CN1324130C

CN1324130C - 一种黄杆菌微胶囊化方法

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Publication number: CN1324130C
Application number: CNB2004100875673A
Authority: CN
Inventors: 李海波; 李培军; 鞠京丽; 张轶; 许华夏
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2024-11-17
Also published as: CN1778893A

Abstract

本发明涉及细胞固定化生物制剂，具体地说是一种黄杆菌微胶囊化方法，可按如下步骤操作，向Na·Alg溶液里加入黄杆菌液体种子，在45℃下，通过9#针头注射器，控制下滴速度60-80滴/分钟，向CS和CaCl₂混合液中滴加，稳定4h，然后在低浓度Na·Alg溶液和柠檬酸溶液中稳定15-20min，以无菌生理盐水浸泡16h，增殖培养制得微胶囊。本发明对Na·Alg-CS微胶囊组方进行了优化，进行了低浓度Na·Alg囊壁修饰和柠檬酸囊内液化，改善了微胶囊的结构，成功固定了黄杆菌；制备的微胶囊菌剂具有优良的物理和生理特性；本发明使微胶囊被束缚在直径较大的胶珠内部，珠壁多孔，避免了微胶囊的流失。

Description

一种黄杆菌微胶囊化方法

技术领域

本发明涉及细胞固定化生物制剂，具体地说是一种黄杆菌(采用海藻酸钠(Na·Alg)-壳聚糖(CS)-氯化钙(CaCl₂)复凝聚)微胶囊化方法。

背景技术

生物微胶囊是将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或微生物、动植物细胞包封在一层亲水性的半透膜内所形成的珠状、椭杆状或椭球状微胶囊，使生物大分子和细胞阻隔在微胶囊的膜内或膜外，而氧气、营养物质以及其它的小分子物质则可以自由通过微胶囊膜进行物质传递，从而达到催化、培养或免疫隔离的目的。通常，微胶囊的直径或有效尺寸约为5μm-200μm，胶囊壁厚约为0.2μm-5μm。

复凝聚技术是制备微胶囊的常用技术之一。复凝聚微胶囊技术是利用非水溶性的固体粉末或液体对细菌进行包囊，其必要条件是：有关的两种聚合物离子的电荷相反，且离子所带电荷数恰好相等。此外，还必须调节体系的温度和盐分的含量。常用的芯材和壁材包括人工合成和天然的两类，如：琼脂类、壳聚糖类(CS)、海藻酸钠类、明胶-阿拉伯胶-紫胶类、淀粉类、乙基(羧甲基)纤维素、硫酸纤维素纳(NACS)-聚氯化二烯丙基二甲基铵(PDADMAC)，聚丙烯酸酯类、聚烯类、聚氨酯等。

Na·Alg和CS具有良好的生物相容性，以此作为微胶囊主体材料的配方较多，但对于Flavobacterium sp.固定化来说，由于Flavobacterium sp.特殊的生理特性，在短时间培养后，常常出现胶囊溶解现象，致使固定化失败。

此外，由于微胶囊个体直径为小，使用过程中易流失，难以控制。

发明内容

本发明的目的在于在针对Na·Alg-CS-CaCl2复凝聚的缺陷，利用低浓度Na·Alg在一定时间内对微胶囊壁做二次修饰，同时利用低浓度柠檬酸做囊内液化，改善微胶囊结构缺陷，制备性能更加优良的固定化微生物菌剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种黄杆菌微胶囊化方法，可按如下步骤进行具体操作：

1)壁材配制：按质量百分比配制2.0-3.0％海藻酸钠的(Na·Alg)水溶液(用自来水浸润24h)，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃，备用)，向其中加入海藻酸钠的水溶液总质量15-30％的黄杆菌(Flavobacterium sp.)液体种子(菌龄16-20h)，搅拌均匀；

2)芯材配制：按质量百分比配制含0.3-0.7％壳聚糖和1.0-2.5％氯化钙的水溶液，pH＝3.5-5.5，灭菌冷却，备用；(使用前于111℃下湿热灭菌30min，备用)

