CN1321199A - 用于繁殖突变疱疹病毒的细胞系 - Google Patents

Abstract

繁殖在内源HSV VP16基因或其同源物上具有突变的突变疱疹病毒的方法,该方法包括用所述突变疱疹病毒感染细胞系并培养所述细胞系,其中所述细胞系包含编码有功能的单纯疱疹病毒(HSV)VP16多肽的核酸序列或其同源物,所述核酸序列有效连接到允许所述多肽在所述细胞系中表达的控制序列;所述核酸序列(1)能够互补所述内源基因,并且(2)不能与所述内源基因发生同源重组。此外,本发明提供可用于培养突变疱疹病毒的细胞系,所述突变疱疹病毒在某些立即早期基因上存在缺陷,并且在VP16或其同源物上存在突变。

Description

用于繁殖突变疱疹病毒的细胞系

发明领域

本发明涉及用于培养突变疱疹病毒的细胞系。本发明尤其涉及培养在这样的基因具有突变的病毒：所述基因是必需结构蛋白，但也具有其它功能，所述基因的失活妨碍病毒生长。本发明提供了增强具有这种失活突变的病毒的生长的细胞系，其中所述病毒具有所述突变的方式使病毒中失活的功能不能通过病毒序列与细胞系中的互补序列的同源重组而得到修复。此外，本发明还提供了可以用于培养突变疱疹病毒的细胞系，所述疱疹病毒在某些立即早期基因上有缺陷，并且在必需结构蛋白上存在突变。

发明背景

已经提出疱疹病毒是用于基因传递的有潜力的载体。例如，不是对于神经系统或体内的其它地方为基因治疗、疫苗或其它目的是这样，就是对于培养中的细胞或动物疾病模型也是这样。虽然由于HSV可以在体外和在体内感染广泛多种细胞类型，并且可以接受大的DNA插入以允许传递多个基因，因而具有作为载体的多种好处，但HSV对大多数细胞类型的感染会导致裂解性复制或所述病毒的其它毒性效应。因此，为用作载体，通常必须以某种方式损伤HSV以预防或最小化这些效应。

可以以多种方法损伤HSV，这包括当在培养所谓扩增子载体中用作辅助病毒时，所述扩增子载体包括含有疱疹原点和包装序列的质粒，所述扩增子载体在转染进允许细胞后能够在辅助病毒存在的情况下复制。例如可以失活在所有细胞类型中复制所需的基因，为在培养物中生长，必须互补这些基因，所述基因包括必需立即早期基因ICP4或ICP27中的一个或另一个或二者。或者可以除去在体内发病需要但对于在培养物中生长非必需的基因，如ICP34.5或ICP6，同样可以除去其缺失进一步降低毒性的其它基因。这些可以包括例如其它IE基因ICP0、ICP22和ICP47，除非这些失活也在用于培养病毒的细胞系中得到互补，否则ICP0和/或ICP22的失活降低病毒在培养物中复制的效率。因此，产生有效并且实用的载体病毒取决于在靶细胞类型中合适地最小化毒性的平衡，以及取决于在培养物中培养病毒的能力，在一些情况下需要使用至少互补病毒中一些失活突变的细胞系。作为一般性的原则，病毒中突变的数目越大，所述病毒越难在培养物中生长。HSV载体在Coffin和Latchman，1996中一般性综述。

从上面可以看出，在产生HSV载体时，需要失活的特别具有吸引力的基因是五个IE基因中的一个或多个基因，因为这些基因的失活也会降低其表达受到这些IE基因产物刺激的其它蛋白的水平，至少对ICP0、ICP4、ICP22或ICP27来说是这样。然而，假如失活这些基因，在培养物中的复制将或者被阻断(ICP4和ICP27)，或者被减弱(ICP0和ICP22)，因此，为进行有效的复制，必须在用于培养病毒的细胞系中互补所失活的基因。

然而，另一种可以降低有功能的IE蛋白的水平而不是在所述IE基因本身中包括失活突变的方法是在编码VP16的基因(Ace等，1988)中包括失活突变。VP16是一种毒粒蛋白，它与细胞的因子一起在感染后引起HSV IE基因启动子的反式激活。因此，在VP16中包括特异性失活突变产生IE基因的表达降低但未完全阻断的病毒(Ace等，1989)。这在产生HSV载体病毒时可能是有利的，因为在一个基因(VP16)中一种功能的失活导致多个IE基因表达水平降低。

然而，不能从所述病毒中缺失编码VP16的基因，因为该基因也是必需结构蛋白。因此使用特异性的突变，降低或完全破坏VP16的反式激活活性，但仍然使所述蛋白能够完成其结构功能(Ace等，1988)。包括这种类型突变(在VP16基因中特异性地插入接头序列，如in1814病毒突变体一样(Ace等，1989))的病毒在体内是基本无毒的，导致在体内和在培养物中生长减慢。因此，与缺乏所述突变的病毒相比，培养包括这样一种突变的病毒原液降低了效率。可以通过在培养基中加入HMBA而部分补偿VP16突变(MacFarlane等，1992)，但不能使用已经工程化表达VP16的未改变拷贝的细胞系、同时在培养物中不产生所述突变已经得到修复的病毒。这是因为：由于所述基因的必需结构功能，它不能从病毒中缺失，因此在用于培养所述病毒的细胞系中包括的未改变拷贝的VP16基因将导致通过所述病毒中突变的VP16序列与所述细胞系中未改变的VP16序列的同源重组而产生含有未改变的VP16序列的病毒。此外，在任何情况下，这样一种细胞系对VP16突变的互补将导致产生含有完全有功能的VP16的新病毒体，当所述新病毒体在非互补细胞中用作载体时，将激活IE基因表达，就象VP16中的突变得到减轻。

