CN1314952A - 直接通过底物再加载进行的酶活性筛选 - Google Patents

直接通过底物再加载进行的酶活性筛选 Download PDF

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亨里克·佩德森
斯文·霍尔德
于尔根·吉姆斯
梅特·K·伦德
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Abstract

从催化剂分子的一个文库中体外筛选目的催化剂分子的一种方法,与所述文库中其余催化剂分子比较,所筛选的分子具有相对更有效的所需特异性催化活性,并且其中所述体外筛选方法特征在于,它允许该目的催化剂分子在最后被收集以前多次催化活性的转换(即底物到产物的催化活性的转换)。该方法的基础在于利用一种或多种试剂,所指试剂能够将目的催化剂分子产生的一种产物转换成所述目的催化剂的底物。

Description

直接通过底物再加载进行 的酶活性筛选
技术领域
本发明涉及一种体外筛选目的催化剂的方法，该方法利用多重催化转换事件和直接的底物再加载。
发明背景
过去，已经以几种不同方法创建出基于新的生物聚合体(即DNA,RNA或多肽)的催化剂。下列段落描述几个这类筛选方法。
(1)．与过渡态类似物结合
利用这种方法已经分离出催化性的RNA,DNA和蛋白质(尤其是抗体)。该方法主要用于以过渡态类似物(TSA)免疫小鼠而分离催化性抗体。此外在噬菌体上展示的抗体以及RNA和DNA文库也用TSA攻击。该理念在于一种与给定的TSA结合的分子(蛋白质，RNA或DNA)可能结合底物并稳定该过渡状态的几何和/或能量特性。这可能产生催化作用。
该方法并不选择催化活性本身，但却选择与一种过渡态类似物(TSA)的结合。然而，由于它是目前分离新的催化剂最常用的方法之一所以在此处予以包括。使用该方法遇到的问题包括：ⅰ)需要了解目标反应的详细机制(以便设计一种适当的TSA)；ⅱ)许多情况下类似过渡态的TSA是难得的或不稳定的；ⅲ)不可能去模拟该反应对等物的结构和电子的动态特性。
因此，该方法只能针对极有限的反应类型。大多数情况下所分离的催化剂其转换数量不佳。
(2)．活性催化剂的功能性标记
该筛选方案已经应用于蛋白质和核酸。底物的设计使一种反应产物在反应过程中产生(该底物称为“自杀底物”或“抑制剂类似物”)。该反应产物可能与产生它的催化剂反应，形成共价键。结果，活性催化剂能够借助于所附着的标签与非活性的催化剂分离。通过这种方法已经分离出在噬菌体上展示的催化性抗体，并在一种模式系统中显示出通过这种方法能够分离催化性活性蛋白质与非活性蛋白质。该方法应该允许稀有催化剂的分离。
该方法的重要局限包括：ⅰ)许多反应不可能设计适当的自杀底物。ⅱ)在通常近几分钟的筛选过程/循环中，入选的催化剂只需表现一次转换。因此，对那些有效的催化剂没有筛选优势。
(3)．连续的演变(RNA)
RNA文库已经被设计成在同一分子中包含底物和潜在的催化域。能够进行所期望的反应(通常是连接反应)的RNAs将自己“活化”以便扩增(RNA多聚酶转录后的反转录)。通过充分稀释并加入核苷酸前体，该持续的筛选能够维持几个小时，然后进行分析。
此方法有两大局限：ⅰ)底物与催化剂都必须是核酸；ⅱ)所催化的反应与入选酶的扩增是不分离的，故该筛选步骤的时间是目标反应的转换时间和“所活化的”分子的扩增时间的总和。由于扩增是以秒计，因此，对那些有效的催化剂没有筛选优势。
(4)．底物-酶-连接的筛选(SELS)
最近，已描述了涉及目标反应的底物与对所附着的底物有潜在催化活性的蛋白质附着的方法(Pedersen等，1998，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.US)，卷95，页10523-10528；Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.,卷38，页1124-1127；Demartis等，1999,JMB，卷286，页617-633；Neri等，1997,WO 97/40141)。在底物的分子内转换中，活性催化剂能够借助于所附着的产物被分离。
这是一种非常普通的方法。然而，因在通常近几分钟的筛选过程/循环中，入选的催化剂只需表现一次转换，因此，对有效的催化剂没有筛选优势。基于同样的原因，可以推测，那些特异活性有轻微差异的酶不可能用这种筛选方法予以区分。
