CN1326355A - 治疗肝素诱导的血小板减少症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过蛋白C治疗肝素清导的血小板减少症的方法。所要求保护的本发明提供了对潜在的严重的衰弱的疾病所需的治疗而避免了一些并发症如出血,毒性和现在所用的抗凝剂的通常的副作用。

Description

治疗肝素诱导的血小板减少症的方法

本申请要求系列号为60/108，432临时申请的优先权，该临时申请的申请日期为1998年11月13日。

本发明涉及医药科学，尤其是用蛋白C治疗肝素诱导的血小板减少症。

蛋白C是一种维生素K依赖型的丝氨酸蛋白酶，是体内自然生成的一种凝血剂，在凝血过程中，它通过抑制因子Va和因子VIIIa的活性而在凝血级联中起作用。人蛋白C以双链酶原形式参与循环，但它必须先转化成活化蛋白C，才能在内皮细胞表面和血小板表面行使功能。活化蛋白C是通过凝血酶与凝血调节蛋白(细胞表面膜蛋白)结合成复合体后，催化双链酶原的限制性水解而得到的。

在与其它蛋白联合作用时，aPC可能起着凝血反应中最重要的负调节因子的作用。这种负调节作用阻止了血栓的形成。除了抗凝血功能而外，aPC还可通过抑制细胞因子(如：TNF和IL-1)的生成而具有抗炎症的功效，此外，它还具有纤溶酶原的特性，使血块更易溶解。因此，蛋白C酶系统代表了抗凝血、抗炎症以及血纤维蛋白溶解作用的主要生理机制。

肝素是一种经常使用的抗凝剂，它能催化抗凝血酶III(AT-III)发生作用，阻止血纤维蛋白的形成，从而延长血液凝固的时间。肝素-抗凝血酶III复合体抑制了凝血酶和参与凝血过程的其它蛋白酶的活性。

在血管外科中，肝素的施用方式是非肠道式的，用于治疗手术后的血栓形成和栓塞。在接受肝素治疗的病人中，大约1％-30％(平均5％)的病人有免疫反应，引发了肝素诱导的血小板减少症(HIT)(Phillips et a1.，Annals of Pharmacotherapy，28：43-45，1994)。这些副作用可能会发展成为人熟知的肝素诱导的血小板减少及血栓形成综合症(HITTS)。HITTS患者面临着静脉或动脉血栓形成的危险，这有可能是危及生命的。例如，下肢肿胀或局部缺血、中风或心肌梗塞，据报道，由此引起的死亡率和主要的发病率达25％到37％(Boshkov，et al.，British Journal of Haematology，84：322-328，1993)。

肝素诱导的血小板减少症是一种很严重的由药物诱导的免疫性的血小板减少病症，这种症状是医师必须应付的。其重要性是显而易见的，原因包括：肝素的大量使用，血小板减少的发生频率高，缺乏更好的抗血栓形成试剂，以及血栓形成并发症的存在。已经很清楚的证明肝素诱导的血小板减少症是由血小板的活化和凝聚引起的，而血小板的活化和凝聚是由肝素特异性抗体诱导的。活化的血小板具有很强的促凝血活性，纤维蛋白血栓(看上去是白色的，导致白色凝块综合症)的形成正是基于这一机制(Arthur，et al.，Pathology，17：82-86，1985)。肝素诱导的血小板减少症的治疗方法包括停止使用肝素而代之以其它的抗血栓形成药物。不幸的是，患者之所以接受肝素治疗是因为他们患有血栓栓塞，或有很大的患血栓栓塞的可能，停止使用肝素就意味着他们失去了抗凝能力。停止使用肝素后，给患者施用另外的药物，如：低分子量的肝素、肝素类药物Org 10172、蛭素或者warfarin(Ratnoff，et al.，Disorders of Hemostasis，Chapter 8，W.B.Sanders Company，Philadelphia；Laposata etal.，Arch Pathol Lab Med，22：799-807，1998)。然而，因为Org10172和低分子量肝素与一些肝素诱导的血小板减少症患者体内的肝素特异性抗体发生交叉反应，所以，对于许多患者来说，这些疗法都不是很有效。此外，Warfarin发挥作用需要几天时间，而且给肝素诱导的血小板减少症患者施用Warfarin会引发静脉性下肢坏死(Warkentin et al.，Ann Intern Med.，127：804-812，1997)。因此，有必要发展一种有效的治疗肝素诱导的血小板减少症的方法。