因此，存在这样的问题：如何有效培养在VP16基因中包括影响所述蛋白的反式激活特性的突变的HSV原种，以致所述病毒中的所述突变在病毒生长中不会被修复。

发明概述

作为载体，在VP16中带有降低所述蛋白的反式激活特性的突变的HSV是特别有吸引力的，特别是在与其它HSV基因中的失活突变结合起来时(见Coffin和Latchman，1996)。然而，假如使用互补VP16的细胞系，则无法在培养物中容易地有效培养这样的病毒并且不修复所述突变(见上文)。VP16的主要功能及其结构功能是在感染后反式激活HSV IE启动子。在另一疱疹病毒即马疱疹病毒1(EHV1)中有一种具有相似作用的蛋白，我们发现该蛋白不仅能反式激活HSVIE启动子，而且当将该蛋白稳定转染进用于培养病毒的细胞时，还能够极大增强在VP16上有突变的HSV的生长。在VP16的EHV 1等同物(基因12；见Lewis等，1997，本文称为EHV-VP16)与HSV-VP16之间几乎没有核苷酸序列相似性，因此修复所述病毒中的突变的同源重组是不可能的。因此，本发明第一次提供了这样的细胞系：所述细胞系允许在VP16上带有降低其反式激活特性的的突变的HSV的有效生长，但其中通过同源重组修复该突变是不可能的。

本发明还提供了一种一般性的方法，通过该方法，利用在一种病毒中具有相似功能的蛋白互补另一病毒中对等蛋白上的缺陷，可以互补在HSV中编码必需结构多肽的基因上的突变或其它病毒中同源基因上的突变，以使其在培养物中生长。例如，使用EHV-VP16对等物(如本文)或来自另一种疱疹病毒的同源蛋白可以互补VP16上的HSV突变，所述来自另一种疱疹病毒的同源蛋白如来自牛疱疹病毒(BHV；Misra等，1994)的BTIF或来自水痘-带状疱疹病毒(VZV；Moriuchi等，1993)的ORF10基因产物。

因此，本发明还提供了一种用于繁殖在其内源HSV VP16基因或其同源基因上具有突变的突变疱疹病毒的方法，该方法包括用所述突变疱疹病毒感染细胞系并培养所述细胞系，其中所述细胞系包含编码一种有功能的单纯疱疹病毒(HSV)VP16多肽或其同系物的核酸序列，所述核酸序列有效连接至允许所述多肽在所述细胞系中表达的控制序列；所述核酸序列(i)可以互补所述内源基因并且(ii)不能与所述内源基因重组。

所述突变最好是降低或完全破坏所述内源基因激活病毒转录的能力的突变。

所述有功能的HSV VP16同系物最好是由疱疹病毒基因编码，更优选是由马疱疹病毒基因编码，如基因12，或者是由牛疱疹病毒基因编码，例如BTIF。所述突变疱疹病毒最好是单纯疱疹病毒(HSV)，更优选是HSV-1或HSV-2或它们的衍生物。

所述突变疱疹病毒还可以包含其它突变，所述突变功能性失活所述病毒的其它基因，并且需要由所述细胞系互补以允许在所述细胞系中的病毒生长。既然这样，所述细胞系将包含其它核酸序列，所述核酸序列编码互补已经被功能性地失活的内源基因的有功能的疱疹病毒基因。例如，在一个优选的实施方案中，所述突变病毒是缺乏有功能的必需立即早期基因的单纯疱疹病毒，所述立即早期基因如ICP4和/或ICP27。因此，如果合适，本发明的细胞系也将包含有功能的ICP4基因和/或ICP27基因，提供有功能的ICP4和/或ICP27，因此允许所述缺陷病毒在培养物中的生长。

在尤其优选的实施方案中，从具有VP16上的in1814失活突变(Ace等，1989)的HSV突变体缺失ICP4基因和/或ICP27基因。在包含EHV-VP16基因以及ICP4基因和/或ICP27基因的细胞系中培养这些突变体，但在插入所述细胞系的序列和保留在病毒中的序列间没有重叠区。防止在病毒生长过程中通过在所述细胞系中的序列和在所述病毒中的序列之间的同源重组而修复所述病毒中的任何一个突变。本发明人发现：在这样的实施方案中，在所述细胞中驱动ICP4和ICP27表达的启动子选择对于可靠地产生包含EHV-VP16和/或ICP27的互补细胞系是重要的。因此，本发明还提供了已经优化了这样的启动子选择的细胞系。在这样的实施方案中，优选ICP27基因表达由ICP27启动子驱动，ICP4基因表达由ICP4启动子驱动或更优选由MMTV LTR启动子驱动。

可以从所述培养的细胞系中分离通过本发明的方法产生的突变疱疹病毒，并可选地对所述突变疱疹病毒进行纯化。所述病毒也可以与一种药学上可接受的载体或稀释剂一起配制成药用组合物。

本发明还提供了这样的细胞系：所述细胞系包含编码有功能的单纯疱疹病毒(HSV)VP16多肽同系物的核酸序列，所述核酸序列有效连接至允许所述多肽在所述细胞系中表达的控制序列，所述核酸序列(i)能够互补HSV VP16基因并且(ii)不能与HSV VP16基因重组。

所述有功能的HSV VP16同系物最好由疱疹病毒基因编码，更优选由马疱疹病毒基因例如基因12编码，或由牛疱疹病毒基因如BTIF编码。所述突变疱疹病毒优选是单纯疱疹病毒(HSV)，更优选是HSV-1或HSV-2或它们的衍生物。

