CN1329510C

CN1329510C - 一种微球菌两级复凝固定化方法

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Publication number: CN1329510C
Application number: CNB2004100875688A
Authority: CN
Inventors: 李培军; 李海波; 鞠京丽; 张轶; 许华夏
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2024-11-17
Also published as: CN1778910A

Abstract

本发明涉及向Na·Alg溶液里加入1ml吐温80和微球菌，在40-45℃，通过9#针头注射器，控制下滴速度40-60滴/分钟，向Gel和CaCl₂混合液中滴加，稳定3.5-5h，然后在CaCl₂溶液中二次钙化10-15min，随后在CS溶液中进行二级复凝聚反应2-3h，再利用柠檬酸囊内液化5-8min，以无菌生理盐水水浸泡6-24h，增殖培养制得微胶囊。本发明优点为：微球菌生理活性良好，微胶囊囊壁的机械强度高、壁结构均匀，微胶囊的缓释性能优异。

Description

一种微球菌两级复凝固定化方法

技术领域

本发明涉及细胞固定化生物制剂，尤指微球菌(Micrococcus sp.)两级复凝固定化方法，具体地说是一种海藻酸钠(Na·Alg)—明胶(Gel)—氯化钙(CaCl₂)—氯化钙(CaCl₂)—壳聚糖(CS)两级复凝微胶囊工艺。

背景技术

微胶囊包埋细菌技术因包埋细菌数量大、缓释、生物相容性好等特点，一直以来被人们广泛关注，已经在制药、食品、酿造、提纯等领域得到了普遍应用；但由于微胶囊壁(厚度)薄，机械强度较小，长期使用易破碎等缺陷，限制了其广泛范围。

传统增强微胶囊壁厚度的方法有两种：一是选用强度高的载体材料，一是延长制囊时间，以增加微胶囊壁厚。但是高强度载体的生物相容性和水溶性一般较差，制得的微胶囊缺少弹性；延长制囊时间将导致胶囊壁产生过多的单质渗出层，并使钙化层过度增厚，阻塞囊壁孔隙，不利于氧气、营养物质以及其它的小分子物质自由通过微胶囊膜进行物质传递，因此，如何在保证微胶囊壁渗透性的基础上，最大限度的提高囊壁强度，是微胶囊技术能否大规模实际应用的关键控制性因素。

微球菌Micrococcus sp.菌体尺寸微小，适宜的微胶囊壁孔径不宜过大，否则容易泄漏；一般在Na·Alg—CS复凝制囊时，为了提高强度而延长时间，导致囊壁孔隙阻塞，固定化失败。

发明内容

本发明的目的在于利用Na·Alg-Gel-CaCl₂一级复凝、CaCl₂二次钙化和CS两级复凝技术，在保证囊壁传质渗透性的前提下，提高微胶囊壁的机械强度，成功固定化微球菌Micrococcus sp.，制备性能优良的微生物菌剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：向Na·Alg溶液里加入1ml吐温80和微球菌，在40-45℃，通过9#针头注射器，控制下滴速度40-60滴/分钟，向Gel和CaCl₂混合液中滴加，稳定3.5-5h，然后在CaCl₂溶液中二次钙化10-15min，随后在CS溶液中进行二级复凝聚反应2-3h，再利用柠檬酸囊内液化5-8min，以无菌生理盐水水浸泡6-24h，增殖培养，备用。

微球菌两级复凝固定化方法，可按如下步骤进行具体操作，

1)壁材配制：按质量百分比配制1.5-2.5％海藻酸钠(Na·Alg)的水溶液(用自来水浸润24h)，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃)，加入与海藻酸钠的水溶液体积比为200∶1的无菌吐温80，并加入海藻酸钠的水溶液总质量15-30％的微球菌液体种子(菌龄16-20h)，搅拌均匀；

2)一级芯材溶液配制：按质量百分比配制含1.5-2.5％明胶(Gel)和1.0-2.0％氯化钙(CaCl₂)的水溶液，pH＝5.0-7.0，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min)，备用；

3)二次钙化溶液配制：按质量百分比配制0.2-0.8％氯化钙(CaCl₂)的水溶液，灭菌冷却(使用前于121℃下湿热灭菌20min)，备用；

4)二级芯材溶液配制：按质量百分比配制0.1-0.7％壳聚糖(CS)的水溶液，pH＝3.5-5.5，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min)，备用；

5)囊内液化液配制：按摩尔浓度配制0.055mol/L柠檬酸水溶液，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min)，备用；

