nm长的片状纤维束。这种束由5-10nm宽紧紧结合在一起的微原纤维组成，它在处理过程中部分个体化。单个的微原纤维在图象背景中可以看到，但更经常的是在与它们结合的束的表面上看到。
实施例5
实施例1的天然细菌纤维素I微原纤维和实施例3中转变为纤维素IIII的那些作为纤维素酶的底物进行测试。测试酶是Humicolainsolens复合(complex)酶，它是当发酵Humicola insolens真菌时可由上清液回收的酶；和Schou C.等人；Stereochemistry，specificityand kinetics of the hydrolysis of reduced celludextrins by ninecellulases；Eur.J.Biochem.；1993；217；第947-953页和Schülein等人；“Humicola insolens，alkaline cellulases”；在“Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases”(编者Suominen P.et Trinikainen T.)；Foundation for Biotechnical andIndustrial Fermentation Research；Helsinkil；第8卷，第109-116页中所述的内切葡聚糖酶V和VI的复合体。该方法按照如下顺序进行：将75μl酶溶液(1mg/ml)与悬浮在pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲液中的600μl纤维素(100μ0g/100μl)微原纤维的等分试样混合。37℃下不搅拌下进行消化。
根据上述Kidby和Davidson(1973)的铁氰化物方法，在降解混合物离心之后，通过测试上清液中还原糖的量来测试纤维素微原纤维的降解动力学。用1ml铁氰化物溶液在沸水中将100μl的试验上清液处理7分钟，所述铁氰化物溶液由300mg六氰基铁III化钾、28g水合碳酸钠(NaCO3.H2O)和1ml 5MNaOH以及1L蒸馏水组成。在420nm处测试溶液的吸光度，由已知浓度的葡萄糖溶液得到的标准曲线计算还原糖的浓度。结果表示在图1中，其中两条曲线表示H.insolens复合酶对纤维素I和IIII细菌微原纤维的消化动力学。该曲线表明，对于两种底物，延长时间产生的可溶还原糖的量非常接近。相反，如图2A和B所示，当两种纤维素底物用内切葡聚糖酶V或VI孵育时，它们的反应性明显不同。图2中可以看出，当由纤维素I到纤维素IIII，对于EG V和EG VI来说降解程度分别大约为9倍和5倍。
实施例6
在一步法中将荧光染料5-5([4，6-二氯三嗪-2-基]氨基荧)光素(DTAF)连接或接枝在MFC I上。已知DTAF的三嗪(triazino)反应基对多糖上的羟基非常活性。因此DTAF分子对于制备荧光纤维素是好的候选物。
第一组试验，通过将10-70mgDTAF(Sigma)与0.1MNaOH悬浮液中的10ml天然细菌纤维素(10mg/ml)混合制备DTAF接枝MFC。将这些混合物搅拌下在室温中保存24小时。然后，用蒸馏水至少离心6次将纤维素样品洗涤到不含有未反应DTAF。衍生纤维素的第二组试验按照第一组试样的方法制备，不同的是DTAF的用量为70-115mg，并且在0.2M NaOH中。
初步试验表明，不可能用光谱法简单快速地估计纤维素标记的程度。因此，假设离心的上清液中荧光探针的试样应当随接枝到纤维素表面上的DTAF量而增加，我们用纤维素酶(H.insolens复合酶，内切葡聚糖酶EGV或EGVI)孵育标记的纤维素微原纤维。
测试是这样进行的，将20μlH.insolens复合酶(1mg/ml)加入到50mM磷酸缓冲液中的600μl标记纤维素(100μg/100μl)中。将该混合物不搅拌下37℃中孵育4小时。同时，用水代替酶进行对比试验以看出荧光探针的不特定释放。将离心后收集的相应试验上清液用蒸馏水稀释4倍。用蒸馏水作对比记录200μl的每个样品的荧光。酶消化过程中试样的荧光的相对强度(RI)是通过从相应对比测试中减去含有酶的测试荧光推导出来的。图3中，可以看出，当化学反应在0.1N NaOH中进行时，荧光探针的释放量增加直到使用的DTAF的量大约为40mg/100mgMFC。当更高浓度的DTAF与MFC反应时，荧光强度恒定，这表明，接枝度没有增加。对于在0.2N NaOH中进行的接枝试验，酶处理后溶解的DTAF的量比在0.1N NaOH中进行标记的量更高。虽然如此，探针的试样恒定，没有随DTAF量的增加而增加。因此，一步接枝试验仅能够使MFC衍生达到一有限量。
实施例7
在多步方法中将DTAF连接或接枝到MFC上。第一组，纤维素标记试验通过将30mgDTAF与0.1M NaOH悬浮液中的10ml天然细菌纤维素(10mg/ml)混合进行。将该混合物室温下搅拌24小时。然后，用蒸馏水离心将样品仔细洗涤。将上述步骤重复几次并将纤维素悬浮液在4℃下保存。除了DTAF的加入量为60mg并且碱性反应介质为0.2M NaOH之外，在同样条件下进行第二组试验。
类似于一步法试验对标记MFC的酶降解进行测试：将pH值为6.5的50mM磷酸缓冲液中的600μl接枝的MFC悬浮液(100μg/100μl)与20μlH.insolens复合体(1mg/ml)、或者20μlEG VI(1mg/ml)或者20ml作基准的水混合。将该混合物不搅拌下在37℃中孵育4小时。用铁氰化物方法分析各个离心的样品的上清液，来测试可溶还原糖的浓度，并通过分光荧光法估计荧光探针释放的范围。