也可以产生这样的细胞系：所述细胞系中，在所述病毒中失活的其它基因在所述细胞系中得到互补以允许所述病毒生长，并且(在HSV的情况下)使用来自其它疱疹病毒的VP16等同物互补VP16基因上的失活突变。例如，如果ICP4和/或ICP27失活，那么可以使用包含ICP4和/或ICP27的细胞系。在该实施方案中，在所述细胞中驱动ICP4和ICP27基因表达的启动子选择是重要的，因此本发明还提供了已经优化了这样的启动子选择的细胞系。驱动ICP27基因表达的优选启动子是ICP27启动子，而驱动ICP4基因表达的优选启动子包括MMTV LTR启动子和ICP4启动子。发明详述 A.疱疹病毒

疱疹病毒包括属于疱疹病毒科成员的任何病毒。包括马疱疹病毒、牛疱疹病毒以及人单纯疱疹病毒组，尤其是HSV1和HSV2。

当本发明的病毒是单纯疱疹病毒时，所述病毒可以衍生自例如HSV1或HSV2株或它们的衍生物，最好是HSV1。衍生物包括含有来自HSV1和HSV2株的DNA的类型间(inter-type)重组体。衍生物与HSV1或HSV2基因组最好有至少70％序列同源性，更优选有至少80％序列同源性，甚至更优选有至少90或95％序列同源性。可以用于获得本发明的病毒的其它衍生物包括已经在基因中有突变的株，所述突变尤其是导致病毒减毒的基因突变。这样的病毒的例子包括在ICP34.5上具有突变的1716株(MacLean等，1991)、R3616株和R4009株(Chou和Roizman，1992)以及R930株(Chou等，1994)、在ICP4上具有缺失的d120株(DeLuca等，1985)、在ICP27上具有缺失的d27-1(Rice和Knipe，1990)或在ICP27和ICP4上具有缺失的d92株(Samaniego等，1995)。

在描述各种HSV基因时使用的术语如在Coffin和Latchman，1996中找到的一样。B.结构基因突变

本发明范围内的突变疱疹病毒通常在编码必需结构多肽的基因上具有突变，其中所述必需结构多肽还具有第二非结构功能，例如转录激活活性或酶活性。所述突变会影响所述蛋白的第二功能(通常是转录激活)，导致病毒生长效率的降低，但并不妨碍所述多肽的表达以使所述多肽能行使其结构功能。在所述结构基因上的突变通常降低或完全破坏由所述基因编码的多肽激活病毒转录的能力，尤其是从立即早期启动子起始的转录。由所述结构多肽介导的病毒转录的降低一般至少为50％，更优选至少70、80或90％。

在本发明一个优选的实施方案中，所述结构基因是编码VP16(UL48)的HSV基因，或在另一种疱疹病毒中发现的所述基因的同源物，如马疱疹病毒基因12或牛疱疹病毒基因BTIF。HSV VP16基因一般具有完全破坏其反式激活能力的插入(见例如，Ace等，1989)。也已经描述了其它具有相似特性的突变体，包括截短HSV VP16的酸性激活域(如见Smiley，J.R.和J.Duncan.1997)。这样的突变体也适于用在本发明中。

“同源基因”是指这样的病毒基因：与在需要繁殖的突变疱疹病毒中发生突变的对应疱疹病毒结构基因在氨基酸水平上具有序列同源性。例如，一般来说HSV基因的同源物将在氨基酸水平上与对应HSV基因在至少20、最好至少30例如至少40、60或100或更多连续的氨基酸的区上至少15％、最好至少20％相同。所述同源基因必须能够互补在需要繁殖的突变疱疹病毒的基因组中存在的突变内源基因的功能。然而，为避免在所述互补细胞系中存在的有功能的疱疹病毒结构基因与所述疱疹病毒基因组中存在的所述突变基因之间的同源重组，所述有功能的基因应该在核苷酸水平上与在所述疱疹病毒中存在的对应突变基因在整个编码序列上至多50％相同，最好至多40或30％相同。

测量蛋白质和核苷酸同源性的方法是本领域内众所周知的，并且本领域内的技术人员理解，在本文中蛋白质同源性是在氨基酸同一性的基础上计算(有时称为“硬同源性(hard homology)”)。

测量核酸和蛋白质同源性的方法是本领域内众所周知的。可以使用例如，提供可以用于计算同源性的BESTFIT程序的UWGCG软件包计算同源性(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页)。相似地，可以用PILEUP和BLAST算法排列序列(例如在Altschul S.F.(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul，S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中所述)。对这样的程序可以有许多不同的设置。依照本发明，可以使用默认设置。

此外，可以在核苷酸水平上修饰所述有功能的结构基因序列(例如通过取代来修饰)，降低在所述细胞系中存在的有功能的基因与在所述疱疹病毒中存在的所述突变基因之间的同源性水平，以进一步降低重组的可能性。利用遗传密码的简并性，可以不改变所述有功能的基因的氨基酸序列而作到这一点。

也可以使用保守取代，例如依照下表进行取代。在第二列中处于同一组并且最好在第三列中处于同一行的氨基酸可以相互取代：

脂肪族	非极性	G  A  P
			I  L  V
		极性-不带电荷		C  S  T  M
	N  Q
			极性-带电荷	D  E
	K  R
		芳族			H  F  W  Y

可以使用多种方法鉴定特定疱疹病毒(例如HSV)的疱疹病毒基因在其它病毒中的同源物，例如在中到高严格性条件下(0.2XSSC/0.1％SDS在约40℃到约55℃下)，用包含全部或部分所述HSV基因的探针探测由其它病毒制得的基因组文库或cDNA文库。或者，也可以使用简并PCR获得种同源物，其中使用设计为靶向所述变异体和同源物内编码保守氨基酸序列的序列的引物。所述引物将包含一个或多个简并位点并在严格条件下使用，所述严格条件低于用于使用单序列引物针对已知序列克隆序列的条件(例如，2xSSC在60℃下)。

