CN1361282A - 一种能够提高结构基因表达的内含子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够提高结构基因表达的内含子。其核苷酸序列如说明书所述。本发明还提供了一种含有本发明的内含子的结构基因;一种增强结构基因表达活性的方法;一种生物杀虫的方法;和一种提高植物抗虫活性的方法。

Description

一种能够提高结构基因表达的内含子及其应用

本发明涉及一种一种能够提高结构基因表达的内含子；以及利用该内含子提高目的基因表达活性的方法；和利用该内含子提高植物抗虫活性的方法。

据不完全统计，全世界每年因病虫害造成的损失约占农作物总产量的37％，其中13％是由虫害引起的(Gathehouse A.M.R.1992)。目前，对农作物害虫的防治主要依赖化学药物。化学杀虫剂在农业生产中的确起到了重要作用，但同时也带来了许多严重问题：一方面，不仅提高了生产成本同时还造成了严重的环境污染和食品中可怕的残毒。另一方面，化学杀虫剂的作用方式是非特异性的，在杀害虫的同时，也会毒害到有益的昆虫及害虫的天敌。从而危及到多种生物资源，破坏生态平衡。长此以往，将会使人类遭受难以估计的损失。为了解决这些问题，必须提高植物自身对害虫的抗性。

近几年来，基因工程技术的发展为培育抗虫作物提供了有力手段。利用基因工程技术把外源抗性基因转化至农作物中并使其表达，从而使农作物获得抗性。目前，已有多种途径可获得抗虫植物。目前，在抗虫基因工程中利用的抗虫基因主要包括苏云金杆菌的δ-内毒素基因和植物来源的抗虫基因(如蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因等)。天然的苏云金杆菌δ-内毒素基因在植物中表达水平低，必须经过人工修饰后才能在抗虫基因工程中发挥作用(Jouanin L.1998；Estruch J.J.1997；Perlak F.J.1991)。并且这种抗虫转基因食物难以被人们接受，所以这种基因不适于转化粮食作物。植物来源的蛋白酶抑制剂是一类含量较为丰富的蛋白质，分子量小，性质稳定，抗虫谱广，故在抗虫工作中有重要作用。蛋白酶抑制剂杀虫机理在于：它能与昆虫消化道的特异蛋白消化酶相互作用，形成酶—抑制剂复合物，阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。一旦昆虫摄食蛋白酶抑制剂就会影响对外来蛋白的消化，最终造成昆虫的非正常发育或死亡(Jouanin L.1998)。在正常情况下，人类和动物所摄取的食物本身就含有蛋白酶抑制剂，并且植物蛋白酶抑制剂经过煮熟后就会失活，因此从食品安全性上考虑，利用植物蛋白酶抑制剂进行抗虫研究是一种最为安全的策略(Duan X.L.1995)。

尽管植物蛋白酶抑制剂有许多优点，但是和δ-内毒素相比，其杀虫活性较低。如在体外杀虫活性分析中发现，当所饲喂的1ml食物中含有50-500ngδ-内毒素蛋白时，对害虫具有明显的毒杀能力，然而当所饲喂的1ml食物中含有毫克级的植物蛋白酶抑制剂蛋白时，才能对害虫具有明显的毒杀能力(Koziel M.G.1993；Boulter D.1993；Shah D.M.1995)。由此看来，要想利用植物蛋白酶抑制剂基因进提高植物的抗虫能力，必须提高植物蛋白酶抑制剂基因在转基因植物中的表达水平。

在抗虫植物转基因工程中，提高外源基因的表达活性的主要途径是利用强启动子。但是我们认为除了利用外源的强启动子外，基因自身的结构(如内含子)也能影响基因的表达水平。目前，植物蛋白酶抑制剂基因在抗虫中的应用正逐渐受到国内外科学工作者的关注。在国内，植物蛋白酶抑制剂在抗虫工程中应用的研究主要集中于豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和水稻胰蛋白酶抑制剂基因(刘春明1992)。在国外，有更多的植物蛋白酶抑制剂基因在抗虫研究中应用，但是国内外这些研究大都集中于这些基因cDNA杀虫活性的研究上。