图4和图5分别表示，用H.insolens复合体和EG VI培养第一组标记纤维素的结果是荧光探针的剧烈释放，其中荧光探针被稀释8倍以降低荧光分光计敏感范围内的强度。图4中，荧光随标记试验步骤数目的增加而增加，这一点表明连接到纤维素微原纤维表面上的DTAF分子的数目也增加。接枝增加时酶作用过程中生成的可溶还原糖的降低能够简单地解释为覆盖在纤维素表面上的接枝分子对酶的阻碍。
EG VI对标记纤维素的降解表示在图5中。同H.insolens复合体一样，荧光随标记试验数目的增加而增加。然而，没有看出由于标记而造成的对酶的阻碍，可溶还原糖的浓度非常恒定。但是，应当注意的是，可溶还原糖的量非常小，铁氰化物方法检测出的结果不能有效地证明浓度的细微变化。
图6和图7表示MFC的降解试验的结果，其中MFC用在0.2N NaOH中的60mg DTAF多步接枝。对于H.insolens复合体或EG VI，两者的作用都引起荧光的增加，直到对接枝了四次的MFC观察到的最大值。对于接枝超过四次的MFC，检测出荧光的降低。对于H.insolens复合体(图6)，荧光的变化明显与还原糖浓度的规律降低有关，这与连接到纤维素微原纤维上的DTAF分子造成对酶的阻碍一致。这表明，对于标记四次，可溶荧光糖的增加比还原糖总量的降低更重要。当酶的阻碍变得更强时，释放的接枝糖的量由于荧光的降低而显著降低。对于图7中的EG VI，除了酶的阻碍不能用铁氰化物方法清楚证明之外，对结果可以得出同样的解释。
实施例8
在多步法中将DTAF连接或接枝到MFC IIII上。根据实施例7中相同的方法，使用0.2N NaOH中的60mgDTAF将其接枝到MFC IIII上。对于MFC I，将接枝的MFC IIII用纤维素酶孵育，图8(H.insolenes)和图9(EG VI)表示了16倍稀释样品的降解结果。荧光的改变与接枝的MFC I遵守同样的规律。然而，当纤维素IIII用60mg DTAF(0.2N NaOH)反应三次后观察到探针的最大释放，而不是用MFC I进行四次反应。H.insolenes复合体的阻碍也可以由产生的还原糖随接枝度的增加而有规律的降低而清楚地看出。对于EG VI，从图9中也可以看出，产生的还原糖的量随接枝DTAF的增加而减少。
正如实施例5所示，MFC IIII对内切葡聚糖酶比微原纤维化纤维素I更活泼。这可以通过可溶还原糖总量的增加而得到证实。标记的MFCIIII也比标记的MFC I更活泼，造成培养基中释放的还原糖的增加。因此，在我们对MFC I的方法中铁氰化物法没有足够的灵敏度来揭示由于接枝纤维IIII对EG VI的阻碍。
实施例9
制备MFC I的膜。将0.3-2mg/ml范围内的多种浓度的MFC水悬浮液放置在室温下，不搅拌，使MFC沉淀。几小时后，浓度更小的MFC I悬浮液(0.3-0.7mg/ml)沉淀了。然而，对于浓度更大的悬浮液(＝1mg/ml)，即使几天后纤维素也不沉淀。对于MFC IIII，当悬浮液的浓度小于1.5mg/ml时就可以观察到纤维素的沉淀。
将不同浓度(0.1mg/ml-2mg/ml)的不同体积(50，100和200μl)的MFC悬浮液在37℃下干燥，使MFC沉淀在96加样孔微量滴定板(Nunc-immuno PlateMaxsorpTM，Nunc)的底面上。很快就可以看出，当干燥的MFC总量超过150mg时，膜就不能粘到加样孔的表面上。当悬浮液体积超过200μl时，纤维素以不可再生的方式粘在加样孔的壁上。业已发现，最好的膜是由浓度大约为1mg/ml或更低的100μl悬浮液得到的。
实施例10
测试未标记膜的酶降解。MFC I的膜通过在96加样孔微量滴定板的每个孔中在37℃下干燥100μl纤维素I的悬浮液(1mg/ml)制成。测试的膜的重复性对它们对酶降解的敏感性：在每个加样孔中加入200μl50mM pH值为6.5的磷酸缓冲液，然后加入20μl H.insolens复合体(1mg/ml)，并保持37℃。收集了多个孵育时间下的8个100μl样品，并用铁氰化物方法测试产生的可溶还原糖的量。根据下面的等式计算平均值和标准误差，其中n是样品个数，x是还原糖的量。
Figure A0081361900321
Figure A0081361900322
下表表示，H.insolens复合体对膜的5个不同时间下的降解的平均值和相应的标准误差。
    纤维素I膜        纤维素IIII膜
时间(h)     当量可溶葡萄糖(mg/100ml) 时间(h)       当量可溶葡萄糖(mg/100ml)
    平均   标准误差     平均   标准误差
    0     0     0.46     0     0     0.26
    1     1.54     0.57     1     1.47     0.43
    2     3.07     1.53     2     2.79     1.14
    4     6.89     1.86     4     7.77     1.25
    6     13.29     1.88     6     13.07     1.44