在HSV1和HSV2的情况下，这样的株尤其包括VP16(UL48)基因上完全破坏或降低所述蛋白的反式激活活性但并不影响其结构功能的突变(见例如，Ace等，1988)。这些病毒株还包括其中含有其它突变的株，所述突变如在HSV1的ICP4和/或ICP27或它们在HSV2中的同功物上的突变，假如这些基因中的一个或另一个或两个都含有失活突变，可能要求使用也互补这些突变的细胞系。优选的病毒包括含有完全破坏VP16的反式激活功能的突变以及完全缺失ICP4和/或ICP27基因(或HSV2中的等同物)的HSV1或HSV2，所述完全缺失使得保留在所述病毒的DNA与用于培养所述病毒的所述细胞系的DNA之间没有重叠区。还可以在所述病毒中制造其它失活突变，例如在ICP34.5、vhs和/或ICP6上的失活突变。特别优选的病毒将在所有这些基因上包括失活突变。

通过本领域内众所周知的几种技术，可以使所提到的各种其它病毒基因在功能上失活。例如，可以通过缺失、取代或插入使它们在功能上失活，其中最好通过缺失。缺失可以除去所述基因的部分或整个基因。例如，可以造成仅一个核苷酸的缺失，以造成移码。然而，最好制造大的缺失，例如缺失至少25％、更优选缺失至少50％的整个编码序列和非编码序列(或者，以绝对数表示，至少10个核苷酸、更优选至少100个核苷酸、最优选至少1000个核苷酸)。尤其优选除去整个基因以及一些侧翼序列。插入的序列可以包括下面描述的异源基因。尤其优选在ICP4中插入异源基因。

在编码必需结构多肽的基因的情况下，显然并不希望缺失所述基因的大部分。然而，如果合适，可以制造小的缺失、插入和/或取代以消除所希望的活性，例如反式激活活性(见例如，Ace等，1989)。

通过本领域内技术人员众所周知的同源重组方法，在所述疱疹病毒上制造突变。例如，HSV基因组DNA与包含侧翼有同源HSV序列的突变序列的载体(最好是质粒载体)一起转染。所述突变序列可以包含缺失、插入或取代，所有这些都通过常规技术构造。插入可以包括选择标记基因，例如lacZ，以根据例如β-半乳糖苷酶活性筛选重组病毒。C.异源基因和启动子

本发明的病毒可以携带异源基因。术语“异源基因”包括任何基因。虽然异源基因一般是不在疱疹病毒的基因组中存在的基因，但可以使用疱疹病毒基因，只要所述编码序列不与其天然连接的病毒控制序列有效连接。所述异源基因可以是野生型基因的任何等位变异体，或所述异源基因可以是突变基因。术语“基因”将包括至少能转录的核酸序列。因此，该定义包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。核酸可以是，例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或它们的类似物。编码mRNA的序列将可选地包括与翻译的编码序列天然地或在其它情况下连接的部分或全部5′和/或3′转录但不翻译的侧翼序列。它还可以可选地包括与所述转录序列天然连接的相关转录控制序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。

可以通过HSV株与例如携带侧翼有HSV序列的异源基因的质粒载体的同源重组，将所述异源基因插入病毒基因组中。使用本领域内众所周知的克隆技术，可以将所述异源基因导入含有疱疹病毒序列的合适质粒载体。所述异源基因可以在任何位点插入病毒基因组，只要所述病毒仍然能够繁殖。优选所述异源基因插入必需基因。

所述异源基因的转录序列最好有效连接到允许所述异源基因在哺乳动物细胞中表达的控制序列，所述哺乳动物细胞最好是中枢神经系统和外周神经系统的细胞。术语“有效连接”指并列(juxtaposition)，其中所述组成部分处于允许它们按照它们固有的方式起作用的关系。与编码序列“有效连接”的控制序列是以这样一种方式连接：在所述方式下，在对所述控制序列适合的条件下实现所述编码序列的表达。

所述控制序列包括允许所述异源基因表达的启动子以及转录终止的信号。从在哺乳动物、最好是人的细胞中有功能的启动子中选择所述启动子。所述启动子可以衍生自真核生物基因的启动子序列。例如，它可以是衍生自在其中异源基因发生表达的细胞的基因组的启动子，所述细胞最好是哺乳动物中枢神经系统或外周神经系统的细胞。至于真核启动子，它们可以是以遍在的方式作用的启动子(如α-肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子)，或者是以组织特异性方式作用的启动子(例如丙酮酸激酶基因的启动子)。特别优选仅在某些神经元细胞类型中作用的启动子(如酪氨酸羟化酶(TH)启动子、L7启动子或神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子)。它们也可以是应答特定刺激的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。

HSV LAT启动子以及包含LAT启动子区的元件的启动子是特别优选的，因为有可能获得所述异源基因在潜伏期内的长期表达。尤其这样的表达盒是特别优选的：所述表达盒主要包含LAT P2区，本身并不作为启动子起作用并且与启动子和异源基因以该顺序连接(WO98/30707)。

术语“长期表达”是指在用本发明的单纯疱疹病毒感染的细胞中表达异源基因，甚至在所述单纯疱疹病毒已经进入潜伏期后仍然表达所述异源基因。所述表达最好在感染后持续至少两周，更优选持续至少一个月或两个月，甚至更优选在细胞的生存期内持续。

表达盒还可以包含以该顺序有效连接到所述HSV LAT P2区的第二启动子和第二异源基因，所述第二启动子和第二异源基因处于与所述第一启动子和第一异源基因相反的取向，其中所述第二启动子和第二异源基因与所述第一启动子和第一异源基因相同或不同。由此构建了处于相反取向、侧翼有单一LAT P2区的一对启动子/异源基因，所述单一LAT P2区允许异源基因对的长期表达，所述异源基因对可以是相同或不同的，由相同或不同的启动子驱动。此外，所述第一异源基因的产物可以在合适生理条件下调节所述第二异源基因的表达(反之亦然)。

