CN1328132A - 胆碱单氧化物酶基因及培育耐旱耐盐植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的山菠菜胆碱单氧化物酶,编码该酶的基因,含有该基因的植物表达载体以及培育耐盐耐旱植株的方法。本发明的基因可用于培育耐盐耐旱植物。

Description

胆碱单氧化物酶基因及培育耐旱耐盐植株的方法
本发明涉及胆碱单氧化物酶，编码该酶的基因，含有该基因的植物表达载体以及培育耐盐耐旱植株的方法。
干旱和盐害是造成作物减产的主要原因，培育耐旱耐盐作物是育种的主要目标之一。甜菜碱是一种植物渗透调节剂。在植物中，其生物合成涉及2个酶：胆碱单氧化物酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)。CMO参于甜菜碱合成的第一步反应，干旱和盐碱诱导该酶的表达。山菠菜(Atriplex hortensis)是一种耐盐植物，发明人已从山菠菜中克隆了CMO基因cDNA并构建了分别适用于单，双子叶植物的表达载体，转化模式植物烟草，转基因烟草有明显的高耐盐性和高耐旱性。
本发明的一个目的是提供一种具有较强的抗干旱和抗盐碱效果的胆碱单氧化物酶，这种酶来源于山菠菜(Atriplex hortensis)。其氨基酸序列示于图1。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的胆碱单氧化物酶的基因。在一个优选的实施方案中，所述的基因具有如图1所示的核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供一种培育耐盐耐旱植株的方法，该方法包括用本发明的胆碱单氧化物酶的基因构建植物表达载体；用构建的植物表达载体转化植物细胞；将转化的植物细胞培育成植株。
本发明的又一个目的是提供一种含有所说的胆碱单氧化物酶的基因的表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括，但不限于，双元农杆菌载体，例如Bin 19(Bevan，M.，1984，核酸研究12：8711-8721)以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。载体可还包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子包括含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大豆贮存蛋白质基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚单位基因)的3’转录的非翻译区域。本发明的胆碱单氧化物酶的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。
本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的表达载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框同相，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。
为了便于转化的植物细胞的鉴定，可对本发明的载体进行进一步的基因工程操作以包括植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素，潮霉素，卡那霉素等。同样，可使用可产生通过颜色变化(例如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶))或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶。
本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。对这些技术的综述参见Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法(Method for Plantmolecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，第二版(1988)。
可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如玉米，大麦，小麦，水稻，黑麦，燕麦，烟草等。