3)囊壁修饰液和囊内液化液配制：按质量百分比配制0.05-0.25％海藻酸钠水溶液，灭菌(使用前于111℃下湿热灭菌30min，备用)；按照摩尔浓度配制0.045-0.065mol/L柠檬酸水溶液，灭菌(使用前于121℃下湿热灭菌20min，备用)；

4)微胶囊制备：在40-45℃下，(通过9#针头注射器)将壁材溶液在无菌条件下按60-80滴/分钟的速度滴入芯材溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定4h；然后将胶珠转移到囊壁修饰液和囊内液化液的混合液中，搅拌15-20min，囊壁修饰液和囊内液化液的体积比为1-1.5∶1；取出胶珠用无菌水或无菌生理盐水浸泡6-24h(通常为16h)，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。

所述壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度较好为2.25-2.75％，通常向其中加入总质量20％左右的黄杆菌液体种子，搅拌均匀；壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度最好为2.5％；

芯材配制中壳聚糖和氯化钙的质量百分比较好分别为0.4-0.6％和1.5-2.2％，pH＝4.0-5.0；芯材配制中壳聚糖和氯化钙的质量百分比最好分别为0.5％和2.0％，pH＝4.8；

囊壁修饰液中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度较好为0.10-0.20％；囊内液化液中柠檬酸水溶液的摩尔浓度较好为0.050-0.060mol/L；囊壁修饰液中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度最好为0.15％；囊内液化液中柠檬酸水溶液的摩尔浓度最好为0.055mol/L；

所述增殖培养是将制备的微胶囊在无菌条件下按照4％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度：28-30℃，摇床转速：130rpm-140rpm，培养时间：24小时，之后更换培养基，共2次培养，备用。

本发明具有如下优点：

1.通过优化Na·Alg-CS-CaCl₂配方各组分的含量，制备得到平均直径为20μm-30μm的微胶囊，胶囊的微观结构均匀，尺寸均一，扩散传质性能优异，固定后的黄杆菌Flavobacterium sp.活性良好。

2.利用二次囊壁修饰和囊内液化等技术措施，成功地改善了胶囊的机械强度，在5000rpm速度下离心30min，胶囊不变形，不破碎；同时，上述措施还大大提高了微胶囊的包埋率，平均包埋率大于85％。

3.用于黄杆菌属Flavobacterium sp.固定，长期培养微胶囊不溶解。

4.胶珠直径1.5mm-2.5mm，结构均匀，强度高，通透性好，对微胶囊起到了良好的束缚保护作用。

5.按上述配方制备的微胶囊具有优异的缓释性能，液体培养30天，失重不明显。

总之，本发明对Na·Alg-CS微胶囊组方进行了优化，并创新性地同时进行了低浓度Na·Alg囊壁修饰和柠檬酸囊内液化，改善了微胶囊的结构，成功固定了Flavobacterium sp.。对制得的Flavobacterium sp.微胶囊连续培养30天，测试了微胶囊的缓释性能和机械强度，结果表明：按照本发明制备的微胶囊菌剂具有优良的物理和生理特性。同时，本发明设计了胶珠包胶囊的成囊方式，使微胶囊被束缚在直径较大的胶珠内部，胶珠壁为多孔结构，成功地避免了微胶囊流失。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)黄杆菌Flavobacterium sp.斜面培养：在牛肉蛋白胨基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH＝7.0-7.2)的试管中接入黄杆菌Flavobacterium sp.，置28℃-30℃培养箱中培养24h；

(2)黄杆菌Flavobacterium sp.液体种子制备：用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH₄O₃，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在摇床转速130rpm-140rpm、28℃-30℃条件下，培养16-20小时，制得液体种子；

(3)壁材配制：按质量百分比称取2.2％Na·Alg，以97.8％质量比的自来水浸润24小时，于111℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃；加入上述总质量20％的液体种子，搅拌均匀；

(4)芯材配制：按质量百分比称取0.6％CS和1.0％CaCl₂，用98.4％的自来水溶解，调节pH＝3.6，于111℃下湿热灭菌30min；

(5)囊壁修饰液和囊内液化液配制：按质量百分比配置0.25％Na·Alg水溶液，于111℃下湿热灭菌30min；按照摩尔浓度配制0.065mol/L柠檬酸水溶液，于121℃下湿热灭菌20min；