本发明首次描述了用蛋白C治疗肝素诱导的血小板减少症的方法。蛋白C，具有抗凝血活性和纤溶酶原活性，可有效治疗肝素诱导的血小板减少症患者体内动脉和静脉血栓的形成，包括富含纤维蛋白的“白色凝块综合症”。

本发明提供了一种治疗肝素诱导的血小板减少症的方法，该方法包括给所说的患者施用药学上有效量的蛋白C。

此外，本发明还提供了一种治疗肝素诱导的血小板减少症的方法，该方法包括给所说的患者施用药学上有效量的活化蛋白C，使活化蛋白C在患者血浆中的水平达到大约2ng/mL到大约300ng/mL。

正如本发明所公开和要求保护的，为了本发明的目的，下面将对一些术语给予定义。

蛋白C指的是一种维生素K依赖型的丝氨酸蛋白酶，它具有抗凝血、抗炎症的功效，并具有纤溶酶原的特性。包括从血浆中分离得到的蛋白C和人工重组制得的蛋白C，但不仅限于这些。尽管蛋白C还可以包括其它物种的或其它来源的蛋白C，这些蛋白C也具有蛋白水解活性、氨基水解活性、酯水解活性和生物活性(抗凝血、抗炎症和纤溶酶原特性)，但是，我们仍然优选人蛋白C。关于蛋白C来源的实例在Gerlitz等的美国专利5,453,373和Foster等的美国专利5,516,650中有过描述，所有的教导都在此引入作为参考。

酶原是蛋白水解酶的非活性前体，本文中所用的蛋白C酶原指的是蛋白C的分泌型的非活性形式，不管是单链还是双链。

活化的蛋白C或aPC指的是已经经过限制性蛋白水解转化成活化形式的蛋白C酶原。尽管aPC还可以包括其它物种的或其它来源的aPC，这些aPC也具有蛋白水解活性、氨基水解活性、酯水解活性和生物活性(抗凝血、抗炎症和纤溶酶原特性)，但是，我们仍然优选人蛋白C。关于蛋白C来源的实例已在上文关于蛋白C的描述中提及。

HPC--人蛋白C酶原。

r-hPC--重组人蛋白C酶原。

R-aPC--重组人活化蛋白C，通过离体活化r-hPC制得，或直接从原核细胞、真核细胞和转基因动物或植物中分泌得到活化形式的蛋白质C，包括，例如从人肾293细胞中获得酶原形式的分泌物，然后纯化并活化。所需技术都是本领域技术人员所熟知的，在Yan的美国专利4,981,952和Cottingham，WO97/20043中都有陈述，所有教导都在本文引入作为参考。

从血浆分离的活化蛋白C指的是通过活化血浆HPC制得的活化蛋白C，该技术在Eibl的美国专利5,478,558中有过描述，所有的教导都在此引入作为参考。

连续输注-指在一特定阶段将某种溶液连续注入静脉。

药团注射-指在大约120分钟的一段时间内注射一确定量(称之为药团)的药物。

适宜的用药形式-以低温冻干形式或溶液形式作为治疗用药物。

单位剂量形式-指物理上离散的单位，该单位以完整的剂量形式适合于人，每一单位所含有的活性物质的量是预先确定的，这一定量的活性物质与适宜的药学上的赋形剂联用，可以达到理想的治疗效果。