基于上述观点，本研究利用PCR技术从番茄中首次分离了一种含有内含子的新型的番茄蛋白酶抑制剂II基因(tin2i)，同时也分离了该基因的cDNA序列，将这两类基因转化到烟草植株中，并比较了这两种序列在转基因植物中的表达活性。另外该基因的内含子能够提高目的基因的表达活性，并且这种提高具有增强子的特性。以期更为深入了解内含子在基因表达调控中的作用机理，同时更为重要的是为抗虫基因工程奠定了应用基础。

本发明的一个目的是提供一种能够提高结构基因表达的内含子。

本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的内含子的结构基因。

本发明的又一个目的是提供一种增强结构基因表达活性的方法。

本发明的又一个目的是提供一种生物杀虫的方法。

本发明的又一个目的是提供一种提高植物抗虫活性的方法。

本发明提供了一种能够提高结构基因表达的内含子，它具有如下所示的核苷酸序列：

gtaagatttt cctttagtct cttttttttt ttttaaaaaa aagagaaaaa tattggttta

tacatacaca agtagtttta tatttttcct tatattatat ttgttgtag

本发明的内含子可以通过一个或多个核苷酸的替换、颠换、缺失和/或增加，并同时具有提高结构基因表达的功能。本发明还提供了一种含有本发明的内含子的结构基因。本发明的内含子可以以任意方向插入在结构基因的任意位置，均能够提高结构基因的表达。这种结构基因可以是编码番茄蛋白酶抑制剂II的基因。

本发明提供了一种具有杀虫活性的新型番茄蛋白酶抑制剂II基因(tin2i)，该基因的全长为684bp，在9bp至60bp之间和170bp至564bp之间是两个开放阅读框，tin2i基因包含了447bp的完整编码序列，编码148个氨基酸和一个TGA终止密码子。61bp至169bp之间存在着一个109bp的内含子序列，命名为TPI。A+T含量丰富，约占内含子核苷酸总数的80.7％(在109个核苷酸中A+T核苷酸总数为88个)，内含子的两端具有典型的GT和AG双核苷酸序列。通过国际互联网络与GenBank/EMBL/DDBJ核苷酸数据库，用BLAST软件对tin2i基因进行同源性比较，结果显示，该基因是首次从番茄中分离的含有内含子序列的新型的番茄蛋白酶抑制剂II基因。

  ccaaatgctt gcacctttaa ttgtgatcca aatattgcct attcaagatg tccccgttca    420caaggaaaat cgttaattta tcccaccgga tgtaccacgt gttgcacagg gtacaagggt    480tgctattatt ttggtaaaga tggaaagttt gtatgtgaag gagagagtga tgaacccaag    540gcaaatatgt accctgtaat gtgactctag acttgtccat cttctggatt gcccaaaatt    600aagtaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacttatat aatgacatgc taatcattat    660aatgtgggga tcaagttgtg tgtt                                           684

其中方框内的核苷酸序列为内含子序列。

番茄蛋白酶抑制剂II氨基酸序列及其蛋白质的结构域分析 二肽Phe-Asn具有抑制胰凝乳蛋白酶的活性；

二肽Arg-Glu是抑制胰蛋白酶的活性位点。

利用国际互联网络将番茄的tin2i推导的番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质的氨基酸序列在GenBank/EMBL/DDBJ等氨基酸数据库中的比较结果显示，番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质与已报道的蛋白酶抑制剂类蛋白质有高度保守的结构域。番茄蛋白酶抑制剂II的第87位-第88位氨基酸之间的二肽Phe-Asn具有抑制胰凝乳蛋白酶的活性，第30-31位的二肽Arg-Glu是抑制胰蛋白酶的活性位点。

本发明还提供了一种增强结构基因表达活性的方法，该方法包括：将本发明的内含子插入待表达的结构基因；使用插入内含子后的结构基因构建表达载体并在宿主中进行表达。

例如，将特异性启动子(伤诱导启动子)或组成型启动子(如35S启动子)—多克隆位点—终止区(如NOS终止子)构成嵌合结构，内含子TPI以任意方向插入嵌合基因的任何位置。然后将上述结构置于T-DNA的左、右边界内(如pBin19)，构成真核生物表达载体。用任意具有ATG起始密码子的目的基因插入上述结构的多克隆位点。利用农杆菌介导的转化方法或基因枪转化方法转化烟草或其他植物的外植体，或愈伤组织，获得转基因植株，其插入的目的基因的表达活性增强。

