CN1329820A - 一种生产瘪籽柚果实的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产瘪籽柚果实的方法,属于植物新品种选育技术领域。其特征在于,通过细胞融合获得种间、属间异源四倍体体细胞杂种,并采用细胞学、同工酶、RAPD等方法进行遗传鉴定,将柑桔体细胞杂种花粉授与二倍体单胚性多籽柚品种,直接生产出瘪籽柚果实。与现有技术相比,本发明既能提高柚子的座果率,又能直接大量生产种子败育的瘪籽柚。
Description
本发明属于植物新品种选育技术领域，是一种使柚子果实中的种子败育生产瘪籽柚的方法，其国际专利分类号是A01H 1/02。
柚(Citrus grandis)是我国和东南亚的特有柑橘类型，具典型单胚性。沙田柚是我国最有名的地方品种，属自交不亲和类型。该品种及由它产生的品种遍及我国柑橘产区，我国目前的柚品种主要问题是种子多，例如广西出产的沙田柚为我国迄今品质最佳的柚子品种，但其唯一的缺点是每果含种子100余粒，这一不利性状已成为影响其出口创汇和市场竞争的主要因素。多年来，柑橘育种工作者一直在努力选育无核品种，但见效不大。我国现有的无核柚品种，如官溪蜜柚为无核品种，但果实粒化(果肉失水变干)严重，耐贮性不好，品质也变差。因此，改良沙田柚，使其产生种子败育生产瘪籽的柚子具有重要意义。
现有的柑橘育种实践表明，通过倍性育种，即培育三倍体可以达到无核。60年代，以美国Soost等为代表的育种工作者开始进行人工培育无核柑桔品种的研究，通过二倍体与同源四倍体杂交，培育了‘Oroblanco’葡萄柚等三倍体无核品种(Soost RK，Cameron JW，1980，Oroblanco，a triploid pummelo-grapefruit hybrid.HortScience，15：667-669)。但柑桔天然同源四倍体较少，人工诱变也较为困难，而且同源四倍体往往育性较低，限制了该育种途径的广泛应用，而且这一途径耗时长，Soost等人培育以上品种花了近20年的时间。
进入八十年代，柑桔细胞融合技术的发展和应用为柑桔无核育种提供了新的思路。1985年Ohgawara等]获得了柑桔属间体细胞杂种(Ohgawara T et al.1985，Somatichybrid plants obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Poncirus trifoliata.Theor Appl Genet 71：1-4)。迄今世界上已获得100余个组合的种间、属间异源四倍体体细胞杂种。但是这些柑橘体细胞杂种并未用于培育无籽柑橘特别是直接用于柚子果实品质的改良上。
本发明的目的在克服已有技术的不足，通过细胞融合，人工于创造柑桔种间、属间异源四倍体体细胞杂种，并利用异源四倍体体细胞杂种花粉授与二倍体柚子花后，利用其三倍体胚易败育的特点，克服了多籽柚果实以及已有无籽柚果实的不足，既达到使其种子败育，又达到提高柚子品质的目的。
本发明是这样实现的：一种培育无籽柚果实的方法，包括原生质体融合，培养再生，倍性及杂种鉴定，育性检测选育过程，通过采用细胞融合经培养，鉴定获得柑桔异源四倍体体细胞杂种，培育该体细胞杂种，将其花粉授与二倍体将产生三倍体胚和四倍体胚乳。三倍体胚发育到80-90天时，由于胚∶胚乳的倍性较正常的2∶3大，而产生败育。此时，果实已渡过第二次生理落果期，种子的停止发育并不影响座果和果实的生长。这一授粉方式的最终结果是，果实成熟时，种子败育，从而生产出瘪籽或无籽柚子果实。另外，原来输送给种籽的养分转而输送给果实汁囊，果实含糖量有所提高。
本发明的进一步的过程是：将亲本(柑橘)之一的悬浮细胞系原生质体与另一不同种或属亲本的叶肉原生质体进行细胞融合、培养并再生植株。采用细胞学、同工酶、RAPD等方法进行杂种鉴定，确定种间、属间异源四倍体体细胞杂种。柑桔体细胞杂种开花后，对杂种的花粉进行育性评价，为育性强的组合的花粉授与二倍体单胚性多籽柚品种，果实成熟时，种子败育，从而生产出无籽(瘪籽)柚果实。原来输送给种子的养分转而输送给果实汁囊，果实可溶性固形物提高了。
本发明的具体细节是：分别建立融合两亲本的悬浮细胞系和离体无菌小苗，酶解法分别获得双亲的胚性细胞悬浮系原生质体和叶肉原生质体。对双亲原生质体采用聚乙二醇或电融合法诱导融合，电融合参数为：交变电场强度125V/cm，作用时间60s，直流电场强度1250V/cm，波宽30-50us，脉冲间隔0.5s，脉冲个数5个。电融合后离心3-5分钟，在BH3培养基上进行液体浅层培养，及时降低参透压并扩大培养面，再生胚状体经诱导生芽、生根或试管嫁接后移至土壤中。采用苏木精染色法对再生植株进行根尖或茎尖染色体计数，确定倍性水平。对双亲及再生四倍体植株进行POX、GOT同工酶分析或RAPD分析，综合鉴定出种间、属间异源四倍体体细胞杂种植株。杂种植株开花后，以醋酸洋红染色法和发芽力测定法明确其育性，将其花粉授与沙田柚品种，以刺激沙田柚座果。沙田柚果实成熟时，产生瘪粒种子或种痕。