发明摘要
本发明拟解决的问题是，提供一种从催化剂分子的文库中，体外筛选目的催化剂分子的方法，与所述文库中其余催化剂分子比较，该分子具有相对更有效的所需特异性催化活性，并且其中所述体外筛选方法特征在于，它允许在目的催化剂分子最后被收集以前，多次催化活性的转换(即底物到产物的催化活性的转换)。
该方法的基础在于在所述体外筛选方法中利用一种包括许多独立单位的样品并且其中所述筛选方法特征在于利用一种或多种试剂，这类试剂能够将目的催化剂分子产生的产物转换成所述目的催化剂的底物。独立单位的图示说明见图1。
相应地，本发明第一方面涉及一种从催化剂分子的文库中，体外筛选目的催化剂分子的方法，与所述文库中其余催化剂分子比较，该分子具有相对更有效的所需特异性催化活性，并且其中所述体外筛选方法特征在于，它允许在目的催化剂分子最后被收集以前，多次催化活性的转换(即底物到产物的催化活性的转换)，其中所述方法包括以下步骤，
(a)放置；一份包括许多独立单位的样品，其中所述的样品包括以独立单位形式提供的催化剂分子的一个库，其中所述独立单位包括一个具有以下通式的第一类独立单位：
C-S，
其中C表示一种催化剂分子而S表示一种底物，该底物能够被包括在所述催化剂分子库中的至少一种催化剂催化成一种产物，因此提供获得含以下通式的第二类独立单位的可能性：
C-P，
其中C具有上述意义而P是由第一类独立单位的底物S经催化转化而来的产物分子；并且
(1)该底物S以一种允许所述独立单位内催化剂与底物之间的催化反应的构像附着于催化剂上；并且
(2)所述底物与催化剂的附着特性提供了利用该产物的一个特点分离明确鉴定使该反应的底物分子向产物分子转化之催化分子所需完整信息之实体的可能性；
其适当的前提条件是：目的催化剂分子表现出所需催化活性，且所述方法特征在于所述样品还应处于以下条件，即其中目的催化剂产生的产物是与一种或者多种将产物转换回底物S的试剂接触；
(b)通过筛选一个或者多个包含该产物分子的独立单位挑选出一种目的催化剂；并且
(c)借助于该产物的一个特点，分离能明确鉴定使该反应的底物向产物多次转化之目的催化分子所需的全部信息；并且任选地
(d)利用步骤(ⅲ)所含完整信息重复步骤(ⅰ)～(ⅲ)一次或者多次以产生目的催化剂分子，并构建包含所产生的目的催化剂分子的一个独立单位，然后将该独立单位作为所述重复步骤的起始物。
术语“所指样品还应处于以下条件，即其中目的催化剂产生的产物是与一种或多种将产物转换回底物的试剂接触”，根据本发明第一方面的步骤(ⅰ)，表示任何试剂和试剂分子的任意组合，其能够催化反应产物(包含在该独立单位内)(P1)成底物(包含在该独立单位内)(S1)或者作为反应物参与P1到S1的反应。对此更多的描述和所指试剂的优选实施例的描述请参考下述“技术人员挑选适当试剂指南”部分。此外，见图2。
根据上述第一方面包含在一种样品中的，术语“独立单位”，表示一个独立单位，其包含按本发明第一方面步骤(ⅰ)指定的通式和本发明第一方面步骤(a)和(b)指定的附着到催化剂分子上的底物分子。这样一个独立单位的一个适当示例见图1。
术语“一个独立单位包含通式：一种催化剂-一种底物；或一种催化剂-一种产物”表示该独立单位中上述每种物质至少有一个分子，即至少一种催化剂分子和至少一种底物分子或至少一种产物分子。相应地，该独立单位可能包含例如同种催化剂分子的不止一份拷贝或可能包含几种不同催化剂分子。
此外，放置在所述独立单位内各独立体之间的术语“-”表示该独立单位内这些独立体之间有一种物理连接，即在一种催化剂-一种底物或一种催化剂-一种产物之间有一种物理连接。
此外，在此所述的“一个独立单位”表示一个独立单位，在所述样品内，为了能够分离隔开的独立单位，该独立单位有可能物理地与其它不同独立单位隔开。
术语“不同独立单位”表示各自包含不同催化剂分子的不同独立单位，即两种不同独立单位的一个示例可以是
2催化剂分子1-底物；和
3催化剂分子2-底物；
其中催化剂分子1和催化剂分子2表示两种不同催化剂分子。
术语“包含许多不同独立单位的一种样品”表示一种样品包含至少两个不同独立单位，优选至少100个不同独立单位，更优选至少10 000个不同独立单位，更优选至少106个不同独立单位，还更优选至少108个不同独立单位，最优选至少1014个不同独立单位。不同独立单位的实际数量基本上与催化剂分子库的实际大小相对应。