纤维素I和纤维素IIII膜的降解动力学是非常相似的。该性能对于悬浮液所进行的动力学试验是一致的。膜沉淀的重复性是通过间接方法进行试验的，包括几个试验步骤例如稀释和化学处理。因此，计算的标准误差包括成膜误差以及其它试验误差。
实施例11
测试标记膜的酶降解。MFC膜通过37℃下干燥96加样孔微量滴定板的每个加样孔中的100μl纤维素悬浮液(1mg/ml)制成。测试的MFC是用纤维素酶在悬浮液中孵育后具有最大荧光释放的MFC。因此，用于成膜的MFC，对于纤维素I是用60mg DTAF进行4次重复的标记步骤，而对纤维素IIII是3次接枝步骤。
测试膜对EG V和EG VI活性物质的反应性。将10μl酶(0.1mg/ml)沉淀在含有200μl的50mM pH为6.5的磷酸盐缓冲液的加样孔中。将微量滴定板保持在37℃。在不同的降解时间，收集8个样品并稀释8次，用分光荧光法分析200μl这些稀释液。下表表示由记录的标记MFC I和纤维素IIII的荧光数据计算的平均值和标准误差。
  纤维素I            没有酶           EG V
  时间(h)           荧光(RI)          荧光(RI)
    平均值    标准误差     平均值   标准误差
    0     148.07     15.52     145.93     28.09
    1     175.02     17.12     260.2     43.15
    2     214.42     20.98     361.36     65.93
    3     221.43     29.65     424.11     79.26
    4     230.70     31.68     405.70     78.96
    5     225.84     32.11     416.98     91.41
 纤维素III             酶            EG V            EG VI
         荧光(RI)          荧光(RI)           荧光(RI)
  时间(h)     平均值   标准误差   平均值  标准误差   平均值 标准误差
    1     62.03     8.50   52.93   16.33   65.25   7.94
    2     81.14     10.70   325.52   67.08   237.60   34.88
    3     86.45     14.047   359.80   115.60   385.31   48.28
    4     85.34     14.86   517.90   136.20   441.46   70.47
    5     88.31     19.13   544.62   137.12   481.05   84.57
    6     87.45     18.15   567.90   150.10   427.07   137.99
对于两种纤维素体系和测试的内切葡聚糖酶，荧光释放似乎是根据相同的图案发出的。荧光释放线形增加直到用酶孵育3-4小时后达到最大值。当反应介质中不含有酶时，更快地通常小于2小时就可以观察到没有特征荧光的最大强度。
考虑到荧光释放之后动力学的重复性，可以发现，该系统允许在试验误差内，在少于1小时内为微量内切葡聚糖酶提供证据。值得注意的是，记录的标准误差是试验误差之和。在降低对分光荧光计敏感度的强荧光强度所需要的几次稀释后，有些误差是肯定要发生的。
标记的纤维素基质不具有这样的性能。对于EG V，确实观察到，用纤维素IIII代替纤维素I得到的荧光释放系数为2.5。
实施例12
使用酵母菌提取物对标记的MFC膜进行试验。图10中的结果是这样得到的，向200μl pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲液中加入50μl酵母菌提取物，然后用上述溶液孵育纤维素IIII膜。尽管强冷却，当酵母菌提取物中含有活性EG VI时，荧光可以随不同降解时间而增加。荧光探针的溶解增加直到在3小时达到最大值为止。在含有活性EG VI的酵母菌提取物和含有诱变非活性EG VI的提取物中间，荧光强度的差别表明，EG VI活性能够在小于2小时内明显检测出。
实施例13
按照实施例7中的多步方法将DTAF连接或接枝到MFC上：将60mgDTAF加入到0.2M NaOH中的10ml纤维素悬浮液(10mg/ml)中。将混合物在室温下搅拌24小时。然后，通过蒸馏水离心仔细洗涤该样品。进行几次标记，并将最终纤维素悬浮液保存在4℃下。
实施例14
测试实施例13标记的微原纤维化棉纤维素对EG V和EG VI的作用。将pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲液中的600μl接枝纤维素悬浮液(100μg/100μl)与20μl酶(1mg/ml)或与20μl作为对比或基准的水混合。37℃下不搅拌进行水解4小时。用铁氰化物和分光荧光法分析各个离心的测试液的上清液。图11和12表明，当标记的微原纤维化棉纤维素分别用EG V和EG VI孵育时，稀释16倍的样品释放的荧光是标记次数的函数。对于这两种情况，荧光的改变与用细菌纤维素所观察到的行为相同。的确，荧光探针的数量随标记次数的增加而增加直到第四次标记达到最大值为止。除此之外，检测的荧光强度对大多数纤维素来说是降低的。对于微原纤维化棉纤维素，荧光试样最大值所需要的标记测试与以前我们观察细菌纤维素I是相同的。