药学上有剂量的-指的是本发明的一种化合物的用量，它能抑制人脓毒症的发生。当然，根据本发明，化合物的具体施用剂量由参与治疗的医师对具体病例的分析来确定。

本发明提供了用活化蛋白C治疗肝素诱导的血小板减少症的方法。蛋白C，具有抗凝血活性和纤溶酶原活性，可有效治疗肝素诱导的血小板减少症患者体内动脉和静脉血栓的形成，包括富含纤维蛋白的“白色凝块综合症”。

根据本发明，施用的蛋白C可通过本领域的任意一种方法或美国专利4,981,952和5,550,036中描述的方法生成或分离而得，在此引入作为参考。例如，可以从一种细胞分泌的全长可溶蛋白C或具有生物活性的蛋白C的多肽变体中制得蛋白C，包括：(a)构建一个含有编码蛋白C的DNA的载体；(b)用该载体转染细胞；(c)在一定条件下培养转染细胞，使其分泌出全长可溶蛋白C或具有生物活性的蛋白C的多肽变体。而且，该细胞应该是真核细胞。例如，哺乳动物细胞。例如，金黄仓鼠AV12细胞，人胚胎293细胞，或小仓鼠肾细胞。

用于治疗肝素诱导的血小板减少症的蛋白质C可以根据已知的制备药学上有效的组合物的方法配制。例如，一个理想的制剂应该是一种稳定的、高纯度的冻干制备物，包填充剂，如蔗糖、盐(如氯化钠)、缓冲液(如柠檬酸钠)和蛋白质C或aPC。

蛋白C以非肠道式施用，确保蛋白C以有效形式传送到血液。施用方法是在约1小时到240小时的时间内连续注入适当剂量的蛋白C。

本领域的技术人员，根据每个病人的临床症状和临床实践，能很容易的优化药学上的有效剂量和包含蛋白C的用于治疗的组合物的施用方法。一般来说，蛋白C的施用量大约为5.0μg/kg/hr-250μg/kg/hr。优选的，用于治疗HIT的蛋白C是活化蛋白C。活化蛋白C的用量大约为1.0μg/kg/hr-96μg/kg/hr。更优选的活化蛋白C的用量大约为1.0μg/kg/hr-50μg/kg/hr。更优选的活化蛋白C的用量大约为1.0μg/kg/hr-35μg/kg/hr。更优选的活化蛋白C的用量大约为5.0μg/kg/hr-30μg/kg/hr。更优选的活化蛋白C的用量大约为15μg/kg/hr-30μg/kg/hr。更优选的活化蛋白C的用量大约为20μg/kg/hr-30μg/kg/hr。优选的活化蛋白C的用量大约为24μg/kg/hr。最优选的活化蛋白C的用量大约为48μg/kg/hr。适宜剂量的活化蛋白C的施用会减少与HIT相关的血栓复合物的形成。

施用的活化蛋白C在血浆中的浓度范围大约为2ng/mL-300ng/mL，优选浓度范围大约为2ng/mL-200ng/mL，更优选的浓度范围大约为30ng/mL-150ng/mL，最优选的浓度大约为100ng/mL。

活化蛋白C的另一种施用方式为：将每小时剂量的1/3以药团注射的方式注入，剩下的2/3剂量以连续输注的方式在1小时内注入，接下来的23小时仍按每小时剂量连续注入，这样，一天注入的剂量仍为24小时的剂量。此外，通过静脉内袋状滴泵(intravenous bagdrip pump)或注射器泵以两倍于正常速率的速率药团注射15分钟，然后，以1.5倍于正常速率的速率药团注射45分钟。正常速率是指已确定的每一时间段内注入适当剂量的治疗试剂的速率，以此速率保持240小时。