(6)微胶囊制备：将壁材溶液在无菌条件下注入注射器内，利用9#针头按照60-80滴/分钟的速度滴入芯材溶液中，不断搅拌。胶珠成型后，维持4h，然后将胶珠转移到囊壁修饰液和囊内液化液的混合液中，搅拌15-20min，用无菌生理盐水浸泡16h，置于增殖培养基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，增殖24h，更换培养基，再次增殖24h，制得微胶囊；

(7)机械强度和缓释性检测：按照4％接种量将微胶囊接入增殖培养基中，培养30d后，取1g微胶囊置于生理盐水中，在5000rpm转速下离心30min，囊体不变形、不破碎；微胶囊失重率小于29％。

实施例2

与实施例1不同之处在于：配制壁材溶液时，按照质量百分比称取2.75％Na·Alg；配制芯材溶液时，按质量百分比称取0.4％CS和1.5％CaCl₂，调节pH＝4.0；配制囊壁修饰液和囊内液化液配制时，按质量百分比称取0.10Na·Alg；按照摩尔浓度称取0.050mol/L柠檬酸。经上述步骤制得的微胶囊机械强度较好，30d失重率小于26％。

实施例3

与实施例1不同之处在于：配制壁材溶液时，按照质量百分比称取2.5％Na·Alg；配制芯材溶液时，按质量百分比称取0.5％CS和2.0％CaCl₂，调节pH＝4.8；配制囊壁修饰液和囊内液化液配制时，按质量百分比称取0.15Na·Alg；按照摩尔浓度称取0.055mol/L柠檬酸。经上述步骤制得的微胶囊机械强度良好，30d失重率小于23％。

Claims

1.一种黄杆菌微胶囊化方法，按如下步骤操作，其特征在于：

1)壁材配制：按质量百分比配制2.0-3.0％海藻酸钠的水溶液，灭菌冷却，向其中加入海藻酸钠的水溶液总质量15-30％的黄杆菌液体种子，搅拌均匀；

2)芯材配制：按质量百分比配制含0.3-0.7％壳聚糖和1.0-2.5％氯化钙的水溶液，pH＝3.5-5.5，灭菌冷却，备用；

3)囊壁修饰液：按质量百分比配制0.05-0.25％海藻酸钠水溶液，灭菌；囊内液化液：按照摩尔浓度配制0.045-0.065mol/L柠檬酸水溶液，灭菌；

4)微胶囊制备：在40-45℃下，将步骤1)壁材配制所得的溶液在无菌条件下按60-80滴/分钟的速度滴入步骤2)芯材配制所得的溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定4小时；然后将胶珠转移到上述囊壁修饰液和上述囊内液化液的混合液中，搅拌15-20分钟，其中上述囊壁修饰液和囊内液化液的体积比为1-1.5∶1；取出胶珠用无菌水或无菌生理盐水浸泡6-24小时，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。

2.按照权利要求1所述黄杆菌微胶囊化方法，其特征在于：上述壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为2.25-2.75％，向其中加入海藻酸钠的水溶液总质量20％的黄杆菌液体种子，搅拌均匀；上述芯材配制中壳聚糖和氯化钙的质量百分比分别为0.4-0.6％和1.5-2.2％，pH＝4.0-5.0；上述囊壁修饰液中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.10-0.20％；上述囊内液化液中柠檬酸水溶液的摩尔浓度为0.050-0.060mol/L。

3.按照权利要求1所述黄杆菌微胶囊化方法，其特征在于：上述壁材配制中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为2.5％；上述芯材配制中壳聚糖和氯化钙的质量百分比分别为0.5％和2.0％，pH＝4.8；上述囊壁修饰液中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.15％；上述囊内液化液中柠檬酸水溶液的摩尔浓度为0.055mol/L。

4.按照权利要求1所述黄杆菌微胶囊化方法，其特征在于：所述增殖培养是将制备的胶珠在无菌条件下按照4％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度28-30℃，摇床转速130rpm-140rpm，培养时间24小时，之后更换培养基，再培养一次，备用。