CN1323886A - 确定微生物对改变生长剂的敏感性之方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种用于确定改变生长剂对微生物生长有明显作用的浓度的方法,包括以下步骤:准备微生物生长培养基;准备敏感试剂,其中包含与标记物混合的改变生长剂,所述标记物具有强度与标记物的浓度成比例的信号;将试剂掺入生长培养基,方式为使改变生长剂与标记物在生长培养基中产生浓度梯度;用靶微生物接种生长培养基;培养该接种的生长培养基足以使靶微生物生长至可检测量的一段时间;评估在含改变生长剂的区域中该微生物的生长特性;测定区域中信号的强度;并利用所述信号的测定强度确定区域中改变生长剂的浓度。

Description

确定微生物对改变生长剂的敏感性之方法和装置

总的说来，本发明涉及确定微生物对改变生长物质之敏感性的方法和装置，尤其涉及确定改变生长剂对微生物有明显作用的最低浓度的方法和装置。

改变生长剂如：抗生素、防腐剂、药物、激素、诱变剂和营养素常常被用来改变、抑制或促进微生物的生长。因为，通常改变生长剂的作用是其浓度的函数，了解改变生长剂对微生物有明显作用的浓度被认为有很大用途。现存的数种评估改变生长剂对微生物的作用的方法和装置是将微生物与改变生长剂的多个间隔浓度接触。例如：Kirby-Bauer检验，使用了放置在一层生长培养基上的许多圆盘，每个圆盘包含一定浓度的抗生素。在生长培养基上生长的细菌形成可见的覆盖层，而在具有足以抑制细菌生长的抗生素浓度的圆盘周围的区域没有。Kirby-Bauer检验的缺陷在于，在任何指定的生长培养基位点上影响抗生素浓度的因素是多种多样的，并不能准确测定抗生素的最小抑制浓度。

另一种估测改变生长剂对微生物的作用的方法和装置是试管稀释法，其中等量的靶微生物被置于大量分布于浅盘中的孔(称为“试管”)，在每个试管中加入不同浓度的改变生长剂。某些浓度的改变生长剂会给靶微生物带来明显的变化，如：它的生长被改变、促进或抑制。试管稀释法的缺陷在于它的精确度取决于试管之间浓度改变的间隔大小。其间隔越小结果越精确，但需要大量不现实数目的试管和工作。另外，制备精确稀释物是需要大量试管的增加成本的昂贵过程因此，提高该方法的精确度也增加实验需要的时间和花费。

确定改变生长剂对靶微生物有明显作用的浓度需要一种高效的、精确的方法和装置。

本发明的一方面，提供了一种确定改变生长剂对靶微生物有明显作用的浓度的方法和装置。

根据本发明，提供了一种确定改变生长剂对靶微生物的生长有明显作用浓度的方法和装置，该方法包括以下步骤：a)准备微生物生长培养基；b)准备敏感试剂，其包括具有与标记物浓度成比例的信号强度的标记物混合的改变生长剂；c)将敏感试剂掺入生长培养基，方式为在生长培养基内产生改变生长剂和标记物浓度梯度；d)用靶微生物接种生长培养基；e)培养接种的生长培养基足以使靶微生物生长到可检测量的一段时间；f)评价含有改变生长剂区域中的微生物的一种或多种生长特性；g)测定该区域内标记物信号的强度；并h)利用测定的标记物信号的强度确定改变生长剂的浓度。

这里所指的“改变生长剂”包括那些可以改变、抑制或促进微生物生长的试剂。例如，包括但不限于，抗生素、防腐剂、药物、化学试剂、激素、诱变剂、营养素或生长促进剂。这里定义的“靶微生物的生长”包括正生长(positivegrowth)或负生长(negtive growth)，突变生长和非典型形状生长。

本发明的一个优点在于提供了可在最短时间内得出精确结果的测定方法，用于测定对靶微生物生长有明显作用的改变生长剂的浓度。本发明用到的敏感试剂包含具有其强度与标记物的浓度成比例的信号的标记物。试剂内标记物的浓度与改变生长剂的浓度成比例。探查区域内标记物信号可以确定在生长培养基该区域内改变生长剂的浓度。因此，可确定改变生长剂的确切浓度而不是大约的浓度，同时不需要大量的耗时的稀释步骤。