本发明中蛋白C用于治疗HIT就在于它为潜在的、严重的、逐渐变弱的紊乱提供了一种必需的治疗方法。蛋白C的施用是很有效的，而且避免了并发症的发生，例如，出血，中毒以及当前使用的抗凝试剂的副作用。

下面提供的实施例仅仅是为了对发明做进一步的阐述。本发明的范围不应该理解为仅仅由下面的实施例组成。

                         制备物1

                     人蛋白质C的制备

重组人蛋白质C(r-hPC)在人肾脏293细胞中产生，本领域的技术人员都应熟悉这一技术。该技术由Yan在美国专利4,981,952中提出，全部内容在此引入作为参考。编码蛋白质C的基因在Bang等人的美国专利4,775,624中公开和要求保护，全部内容在此引入作为参考。用于在293细胞中表达蛋白质C的质粒是在Bang等人的美国专利4,992,373中公开的质拉PLPC，全部内容在此引入作为参考。在欧洲专利申请0,445,939和Grinnell等，1987，Bio/Technology5：1189-1192中对质粒pLPC的结构也做了描述，在此引入供参考。简要的说来，质粒经转染进入293细胞，鉴别出稳定的转化体，在无血清培养液中传代培养并生长。发酵之后，经微过滤就可得到无细胞的培养液。

对Yan在美国专利4,981,952中提出方法稍做改进，就可从培养液中分离出人蛋白质C。在EDTA溶液中，调节澄清培养液的浓度，使之达到4mM，再用阴离子交换树脂(Fast-Flow Q，pharmacia)吸附。接着用4倍体积的20mM Tris，200mM NaCl，pH7.4的溶液洗涤，再用2倍体积的20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4的溶液洗涤，然后，用20mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl₂，pH7.4的溶液洗脱。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，洗脱出的蛋白质纯度达95％以上。

蛋白质的进一步纯化通过下述步骤完成：在NaCl溶液中调节蛋白质浓度，使之达到3M，用疏水树脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)吸收，该树脂需用20mM Tris，3M NaCl，10mM CaCl₂，pH7.4的溶液平衡。然后用2倍体积没有CaCl₂的平衡缓冲液洗涤，最后用20mM Tris，pH7.4的溶液洗脱重组蛋白质C。

洗脱后的蛋白质通过去除残存的钙而活化。重组人蛋白质C通过金属亲和柱(Chelex-100，Bio-Rad)去除残存的钙，然后再次经阴离子交换树脂(Fast Flow Q，pharmacia)纯化。这两个柱子要按顺序排列，并在20mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.4的溶液中平衡。加入蛋白质，在将Chelex-100亲和柱与系统断开之前，应用1倍体积的相同缓冲液洗涤。阴离子交换树脂柱也应用3倍体积的平衡缓冲液洗涤，然后再用0.4M NaCl，20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液洗脱。重组人蛋白质C的浓度和重组活化蛋白质C的浓度分别在紫外280nm(激发E^0.1％＝1.81或者1.85)处检测。

                    制备物2

                重组人蛋白C的活化

在4℃，50mM HEPES，pH7.5的环境中，牛凝血酶与活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)结合，该偶联反应在已经准备好的大约每毫升5000单位凝血酶的树脂柱中进行。凝血酶溶液循环过柱大约3小时，然后加入2-氨基-乙醇(MEA)，至终浓度为0.6mL/L，再循环过柱10～12小时，以确保完全阻断树脂上未反应的胺。阻断之后，用10倍体积的1M NaCl，20mM Tris，pH6.5的溶液洗涤结合了凝血酶的树脂，以去除所有非特异性的杂蛋白，在活化缓冲液中平衡之后，进行活化反应。