本发明还提供了一种生物杀虫的方法，包括：将本发明的内含子插入番茄蛋白酶抑制剂II基因；在任何合适的宿主中表达并纯化得到的番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质；将得到的番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质喷洒在植物上。

例如，在真核生物表达系统中表达tin2所编码的蛋白质，并纯化番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质。将纯化的蛋白质或表达该蛋白的真核细胞裂解液喷洒在植物上，能够抑制棉铃虫幼虫的生长，并杀死幼虫。

本发明还提供了一种提高植物抗虫活性的方法，包括：使用上述的含有本发明的内含子的番茄蛋白酶抑制剂II基因构建植物表达载体；使用所构建的表达载体转化植物细胞；培养转化的植物细胞生成植株。

例如，将tin2i基因与特异性启动子或组成性启动子和真核生物表达载体构建抗虫的植物表达载体。利用农杆菌介导的转化方法或基因枪转化方法转化烟草和生菜的外植体或愈伤组织，获得抗虫活性明显提高转基因植株。

实施例

1 tin2i基因克隆的方法

根据Graham J.S.等人1985年从番茄植株中分离的番茄蛋白酶抑制剂II基因的cDNA序列，设计一对引物。从受伤诱导的番茄中分离到番茄蛋白酶抑制剂II基因的cDNA序列，同时又从番茄基因中分离了番茄蛋白酶抑制剂II基因的基因组DNA序列，利用Genetyx软件对这两种序列进行同源性比较，结果表明，从番茄基因组中分离的DNA片段中含有一个长度为109bp内含子序列(TPI)，这是我们首次发现的该基因的新的结构特征，据此将该基因命名为tin2i基因。

2.内含子TPI提高目的基因表达活性的相关实验

将内含子按正向和反向两种形式各自分别插入到植物表达载体pBI121的GUS报告基因上游与下游，构成4种结构不同的重组质粒pBTB1、pBTB7、pBTE2和pBTE4。把上述4种表达载体和pBI121质粒经农杆菌介导侵染烟草叶片外植体后，用荧光分析仪检测内含子对GUS报告基因瞬时表达活性的影响。与pBI121质粒的结果相比，内含子正向插入GUS基因编码区上游时(pBTB1)，GUS瞬时表达活性提高了约2倍；内含子反向插入GUS基因编码区上游时(pBTB7)，GUS基因瞬时表达活性提高了约4倍；内含子正向插入GUS基因编码区的下游时，GUS基因的瞬时表达活性提高了约9倍(pBTE2)；内含子反向插入GUS基因编码区的下游时，GUS基因的瞬时表达活性提高了约5倍(pBTE4)。这些事实说明，本实验分离的番茄蛋白酶抑制剂II基因的内含子TPI序列能够有效地增强报告基因GUS的表达活性，而且这种增强作用与TPI序列的插入方向和位置均无关系，具有明显的增强子特性。

样品	GUS活性(pmol 4-MU/min/μg protein)
					1	2	3	平均值
	CK	0.14	0.16	0.16					0.15
pBI121					5.50	5.20	6.00	5.20
	pBTB1	11.90	13.70	12.20					12.60
pBTB7					22.70	21.00	23.20	22.30
	pBTE2	48.30	50.40	48.20					48.90
pBTE4					27.20	30.00	28.90	28.70
	pBTPI	57.60	50.00	58.00					55.20

含有内含子的各种植物表达载体转化的烟草叶片外植体中GUS基因的瞬时表达活性

3 tin2核苷酸序列杀死害虫的相关实验：

将tin2核苷酸序列克隆在大肠杆菌表达载体上，转化大肠杆菌，经过IPTG诱导表达后，表达产物经过镍柱纯化，得到了分子量约20kD的融合蛋白。活性分析表明番茄蛋白酶抑制剂II能够抑制胰蛋白酶的活性。

4 tin2i基因的杀虫活性相关的实验

为了检测tin2i基因杀虫活性，我们构建了含有tin2i基因及其对应的cDNA序列的两种植物表达载体，转化到模式植物烟草中。对番茄蛋白酶抑制剂II的活性进行了相关分析。