实施例15
制备微原纤维化棉纤维素膜。该纤维素膜是按照实施例9中描述的相同方法得到的：将微量滴定板的每个加样孔中的100μl纤维素悬浮液(1mg/ml)在37℃下干燥过夜。
实施例16
测试未标记微原纤维化棉纤维素膜对H.insolens复合体的反应性。将微量滴定板的每个加样孔中装入200μl pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲液，随后加入20μlH.insolens复合体(1mg/ml)。将该混合物保持在37℃。对于不同孵育时间，收集8个100μl样品并用铁氰化物方法测试生成的可溶还原糖的量。下表表示由试验数据计算的平均值和标准误差。
  时间(h)   当量可溶葡萄糖(mg/100ml)
   平均值   标准误差
    0     0     0.28
    1     2.21     0.66
    2     5.13     1.27
    4     9.87     1.75
    6     17.66     1.19
降解动力学、包括膜沉淀、稀释和还原糖测试的总试验标准误差都与以前细菌纤维素I和IIII观察到的具有好的重复性的沉淀膜一致。
实施例17
用标记的微原纤维化棉纤维素测试膜对酶的反应性，该纤维素膜能够在用酶孵育后具有最大的荧光释放。标记的棉纤维素是用0.2M NaOH中的60mg DTAF重复进行4次标记得到的。
膜降解是这样进行的，将10μl EG V和EG VI(0.1mg/ml)加入到200μl pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲液中，并沉淀在微量滴定板的加样孔中。将该样品保持在37℃。在不同降解时间，收集8个样品并稀释8次。用分光荧光法分析200μl这些稀释液。下表表示由记录的数据计算的平均值和标准误差：
        没有酶          EG V         EG VI
       荧光( RI)         荧光(RI)        荧光(RI)
  时间(h)   平均值 标准误差   平均值 标准误差   平均值   标准误差
    0   206.08   15.76   197.60   24.07   232.47     29.66
    1   245.22   17.34   325.12   52.44   328.25     56.06
    2   287.01   25.85   454.82   87.93   457.45     73.18
    3   289.89   30.56   549.99   95.97   526.94     53.86
    4   277.01   22.51   547.62   117.77   539.83     52.38
    5   271.00   33.43   573.95   121.79   567.67     66.67
对于荧光强度和探针溶解动力学，标记纤维素膜的降解图案非常类似于细菌纤维素I的。因此，对于细菌纤维素来说，用这种标记纤维素膜可以在小于2小时内检测出内切葡聚糖酶的活性是合理的。
实施例18
将血红蛋白用荧光素-异硫氰酸盐异构体I(FITC)标记。将17.500g牛血红蛋白(Sigma，H-2625)溶解在6001 0.25M的钠缓冲液(pH＝9.0)中。将溶解在250ml 0.25M的钠缓冲液(pH＝9.0)的75mgFITC(Sigma，F-1522)剧烈搅拌下10分钟内滴加进。将该混合物在黑暗的室温下反应1小时。在PBS-缓冲液作用下，将过量的FITC通过在Filtron Amicon RA2000超滤掉，所述缓冲液含有在10.00L miliQ水中的80.0g NaCl(Merck 6404)，2.0g KCl(Merck 4936)，10.4g K2HPO4(Merck 5101)和3.17g KH2PO4(Merck 4873)，其pH＝7.2。
实施例19
将半乳甘露聚糖(刺槐豆胶)用荧光素-5-氨基硫脲标记。将溶解在250mL miliQ水中的3.0032g半乳甘露聚糖(Sigma，G-0753)用半乳糖氧化酶(Cibrina candolleana 8637/F9700806)在室温下氧化48小时。氧化后用几滴PHBAH试剂(在10.0mL 2％d NaOH溶液中含有150mg p-hydroxybenzosyrehydrazid，和500mg酒石酸钾钠)在95℃下处理小样品5分钟后，进行吸光(Abs410)。将混合物加热到90℃5分钟使该酶失活。加入溶解在2mLDMF中的75.2mg荧光素-5-氨基硫脲(分子探针F-121)，并将该混合物室温下黑暗中反应48小时。将标记的聚合物在400mL MeOH中沉淀，随后用EtOH水洗直到上清液中不再含有探针。将标记的聚合物再次溶解在水中并冷冻干燥。生成的量为：2.112g。
实施例20