可以使用本领域内技术人员熟知的常规克隆技术制造包含异源基因和控制序列的表达盒以及其它合适的构造物(见例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring HarborPress)。所述LAT P2区在此定义为HSV1 17+株的HSV1核苷酸118866-120219(GenBank HE1CG：从Pst I-BstXI位点)、该区的片段或衍生物，其中包括其它HSV1株和HSV2的同源区，所述LAT P2区能够为它们所连接的启动子提供长期表达能力。

所述启动子是诱导型也是有利的，以便可以在所述细胞的生存期内调节所述异源基因的表达水平。诱导型意味着使用所述启动子获得的表达水平是可以调节的。例如，在将多于一个异源基因插入HSV基因组的优选实施方案中，一个启动子将包含对tet阻抑物/VP16转录激活物融合蛋白应答的启动子，并驱动需要调节的异源基因的表达。所述第二启动子将包含驱动所述tet阻抑物/VP16融合蛋白表达的强启动子(如CMV IE启动子)。因此，在这个例子中，所述第一异源基因的表达将取决于四环素存在与否。

此外，可以通过添加其它调节序列来改进这些启动子中的任何一个，所述调节序列如增强子序列(包括LAT区的元件)。也可以使用包含来自上面所述的两个或更多个不同启动子的序列元件的嵌合启动子，例如MMLV LTR/LAT融合启动子(Lokensgard等，1994)或包含LAT区的元件的启动子(见上文)。

所述异源基因可以编码例如参与调节细胞分裂的蛋白，如促有丝分裂生长因子，包括神经营养生长因子(neurotrophic growth factor)(如脑衍生神经营养因子、神经胶质细胞衍生神经营养因子、NGF、NT3、NT4和NT5、GAP43以及)、细胞因子(如α、β或γ-干扰素、白细胞介素(包括IL-1、IL-2)、肿瘤坏死因子或胰岛素样生长因子I或II)、蛋白激酶(如MAP激酶)、蛋白质磷酸酶以及上述任何一种的细胞受体。所述异源基因可以编码涉及细胞代谢途径的酶以及涉及调节这些途径的蛋白质，如蛋白激酶和蛋白质磷酸酶，其中所述涉及细胞代谢途径的酶，如涉及氨基酸生物合成或降解的酶(如酪氨酸羟化酶或GTP-环化水解酶)、涉及嘌呤或嘧啶生物合成或降解的酶、以及涉及神经递质如多巴胺的生物合成或降解的酶。所述异源基因还可以编码转录因子或涉及它们的调节的蛋白(如Brn3家族的成员或Rb家族的袋状蛋白(pocket protein)如Rb或p107)、膜蛋白(如视紫红质)、结构蛋白(如肌营养不良蛋白)或热休克蛋白如hsp70。

所述异源基因最好编码有治疗用途的多肽。例如，在上面所述的蛋白中，酪氨酸羟化酶和神经胶质细胞衍生神经营养因子可以用于治疗帕金森氏病，视紫红质可用于治疗眼科疾病，肌营养不良蛋白可用于治疗肌肉营养不良，而热休克蛋白可用于治疗与局部缺血性应激(ischaemic stress)有关的心脑疾病。有治疗用途的多肽还可以包括细胞毒性多肽如蓖麻毒蛋白或这样的酶：所述酶能够转化前体药物前体成为细胞毒性化合物以用于例如病毒导向的酶前体药物治疗或基因导向的酶前体药物治疗的方法。在后一种情况中，需要确保所述酶具有指导其到达细胞表面的合适信号序列，最好是允许所述酶暴露于细胞表面之外同时保持锚着在细胞膜上的信号序列。合适的酶包括细菌硝基还原酶(nitroreductase)如在WO93/08288中公开的大肠杆菌硝基还原酶或羧肽酶，尤其是如在WO88/07378中公开的羧肽酶CPG2。其它酶可以参阅EP-A-415731。合适的药物前体包括氮芥前体药物和其它化合物，如通过引用结合到本文中的WO88/07378、WO89/10140、WO90/02729和WO93/08288中所公开的化合物。

异源基因还可以编码用作疫苗的抗原性多肽。这样的抗原性多肽最好衍生自致病生物，如细菌或病毒。

异源基因还可以包括标记基因(例如编码β-半乳糖苷酶或绿荧光蛋白的基因)或其产物调节其它基因表达的基因(例如转录调节因子，包括上文所述的tet阻抑物/VP16转录激活物融合蛋白)。

基因治疗和其它治疗应用很可能要求给予多种基因。多基因的表达对于治疗多种病理状况是有利的。疱疹病毒是唯一合适的，因为它们没有其它病毒载体系统的受到限制的包装能力。因此在它的基因组中可以容纳多个异源基因。例如，有至少两种达到该目的的方法。例如，可以将多于一个的异源基因和相关控制序列引入特定HSV株。还有可能如上所述，使用从中间的LAT P2元件起始的以相反取向相对的启动子对(相同或不同的启动子)，这些启动子每一个都驱动异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。E.互补的结构基因

在本发明的细胞系中存在的编码有功能的疱疹病毒结构多肽的核酸序列将能够反式互补在需要繁殖的突变疱疹病毒中对应突变内源基因的活性。一般来说，所述有功能的互补基因将是所述突变内源基因的同源物。上面描述了鉴定还不知道的合适同源物。然而，如上文所述，所述有功能的结构基因必须不能通过与突变病毒中存在的所述突变内源基因的同源重组而重组以修复所述突变内源基因。因此，所述两个基因之间核苷酸同源性的水平必须使得在所述两个序列之间不能发生同源重组。上面描述了需要达到该目的所需的核苷酸同源性的合适水平。