本发明的效果是通过细胞融合技术和现代分子生物学检测技术，人工创造了一批柑桔种间、属间体细胞杂种植株，并针对国内外柚生产中的问题，创造性地提出了以柑桔体细胞杂种花粉授于二倍体柚果实进而生产无籽柚果实的新思路，这一发明已经得到多次实验和生产实践的证实。到目前为止已获得柑橘属间提细胞杂种7个，种间杂种9个，如实施例一的表1所示。本发明的进一步实施必将对我国无籽柚果实产业化和柚子果品的出口产生积极的影响。
本发明的积极效果还可以通过以下的实施例得到说明
实施例1表1本发明通过细胞融合途径获得的异源四倍体柑橘体细胞杂种名录组合名称 学名 育成年份属间杂种枳壳＋橘柚 Poncirus trifoliata＋Tangelo(C.reticulata×C.paradisi) 1997金柑＋伏令夏橙 Fortunella crassifolia cv.Meiwa＋C.sinensis cv. 1990
Valencia澳洲指橘＋椪柑 Microcitrus papuana＋C.reticulata cv.Ponkan 1997长寿金柑＋红橘 F.obovata＋C.reticulata cv.Hongju 1998黄皮＋脐橙 Clausena lansium cv.Jixin＋C.sinensis 1997九里香＋橘柚 Murraya pantculata＋Tangelo(C.reticulata×C. 1996paradisi)枳壳＋红橘 P.trifloiata＋C.Reticulata cv.Hongju 1997种间杂种甜橙＋粗柠檬 C.sinensis cv.Hamlin＋C.jambhiri 1990甜橙＋宜昌橙 C.sinensis cv.Valencia＋C.ichangensis 1991橘柚＋粗柠檬 Tangelo(C.reticulata×C.paradisi)＋C.jambhiri 1996脐橙＋葡萄柚 C.sinensis cv.Skagg’s Bonanza＋C.paradis cv.Marsh 1996脐橙＋枸头橙 C.sinensis cv.Bonanza＋C.aurantium cv.Goutou 1997脐橙＋柠檬 C.sinensis cv.Newhall＋C.limon cv.Eureka 1997红橘＋粗柠檬 C.reticulata cv.Hongju＋C.jambhiri 1997脐橙＋粗柠檬 C.sinensis cv.Newhall＋C.jambrihi 1997红橘＋枸头橙 C.reticulata cv.Hongju＋C.aurantium 1998
实施例2
表2本发明培育的柑橘体细胞杂种花粉授以沙田柚果实的种籽状况
| 比较项目 | 授以普通二倍体酸柚花粉的果实 | 授以体细胞杂种(HR)花粉的果实 | 授以体细胞杂种(RB)花粉的果实 |
| 正常(粒/果) | 48.3 | 0 | 1 |
| 瘪粒(粒/果) | 18.3 | 28 | 23.3 |
| 小瘪(粒/果) | 8.7 | 15.3 | 18.7 |
| 种痕(粒/果) | 52.3 | 80.2 | 112.3 |
| 总数(粒/果) | 127.6 | 123.6 | 155.3 |
| 种籽总重(g果/) | 34.5 | 6.35 | 6.17 |
由表2可见，与对照相比(用普通二倍体酸柚授粉)，授体细胞杂种花粉后的沙田柚果实饱满种子由对照的48.3粒/果下降到1粒/果，最少的为0粒饱满种子。
实施例3表3柑桔体细胞杂种花粉授以沙田柚果实后的果实经济性状分析
| 比较项目 | 授以普通酸柚花粉的果实 | 授以体细胞杂种(HR)花粉的果实 | 授以体细胞杂种(RB)花粉的果实 |
| 单果重(g) | 1027.50 | 821.25 | 878.75 |
| 纵径(cm) | 16.80 | 17.22 | 17.40 |
| 横径(cm) | 14.35 | 13.43 | 13.30 |
| 果皮厚(cm) | 1.15 | 1.55 | 1.23 |
| 果皮重(g) | 520.0 | 490.84 | 532.9 |
| 可溶性固形物(％) | 13.5 | 15.0 | 16.0 |
| 柠檬酸(％) | 0.26 | 0.26 | 0.26 |
| 可食率(％) | 46.03 | 39.46 | 38.66 |
由表3可见，与对照相比(用二倍体酸柚授粉)，授体细胞杂种花粉后的沙田柚果实可溶性固形物含量提高了2.0个百分点。
与已有技术相比，本发明具有如下优点：1)细胞融合方法创造异源四倍体，不仅克服了不同种间、属间的生殖隔离，效率较高，而且比同源四倍体花粉育性高。2)我国柚产区人工授粉较为普遍，以柑桔异源四倍体体细胞杂种花粉代替二倍体酸柚花粉，授与沙田柚，不仅不影响座果和产量，果实由多籽变无籽，而且果实含糖量提高了1-2个百分点。
Claims (1)
1、一种生产瘪籽柚果实的方法，包括原生质体融合，培养再生，倍性及杂种性鉴定，育性检测，有性杂交过程，其特征在于，采用细胞融合，经培养，鉴定，获得柑桔异源四倍体体细胞杂种，将其花粉授与二倍体柚，直接生产种子败育的瘪籽柚果实。
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