制备一批新的细菌纤维素I：将含有大约900g得自木醋杆菌(Acetobacter Xyliumz)的湿细菌纤维素的3罐Nata de Coco以立方体形式(in cubes)用10L去离子水洗涤。然后用3L 1％的NaOH溶液洗涤该立方体。更换该碱液每天两次共5天。最后用3L去离子水洗涤该立方体，每天两次更换该水共5天。在韦林氏搅切器中均化该立方体并用去离子水(Cut-off 12-14000)透析4天。
实施例21
含有标记血红蛋白或标记半乳甘露聚糖的纤维素膜的制备：将实施例20的悬浮细菌纤维素(1mg/ml)在用Polytron PT 3000(Kinematica，Switzerland)以10000rpm速度分散和微原纤维化3分钟之前，与500μg/ml荧光素标记的血红蛋白或50μg/ml荧光素标记的半乳甘露聚糖和25μg/ml Keltrol T黄原胶(Kelco，chicago，USA)混合。分别将100μl、20μl和3μl该混合物加入到96、384和1536加样孔滴定板的每个加样孔中，37℃下干燥过夜。微量滴定板是带有MaxisorpTM表面的96孔(Cat.#442404)和384孔(cat.#464718)，购自丹麦的NUNC，而1536加样孔滴定板购自德国的Greiner labortechnik(cat.#782101)。
使用实施例21制备的膜检测酶。所有酶的测试都是在pH＝8.0的含有1mM CaCl2的50mM HEPES中进行。对于96、384和1635加样孔微量滴定板中进行的检测，每个加样孔中分别加入165μl、80μl和8μl的稀释酶。将该反应液在700rpm的Thermostar(BMG，德国)中40℃下培养40分钟。当使用96、384和1536加样孔滴定板时，孵育后分别将100μl、60μl和4μl样品转移到新的空白微量滴定板中，并在安装有合适的光导管的Polarstar Galaxy(BMG，德国)中分析荧光强度。空白96、384和1536加样孔滴定板分别购自Bibby Sterilin，England，cat#611F96BK；NUNC，Denmark，cat#264556；和Greiner labortechnik，cat#782076。
实施例22
使用含有标记血红蛋白的膜和实施例21的检测方法测试两种不同蛋白酶的活性。下表表示对于96、384和1536加样孔滴定板，除去的标记血红蛋白的量(用％w/w表示)：
96加样孔滴定板 384加样孔滴定板 1536加样孔滴定板
    Savinase
    0.25μg/ml     42％     47％     ND
    0.5μg/ml     50％     66％     42％
    1.5μg/ml     100％     100％     100％
    C-组分
    0.25μg/ml     16％     21％     ND
    0.5μg/ml     10％     12％     ND
    1.5μg/ml     12％     14％     ND
Savinase是购自Novo Nordisk A/S的蛋白酶，而组分C是KakudoS.等人；Purification，Characterization，Cloning and Expressionof a Glutamic acid-specific Protease from Bacillus lichiniformisATCC 14580；J.Biol.Chem.；1992；第267卷第33期，第23782-23788页中描述的谷氨酸特异蛋白酶。ND表示没有测出。
96、384和1536加样孔滴定板中荧光标记血红蛋白的缺失非常好地说明了酶的检测可以精确低到非常小的容量。
实施例23
使用含有黄原胶和标记半乳甘露聚糖的膜和实施例21的检测方法测试四种不同甘露聚糖酶的活性。下表表示对于96加样孔滴定板，除去的标记半乳甘露聚糖相对于BXM 3(10Mg/ml BXM 3＝100％)的量(用％w/w表示)：
  0.2μg/ml   10μg/ml
  BXM 1   9％   36％
  BXM 3   65％   100％
  BXM 5   40％   92％
  BXM 7   0％   21％
BXM 1、BXM 3、BXM 5和BXM 7公开在国际专利申请PCT/DK99/00314中。
结果表明，使用含有标记半乳甘露聚糖的纤维素膜，可以分类不同甘露聚糖酶并可以选择BXM 3以表示最佳性能。
实施例24
将实施例21的方法检测甘露聚糖酶的活性与编织布样检测甘露聚糖酶的活性进行比较。为了用荧光标记的半乳甘露聚糖酶染色编织布样，将织物浸没在一水溶液中，该水溶液含有0.225g/l未标记刺槐豆胶(Sigma，USA)、0.025g/l荧光素标记的刺槐豆胶和0.125g/l KeltrolT黄原胶(Kelco，Chicago，USA)。然后将织物通过辊子以去掉任何多余的染料溶液，随后黑暗中空气中干燥过夜。最后，将染色的织物用含有2g/l洗涤剂的14L蒸馏水在1小时内漂洗两次，并在黑暗下空气中干燥。
用编织布样对甘露聚糖酶活性的测试是这样进行的，40℃下用标记的编织布样培养甘露聚糖酶溶液40分钟，同时以700rpm的速度振动。随后，将溶液用板形洗涤器(plate washer)(EL 403H，Bio-TEkInstruments，Vermont，USA)抽气并用Polarstar Galaxy(BMG，Germany)测试织物中保留的标记半乳甘露聚糖的荧光。