术语“包含许多独立单位的一种样品”和术语“包含许多不同独立单位的一种样品”在此可以交替使用。
术语“催化剂分平的一个库”表示一个库包含至少两个不同催化剂分子，优选至少100个不同催化剂分子，更优选至少10 000个不同催化剂分子，更优选至少106个不同催化剂分子，还更优选至少108个不同催化剂分子，最优选至少1014个不同催化剂分子。
术语“一种能够被包含在所述催化剂分子库中的至少一种催化剂分子催化成一种产物分子的底物”基本上表示任何适当的底物分子。基本上所述底物分子是根据所需特异催化活性选择的。例如，假使所需催化活性是一种蛋白酶活性那么一种适当的底物可能是一种肽分子然后产物将是一种降解了的肽。术语“底物”和“底物分子”可能交替使用。
术语“产物”表示通过在此指定的一种目的催化剂经过底物到产物的催化反应所获得的产物。术语“产物”和“产物分子”可能交替使用。
术语“催化剂”表示具有一种所需催化活性的任何催化剂分子，诸如无机和有机分子，蛋白质，酶，肽，核酸，生物聚合体和非生物聚合体，有机或无机小分子。术语“催化剂”和“催化剂分子”可能交替使用。
术语“底物以一种允许所述独立单位内催化剂与底物之间的催化反应的构像附着于催化剂上”表示，在每个独立单位内，底物与催化剂之间的直接或间接的物理连接。该连接应该优选在该独立单位内最大化催化剂与底物的生产性反应，同时最小化不同独立单位的催化剂与底物的反应。
术语“底物与催化剂的所述附着特性提供了可能性，即利用该产物的特点而分离明确鉴定能多次转化该反应的底物分子成为产物分子之催化分子所需完整信息之实体的可能性”根据本发明第一方面步骤(b)表示所述完整信息通过该产物的一种或多种特性来分离。
该产物的适当特性的一个示例可能是，所述产物不与基质结合而底物与基质结合。这种情况下一种适当的筛选方法可能是，独立单位以催化剂-底物-基质的形式结合到固体支持物上，并在形成催化剂-产物时被释放。这样一种系统的一个实例的详细描述参考此间的一个实施例(见下)。
该产物的适当特性的另一个示例可能是其与一种受体如图1所示结合。
术语“对能够多次催化反应底物分子成为产物分子之催化剂进行明确鉴定所需完整信息的实体”根据本发明第一方面步骤(b)，或者表示所述信息携带在这类催化剂分子上，或者表示所述信息中还包含使该催化剂的明确鉴定成为可能的其它信息。当目的催化剂分子是肽或多肽时，这些其它信息可能，如包含编码肽或多肽的DNA序列。例如，当所分离的实体是丝状噬菌体，其含有附着于该噬菌体表面之目的多肽的编码DNA序列。更多的细节见例如图5和下文。
术语“在目的催化剂分子显示其所需催化活性的适当条件下”根据本发明第一方面步骤(ⅰ)，表示目的催化剂分子显示其所需催化活性的任何适当条件。
如果筛选目的是为了识别在碱性pH下具有活性的目的催化剂，则这类适当的条件可能是碱性pH。
术语“已经能够多次催化底物到产物的反应的目的催化剂分子”根据本发明第一方面步骤(ⅲ)，表示所述目的催化剂分子已经使底物到产物的催化反应实施了至少2次，更优选至少100次，更优选至少10 000次，更优选至少106次，最优选至少1010次。
术语“利用包含在步骤(ⅲ)所述实体的信息重复步骤(ⅰ)～(ⅲ)一次或者多次以产生目的催化剂分子，并构建一个包含所产生的目的催化剂分子的独立单位，然后将该独立单位作为所述重复步骤的起始物”根据本发明第一方面步骤(ⅳ)，表示所指的重复可能是1次，更优选2次，更优选5次以上，还更优选10次以上，最优选25次以上。
上述体外筛选方法的一个优点在于，它允许催化剂分子在一轮筛选过程(即目的催化剂分子最后被收集以前)中进行底物到产物的多次转换(见图2说明)。
该方法与本领域以前所述的筛选方法有本质差别，以前的方法或者涉及与该指定反应的过渡态类似物结合，其间或者无底物转换(见上述“发明背景”#1)或者只有一次底物转换(见上述“发明背景”#2,3和4)。
该方法可能具有两个优点，以下用本发明方法的可能筛选方案对此可作说明(参图2)：
(a)根据本发明第一方面步骤(ⅰ)，在适当条件下放置包含许多独立单位的样品，所述条件中目的催化剂分子表现出所需催化活性并且所述独立单位与试剂分子在产物-结合柱的一端(起始端)接触，其中将特异性结合产物的受体偶联至该产物-结合柱的基质上，并与该产物柱缓冲液中适当量的试剂偶联；
(b)根据本发明第一方面步骤(ⅱ)筛选目的催化剂，方法是筛选一个或者多个含该产物分子的独立单位，收集最后到达该柱另一端(收集端)的独立单元。