附图简要说明：图1是山菠菜CMO基因全序列及编码的氨基酸序列，*表示成熟多肽起始氨基酸，表示Rieske-Type[2Fe-2S]簇结合区的保守Cys-His对， 表示多铁原子核结合域的保守氨基酸残基。图2表示在2％NaCl盐水诱导下山菠菜叶片中CMO基因表达的Northern分析结果，分别于处理前，处理后1、2、3和4天时取样，总RNA的18SrRNA杂交结果作为内标。图3表示转AhCMO烟草1#和对照在0.9％(A)、1.2％(B、C)、1.5％(D、E)NaCl的含盐MS培养基中生长状态对比，A、B、D为1#，C、E为对照。图4表示转AhCMO烟草1—4#和对照在含10％PEG-6000的MS培养基中生长状态对比，A、B、C、D为1—4#，E为对照。图5表示转CMO基因烟草的Northem验证结果。三个泳道从左到右依次为对照(CK)、未处理的转基因烟草1#(-)、1.2％NaCl处理一天(+)的转基因烟草1#，总RNA的18S rRNA杂交结果作为内标。图6表示山菠菜基因组DNA的Southern分析结果，B为BamHI，D为DraI，E为EcoRI，H为HindIII。
实施例一.山菠菜cDNA文库构建及CMO cDNA克隆，序列分析及逆境胁迫下CMO基因的表达1.山菠菜cDNA文库构建及CMO cDNA克隆、鉴定
山菠菜种在盆中，50天后，以含2.0％NaCl溶液浇灌。cDNA文库构建按Sambrook(1987)方法进行。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚，氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/L LiCl悬浮RNA沉淀，氯仿抽提一次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀RNA，之后，溶于水。经mRNA纯化试剂盒处理，得到mRNA。取2ug mRNA进行逆转录反应，然后再进行二链合成。双链cDNA与EcoRI接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacryl-400)去除多余接头，然后与酶切的脱磷pExcell载体(Pharmacia)连接，取5ul连接产物加入包装蛋白，建成cDNA文库。
以发明人克隆的菠菜CMO cDNA为探针筛选了2.5×105未扩增斑得到37个阳性斑，其插入片段为1.77Kb。克隆片段测序采用Taq DyePrimer Cycle Sequencing试剂盒(Amersham)在ABI377型自动测序仪上进行。该片段包含一个1314bp的开放读码框，编码由438个氨基酸组成的多肽，其5’端为136bp，3’端为314bp。山菠菜CMO cDNA全序列及氨基酸序列见图1。2.山菠菜CMO活性与环境胁迫的关系
以2.0％NaCl溶液连续处理山菠菜4天，分别在1，2，3和4天收集叶片，提取RNA作Northern分析。结果表明CMO基因的表达量随盐胁迫的时间而增加。处理4天的表达量约为处理前的4倍。因此，CMO基因是受盐诱导的(图2)。二.CMO基因植物表达质粒的构建和农杆菌介导转化
CMO cDNA植物表达载体的构建按常规方法进行。双元表达载体pBI121含35S启动子和翻译增强子TMV的Ω片段。CMO cDNA经EcoRI和SalI酶切后扦入pBI121.得到的含35S启动子的植物表达载体直接转导农杆菌AGL1将约5mm大小的无菌烟草叶片分别浸入稀释5倍的AGL1农杆菌液中，约30min后取出，放在无菌滤纸上，吸去菌液，接种在MS2培养基(MS基本培养基含1mg/6-BA，0.1mg/LIAA)中共培养3天后转入筛选培养(MS2含100mg/L卡那酶素和600mg/L头孢霉素)。对照用含pBI121的农杆菌侵染，共得到转CMO基因的植株7棵。用无性培养技术每棵繁殖6棵备用。三.转基因植株的耐盐性和耐旱性测定
将转基因植株和对照都分别移栽到含0，0.9，1.2，1.5％的NaCl和10％PEG-6000的MS培养基中继续生长，在0.9％和1.2％的盐浓度下，7个转基因株系均长势良好，而同时移载的对照则叶片发黄，生长停滞；在1.5％的盐浓度下，转基因植株和对照均不能正常生长，叶片发黄并死亡(图3)。在10％PEG-6000中7株转基因植株均长势良好，而对照萎蔫，生长停滞(图4)。四.转基因植株的分子鉴定
Northern分析按常规进行，结果示于图5。五.CMO基因在山菠菜基因组中的分析
山菠菜总DNA经BamHI，DraI，EcoRI和HindIII完全酶解后以CMOcDNA为探针作Southem分析，由于CMO cDNA中不含BamHI和DraI切点，含EcoRI和HindIII各1个切点。BamHI酶切时仅检测到1条杂交带，说明CMO基因在山菠菜基因组中仅含1个拷贝。其他酶切时有多条杂交带暗示：在CMO全基因中含多个内含子(图6)。