除了测试保留在膜中的标记半乳甘露聚糖的荧光之外，使用含有黄原胶和标记的半乳甘露聚糖的膜以及实施例21的检测方法，用标记纤维素膜检测甘露聚糖酶的活性。
对比结果表示在下表中：
  μ/ml BXM 3   织物(改变％)   细菌纤维素(改变％)
  15.0   99.8   100
  5.0   110.4   106.0
  2.5   91.5   90.3
  1.0   51.2   66.7
  0.2   17.3   28.8
  0.0   0   0
该结果表明，对于织物和纤维素膜而言，荧光相对BXM 3甘露聚糖酶浓度的变化量类似。因此，底物从纤维素膜上的除去非常类似于底物从织物上的除去，并且当检测酶时可以在微量级容器中使用MFC膜代替织物。根据4次测试，织物和细菌纤维素膜的标准偏差分别为4-8％和2-8％，证明，使用的纤维素膜的测试更具有重复性。
实施例25
双重探针测试酶的专一性。
进行该试验是用于表明，纤维素膜可以混入两种不同酶底物来制备，其中不同的酶具有不同的专一性。通过混合两种不同的底物，每一种底物均用具有独特的光谱特性的探针标记，我们可以利用信号的比例将酶样品对两种底物均用的专一性进行分类。
为了用纤维素酶来解释该概念，制备了两种底物：用伊红标记的羧甲基纤维素(CMC-E)和用荧光素标记的细菌纤维素(BC-F)。用这两种底物的混合物在微量滴定板加样孔中制备膜，用两种不同纤维素酶中的一种孵育该膜：来自H.insolens的内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶V(这两者都是用上述A.oryzae描述的方法克隆和表达)。已知这两种酶具有不同的底物专一性。
试验：
按照上述方法制备BC-F。
CMC-E是按照下述步骤制备的：将1.005g CMC溶解在50mL水中，并用0.1N NaOH将pH值调整到5.9。加入48.9mg溶解在2mL DMF中的5-氨基伊红。1小时内以小份的形式加入1.24g EDAC。将反应混合物室温下搅拌过夜。将产物在15mL MeOH和500mL EtOH混合物中沉淀。将标记的聚合物用EtOH洗涤并冷冻干燥。
在96加样孔滴定板的每个加样孔中，将10mL CMC-E(0.5mg/ml)与100mL BC-F(1mg/ml)混合，并在50℃下孵育过夜形成双重标记膜。
制备浓度为0、62.5、125和250mg/L的EG I和EG V溶液。
在每个加样孔中，将25mL酶溶液和200mL缓冲液(0.05M tris，pH7.6)在37℃下孵育2小时。
从每个加样孔的上清液中取25mL作样品，并用200mL缓冲液稀释，用Polarstar荧光计测试515/555nm(伊红)和485/520nm(荧光素)处的荧光强度。每个数据都用空白样品的平均荧光强度修正，计算修正的伊红和修正的荧光素荧光强度之比作为酶专一性的指标。
结果
伊红荧光强度(修正的，任意单位)
    浓度(mg/L)     EG I     EG I     EG V     EG V
    0                    0±626
    62.5     1822     2436     3753     3268
    125     2489     2847     4928     4382
    250     2141     2672     5406     5312
荧光素荧光强度(修正的，任意单位)
    浓度(mg/L)     EG I     EG I     EG V     EG V
    0                     0±65
    62.5     1450     1720     6073     5666
    125     1856     2219     7180     6301
    250     2065     2897     9627     9882
修正的荧光强度之比(伊红/荧光素)
    浓度(mg/L)     EG I     EG I     EG V     EG V
    0                      ND
    62.5     0.80     0.71     1.62     1.73
    125     0.75     0.78     1.46     1.44
    250     0.96     1.08     1.78     1.86
从结果中可以看出，任何时候EG V酶都具有更高的E/F比，说明了该酶独立的专一性。由于EG V和EG I都是市售酶，每一个都具有独立的洗涤作用，因此这种试验形式能够快速决定纤维素酶是否具有类似EG I或EG V的底物专一性。
实施例26
使用细菌纤维素膜来试验蛋白质从固体表面上的降解
将荧光标记了的血红蛋白与细菌纤维素混合，纤维素膜是在聚苯乙烯96加样孔微量滴定板的加样孔中制备的。将纤维素膜干燥并用在蛋白酶的剂量-反应洗涤性能试验中。用Savinase蛋白酶(一种常规洗涤蛋白酶)测试洗涤剂的“去污”能力。
血红蛋白的标记