该筛选方法中下述事件在产物柱子内发生：
1)包含潜在的目的催化剂分子的独立单位转化所附着的底物为产物；
2)所述独立单位(现在包含该产物)扩散至并结合于该产物柱靠近起始端的受体；
3)试剂分子在产物柱子缓冲液中介导反应产物转化为底物并因此产生一种单元结构：催化剂分子-接头-底物，因此上面所述释放的独立单位现在包括底物和潜在的目的催化剂分子，其催化底物到产物的一次转换，并重新生成步骤1)独立单位的原有形式。相应地，该单位能够因此再一次进行反应(1)；与相对更靠近产物柱收集端的受体结合。
具有最有效之所需特异性催化活性的目的催化剂分子在给定时间间隔内将完成大多数底物到产物的转换，结果，将花费更多时间固定到产物结合受体上。因而，包含所述最有效的催化剂分子的(那些)独立单位将最后到达该柱子的收集端。
利用本发明第二方面方法的这种实例，在本领域的两个优势可能在于：
ⅰ)“可选择的”催化活性可能比本领域已有筛选方法所选高得多。可选的步骤涉及进行指定反应，扩散至并结合于产物结合柱上的产物，最后由所述试剂将附着的产物重新转化为附着的底物。由于扩散通常较快，故可仅通过控制柱子上产物结合受体的量或者产物-柱缓冲液中Y-S成分的类型/含量而控制筛选的严谨性；
2)活性方面的微小差异能够予以区分；因为随着催化剂流过柱子该筛选步骤可重复多次，即使催化剂活性的微小差异也将导致柱子上不同的滞留时间，并因此产生的不同浓缩作用。
因此，在本领域的一个优势可能在于活性方面的微小差异能够予以区分；因为该筛选过程中筛选步骤可重复多次，即使催化活性的微小差异也可能随后被区分开。
本发明的另一方面涉及产生目的催化剂分子的方法，该方法包括实施本发明对多次催化活性转换进行体外筛选的方法，还包括下述步骤，
a)用适当的生产方法产生所需适当数量的上述目的催化剂分子。
附图简述
图1：图示具有下列通式的第一类独立单位的适当示例：
C-S，
其中C表示一种催化剂分子而S表示一种底物。该底物S以一种允许所述独立单位内催化剂与底物之间进行催化反应的构像附着于催化剂上。所述催化剂产生第二类独立单位：
C-P，
其中C表示一种催化剂分子而P表示一种产物分子。
所述底物与催化剂的附着特性使得有可能利用产物的一个特点(例如对基质的结合亲和力)，分离一个实体(例如催化剂本身或一种展示它的噬菌体)，该实体包含能明确鉴定催化底物分子转化为产物分子之催化剂分子的信息。
图2：图示一适当实例，其中本发明的样品处于使目的催化剂产生的产物与能主动地将其转换回底物的一种或多种试剂接触的条件下。这使得目的催化剂分子能在其被最后收集以前多次催化活性的转换(即有效催化底物到产物的转换)。
图3：图示能如本文所述将产物转化为底物的试剂的优选条件。
定义：
S1：目标反应前附着到独立单位的底物。
P1：目标反应发生后附着到独立单位的产物。
S2：后续(目标)反应中所有其它底物。
P2：代表后续反应中所有其它产物。
R：逆反应的反应物(反应物因此是试剂)。
图4：碱基-接头-底物偶联物的结构与合成。
图5：底物与噬菌体上pⅢ蛋白质的共价附着。(a)编码酸性肽序列和C-末端半胱氨酸的DNA被融合到基因gⅢ的N-末端，形成酸性辅助噬菌体。一种噬菌粒编码与pⅢ蛋白质融合的蛋白质文库；(b)噬菌体的产生导致噬菌体颗粒显示该噬菌粒所编码的蛋白质；该pⅢ蛋白质具有酸性肽延伸；(c)酸性肽和碱性肽的螺旋构象将底物非共价地附着到噬菌体pⅢ蛋白质；(d)还原剂的去除导致酸性肽和碱性肽通过其C-末端半胱氨酸交联；(e)本研究中显示葡萄球菌核酸酶的噬菌体通过一个5′-生物素化的单链的寡聚脱氧核苷酸与链抗生物素蛋白附着。显示活性酶的噬菌体通过在一种分子内反应中裂解寡聚脱氧核苷酸被释放。
图6：噬菌体从固体支持物的固相化和裂解。将非碱基-接头，碱基-接头-pTp或碱基-接头-寡聚脱氧核苷酸偶联物交联到(a)显示SNase的噬菌体或(b)对照蛋白Fab 39-All。柱子1～4显示在链抗生物素蛋白磁珠上的固相化。对固相化的检测通过对磁珠直接进行噬菌体滴定(柱1～3)，或DNaseⅠ处理磁珠后(柱子4)而进行；柱子5～7显示渗漏(无Ca2+时的释放)；柱子8～10显示Ca2+诱导的释放(裂解)。回收百分率显示在柱子顶部。
图7：图示对本文实施例2(见下)的支持。具有糖苷酶活性的酶的优化。