本发明的另一优点在于提供了一种确定对靶微生物的生长有明显作用的改变生长剂浓度的高效方法。本发明所述方法可提供准确的生长改变试剂的信息，无需试管稀释法所需的昂贵的多步稀释。本领域技术人员知晓，缩短昂贵的医学实验室时间且减少设备可使本发明的成本大大低于现有的任何一种方法。

本发明的另一优点在于提供了用于确定对靶微生物生长有明显作用的生长改变试剂浓度的“用户友好”的装置。本装置的实施方案方便了检测过程，将样品溢出的可能性降到最低，并可在检验后方便地处理。此特性及其它方面使该装置因易处理而有吸引力。

本发明的这些及其它方面、特征和优点参照详细描述的最好实施模式以及附图是显而易见的。

图1．本发明所述方法中Kirby-Bauer平板型装置的横截面示意图。

图2．表示与图1显示的Kirby-Bauer型装置相关的标记物的信号强度为线性距离的函数的图。

图3．用于表示本发明方法的含有微生物生长培养基的槽的横截面示意图。

图4．表示与图3所示的装置相关的标记物的信号强度为线性距离的函数的图。

图5．图3中所示横截面示意图，还包括将敏感试剂添加到基质中。

图6．图解表示一个本发明装置的具体实施方案。

图7．图6所示装置的横截面图。

用于确定对靶微生物生长有明显作用的改变生长剂浓度的本发明所述的方法包括，提供能支持微生物生长的培养基，有效量的靶微生物和敏感试剂。通常采用凝胶、半固体或渗透性固体形式的生长培养基。在使用过程中可以再水合的脱水生长培养基是特别有利的，因为脱水培养基容易延长保存的时间。靶微生物可以由从尿、脑脊液和体腔液中提取的第一代微生物，或例如从在另一种生长培养基上生长的菌落提取的微生物悬浮液组成。靶微生物也可从周围环境例如水，食物或食品表面中获得。

敏感试剂包含改变生长剂和标记物。在第一个实施方案中，敏感试剂包含与有用却未精确测定的标记物混合的精确量的改变生长剂。第二个实施方案中，将试剂的改变生长剂和标记物用已知精确比例混合，并可根据应用调整试剂的总量。这些试剂的实施方案仅需要精确已知一个参数(改变生长剂的量或生长改变试剂与标记物的比例)，这样可最小化制备敏感试剂的成本，从而降低整个方法的成本。

标记物可为任何如下物质：1)具有与标记物浓度成比例的强度的可鉴别信号；2)具有在待检样品内可与其它元件区分开的信号；3)具有一个信号并且信号强度不受靶微生物生长的不利影响；4)对靶微生物生长无实质上的不利影响；5)对待评价的生长改变剂的作用无不可预计的或不利的影响；6)如需要，在培养过程中可与改变生长剂在生长培养基内以可预计的方式共扩散的标记物，使局部标记物浓度与该局部改变生长剂浓度成比例。例如，可以使用具有生长培养基激发或发射波长范围之外的激发或发射波长的荧光标记物，且其不与靶微生物或生长培养基结合。标记物和改变生长剂优选在生长培养基中以同样的速率扩散，尽管不一定需要相似的扩散速率。或者可以使用具有不同的但是已知的扩散速率的标记物和改变生长剂。在另一个实施例中，可以使用被改变生长剂吸附的可识别染料。由于是改变生长剂“携带”染料；从染料发射的标记物信号强度与改变生长剂的浓度成比例。本说明书中“比例”和“成比例的”包括可数学性描述的任何关系，如x∶y,x∶y²,x∶1/y等。

本发明方法进一步包括如下步骤：a)将敏感试剂掺入生长培养基；b)用靶微生物接种生长培养基；c)培养该接种的生长培养基；d)评测靶微生物在生长培养基一定区域内的一种或多种生长特性；e)测量该区域内标记物信号的强度，并且f)用该区域内测得的标记物信号强度确定该区域内改变生长剂的浓度。在有些应用中，可能用于在生长培养基的多个区域内评测靶微生物的一种或多种生长特性。改变生长剂的浓度将以同样地方法在那些区域内确定。