因此，所述有功能的结构基因将一般起源于与所述突变内源基因不同的病毒，如不同的病毒种。因此，例如，当所述突变疱疹病毒是在其内源VP16基因带有突变的HSV时，所述有功能的基因将是来自不同病毒的VP16的同源物，例如马疱疹病毒基因12、牛疱疹病毒BTIF基因或VZV ORF10基因。特别优选的VP16序列是编码来自EHV1的基因12的序列(完整EHV1基因组的核苷酸13505-14944[GenBank file HSECOMGEN])。

同样，当需要繁殖分别在其内源基因12或BTIG基因带有突变的马疱疹病毒或牛疱疹病毒时，所述细胞系可以包含有功能的HSVVP16编码序列。

所述有功能的结构多肽的编码序列有效连接允许所述多肽在本发明的细胞系中表达的控制序列。本发明的细胞系一般是哺乳动物细胞，因此所述控制序列将是能够在哺乳动物细胞中发挥功能的调节序列。所述控制序列可以是在所述细胞系中具有组成型活性或者可以是诱导型活性。合适的控制序列如上文描述。F.细胞系

用于本发明的细胞系包括任何这样的细胞系：所述细胞系包含编码有功能的疱疹病毒结构多肽的核酸序列，该核酸序列有效连接到允许所述多肽在所述细胞系中表达的控制序列。合适的细胞系是容纳疱疹病毒并形成集落的细胞系。所述细胞系一般是哺乳动物细胞系，如啮齿动物细胞系或人类细胞系。

所述有功能的疱疹病毒结构多肽是来自一种病毒的多肽，它可以互补另一种其中编码同源多肽的基因已经突变的病毒的生长。优选的多肽在所述病毒中行使必需结构功能以及第二种功能，失活所述第二种功能降低病毒生长效率。在HSV1或HSV2的情况下，优选的突变包括在VP16基因中由Ace等，1988或Smiley和Duncan，1997所述类型的突变。因此，本发明优选的细胞系包含来自另一种病毒的编码VP16的同功物的基因，例如来自EHV1的基因12、来自BHV的BTIF或来自VZV的ORF10。

可以通过标准方法产生表达有功能的疱疹病毒结构多肽的细胞系，如用包含编码所述结构多肽的核酸的载体(最好是质粒载体)以及编码选择标记(如新霉素抗性)的载体(最好是质粒载体)共转染哺乳动物细胞，如Vero细胞或BHK细胞。然后使用本领域内技术人员已知的方法(例如如Rice和Knipe，1990中所述方法)，在例如它们支持VP16突变HSV株生长的能力的基础上进一步筛选含有选择标记的集落，以确定哪些集落还表达有功能的多肽。

尤其优选的细胞系将基于BHK细胞或Vero细胞，并包含EHV1基因12序列以及ICP27基因和/或ICP4基因或来自HSV2的等同物，允许在VP16上有失活突变、在ICP27和/或ICP4基因上有其它失活突变的HSV的繁殖。最好所述细胞系内的DNA与保留在需要培养的病毒中的DNA之间没有重叠区，防止通过所述病毒中的DNA以及所述细胞系中的DNA的同源重组而修复在需要培养的病毒中的失活突变。

表达ICP27和/或ICP4的细胞系是本领域内已知的，例如V27细胞(Rice和Knipe，1990)、B130/2细胞(WO98/30707)，或曾使用的(used)E26细胞(Samaniego等，1995)。可以利用这些细胞系产生本发明的细胞系。然而，正如我们发现驱动ICP4和ICP27的启动子选择在这样的实施方案中是重要的，本发明还通过ICP4启动子或MMLV LTR启动子驱动ICP4表达、ICP27启动子驱动ICP27表达，提供其中已经优化了这样的启动子选择的细胞系。

本发明将参照下面仅是说明性而非限制性的实施例来进行描述。实施例

在下面实施例中涉及的HSV-1核苷酸数目参照GenBank fileHE1CG。实施例1.EHV-VP16可以反式诱导HSV立即早期基因启动子

进行CAT测试(使用Gorman 1985的方法)，其中包含处于HSV1ICP4、ICP0或ICP27控制下的氯霉素乙酰转移酶基因(分别是pIGA102、pIGA65和pIGA95；Gelman和Silverstein，1987)的质粒构造物与控制质粒(pcDNA3；Invitrogen)或其中插入HSV-VP16(pCMV16；Moriuchi等，1995)或EHV-VP16序列的相似质粒共转染进BHK细胞。每次转染使用每种质粒5μg，将质粒加入6孔板中。一式两份地进行试验。通过用EcoR I和Xba I消化EHV-VP16序列原先克隆进的pcDNA1/amp，释放EHV-VP16序列后，将该序列插入pcDNA3(Invitrogen)的EcoR V和Xba I位点，构造EHV-VP16表达构造物(pcDNA3/E)。结果

结果表示为根据对得到的TLC板的phosphorimagery而得到的¹⁴C标记氯霉素从非乙酰化形式到乙酰化形式的转化率(％)。显示了每个重复试验的结果。

测试启动子	激活物	转化率(％)
			ICP0	对照	31，33
ICP0	HSV-VP16	83，83
			ICP0	EHV-VP16	82，84
ICP27	对照	15，16
			ICP27	HSV-VP16	44，38
ICP27	EHV-VP16	27，34
			ICP4	对照	34，30
ICP4	HSV-VP16	75，76
			ICP4	EHV-VP16	75，63

这些结果显示：EHV-VP16可以以HSV-VP16反式激活ICP0和ICP4启动子的相似程度反式激活HSV 1E启动子，其激活ICP27启动子的程度就低一些，而无论如何ICP27启动子都比其它两个测试的启动子对HSV-VP16反应性更低。这暗示如果EHV-VP16在用于培养病毒的细胞中表达，EHV-VP16可以功能性互补其中反式激活活性已经被降低的HSV-VP16突变体如in1814(Ace等，1989)，只要在所述细胞系中这样的病毒可以更有效地繁殖。实施例2：包含EHV-VP16的细胞系可增强在VP16带有失活突变的 HSV的生长