(1)转tin2i基因烟草植株中蛋白酶抑制剂II活性的体外检测

因为番茄蛋白酶抑制剂II能够抑制胰蛋白酶的活性，而胰蛋白酶与底物TAME作用后，其产物能够在247nm处产生光吸收。根据光吸收值的大小，能够计算出相应的胰蛋白酶活性。因此，如果在反应混合物中分别加入等量的底物TAME、等量的标准胰蛋白酶和不同量的转基因烟草叶片提取物。那么随着叶片提取物量的提高，蛋白酶抑制剂的量也相应提高，这样反应混合物中胰蛋白酶的活性则会降低，247nm处的光吸收也就降低，这就是测定番茄蛋白酶抑制剂活性的原理。

据此，我们提取了转基因植株的叶片总蛋白，并检测了叶片提取物对胰蛋白酶的抑制活性。随着转基因烟草叶片蛋白质提取物量的增加，转基因烟草植株的反应体系中所剩余的胰蛋白酶活性均逐渐降低。表1显示了转tin2i基因烟草植株T22和转番茄蛋白酶抑制剂II基因的cDNA的植株CT22胰蛋白酶活性检测结果均逐渐降低。当T22植株叶片蛋白质提取物用量达25.0μg时，反应混合物中胰蛋白酶的活性仅剩下50％；当CT22烟草植株叶片蛋白质提取物用量达25.0μg时，反应混合物中胰蛋白酶的活性仍剩下70％。在非转基因烟草中，尽管也存在着蛋白酶抑制剂活性，但这种活性极低，当叶片蛋白质提取物用量达25.0μg时，反应混合物中胰蛋白酶的活性仍高于90％。

这个实验初步表明tin2i基因和tin2基因能够在转基因烟草中能够正确表达出相应的蛋白酶抑制剂活性，并且在转化tin2i基因的烟草中，番茄蛋白酶抑制剂的活性较其相应cDNA的转基因植株更强。

表1转基因烟草中胰蛋白酶抑制剂活性测定

显示随着叶片总蛋白的增加，剩余的胰蛋白酶活性的变化，所得数据是3次测定的平均值

(2)转tin2i基因烟草植株的对棉铃虫的致死实验

分别取两株转tin2i基因植株和一株非转基因对照烟草植株的第4片展开叶，用0.1％的次氯酸钠溶液浸泡5分钟，进行表面消毒，然后用清水冲洗后晾干。将每个叶片剪成直径为5cm的叶盘，放在经高压消毒过的5cm平皿中(平皿的底部铺有一张用水浸湿的滤纸)，每个平皿接入5头棉铃虫2龄幼虫，上面盖上保鲜膜，盖上盖，于26℃培养箱中培养3天，3天后观察到对照烟草植株的叶片被虫取食的非常明显，并且幼虫体积明显大于接种时的虫体；转基因烟草T21和T22植株叶片基本无虫食现象，并且幼虫的体积明显小于对照；同时也观察到棉铃虫T21、T22植株叶片上均有3头死亡的幼虫，这个实验表明tin2i基因对棉铃虫具有较强的毒杀能力。

(3)转基因烟草植株的杀虫活性检测

我们对5株转tin2i基因烟草植株T21、T22、T24、T25、T27和5株转相应cDNA序列的烟草植株CT22、CT23、CT24、CT26、CT27进行了全面的杀虫活性实验。叶片的处理同上，将叶片用打孔器打成直径为2cm小圆片，放在24孔盒中，每个孔内放入2片小圆片，每个有小圆片的孔内接入棉铃虫2龄幼虫1头，接好虫后，将24孔盒用保鲜膜封好，盖上盖，并用橡皮筋勒紧，每个4个24孔盒为一个处理，总需11×96头2龄幼虫。接虫10孔盒放于(27+1)℃的恒温光照培养箱，3天后检查棉铃虫幼虫取食和存活情况，用方差分析软件进行数据处理，结果表明，尽管不同转基因植株之间的杀虫活性有明显的差异，但转基因烟草植株表现出明显的杀虫活性。(表2)。