在某些应用中，本发明方法可进一步包括将微生物的生长特性的改变与改变生长剂的浓度相关联的步聚。相对于浓度的微生物生长改变的方式取决于具体应用，例如其关系可以是线性、指数性、阶梯函数等关系。沿梯度精确确定其浓度的本发明所述的方法可确定所述关系。

对生物体的影响可以通过多种方法来确定。例如：检查生长培养基上相邻的生长区域，其中生长的覆盖或生长密度的改变可以指示其改变生长剂的作用。更灵敏的方法是检查单个菌落生长特征如生长速率、菌落面积、菌落形态等的改变。单独生物体、小菌落群或微生物也可以检查这种改变。

将敏感试剂掺入生长培养基混合，方式为使生长培养基内形成至少一个试剂浓废梯度。改变生长剂和标记物在梯度终点的浓度优选是这样的，使得对靶微生物生长有明显作用的生长改变试剂的浓度总落在梯度的两个端点之间。例如，可以将试剂掺入生长培养基或将试剂添加到生长培养基表面而直接完成掺入。通过将试剂添加到一种基质(substrate)和将该基质接触或接近生长培养基，也可完成间接掺入。

可采用任何已知可用于生长培养基和靶微生物的方法接种生长培养基。接种到生长培养基上的靶微生物数量应该足以将掺入试剂的生长培养基整个区域充分覆盖。接种物的足够浓度依赖于可得的检测参数，包括生长培养基的类型，靶微生物、改变生长剂等。掺入敏感试剂并接种了靶微生物的生长培养基可在任何可以使生长培养基和靶微生物接受的条件下培养。

因为，改变生长剂对靶微生物生长有明显作用的点落在梯度的两个端点之间，该梯度可确定改变生长剂对微生物的作用为生长改变试剂浓度的函数。在多数情况下，有一个改变生长剂无明显作用的生长培养基第一区段，和改变生长剂对一个或多个特征有明显作用的生长培养基第二区段，以及位于第一区段和第二区段之间的边界区域。边界区的范围取决于周围的环境，包括改变生长剂的类型、微生物的类型、浓度梯度的斜率等。取决于改变生长剂和微生物，跨越边界区域的改变可以与改变生长剂的浓度数学上相关联。如果改变生长剂能促进生长，例如，由这种数学关系得出的确切生长浓度曲线可对选择在商业化工艺中加入这种试剂的最优成本/收益比例有帮助。

如改变生长剂是一种抑制剂，例如在具有基本上未抑制发育的第一区段(抑制剂浓度太低因而不能对微生物起到明显作用)和基本上抑制发育的第二区段(抑制剂达到足够的浓度可对微生物起到明显作用)之间定义了该边界区的边界。落在边界区上梯度的点是改变生长剂对微生物起明显作用的最低浓度。如果是另一方面，改变生长剂是一种营养物质，第一区段(具有营养物质有效浓度)可能比第二区段(具有营养物质的无效浓度)具有的发育速度更快。

微生物的生长特征差异的另一例子是微生物的非典型形态的明显不同。如果改变生长剂会导致微生物产生微生物非典型形态，则会有第一区段，其具有基本上正常形态的微生物(改变生长剂浓度太低因而不能对微生物有明显作用)，和第二区段，其具有统计学上明显的非典型形态的微生物群体(改变生长剂达到足够浓度以对微生物具有明显作用)。

改变生长剂对微生物的作用以及边界区域的位置一般由光学方法来确定，例如由培养基上包被的微生物的光密度值变化确定。有时候，使用确定改变生长剂的作用和边界区位置的第二种方法，其中包含这样的标记物(与试剂中包含的标记物相同或无关)，包括但不限于与生长的微生物相互作用，或被其代谢，生产出敏感物质。探查与所述靶微生物生长一起存在的敏感产物以建立边界。确定改变生长剂的作用和边界区位置的第三种方法包括评价带有靶微生物生长的区域光散射特征与基本上无靶微生物生长区域的光散射特征的关系。在所有三种方法中，一旦边界区域被确定，可探查试剂中的标记物信号，且测定其强度。如果要评估在培养基上所述部分的单个菌落或微生物，它们可以容易地用放大镜或显微镜观察或拍照。