图8：图示一种体外筛选方法，其中目的催化剂分子的筛选，是通过与产物分子的特异性固相化进行的。该方法可以反过来操作，其中基本上包含底物分子和催化剂分子的每种独立单位与一种基质结合，其中该单位是在底物被转换成产物时从所述基质释放的。
图9：图示对本文实施例3(见下)的支持。包含本发明第一方面特征的一种独立单位的一个实施例。
图10：图示对本文实施例5(见下)的支持。野生型RNase A肽在磁珠上的富集。
图11：图示对本文实施例4(见下)的支持。分泌型酶的活性的优化。
图12：图示对本文实施例6(见下)的支持。展示于噬菌体上的活性DNA聚合酶变体的分离。
图13：图示对本文实施例7(见下)的支持。DNA聚合酶变体通过电泳进行的分离。
图14：图示对本文实施例8(见下)的支持。具有连接酶活性的一种脱氧核酶的优化。
本发明的实施例描述如下，仅作为示例。
发明详述：
根据本发明的第一方面体外筛选多次催化活性转换的方法：
术语“筛选”优选表示根据本发明第一方面的步骤(ⅱ)，所指筛选进行一份样品的1个以上，优选1000个以上，更优选106个以上，还更优选1010个以上，最优选1014个以上的独立单位中进行，优选不需要技术人员的干预。
术语“柱子”在此表示各种固体支持物。例如：柱子，包括biacore设备的平面。此外有些情况不需要固体支持物。依据电场中的迁移进行的分离就属此例。
目的催化剂产生的产物与将其转化回底物的一种或多种试剂接触：
如上所述，术语“所指样品还处于目的催化剂产生的产物与将产物转化回底物的一种或多种试剂接触的条件下”，根据本发明第一方面的步骤(ⅰ)，表示任何试剂和试剂分子的任意组合，其能够催化反应产物(包含在独立单位内)(P1)成底物(包含在独立单位内)(S1)或者作为反应物参与P1到S1的反应。对此更多的描述和所指试剂的优选实施例的描述请参考下述“技术人员挑选适当试剂指南”部分。此外，见图2和图3。
在根据体外筛选多次催化活性转换的方法所进行的筛选循环中，依据本发明，使第一轮筛选的严谨度小于后续多轮筛选可能较有利。例如柱缓冲液可以使用低浓度的试剂，和/或用较少量的产物结合受体固定到柱基质上，某些情况下第一轮希望使用非Y-底物。此外，可以使用低效率的试剂或产物结合受体。然后在后续的筛选循环中增加浓度。为了进一步增加筛选的严格程度，可以在缓冲液中添加过量的底物S作为一种竞争底物。其它改变筛选严格程度的方法包括：改变连接酶与底物的接头长度，柱缓冲液中添加对底物或酶有亲和力的因子，或添加影响底物-酶反应的因子(例如与酶的活性位点结合的受体/抗体，酶抑制剂，对底物有亲和力的受体/抗体)。
最后，为了限制催化剂在底物转换过程中的作用时间，可以在筛选过程中使用例如电脉冲或光脉冲。适当间隔的脉冲能够制造例如临时的pH或离子梯度，该梯度将启动由催化剂进行的底物到产物的反应。该脉冲应该间隔足够的时间以便留出足够时间让溶液中的催化剂在脉冲启动下一步反应以前固定到受体上。按此方式，柱子中筛选的停滞时间(即催化剂从一个受体扩散到下一个受体所花费的时间)能够急剧地减少，并创造出很严格的条件。
一般地，优化所述特异性的试验构成在技术人员的普通知识范围之内。
非限制性的优选的情况是试剂不能有效地作用于所固定的产物，只能作用于游离的产物，柱子对该产物的亲和力必须加以调整以便在游离与结合的产物之间建立适当的平衡。然而，假如所述试剂对游离产物和固定到柱子上的产物都起作用那么得到的是最佳的严格筛选条件。
下面所列为适当的“试剂”的示例：
“所需反应”，“试剂”
#1．“DNA聚合反应”，“DNase”
#2．“RNA聚合反应”，“RNase”
#3．“利用包括非天然碱基的核苷酸的RNA聚合反应”，“RNA骨架裂解酶”
#4．“糖原降解”，“UDP-葡萄糖+糖原合酶”
#5．“多糖合成”，“多糖裂解酶”
#6．“序列特异性dsDNA裂解”，“序列酶+脱氧核糖核苷-三磷酸”
#7．“酯水解”，“活化的亲核试剂”
#8．“酰胺键形成”，“蛋白酶”
#9．“脂水解”，“乙酰辅酶A+脂合酶”
#10．“磷酸化”，“磷酸酶”
#11．“酯水解”，“1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺-氢氯化物+乙醇”
#12．“D-型到L-型异构化作用”，“L-型到D-型异构酶”
#13．“脯氨酸反式-到-顺式异构化作用”，“脯氨酸顺式-到-反式并构酶”#14．“内酯或内酰胺环化作用”，“内酯酶或内酰胺酶”