在EDTA溶液中调节纯的重组人蛋白C(r-hPC)，以螯合所有残存的钙，然后用20mM Tris，pH7.4的溶液或20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液调至浓度为2mg/mL。将该溶液通过37℃时用50mM NaCl，20mMTris，pH7.4的溶液或50mM NaCl，20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液平衡过的凝血酶树脂柱。调节流速，使重组人蛋白C与凝血酶树脂柱的接触时间大约为20分钟。收集洗脱液，并立即做氨基水解活性分析。如果收集到的物质与标准的蛋白C相比没有特异的氨基水解活性，那么让其再过一次凝血酶树脂柱，以激活重组人蛋白C。然后用20mM Tris，pH7.4的溶液或20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液将其稀释至1∶1，以保证蛋白C在下一步使用之前维持在较低的浓度水平。

凝血酶与蛋白C的分离是通过蛋白C与阴离子交换树脂结合来实现的，该阴离子交换树脂需在活化缓冲液(20mM Tris，pH7.4的缓冲液或20mM Tris-乙酸，pH6.5的缓冲液)中用150mM NaCl平衡。在此条件下，凝血酶不与阴离子交换树脂发生反应，而只是通过树脂柱流出。一旦蛋白C结合在树脂柱上，就可用2～6倍体积的20mM平衡缓冲液洗涤，然后在5mM Tris-乙酸，pH6.5的缓冲液中或20mMTris，pH7.4的缓冲液中用0.4M NaCl一步洗脱蛋白C。用于冲洗的缓冲液越多，十二肽的去除也就越完全。从树脂柱上洗脱下来的蛋白C可在-20℃冷冻保存，或以低压冻干粉末的形式保存。

活化的蛋白C的抗凝活性是通过测定凝血时间的延长来确定的，而凝血时间的延长是激活部分凝血因子III时间的延长引起的。将样品用稀释缓冲液(1mg/mL放射免疫分析纯的牛血清白蛋白，20mMTris，pH7.4，150mM NaCl，0.02％NaN₃)按梯度稀释，使蛋白C的浓度达到125-1000ng/mL，制作标准曲线。在每个样品管中，加入50μl预冷的马血浆和50μl重组的APTT试剂(Sigma)，37℃温育5分钟。温育后，向每个样品管中加入50μl的相应的样品或标准物。用稀释缓冲液代替样品或标准物来确定基本的凝血时间，在每一样品管中加入50μl，37℃的30mM CaCl₂后，立即开始计时。根据标准曲线的线性回归方程计算样品中活化蛋白C的浓度。这儿所报导的凝血时间是至少三次重复实验的平均值，包括标准曲线样品。

以上的描述已足以使一个本领域的技术人员制备用以治疗肝素诱导的血细胞减少症的蛋白C。

                    制备物3

                 活化蛋白C的配制

活化蛋白C的稳定冻干溶液按下述方法制备：冻干含有大约2.5mg/mL活化蛋白C、15mg/mL蔗糖、20mg/mL氯化钠和pH值介于5.5～6.5之间的柠檬酸钠缓冲液的溶液。此外，再低温冷冻含有大约5mg/mL活化蛋白C、30mg/mL蔗糖、38mg/mL氯化钠和pH值介于5.5～6.5之间的柠檬酸钠缓冲液的溶液。

蛋白C、盐和填充剂三者的重量之比是该过程中与冷冻干燥相关的重要因子。这一比值的变化取决于蛋白C的浓度、盐的种类和浓度，以及填充剂的种类和浓度。优选比例为：大约1份活化蛋白C、7.6份盐和6份填充剂。

适于通过连续注入的方法使用的单位剂量的活化蛋白C溶液按下述方法配制：将活化蛋白C、氯化钠、蔗糖和柠檬酸钠缓冲液混匀，然后取4mL该溶液转移到单位剂量容器中并冻干，密封，储存备用。该单位剂量容器中应含有5～20mg的活化蛋白C，按大约0.01～0.05mg/kg/hr的剂量输入病人体内。

                     实施例1

        用安慰剂作对照的双盲试验LY 203038

用重组人活化蛋白C(rhAPC)治疗肝素诱导的血小板减少症(HIT)