与敏感试剂中的生长改变试剂混合的标记物提供了生长培养基所有区段的定量信息，包括可计算改变生长剂的浓度的边界区域。特别是，边界区中标记物信号的强度与边界区中标记物浓度成比例，且可以根据标记物和改变生长剂浓度之间的已知比例关系来确定改变生长剂的浓度。确定改变生长剂浓度的确切方法取决于生长培养基的物理参数，例如敏感试剂如何分散，标记物与试剂中改变生长剂的比例关系等。下面的实施例将说明利用本发明所述的方法如何计算改变生长剂的浓度。

实施例1

参见图1和2所示，在第一个实施例中本发明所述方法使用Kirby-Bauer型装置10(横截面图所示)，它包括一个平板12，以靶微生物接种的均一厚度“T”的微生物生长培养基层14，和圆盘16。敏感试剂(与不准确定量的荧光标记物混合的已知确定量的改变生长剂)添加到圆盘16上该圆盘与生长培养基14相接触。敏感试剂分散到生长培养基14中，形成随其传递时径向的浓度梯度18(如附图1所示)。培养接种后的生长培养基14，带有可检测到的微生物生长的区段20和无可检测的微生物生长之区段22相邻。

如图1和2所示，将该平板放置于市售扫描荧光计(未显示)中，其经调整用于探查该标记物的荧光信号特性。荧光仪形成如曲线25(图2)的曲线，代表信号强度为平板上的径向距离的函数。标记物的信号强度是给定体积(V)的标记物浓度的函数，是通过探查具有均一厚度的(T；V=A*T)生长培养基上的面积(A)所决定。在边界区24(在20、22区段之间)中标记物的信号强度表示为例如位于边界区24中的生长培养基体积(V)内测量的信号强度。如前述，区段20、22之间的区域24的位置可通过光学、或别的方式被确定。在圆盘16下的生长培养基14和具有可检测靶微生物生长的生长培养基区段20中，标记物的信号可由于干扰变得模糊。标记物的总信号强度可通过用曲线拟合数学分析评估模糊区域中的信号强度来确定。为了阐明，图2显示一个在模糊区域的数学拟合适曲线27的例子。总的标记物的信号强度随后由曲线下所示面积的积分来确定。如上述，以线性方式扫描标记物信号跨过检测面积的中心。因敏感试剂实际上在生长培养基周围呈径向扩散，可能有必要调整信号积分以反映试剂的经向扩散。通过扫描含径向扩散的试剂的整个表面，可避免信号积分调节。

在边界区24的给定体积(V)中的标记物浓度可以表示为标记物信号在边界区域24的强度(由体积V探查)对生长培养基14的总体积内的标记物信号的总强度之比例。通过标记物和改变生长剂的扩散速率之比，将标记物在边界区24中的浓度与改变生长剂在边界区24(同样体积V)中的浓度相关联。如果扩散速率相等，改变生长剂在边界区中的浓度可以如下确定：

重新整理上式，可得到在边界区24的未知的改变生长剂浓度的结果：

如果改变生长剂与标记物的扩散速率不同，使用代表两个扩散速率之间数学关系的校正因子用于校正该差异。另外，上述表达式中需要在培养基14的总体积中改变生长剂的量准确已知。如果所有的敏感试剂(包含与不精确测量的荧光标记物混合的已知精确量的改变生长剂)掺入生长培养基，那么改变生长剂的量可从试剂确定。也可使用其它确定生长培养基14总体积内的改变生长剂的量的方法。

实施例2

如图3-5所示，槽26包含用靶微生物接种的已知均匀厚度“T”的生长培养基层28。图3所示一个实施方案，其中将包含已知浓度准确比率的改变生长剂与标记物的敏感试剂量，添加到位于槽26一端的生长培养基28的表面30。图5所示另一个实施方案，其中将含有已知准确浓度比率的改变生长剂与标记物之敏感反应物的量，添加到置于与生长培养基28的表面34相接触的基质32上。在这两种实施方案中，选择改变生长剂与标记物最初浓度的比率，以确保改变生长剂和标记物在生长培养基28中充分地扩散，以在可能的边界区域提供易于检测量的标记物。起始浓度的比率可用常数“K1”来表示