通过将15.4g蛋白酶溶解在600ml 0.25M NaHCO3(pH9.0)中和将156.8mg荧光素-5-异硫氰酸盐“异构体I”(FITC；分子探针F-143)溶解在250ml 0.25M NaHCO3(pH9.0)中，将FITC共价偶联到牛血红蛋白上(Sigma H-2625，lot.125H9310)。将这两种溶液混合并在室温下黑暗中搅拌60分钟。用4L Sephadex 25柱(AmershamPharmacia Biotech)凝胶过滤除去未连接的FITC。用甘油将收集的880ml样品补至最终浓度为50％(w/v)。加入0.1％(w/w)50％的戊酸酐(Merck 814393)并将混合物室温下搅拌1小时。
细菌纤维素：
细菌纤维素(BC)是由Nata de Coco(Del Nonte)这样制成的，将立方体在水中清洗，随后在1％NaOH中洗涤5整夜并在水中洗涤6整夜。随后将立方体在搅切器中均化并在miliQ水(12-14000截止(cut-off))作用下进行透析。最终产品的浓度为1g固体/L水。
带有标记的血红蛋白的纤维素膜的制备：
将制备的FITC-血红蛋白和BC按照血红蛋白∶BC之比为1∶10，1∶4和1∶2的比例混合，膜是通过将这些混合物在聚苯乙烯微量滴定板(Nunc269620)的加样孔中进行配制。将配制的混合物50℃下干燥一整夜。
在水中制备纯化的Savinase的不同浓度的样品，并溶解在6g/l市售洗涤剂中。每个加样孔中加入存在于洗涤剂中的总共165μl蛋白酶。室温下振动该板30分钟，取洗涤上清液100μl作样品，并转移到空白微量滴定板(Sterilin 611F96BK)上。用分光荧光计(BMG Polarstar)测试上清液的荧光(485nm处的激发，520nm处的发射)。
结果
荧光强度(任意单位)
    血红蛋白∶BC     1∶2     1∶4     1∶10
    μg蛋白酶/ml
    0     20745     14848     6086
    0.1     25687     16773     6437
    0.25     28659     20279     8210
    0.5     32892     25093     10779
    1     35339     30037     14336
    2     38813     35370     18134
    3     42860     38996     18118
    5     47854     41867     20472
在选择的条件中，洗涤上清液的荧光随酶剂量的增加而增加表明释放的血红蛋白的量增加，而荧光度随膜中标记的血红蛋白的增加而增加。该实施例还表明，在真实的清洁应用中具有优异性能的酶可以在使用纤维素膜代替真实织物的本发明试验体系中得到评价。

Claims (59)

1.一种筛选活性物质的方法，包括将含有该活性物质的样品与含有微原纤维化纤维素的纤维素膜接触并检测纤维素膜和活性物质之间的相互作用。
2.权利要求1的方法还包括如下步骤：
(a)将含有微原纤维化纤维素的纤维素膜沉淀在容积小于10ml的容器的至少一个内表面上，优选容器的底表面，
(b)将溶解或分散在液体中的活性物质加入到所述膜中，
(c)培养带有活性物质的膜，并且
(d)检测活性物质与纤维素膜之间的相互作用，优选检测由于相互作用而从膜中释放的化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中活性物质选自生物化合物、无机清洁化合物和有机清洁化合物。
4.权利要求3的方法，其中生物化合物是酶。
5.权利要求4的方法，其中酶选自氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂合酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
6.权利要求5的方法，其中酶是选自漆酶、氧化酶和过氧化物酶的氧化还原酶。
7.权利要求6的方法，其中过氧化物酶是盐过氧化物酶(haloperoxidase)。
8.权利要求5的方法，其中酶是选自纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的水解酶。
9.权利要求1-8的方法，其中在相互作用步骤中还存在一洗涤剂。
10.由权利要求1-9的方法鉴定的生物化合物。
11.一种筛选编码生物化合物的核酸序列的方法，包括：
(a)在表达系统中表达核酸序列，以制成生物化合物，
(b)将该生物化合物与纤维素膜接触，
(c)测试生物化合物和纤维素膜之间的相互作用，和
(d)选择发生可检测的相互作用的表达系统并恢复核酸序列。
12.权利要求11的方法，其中表达系统是体外偶联翻译/转录系统。
13.权利要求11的方法，其中表达系统是细胞表达系统。
14.权利要求13的方法，其中细胞表达系统是野生型细胞。
15.权利要求13的方法，其中细胞表达系统是宿主细胞培养物，其中的转化体含有核酸序列。
16.权利要求15的方法，其中宿主细胞选自细菌、古细胞和真菌。
17.权利要求16的方法，其中未转化宿主细胞不能清楚地表达生物化合物。
18.权利要求17的方法，其中缺失使未转化宿主细胞能够清楚表达生物化合物的核酸序列。
19.权利要求16的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细菌。
20.权利要求19的方法，其中大肠杆菌是大肠杆菌SJ2。
21.权利要求16的方法，其中宿主细胞是Electro-MAX DH10B细胞。