#15．“氧化或还原”，“还原酶或氧化酶”
#16．“脱硫作用”，“磺基转移酶”技术人员挑选适当试剂指南
本段将产物到底物分子的转化称为“直接再加载”或“底物再加载”。
本段的“条件”根据直接再加载方案的上下文定义，即，使底物S1和产物P1被附着到包含上述催化剂的独立单位上的条件。S1,P1,S2,P2的定义见图3。
催化剂不能改变化学反应的平衡。或者，催化剂通过同种因子加速正向或逆向反应。但是，在反应物尚未到达平衡的条件下，催化剂能够加速平衡的到达。
为了使直接底物再加载操作在最佳条件下进行，由“催化剂”(独立单位)催化的反应优选是在能量方面有利的，即，所催化的(目标)反应在测定条件下是能量下降的(见图3,A-D)。“目标反应”与“试剂”的可能组合有许多，下面的示例描述了其中一些对直接再加载操作可能切实可行的组合。为了指导技术人员挑选正确的试剂，对有效试剂的特点在每种情况中予以描述。
图3A描述只涉及一种底物(S1)和一种产物(P1)的反应，所指底物和产物都附着于“催化剂”上。这种反应的一个示例可以是化合物(S1)与其异构体(P1)的异构化作用。S1到P1的转化是能量下降的，而且是一个能够用所述操作达到目的的反应。逆反应，P1到S1的转化是能量上升的；因此，缓冲液应该包括一种反应物，该反应物与P1一起，比S1所处能量高一些。这种反应物的一个示例是ATP；在该示例中，缓冲液将包括ATP和一种酶，所指酶能够利用储存在ATP中的能量将P1异构化成S1(ATP不必与P1反应，但是，所指酶将利用在能量方面有利的ATP水解使在能量方面不利的P1到S1的转化加倍进行)。
图3B显示涉及多种底物但只一种产物的正向反应。RNA聚合作用就是一例，其中S1底物是核糖核苷酸上的3′-羟基，S2底物是溶液中的各种核糖核苷-三磷酸。正向反应由核糖核苷-三磷酸的水解推动，因此是能量下降的。但是，底物再加载过程(3′-羟基的再生)也是下降的。初次看到这种情况可能觉得奇怪；然而，这两种过程沿着不同的反应路径进行(例如，核糖核苷-三磷酸不可再生)。原则上，逆反应不需要酶。但是，所举示例中逆反应是磷酸二酯键的水解，是一种非常缓慢的反应。假如添加了一种核糖核酸酶底物再加载因此会有效得多。
图3C涉及一种底物S1和两种以上比S1能量更低的产物P1和P1。反应物添加到缓冲液中；反应物与P1形成S1的反应是能量下降的，因为其用于启动反应。该启动可用作催化糖原水解(即，该S1底物是糖原)的“催化剂”(独立单位)，因此与催化剂附着的P1产物将是一种葡萄糖(的聚合物)。试剂可包括糖原合酶，该酶从UDP-葡萄糖和葡萄糖(的聚合物)生成糖原。所指酶因此将利用在能量方面不利的葡萄糖单位的融合使在能量方面有利的UDP-葡萄糖的水解加倍进行。
图3D描述一种更加复杂的情形，其中一种以上的底物被转化成一种以上的产物。同理，产物的形成是能量下降的；图3D描述了S1从P1自发形成(不需要反应物)的情形。假如目标反应是一种ATP-依赖的异构化作用(因此，S2=ATP和P2=ADP)，而且S1与P1是异构体，那么P1到S1的异构化作用可能是能量下降的(而且不需要任何额外的反应物)。底物再加载反应的效率可能被另一种催化ATP-非依赖性异构化的催化剂(酶)的加入而加速。
重要的是要记住水分子可能被当作底物，例如在水解反应中。
此外，尽管上面说过，直接再加载筛选能够以一种方式启动以便目标反应在试验条件下不是热动力学下降的。例如设想一种目标反应其中S1被裂解而形成P1和P2，而且缓冲液中有过量的P2存在以致S1从P1和P2的形成在能量方面是有利的，即，该平衡是朝向S1的形成。然而，由于平衡是动态的，S1将不断地被降解和形成，但在任何时候S1将比P1多。当S1到P1和P2的单个反应发生时，P1可被分离(例如，结合到一个产物-结合柱子上)，因而，催化剂将与P1一起被分离。过量的P2将导致一种非常有效的底物再加载，但不排除正向反应的发生。
优选，试剂应该使催化剂上附着的底物S1再生。
优选，试剂通过一个与产物产生路径不同的反应路径使底物再生。
一种包括许多不同独立单位的样品
按上面指定的所述样品可能包括至少两个不同独立单位，最多数个不同独立单位。
不同独立单位的实际数量一般对应于催化剂分子库的实际大小。
除所指定的不同独立单位外，所述样品可能原则上还包括任何其它适当的物质。
包括在所述样品中的其它所述不同独立单位可溶解在任何适当的缓冲液，比如水中。
不同独立单位：