K1=〔改变生长剂浓度〕_起始/〔标记物浓度〕_起始

代表改变生长剂与标记物起始浓度的比率之准确值在敏感试剂制备时被确定。提供了对照块36，其独立置于生长培养基层28，它含有已知量的标记物，发射已知强度的荧光信号。含于对照块36的标记物可以与试剂中所用的不同。如果标记物不同，或者如果在对照块36内的标记物与在生长培养基28中的标记物的反应不同，每种标记物的浓度与信号强度的比率必须是已知的。

敏感试剂扩散到生长培养基28中，沿路径侧向形成逐渐递减的浓度梯度38(如图3和5所示)。培养接种的生长培养基28，有可检测的微生物生长的区段40逐渐邻近无可检测的微生物生长的区域42。将经调节以探查标记物特征性荧光信号的市售荧光扫描仪(未显示)用于检测在区段40、42之间边界区44的给定体积(V)中发射的标记物信号强度，这里的体积(V)由接种的生长培养基所扫描的面积(A)(具有均匀厚度(T))所确定(V=A*T)。如前所述，在区段40、42之间的边界区44的位置可采用光学方法或别的方法所确定。荧光仪产生代表信号强度为通过槽26侧面距离的函数的曲线43(图4)。

在边界区域44的改变生长剂的浓度可以通过先利用下面关系式测定边界区域44给定体积(V)中的标记物浓度来计算：

由于边界区44的标记物信号是已知的，可以重排以解出未知标记物浓度：

一旦在边界区域44的标记物浓度被确定。在边界区域44的改变生长剂浓度可通过改变生长剂与标记物的初始浓度的比率(K1)乘以边界区域44中的标记物浓度而得到，条件是改变生长剂和在敏感试剂中的标记物有相同的扩散速率：

K1×〔标记物的量/V〕边界=改变生长剂在边界区的浓度

如果改变生长剂与标记物的扩散速率不同，将代表两个扩散速率之间的数学关系的校正因子用于校正该差异。

如图6和7所示，用于确定改变生长剂对靶微生物生长有明显作用的浓度的优选装置46包括带有孔(well)50的盒体48，掺入培养基层52的敏感试剂，一对吸收条54和透明的孔盖56。孔50包括一对延伸到孔50的壁之间的槽58。生长培养基52放置于孔50中，吸收条54放于每个槽58中。生长培养基52如附图7所示，包括数个不同的区段60，各掺入试剂的梯度条62。在实例中，可用于估计各种不同的改变生长剂，每个试剂梯度条62可包括一种不同的改变生长剂。与盒体48相接触的透明孔盖56在孔50之上，保护并保持生长培养基52和吸收条54在孔50内。盒体48可以另外包括多个孔50，每个孔与上述描述相似。该装置还包括一个入口64，通过其可将靶微生物溶液分配入培养基52。

装置46还包括机读码信息标签66和供使用者阅读的信息标签68。机读信息标签66包括数据块70，其含有相关的信息如，待做的检验。标定常数、患者身份、等，所述信息呈机读信息如条形码或磁性条。取决于于所应用的分析，机读标签66可直接包括使分析仪器进行已知分析的所有必要信息。在另一例子中，机读标签66可以指导分析装置接收分析装置中包括的数据档案，或由分析装置遥控接收。因此，可以说标签66直接或间接包括使该分析装置进行已知分析的必要信息。机读信息标签66还可以包括一个参考块72，包含用于分析培养基内的试剂标记物信号的敏感标记物的已知量。供使用者阅读的信息标签68包含那些使用者在无机器帮助下可以识别该装置46的信息。

虽然本发明已知被详细描述展现了其实用的关键细节，但本领域技术人员知晓在形式和细节上的各种改变都被认为是不脱离本发明的实质性特点和范围。

Claims (18)