进行试验，确定包含EHV-VP16的细胞系是否可以互补由于VP16基因的突变导致的病毒生长缺陷，而所述突变在其它情况下防止对IE启动子的有效反式激活并因此造成病毒生长不良。

在10cm平板中，或者用仅包含新霉素(neo)抗性选择标记基因的质粒(pcDNA3)，或者用包含neo以及处于CMV启动子和BGHpA序列控制下的EHV-VP16的质粒(pcDNA3/E)转染(使用Gorman，1985的方法)BHK细胞(在DMEM+10％FCS中于37℃/5％CO2下培养，其中DMEM和FCS都来自Gibco)。转染后，用G418(800μg/ml；Gibco)杀死不稳定转染的细胞，并使平板生长(grow over)。然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移至24孔板进行培养，以使得能用病毒突变体和野生型对照病毒进行评价。该程序允许测试EHV-VP16以及对照(仅有neo)对所测试的基因突变体的“平均”效应，而不存在假如在每种情况下克隆单转染子的集落时发生的克隆变异。结果显示了以感染复数MOI 0.01感染24小时后的总病毒产量/孔。在培养基中包括或不包括HMBA(3mM)的情况下，一式双份地进行试验(MacFarlane等，1992)。

病毒17+是野生型病毒，in1814包含在VP16上的失活突变(Ace等，1989)，而病毒1764包含在VP16上的失活突变，并且缺失ICP34.5的两个拷贝，该缺失本身并不显著影响HSV在BHK细胞中的生长(见Coffin等，1996)。

结果：

受试病毒	转染的质粒	产量+HMBA	产量-HMBA
				17+	neo	150000/250000	400000/250000
in1814	neo	10000/15000	1000/1500
					EHV-VP16	200000/90000	80000/65000
1764	neo	35000/45000	5000/4500
					EHV-VP16	400000/300000	100000/250000

这些结果显示：EHV-VP16可以互补由于在VP16基因中包括失活突变而导致的病毒生长缺陷，例如在病毒in1814中的生长缺陷(Ace等，1989)。可以培养这样的病毒达到接近野生型的水平，互补的水平高于以前报道的在培养基中包括HMBA而增加在VP16上具有突变的HSV的生长效率的水平(MacFarlane等，1992)。实施例3：包含EHV-VP16和ICP27的细胞系产生在VP16和ICP27 上有缺陷的HSV突变体的增强的生长

在用仅包含ICP27的质粒(用Sac I和Sph I将所述ICP27编码序列启动子和polyA从pSG130BS[Sekulovich等1988]上切下，并插入pPGKneo[Soriano等1991]的EcoR I和Sal I位点之间)或用包含ICP27的质粒以及pcDNA3/E转染后，克隆出通过上面方法制备的BHK细胞系。这显示在大多数情况下，使用由双转染得到的克隆可以获得在ICP27和vmw65(VP16；HSV1突变体1764/27-/pR20)具有缺陷的病毒的更好生长(根据生长曲线评价)。这些试验还显示在包含EHV基因12的细胞上培养vmw65失活(VP16)同时缺失或不缺失ICP27的HSV1突变体时，有大得多的噬菌斑。

病毒1764/27-/pR20包含HSV1 LAT(核苷酸118，866-120，219[PstI-BstXI])/CMV/lacZ盒，以便使用侧翼区(由单一Bgl I位点分开的核苷酸110,095-113,229[EcoR I-Nde I]和120,468-125,068[Hpa I-Sac I])并选择和纯化在B130/2细胞(Howard等，1998)上的X-gal染色噬菌斑，插入所述盒以缺失病毒株1764(Coffin等，1996)中的完整ICP27编码序列、UL55、UL56(二者都是非必需基因；Roizman，R.和A.Sears.1996)以及部分LAT区。实施例4：在产生有效培养在VP16、ICP27和ICP4具有缺陷的HSV 突变体的细胞系时，驱动ICP4的启动子选择是重要的

在此产生了能够允许具有VP16缺陷并同时缺失ICP27和ICP4的病毒的有效生长的细胞系。

如上所述，我们已经发现：驱动ICP27的ICP27启动子提供了互补缺失ICP27的病毒的细胞系(当该细胞也包含EHV基因12时)。因此，预期ICP27启动子在互补VP16、ICP27和ICP4的细胞中也可以提供对ICP4的最佳调节。因此，这样产生了细胞系：将编码腐草霉素抗性的质粒中处于ICP27启动子和poly-A控制下的ICP4(质粒p27/4zeo)转染进已经有效允许缺乏ICP27并且在VP16有缺陷的病毒繁殖的细胞(在上面实施例3中产生的细胞系)。挑出腐草霉素/新霉素抗性集落并将它们克隆出来。然而，通常发现它们仅产生在VP16、ICP27和ICP4上有缺陷的HSV-1突变体(病毒1764/27-/4-/pR20.5)的非常微弱的生长，在140个挑出的集落中仅有5个产生显著的生长。用来自pSG130BS的BamH I-Drd I(HSV-1核苷酸113,322-113,728)启动子片段取代质粒p4/2zeo中的ICP4启动子(BstE II位点[HSV-1核苷酸131,187]的上游；见下文)，构建质粒p27/4zeo。除去Mse I位点(HSV-1核苷酸127,167)后的序列并用来自pSG130BS的编码ICP27 poly A序列的EcoN I-Sac I(HSV-1核苷酸115,267-115,743)片段取代，从而取代ICP4 Poly A序列。