如上所述一个独立单位包括通式：
催化剂-底物；或者
假如该底物已经被转化成产物，则该通式为：
催化剂-产物。
此外，术语“不同独立单位”表示不同独立单位各自包括不同的催化剂分子，即两个不同的独立单位的一个示例可以是
(1)催化剂分子1-底物；和
(2)催化剂分子2-底物；
其中催化剂分子1和催化剂分子2表示两种不同催化剂分子。
此外，“一个独立单位”在此表示一个独立单位，其可在所述样品中以物理方式与其它不同独立单位隔离，以便能够分离独立的单位。
一个生物学上可扩增的独立单位：
本发明的一个实施例涉及一种样品，该样品包括许多根据本发明的不同独立单位，其中根据本发明的第一方面步骤(ⅰ)所指独立单位是一个生物学上可扩增的独立单位。
本发明的另一个实施例涉及一种样品，该样品包括许多根据本发明的不同独立单位，其中根据本发明的第一方面步骤(ⅰ)所指独立单位是一个生物学上可扩增的独立单位而且所指底物和所指催化剂分子两者都附着到所述生物学可扩增的独立单位表面。
术语“一个生物学上可扩增的独立单位”表示在所述独立单位中；
(ⅰ)目的催化剂分子是生物学可扩增的分子；或
(ⅱ)目的催化剂分子由能明确鉴定该催化剂分子的实体所含信息进行生物学编码；
使扩增所述目的催化剂分子以便获得所述催化剂分子的多拷贝成为可能。
术语“生物学编码”在上述(ⅱ)点表示所指的信息以遗传密码的形式被包含在一种DNA或RNA分子内。
与上述(ⅰ)点有关的生物学可扩增之独立单位的示例是其中目的催化剂分子为DNA或RNA分子的独立单位，因为在本领域熟知DNA或RNA分子可以轻易扩增。
与上述(ⅱ)点有关的生物学可扩增之独立单位的示例是独立单位其中目的催化剂分子为肽或多肽，且所述含能明确鉴定该催化剂分子的信息的实体是编码所述肽或多肽的DNA分子。
与上述第二个实例有关的，物理学连接必须存在于肽和编码该肽的DNA之间，以便用该DNA编码的肽分离该DNA。该连接可以是直接的，此时肽直接附着到编码它的核酸上，或者间接的，此时肽附着到例如含编码该肽之核酸的细胞表面，或说肽是由该细胞分泌的，因而肽浓度在同一细胞所附着的底物周围要高于样品中其它细胞所附着的底物周围。这种细胞在此定名为“载体系统”，下面将进一步讨论。
柔性连接头：
本发明的一个实施例涉及一种样品，该样品包括许多根据本发明的第一方面的不同的独立单位，其中步骤(ⅰ)所述独立单位包含下列结构：催化剂分子-柔性接头-底物。
术语“柔性接头”在此是指作为一个整体连接催化剂与底物的分子。例如，假如底物通过一种柔性分子附着到磁珠上，而且催化剂也通过一种柔性分子附着到磁珠上，“柔性接头”将代表“柔性分子-磁珠-柔性分子”，而且该柔性接头的特征将反映两种柔性分子和连接两者的磁珠部分的各自特征。柔性接头可能由例如柔性多肽，聚乙烯乙二醇(PEG)，以及其它有合理柔性的聚合物。
此外，柔性接头还可连接催化剂分子与一种载体系统(见下)。
载体系统
本发明的一个实施例涉及一种样品，该样品包括许多不同的根据本发明的独立单位，其中本发明的第一方面步骤(ⅰ)所述独立单位包含下列结构：催化剂分子-载体系统-底物，或更优选：催化剂分子-载体系统-柔性接头-底物。
术语“载体系统”表示一种物理地连接催化剂分子与底物的系统/实体，或者，携带能明确鉴定该催化剂分子之信息的系统/实体，其中所指载体系统不直接参与该催化剂分子所催化的底物到产物的反应。
这种载体系统在此进一步分成生物学可扩增的载体系统和生物学不可扩增的载体系统。
生物学可扩增的载体系统的实例包括(载体系统-催化剂分子)：噬菌体-多肽(Boublik等，1995，生物技术(Biotechnol)(NY)，卷13，页1079-1084)，丝状噬菌体-多肽(Key,Winter和McCafferty,1996，“肽和蛋白质的噬菌体展示，实验室手册”，学院出版社(Academic Press))，反转录病毒-多肽(Buchholz等，1998，天然生物技术(Nature Biotechnology)，卷16，页951-954)，质粒-肽(Schatz等，1996，酶学方法(Meth.Enzym.)