1．一种用于确定改变生长剂对微生物生长有明显作用的浓度的方法，包括以下步骤：

a)准备微生物生长培养基；

b)准备敏感试剂，其中包含与第一种标记物混合的改变生长剂，所述第一种标记物具有强度与所述第一种标记物的浓度成比例的第一种信号；

c)将所说试剂掺入生长培养基，方式为使改变生长剂与第一种标记物在生长培养基中产生浓度梯度；

c)用靶微生物接种所述生长培养基；

d)培养该接种的生长培养基足以使靶微生物生长至可检测量的一段时间；

e)评估在含所述改变生长剂的区域中该微生物的生长；

f)测定所述区域中第一种信号的强度；并

g)利用所述第一种信号的测定强度确定所述区域中改变生长剂的浓度。

2．根据权利要求1所述的方法，其中通过将该试剂添加到生长培养基表面而将所述试剂掺入到所述生长培养基。

3．根据权利要求1所述的方法，其中所述掺入步骤包括将所述敏感试剂添加于一种基质，并且将所述基质接触或接近该生长培养基。

4．根据权利要求1所述的方法，其中准备所述敏感试剂的步骤进一步包括：提供与有用量的所述标记物混合的精确已知量的改变生长剂。

5．根据权利要求1所述的方法，其中准备所述敏感试剂的步骤还包括：以已知准确比例提供所述改变生长剂与第一种标记物，其中所述的准确比例可以数学表示为初始改变生长剂浓度与初始标记物浓度的比率。

6．根据权利要求1所述的方法，其中所述区域被安排在改变生长剂没有明显作用的生长培养基第一区段与生长改变剂有明显作用的生长培养基第二区段之间。

7．根据权利要求6所述的方法，其进一步包括步骤探查该生长培养基对先散射特征的差异，且利用该光散射特性来确定该区域。

8．根据权利要求1所述的方法，其还包括步骤：将所述微生物生长的一种或多种改变与改变生长剂的浓度相关联。

9．根据权利要求8所述的方法，其中在沿所述梯度的多个区域中测量的第一种信号。

10．一种用于确定改变生长剂对靶微生物生长有明显作用的最低浓度的方法，包括以下步骤：

a)准备微生物生长培养基；

b)准备敏感试剂，其中包含与标记物混合的改变生长剂，所述标记物具有强度与所述标记物的浓度成比例的信号；

c)将该试剂掺入所述生长培养基，方式为使改变生长剂与标记物在生长培养基内产生浓度梯度；

d)用所述靶微生物接种所述生长培养基；

e)培养该接种的生长培养基足以使所述靶微生物生长到可检测量的一段时间；

f)评价生长培养基中在其上微生物生长特性有明显差异的区域，所述区域相互之间通过边界区域互相分离；

g)测定该边界区中所述标记物的信号强度；并

h)利用所述标记物信号的测定强度计算所述改变生长剂的浓度。

11．一种用于确定改变生长剂对靶微生物生长有明显作用的浓度的方法，包括以下步骤：

a)准备微生物生长培养基；

b)准备掺入所述生长培养基的敏感试剂；

c)用靶微生物接种生长培养基；

d)培养该接种的生长培养基足以使靶微生物生长到可检测量的一段时间；

e)确定在微生物生长上存在差异的生长培养基之一对相邻区域的边界区；

f)探查在所述边界区中的敏感试剂；

g)利用所述探查的敏感试剂计算所述抗生素的浓度。

12．一种用于确定改变生长剂对靶微生物生长有明显作用的浓度的装置，包括：

一层微生物生长培养基；和包含改变生长剂和标记物的敏感试剂，所述标记物具有强度与标记物的浓度成比例的信号；其中所述试剂掺入到所述层或生长培养基中，所用方式在所述生长培养基内产生所述改变生长剂和标记物的浓度梯度。

13．根据权利要求12所述的装置，其中所述敏感试剂包含与有用量的所述标记物混合的已知准确浓度的所述改变生长剂。

14．根据权利要求12所述的装置，其中所述敏感试剂包含已知准确比例的改变生长剂与第一标记物，所述准确比例可在数学上表示为初始浓度的比。

15．根据权利要求12所述的装置，还包括：

一种探查所述标记物信号的传感器；和确定所述靶微生物生长的工具；其中所述传感器可操作地探查在与检测到靶微生物生长相邻的边界所述标记物信号。

16．一种敏感试剂，包含：一种改变生长剂；和一种具有强度与标记物浓度成比例的信号的标记物。

17．根据权利要求16所述的敏感试剂，其中所述试剂包含第一种量的所述改变生长剂和第二种量的所述标记物，并且第一种量比第二种量保持的更为精确。

18．根据权利要求16所述的敏感试剂，其中所述改变生长剂与所述标记物以准确比例混合。

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