Claims (10)

1.一种来源于山菠菜(Atriplex hortensis)的分离的胆碱单氧化物酶。
2.按照权利要求1所述的胆碱单氧化物酶，它具有如下的氨基酸序列：M A A S A T T M L L K Y P T T V C G I P N S S A          24N N S T D P S N N I V Q I P Q T T T T N S P L L          48K F R T P N K P V N A V A A P A F P S V T T T T          72T T T P S S I Q S L V K D F D P L V P A E D A L          96T P P S S W Y T E P A F Y A H E L D R I F Y K G         120W Q V A G Y S D Q V K E A N Q Y F T G T L G N V         144E Y L V C R D G E G K V H A F H N V C T H R A S         168I L A C G S G K K S C F V C P Y H G W V Y G M N         192G S L T K A S K A T P E Q S L N P D E L G L V P         216L K V A V W G P F I L I S L D R S S R E V G D V         240G S E W L G S C A E D V K A H A F D P N L Q F I         264N R S E F P I E S N W K I F S D N Y L D S S Y H         288V P Y A H K Y Y A T E L D F D T Y Q T D M V G N         312V T I Q R V A G T S N N G F N R L G T Q A F Y A         336F A Y P N F A V E R Y G P W M T T M H I V P L G         360P R K C K L V V D Y Y I E K S K L D D K D Y I E         384K G I A I N D N V Q K E D V V L C E S V Q K G L         408E T P A Y R S G R Y V M P I E K G I H H F H C W         432L H Q V L K *                                           438
3.一种编码权利要求1或2的胆碱单氧化物酶的基因。
4.按照权利要求3所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列：
   atacaggcctcgagggccgaattccgttgctgtcgattgttgatcattcatctcatcacctcct    64tatatattatattaaaataaattaataaatattaacaaggaagtgtttaagtttgttgatcatacaacaatc  136ATGGCAGCAAGTGCAACAACAATGTTGCTAAAATACCCAACTACTGTTTGTGGAATACCAAATTCATCCGCA  208AACAATTCTACTGATCCTTCAAATAACATCGTCCAAATTCCACAAACTACTACTACTAATAGCCCGCTACTT  280AAGTTCCGTACTCCTAATAAACCCGTTAACGCCGTCGCTGCCCCGGCTTTTCCGTCCGTAACCACCACTACA  352ACCACCACTCCGTCGTCCATCCAATCACTTGTCAAGGATTTCGATCCTCTTGTTCCGGCCGAGGATGCTCTT  424ACTCCTCCTAGCTCTTGGTATACCGAACCTGCCTTCTATGCTCATGAACTTGACCGTATCTTTTACAAAGGA  496TGGCAAGTCGCAGGGTACAGTGATCAAGTTAAGGAGGCTAACCAATATTTCACCGGAACGTTAGGAAATGTT  568GAATATTTGGTGTGTCGAGATGGAGAAGGAAAAGTTCATGCATTTCACAATGTTTGCACCCATCGTGCATCT  640ATCCTTGCTTGTGGAAGTGGCAAAAAGTCATGTTTCGTATGCCCTTATCATGGATGGGTATATGGCATGAAT  712GGATCGCTTACGAAAGCTTCAAAAGCAACACCAGAACAATCACTAAATCCCGATGAACTTGGGCTTGTACCA  784CTAAAAGTTGCAGTATGGGGCCCATTTATACTCATCAGTTTGGACAGATCAAGCCGTGAAGTAGGTGACGTT  856GGATCTGAATGGCTTGGTAGTTGTGCTGAAGATGTTAAGGCCCATGCTTTTGACCCGAATCTTCAGTTCATT  928AATAGGAGTGAATTTCCAATTGAATCTAATTGGAAGATTTTCAGTGACAACTATTTGGATAGCTCTTACCAT 1000GTTCCTTATGCACACAAATACTATGCAACTGAGCTCGACTTTGATACTTACCAAACCGATATGGTTGGAAAT 1072GTCACGATTCAAAGGGTGGCTGGGACTTCAAACAATGGTTTTAATAGACTTGGAACTCAAGCCTTCTATGCT 1144TTTGCATACCCTAACTTTGCTGTGGAAAGGTATGGCCCTTGGATGACTACAATGCATATTGTTCCATTAGGA 1216CCAAGGAAATGCAAACTAGTGGTGGACTACTATATTGAAAAATCAAAGCTGGACGACAAGGATTACATCGAA 1288AAGGGCATAGCAATCAATGATAATGTGCAGAAAGAAGATGTGGTGTTGTGTGAAAGCGTCCAAAAAGGGTTG 1360GAGACACCAGCATATCGTAGTGGAAGATATGTGATGCCAATTGAGAAAGGAATTCACCATTTCCACTGCTGG 1432TTACACCAAGTGTTGAAGTGAttgcacccagattatatgtaatcttggtttctttccttctatgattggata 1504ttataataagtaaaattataatgtcatcatttagttgagattgttgttagagttgagcttatgctcattagt 1576aacgtgtgtatgtgtgtatgtgtttggtcatggtaaaaaatgtttgttattgctagaattttataataatag 1648tatggtgctgatgtccagtataaataaagaacatagcacccctttccctacttaagaaattatattccatat 1720attttcaggggaactatgagattgtctatgaacaaaaaaaaaaaaaa                          1767
5.一种含有权利要求3所述的胆碱单氧化物酶基因的植物表达载体。
6.一种培育耐盐耐旱植株的方法，包括用权利要求3所述的胆碱单氧化物酶的基因构建植物表达载体；用构建的植物表达载体转化植物细胞；将转化的植物细胞培育成植株。
7.按照权利要求6所述的方法，其中所述的植物表达载体是双元农杆菌载体。
8.按照权利要求6所述的方法，其中所述的转化是通过农杆菌介导或基因枪法进行的。
9.按照权利要求6所述的方法，其中所述的植物是单子叶植物或者双子叶植物。
10.按照权利要求6所述的方法，其中所述的植物是烟草。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1307309C (zh) * 2004-12-31 2007-03-28 南京农业大学 水稻单子叶植物胆碱单加氧酶基因的应用
CN101985626A (zh) * 2010-11-13 2011-03-16 上海交通大学 原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1307309C (zh) * 2004-12-31 2007-03-28 南京农业大学 水稻单子叶植物胆碱单加氧酶基因的应用
CN101985626A (zh) * 2010-11-13 2011-03-16 上海交通大学 原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途
CN101985626B (zh) * 2010-11-13 2012-04-25 上海交通大学 原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途

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