接受过肝素处理的病人中，7天内有1％的病人患有肝素诱导的血小板减少症，14天内有3％的病人患有肝素诱导的血小板减少症。即使不再接收肝素，仍有50％的患肝素诱导的血小板减少症的病人出现静脉血栓，偶儿也出现动脉血栓。对于患肝素诱导的血小板减少症的病人，肝素会导致血小板释放血小板因子IV。肝素与血小板因子IV形成的复合体引发HIT-IgG的释放，而HIT-IgG与肝素和血小板因子IV形成的复合体与血小板Fc感受器结合，从而激活了血小板。

通过释放更多的血小板因子IV，血小板的激活能导致凝血酶的形成。HIT-IgG识别血小板因子IV与内皮细胞上的硫肝素硫酸形成的复合体，引发内皮细胞表面组织因子的表达，并引发凝血过程。血小板因子IV则通过中和肝素，不断的形成凝血酶。

治疗肝素诱导的血小板减少症，不仅要停用肝素，还要防止形成血栓的后遗症。能阻断凝血酶合成的物质通常都能起到这一作用，重组活化蛋白C(r-aPC)就是一种阻断凝血酶合成的阻断剂，它通过抑制凝血过程中因子Va和因子VIIIa的活性而阻断凝血酶的合成。输入重组活化蛋白C将导致激活部分凝血因子III的时间延长，当然，这也取决于所用重组蛋白C的剂量大小。重组蛋白C就是这样起作用的。

本试验旨在表明：对于肝素诱导的血小板减少症患者，使用重组活化蛋白C治疗，比起使用安慰剂治疗，在死亡、新血栓形成以及截肢三个方面都有统计意义上的显著降低。

本试验适用于那些通过下述方法确诊的肝素诱导的血小板减少症患者：1)使用肝素5天或更多之后，血小板数量低于基线的50％或以于150000；2)通过分析血小板上¹⁴C标记的5-羟色胺的释放，对肝素依赖型的IgG进行阳性检测。

服合入选HIT以及没有例外标准的患者停止使用肝素。除了接受warfarin治疗外，患者还接受90小时的安慰剂或r-aPC治疗。r-aPC的用量为48μg/kg/hr，先前的试验证明该剂量能将aPTT提高到基线的2倍。

本研究的第一终点是在30天内发生了死亡、下肢截肢和新的血栓形成的联合终点。使用安慰剂的(患者)比例假定为50％。将r-aPC和安慰剂在安全性方面相对比，将发生临床上的显著出血作为另外的第一终点。本试验的第二终点为血小板恢复的时间点。

Claims (10)

1.一种治疗肝素诱导的血小板减少症(HIT)患者的方法，包括给所说的患者施用药学上有效量的蛋白C。

2.权利要求1的方法，其中蛋白质C是人蛋白质C酶原。

3.权利要求1的方法，其中蛋白C是活化的人蛋白C。

4.权利要求3的方法，其中活化的人蛋白C的量大约是1μg/kg/hr-96μg/kg/hr。

5.权利要求4的方法，其中活化的人蛋白C的用药方式是连续输注大约1-240小时。

6.一种治疗有需要的患者中肝素诱导的血小板减少症的方法，包括给所说的患者施用药学上有效量的活化蛋白C，使血浆中活化蛋白C的浓度达到大约2ng/mL-300ng/mL。

7.权利要求6的方法，其中活化蛋白C的施用方式是药团注射。

8.权利要求6的方法，其中活化蛋白C的施用方式是连续输注大约1—240小时。

9.权利要求6的方法，其中活化蛋白C的施用方式是首先药团注射，后连续输注。

10.权利要求9的方法，其中1/3量的活化蛋白C以药团注射方式给药，使血浆中的活化蛋白C的浓度达到大约2ng/mL-300ng/mL，接下来，剩余的2/3剂量的活化蛋白C以连续输注方式给药。