               表2转基因烟草植株的杀虫检测

烟草植株	幼虫平均死亡率(％)(SEM)	差异显著性*
			T21T22T24T25T27CT22CT23CT24CT26CT27对照烟草植株	22.9+4.361.5±4.633.3±7.26.8+2.311.7+0.824.0+2.012.7±2.45.6±1.44.1±2.13.3+1.12.8+1.4	bcabdcdbccddddd

*a表示致死率大于50％，杀虫活性显著；b表示致死率在30％-50％，杀虫活性显著；bc表示致死率在20-30％之间，杀虫活性为较显著；cd，d代表致死率小于20％，杀虫活性不显著。

从表2中可以看出，在5株转化tin2i基因的烟草植株中，T22植株的杀虫活性最强，使得棉铃虫的死亡率为61.5％，T21和T24植株的杀虫活性分别为22.9％和33.3％，虽然低于T22植株，但仍显著高于对照烟草植株。T25、T27植株使得幼虫的死亡率分别为6.8％和11.7％，与对照烟草的杀虫活性(2.8％)无显著差异。而在5株转化tin2基因的烟草植株中，CT22植株的杀虫活性为24.0％，与对照烟草植株的杀虫活性有较显著的差异，而其他4株转tin2-cDNA基因的烟草植株中的杀虫活性与对照无明显差异(表2)。

由此看来，转tin2i基因的5株烟草植株的杀虫活性明显高于转tin2-cDNA的烟草植株。所以可以说，含有内含子的tin2i基因在抗虫工程中具有很高的价值，为转基因抗虫研究提供了一种新的手段。

5.tin2i基因及其内含子在生物学中的应用

利用内含子作为增强子提高许多有价值的基因在真核生物中的表达水平；利用tin2i基因提高转基因烟草、生菜的抗虫活性。从而提高农作物的产量和改良农作物的品质。

Claims (8)

1.一种能够提高结构基因表达的内含子，它具有如下所示的核苷酸序列：

gtaagatttt cctttagtct cttttttttt ttttaaaaaa aagagaaaaa tattggttta

tacatacaca agtagtttta tatttttcct tatattatat ttgttgtag

2.一种通过对权利要求1所述的内含子进行一个或多个核苷酸的替换、颠换、缺失和/或增加而得到的，并同时具有提高结构基因表达功能的核苷酸序列。

3.一种含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的结构基因。

4.按照权利要求3所述的结构基因，它编码番茄蛋白酶抑制剂II。

5.按照权利要求4所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列：

tatccatcat ggctgtccac aaggaagtta attttgtcgc ttacctacta attgttcttg    60

gtaagatttt cctttagtct cttttttttt ttttaaaaaa aagagaaaaa tattggttta    120

tacatacaca agtagtttta tatttttcct tatattatat ttgttgtagg aatgtttcta    180

tatgttgatg ccaaggcttg tactagagaa tgtggtaatc ttgggttcgg gatatgccca    240

cgttcagaag gaagtccgct aaatcccata tgcatcaatt gttgctcagg ctataagggt    300

tgtaattatt ataattcttt cggaaaattt atttgtgaag gagaatctga tccaaaaagg    360

ccaaatgctt gcacctttaa ttgtgatcca aatattgcct attcaagatg tccccgttca    420

caaggaaaat cgttaattta tcccaccgga tgtaccacgt gttgcacagg gtacaagggt    480

tgctattatt ttggtaaaga tggaaagttt gtatgtgaag gagagagtga tgaacccaag    540

gcaaatatgt accctgtaat gtgactctag acttgtccat cttctggatt gcccaaaatt    600

aagtaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacttatat aatgacatgc taatcattat    660

aatgtgggga tcaagttgtg tgtt                                           684

6.一种增强结构基因表达活性的方法，该方法包括：

a.将权利要求1或2所述的内含子插入待表达的结构基因；

b.使用插入内含子后的结构基因构建表达载体并在宿主中进行表达。

7.一种生物杀虫的方法，包括：

a.将权利要求1或2所述的内含子插入番茄蛋白酶抑制剂II基因；

b.在任何合适的宿主中表达并纯化得到的番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质；

c.将得到的番茄蛋白酶抑制剂II蛋白质喷洒在植物上。

8.一种提高植物抗虫活性的方法，包括：

a.使用权利要求4所述的基因构建植物表达载体；

b.使用所构建的表达载体转化植物细胞；

c.培养转化的植物细胞生成植株。