22.权利要求16的方法，其中宿主细胞是芽孢杆菌属细菌。
23.权利要求16的方法，其中真菌是酿酒酵母。
24.权利要求16-23的方法，其中宿主细胞是用质粒转化的。
25.权利要求24的方法，其中质粒是pSJ1678或pZErO-2。
26.权利要求24的方法，其中质粒含有能够使转化的宿主细胞抗抗生素的核酸序列。
27.权利要求26的方法，其中转化的宿主细胞抵抗选自氯霉素、四环素、卡那霉素、氨苄青霉素、红霉素或zeocin的抗生素。
28.权利要求11-27的方法，其中核酸序列是得自核酸序列源的基因库。
29.权利要求28的方法，其中核酸序列源是选自细菌细胞、古细胞和真核细胞的细胞。
30.权利要求29的方法，其中细菌细胞是芽孢杆菌属。
31.权利要求29的方法，其中真核细胞选自真菌细胞、人体细胞和植物细胞。
32.权利要求28-31的方法，其中核酸序列源是被体外基因改组修饰的细胞。
33.权利要求11-27的方法，其中核酸序列源是选自DNA、RNA、cDNA和人工基因的体外制成的核酸序列。
34.权利要求33的方法，其中体外制成的核酸序列是通过选自改组、随机诱变和PCR技术制成的。
35.权利要求12的方法，包括：
a)制备基因库，
b)将基因库中的基因片段分离在单个容器中，
c)扩大分离的基因片段，
d)进行扩大基因片段的体外偶联转录/翻译以表达生物化合物，
e)将每个独立容器中的生物化合物或其次级样品与纤维素膜接触，
f)孵育纤维素膜上的生物化合物，
g)检测纤维素膜和生物化合物之间的相互作用，
h)回收发生了相互作用的容器中的基因片段。
36.权利要求13的方法，包括：
a)预先繁殖和稀释含有核酸序列的细胞表达系统，
b)将该细胞表达系统分离在独立的容器中，
c)繁殖分离的细胞来增加每个独立的容器中每个细胞的克隆数目，
d)将每个独立容器中的细胞表达系统与纤维素膜接触，
e)孵育纤维素膜上的细胞表达系统，
f)检测纤维素膜和细胞表达系统产生的生物化合物之间的相互作用，并且
g)回收发生了相互作用的容器中的基因片段。
37.一种通过权利要求11-37的方法发现的编码生物化合物的核酸序列。
38.一种工业制备新生物化合物的方法，包括：
a)在细胞群或体外表达系统中，通过将细胞群与纤维素膜接触，鉴定表达生物化合物的细胞或系统，
b)选择生产生物化合物的细胞或系统，
c)鉴定编码生物化合物的核酸序列，
d)培养含有编码生物化合物的核酸序列的细胞以制备生物化合物，并且
e)回收生物化合物。
39.一种含有微原纤维化纤维素的改性纤维素膜，其中该膜还含有连接到纤维素膜上的物质。
40.权利要求39的纤维素膜，其中物质是通过共价键、离子键或氢键连接到纤维素膜上的。
41.权利要求40的纤维素膜，其中物质是在成膜后连接到膜的表面上。
42.权利要求39-41的纤维素膜，其中化合物选自染料、放射性化合物、非纤维素底物和非微原纤维化纤维素底物。
43.权利要求42的纤维素膜，其中染料选自吸光性染料和荧光染料。
44.权利要求43的纤维素膜，其中染料是荧光染料。
45.权利要求42的纤维素膜，其中放射性化合物选自S35、P32、H3和I125的同位素。
46.权利要求42的纤维素膜，其中非纤维素底物选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物聚合物、低聚物或单体、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酸的醇酯和脂肪酸的甘油三酯。
47.权利要求46的纤维素膜，其中碳水化合物聚合物是多糖。
48.权利要求42的纤维素膜，其中非微原纤维化纤维素底物是基本上无定形的纤维素。
49.权利要求46-48的纤维素膜，其中非纤维素底物或非微原纤维化纤维素底物是用染料标记的。
50.权利要求39-49的纤维素膜，其中膜的平均干厚度大约为10μm-100μm。
51.权利要求39的纤维素膜，其中物质是在成膜之前通过将物质与纤维素混合的方法连接到纤维素膜上的。
52.一种制备权利要求39-51的纤维素膜的方法，包括制备微原纤维化纤维素的悬浮液，将微原纤维化纤维素以膜的形式沉淀在一表面上，并在成膜之前、过程中或之后将微原纤维化纤维素与物质接触。
53.权利要求52的方法，包括：
(a)在一容器中制备微原纤维化纤维素在液体中的悬浮液，
(b)使微原纤维化纤维素沉淀在容器的表面上，
(c)除去液体。
54.权利要求53的方法，其中容器表面是由塑料、玻璃、金属、木头、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料制成的。
55.权利要求54的方法，其中容器容积小于10ml。
56.权利要求55的方法，其中容器表面是由塑料制成的，并且容器是微量滴定板上的一个加样孔。
57.权利要求53的方法，其中悬浮液中微原纤维化纤维素的浓度小于10mg/ml悬浮液，优选小于2mg/ml悬浮液，更优选小于1mg/ml悬浮液，最优选小于0.7mg/ml悬浮液。
58.权利要求53的方法，其中沉淀并干燥在表面上的微原纤维化纤维素的量小于250μg，优选小于200μg，最优选小于150μg。
59.一种用于筛选的测试容器，其中至少一个表面上覆盖有纤维素膜。
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