6)微胶囊制备：在40-45℃下，将壁材溶液在无菌条件下按40-60滴/分钟的速度滴入一级芯材溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定3.5-5h；，将胶珠转移到二次钙化液中，二次钙化10-15min，然后将胶珠转移到二级芯材溶液中，进行二级复凝聚反应2-3h；将胶珠转移到柠檬酸溶液中，搅拌囊内液化5-8min；取出胶珠用无菌水或无菌生理盐水浸泡6-24h(通常为16h)，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。

壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为1.6-2.0％(以自来水浸润24h)，灭菌冷却，向其中加入海藻酸钠的水溶液总质量20％的微球菌液体种子，搅拌均匀；一级芯材配制中明胶和氯化钙的质量百分比分别为1.8-2.2％和1.2-1.8％，pH＝5.5-6.5；二次钙化溶液配制中氯化钙水溶液的质量百分比浓度为0.3-0.6％；二级芯材溶液配制中壳聚糖(CS)水溶液的质量百分比浓度为0.25-0.55％，pH＝4.0-5.0。

壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为1.8％(以自来水浸润24h)；一级芯材配制中明胶(Gel)和氯化钙(CaCl₂)的质量百分比分别为2.0％和1.5％，pH＝6.0；二次钙化溶液配制中氯化钙水溶液的质量百分比浓度为0.5％；二级芯材溶液配制中壳聚糖(CS)水溶液的质量百分比浓度为0.4％，pH＝4.5。

所述增殖培养是将制备的微胶囊在无菌条件下按照4％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度：28-30℃，摇床转速：130rpm-140rpm，培养时间：24小时，之后更换培养基，共2次培养，备用。

本发明具有如下优点：

1.微球菌(生理)活性良好。本发明通过优化两级复凝聚体系组分含量，包括Na·Alg、Gel、CS、CaCl₂，制备得到平均直径为25μm-45μm的微胶囊，微胶囊扩散传质性能优异，固定后的微球菌Micrococcus sp.(生理)活性良好。

2.提高了囊壁的机械强度。本发明采用Na·Alg-Gel-CaCl₂-CaCl₂-Na·Alg-CS两级复凝聚技术，在保证囊壁传质渗透性能的同时，成功地改善了微胶囊的结构，提高了囊壁的机械强度；制得的微胶囊机械强度高，在5000rpm速度下离心30min，胶囊不变形，不破碎；用于微球菌属固定，长期培养微胶囊不溶解。

3.胶珠壁结构均匀。微胶囊被束缚在直径1.5mm-2.5mm的多孔胶珠内部，胶珠壁结构均匀，有效防止了微胶囊流失，并起到了强化微胶囊机械强度的效果。

4.缓释性能优异。按本发明(配方)制备的微胶囊在液体环境中(连续)培养30天，微胶囊的缓释性能优异。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)微球菌Micrococcus sp.斜面培养：在牛肉蛋白胨基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH＝7.0-7.2)的试管中接入微球菌Micrococcus sp.，置28℃-30℃培养箱中培养24h；

(2)微球菌Micrococcus sp.液体种子制备：用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MgSO4·7H20，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在摇床转速130rpm-140rpm、28℃-30℃条件下，培养16-20小时，制得液体种子；

(3)壁材配制：按质量百分比称取2.5％Na·Alg，以97.5％质量比的自来水浸润24小时。于111℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃，加入1ml无菌吐温80，并加入上述总质量20％的液体种子，搅拌均匀；

(4)一级芯材溶液配制：按质量百分比称取2.5％Gel和2.0％CaCl₂，以自来水定容，调节pH＝7.0。于111℃下湿热灭菌30min；

(5)二次钙化溶液配制：按质量百分比称取0.8CaCl₂，以自来水定容，pH自然。于121℃下湿热灭菌20min；

(6)二级芯材溶液配制：按质量百分比称取0.7％CS，以自来水定容，调节pH＝5.5。于111℃下湿热灭菌30min；

(7)囊内液化液配制：按照摩尔浓度配制0.055mol/L柠檬酸水溶液，于121℃下湿热灭菌20min；

(8)微胶囊制备：将壁材溶液在无菌条件下注入注射器内，利用9^#针头按照30滴/分钟的速度滴入一级芯材溶液中，不断搅拌。胶珠成型后，维持5h，将胶珠转移到二次钙化液中，稳定10min，然后将胶珠转移到二级芯材溶液中，稳定3h，将胶珠转移到柠檬酸溶液中，搅拌5min，用无菌生理盐水浸泡16h，置于增殖培养基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MGSO4·7H20，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，增殖24h，更换培养基，再次增殖24h，制得微胶囊。