使用互补ICP27和ICP4的B4/27细胞，通过将一个盒插入ICP4侧翼序列(缺失核苷酸124,945-125,723[Not I-Not I；编码ICP34.5]的HSV-1核苷酸123,459-126,774[Sau3a I-Sau3a I]和131,730-134,792[Sph I-Kpn I]，在质粒pDICP4中由单一Xba I和Sal I位点分开)并重组进入病毒株1764/27-w(通过与空(empty)ICP27侧翼区的重组除去lacZ插入的病毒株1764/27-/pR20)，构建病毒株1764/27-/4-/pR20.5，其中所述盒包含被HSV-1 LAT序列(如实施例3中的Pst I-BstXI)分开并以背对背的取向分别由CMV和RSV启动子驱动的GFP(E-GFP；Clontech)和lacZ。选择X-gal染色/绿色荧光的噬菌斑并进一步纯化。通过将pSG130BS、质粒p4/2(见下文)以及pMAMneo(Invitrogen)共转染进BHK细胞，制备细胞系B4/27。然后选择新霉素抗性克隆。

在这些令人失望的结果后，测试了驱动ICP4的其它启动子。因此产生了其它腐草霉素/新霉素抗性细胞系，在所述细胞系中ICP4或者由ICP4启动子和poly A(使用质粒p4/2zeo)驱动，或者由地塞米松诱导型MMTV启动子和SV40 poly A(使用质粒pMAMzeo/ICP4)驱动。在此希望由ICP4启动子正确调节的ICP4表达或地塞米松诱导型ICP4表达能够提供能改善具有VP16、ICP27和ICP4缺陷的HSV-1突变体的生长的细胞系。

为构造p4/2zeo，从质粒pVgRxR(Invitrogen)上切下作为BamHI片段的腐草霉素抗性基因盒，并将其插入质粒p4/2的单一Bgl II位点，产生质粒p4/2zeo。p4/2包含插入pSP72(Promega)中的ICP4启动子、编码区和poly A(HSV-1核苷酸126,764-131,730[Dde I-SphI])。为构造pMAMzeo/ICP4，如上所述再次用作为BamH I片段的腐草霉素抗性基因取代质粒pMAMneo(Invitrogen)中的新霉素抗性基因(作为BamH I片段切下)。然后在所述MMTV启动子后在Xho I位点插入ICP4编码区(HSV-1核苷酸127,167-131,187[Mse I-BstEII])。

挑出分别使用ICP4启动子和MMTV启动子的138和88个克隆，并分析病毒生长特征。在由ICP4启动子驱动的克隆中，大部分仅对VP16/ICP27/ICP4缺陷病毒具有有限的允许性(permissivity)，但是有两个克隆能够产生有效的生长。据认为这种变异性可能反映了在表达EHV基因12的细胞中改变ICP4启动子调节的位置效应，所述细胞在很少情况下允许VP16/ICP27/ICP4缺陷型病毒的有效生长。然而在挑出的ICP4由MMTV启动子控制的克隆中，88个克隆中有60个产生有效的生长，这至少与在包含两个ICP4启动子的细胞系中的生长一样好。这指出在包含EHV基因12的细胞系中，与使用ICP4启动子时不同，MMTV启动子的位置效应对于有效的ICP4调节的重要性最小。然而，使用包含处于MMTV启动子控制下的ICP4的细胞时，接种时在培养基中添加地塞米松并不增加VP16/ICP27/ICP4缺陷型病毒的产量。

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Claims (16)

1.繁殖在内源HSV VP16基因或其同源物上具有突变的突变疱疹病毒的方法，该方法包括用所述突变疱疹病毒感染细胞系并培养所述细胞系，

其中所述细胞系包含编码有功能的单纯疱疹病毒(HSV)VP16多肽或其同系物的核酸序列，所述核酸序列有效连接到允许所述多肽在所述细胞系中表达的控制序列；所述核酸序列(1)能够互补所述内源基因，并且(2)不能与所述内源基因发生同源重组。

2.依照权利要求1的方法，其中所述突变降低或完全消除所述内源基因激活病毒转录的能力。

3.依照权利要求2的方法，其中所述有功能的HSV VP16同源物由从牛疱疹病毒基因和马疱疹病毒基因选出的疱疹病毒基因编码。

4.依照权利要求3的方法，其中所述疱疹病毒基因是马疱疹病毒1基因12或牛疱疹病毒基因BTIF。

5.依照前面所述权利要求中任何一项的方法，其中所述控制序列包括组成型活性启动子或诱导型启动子。

6.依照前面所述权利要求中任何一项的方法，其中所述突变疱疹病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。

7.依照权利要求6的方法，其中所述HSV是HSV-1或HSV-2。

8.依照前面所述权利要求中任何一项的方法，其中所述突变疱疹病毒包含功能性失活所述病毒的一个或多个其它内源基因的其它突变，所述细胞系包含编码有功能的疱疹病毒基因的其它核酸序列，所述其它核酸序列互补所述功能性失活的其它内源基因。

9.依照权利要求8的方法，其中所述其它核酸序列编码HSV-1ICP27和/或ICP4，或其在HSV-2或另一种疱疹病毒中的等同物。

10.依照权利要求9的方法，其中HSV-1 ICP27或其等同物由ICP27启动子驱动和/或其中HSV-1 ICP4或其等同物由MMTV LTR启动子驱动。

11.依照前面所述权利要求中任何一项的方法，所述方法还包括从所述培养的细胞系分离突变疱疹病毒并可选地纯化所述突变疱疹病毒。

12.依照权利要求11的方法，所述方法还包括将所述突变疱疹病毒与一种药学上可接受的载体或稀释剂配制成药用组合物的步骤。

13.权利要求1、3-5、8、9或10中任何一项所定义的细胞系的用途，它用于繁殖权利要求1、2、6或7中任何一项所定义的突变疱疹病毒。

14.权利要求1、3-5、8、9或10中任何一项所定义的细胞系。

15.用依照权利要求1到11中任何一项的方法获得的病毒。

16.用依照权利要求12的方法获得的药用组合物。