(9)机械强度和缓释性检测：按照4％接种量将微胶囊接入增殖培养基中，培养30d后，取1g微胶囊置于生理盐水中，在5000rpm转速下离心30min，囊体不变形、不破碎。微胶囊失重率小于24％。

实施例2

与实施例1不同之处在于：配制壁材溶液时，按照质量百分比称取2.0％Na·Alg；配制一级芯材溶液时，按质量百分比称取2.2％Gel和1.8％CaCl₂，调节pH＝6.5；配制二次钙化溶液时，按质量百分比称取0.6CaCl₂；配制二级芯材溶液时，按质量百分比称取0.55％CS，调节pH＝5.0；控制壁材溶液下滴速度35滴/分钟，一级复凝胶珠成型后，维持4h，胶珠转移到二级芯材溶液中，稳定2.5h；经上述步骤制得的微胶囊机械强度较好，30d失重率小于23％。

实施例3

与实施例1不同之处在于：配制壁材溶液时，按照质量百分比称取1.8％Na·Alg；配制一级芯材溶液时，按质量百分比称取2.0％Gel和1.5％CaCl₂，调节pH＝6.0；配制二次钙化溶液时，按质量百分比称取0.5CaCl₂；配制二级芯材溶液时，按质量百分比称取0.4％CS，调节pH＝4.5；控制壁材溶液下滴速度45滴/分钟，一级复凝胶珠成型后，维持3.5h，胶珠转移到二级芯材溶液中，稳定2h；经上述步骤制得的微胶囊机械强度较好，30d失重率小于19％。

Claims

1.一种微球菌两级复凝固定化方法，按如下步骤操作，其特征在于：

1)壁材配制：按质量百分比配制1.5-2.5％海藻酸钠的水溶液，灭菌冷却，加入与海藻酸钠的水溶液体积比为200∶1的无菌吐温80，并加入海藻酸钠的水溶液总质量15-30％的微球菌液体种子，搅拌均匀；

2)一级芯材溶液配制：按质量百分比配制含1.5-2.5％明胶和1.0-2.0％氯化钙的水溶液，pH＝5.0-7.0，灭菌冷却，备用；

3)二次钙化溶液配制：按质量百分比配制0.2-0.8％氯化钙的水溶液，灭菌冷却，备用；

4)二级芯材溶液配制：按质量百分比配制0.1-0.7％壳聚糖的水溶液，pH＝3.5-5.5，灭菌冷却，备用；

5)囊内液化液配制：按摩尔浓度配制0.050-0.060mol/L柠檬酸水溶液，灭菌冷却，备用；

6)微胶囊制备：在40-45℃下，将壁材溶液在无菌条件下按40-60滴/分钟的速度滴入一级芯材溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定3.5-5h，将胶珠转移到二次钙化液中，二次钙化10-15min，然后将胶珠转移到二级芯材溶液中，进行二级复凝聚反应2-3h；将胶珠转移到柠檬酸溶液中，搅拌囊内液化5-8min；取出胶珠用无菌水或无菌生理盐水浸泡6-24h，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。

2.按照权利要求1所述微球菌两级复凝固定化方法，其特征在于：壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为1.6-2.0％，灭菌冷却，加入海藻酸钠的水溶液总质量20％的微球菌液体种子，搅拌均匀；一级芯材配制中明胶和氯化钙的质量百分比分别为1.8-2.2％和1.2-1.8％，pH＝5.5-6.5；二次钙化溶液配制中氯化钙水溶液的质量百分比浓度为0.3-0.6％；二级芯材溶液配制中壳聚糖水溶液的质量百分比浓度为0.25-0.55％，pH＝4.0-5.0。

3.按照权利要求1所述微球菌两级复凝固定化方法，其特征在于：壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为1.8％；一级芯材配制中明胶和氯化钙的质量百分比分别为2.0％和1.5％，pH＝6；二次钙化溶液配制中氯化钙水溶液的质量百分比浓度为0.5％；二级芯材溶液配制中壳聚糖水溶液的质量百分比浓度为0.4％，pH＝4.5。

4.按照权利要求1所述微球菌两级复凝固定化方法，其特征在于：所述增殖培养是将制备的微胶囊在无菌条件下按照4％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度28-30℃，摇床转速130rpm-140rpm，培养时间24小时，之后更换培养基，共2次培养，备用。