，卷267，页171-191)，多聚核糖体-肽(Mattheakis等，1994，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，卷91，页9022-9026；He和Taussig,1997，核酸研究(Nucleic Acids Research)，卷25，页5132-5134)，细菌-肽(Brown,1997，天然生物技术，卷15，页269-272)和mRNA-肽(Roberts和Szostak,1997，美国国家科学院院报，卷94，页12297-12302),cDNA-肽(类似于mRNA-蛋白质融合展示，除了蛋白质已经被附着到编码该蛋白质的mRNA的cDNA上，而不是附着到mRNA本身)，肽-分泌细胞-肽(Kinsella和Cantwell,1991，酵母(Yeast)，卷7，页445-454)，肽-人造的分泌微球体-肽(人造的微球体包括在该微球体中所包含的基因所表达的蛋白质，见Tawfik和Griffiths,1998，天然生物技术，卷16，页652-656)。
生物学不可扩增的载体系统的实例包括(载体系统-催化剂分子)：磁珠-有机分子或磁珠-肽(Brenner和Lerner,1992，美国国家科学院院报，卷89，页5381-5383)。
应该注意一个包括磁珠-DNA序列结构的独立单位在此指一种生物学上可扩增的单位(见上述)，但该载体系统，象这种(磁珠)是一种生物学上不可扩增的载体系统。
催化剂和催化剂分子的文库：
如上所述术语“催化剂”表示任何具有所期望的催化剂活性的催化剂分子，例如有机分子和无机分子，蛋白质，肽，核酸，生物聚合物和非-生物的生物聚合物，有机或无机小分子。另外术语“催化剂”和“催化剂分子”可能交替使用。
相应地，本发明的另外一个实施例涉及，
(ⅰ)根据本发明的一种方法，其中所述催化剂分子库是一种天然的或非天然的肽或多肽的库，优选是一种酶库；或者
(ⅱ)一种根据上款实施例(ⅰ)的方法，其中所述的库是一种包括许多不同酶活性的库；或者
(ⅲ)一种根据上款实施例(ⅰ)的方法，其中所述的库包括从一种或多种前体多肽衍生出的变体，其中所述前体多肽显示密切相关的酶活性。
术语“包括许多不同酶活性的库”优选表示一种库，其中所述不同酶活性是本质上不同的活性，例如，蛋白酶活性，淀粉酶活性。这类文库之优势可能在于能根据所需比活性来改变底物。例如先用在此所述的体外筛选法以诸如肽为底物来分离如目的蛋白酶，随后可通过将底物变为如淀粉分子来分离淀粉酶。
可用制备这类文库的众多已知方法的任一种来制备上述文库。
所以，本发明的另外一个实施例涉及根据前面刚描述的发明实施例的一种包括许多不同独立单位的样品，其中所述的库包括改变的/重组的/掺杂的多肽。
术语“天然的或非天然的肽或多肽”表示肽或多肽可以是天然的，或人工制备的。
本发明的另一个实施例涉及，
(ⅰ)根据本发明的一种方法，其中所述催化剂分子库是天然或非天然核酸的库；
(ⅱ)根据以上方案(ⅰ)的方法，其中所述库是包括具有许多不同催化活性的核酸的库；
(ⅲ)根据以上方案(ⅰ)的方法，其中所述库是包括衍生自一种或多种前体核酸的核酸变体的库，其中所述前体核酸显示密切相关的催化活性。
术语“包括具有许多不同催化活性的核酸的库”优选表示一种库，其中所述不同催化活性是基本上不同的活性，例如，核酸酶，连接酶，异构酶，磷酸化酶。这类库的优势可能是通过按所需比活性而改变底物，可将所述库用于识别许多目的核酸。如果先用此处所述体外筛选法以两种DNA寡聚核苷酸作底物分离如目的DNA连接酶，则将底物变为RNA寡聚核苷酸可分离核酸酶。
可用制备这类文库的众多已知方法的任一种来制备上述文库。
所以，本发明的另外一个实施例涉及根据前面刚描述的发明实施例的一种包括许多不同独立单位的样品，其中所述的核酸库是包括改变的/重组的/掺杂的核酸的库。
术语“天然或非天然核酸”表示核酸可包括五种天然碱基(A,T,G,C,U)的任一种，或任何非天然碱基或骨架结构。
本发明另外的实施例涉及
(ⅰ)根据本发明包括许多不同独立单位的样品，其中所述催化剂分子的库是一种包括天然聚合体分子，或非天然聚合体分子，或有机小分子，或无机小分子或所述这些分子的混合物的库；或
(ⅱ)根据刚描述的实施例包括许多不同独立单位的样品，其中所述库通过组合化学制备。
优选，该样品可含有有效组合库(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1997，卷94，页2106-2110)，即每种潜在的催化剂由一种以上亚单位组成，通过可逆的共价或非共价相互作用维持在一起，这些亚单位在多次转换试验中结合和分离几次。
在说明有效组合库时，在本文通篇使用的术语“明确鉴定”应理解为对回收的实体的明确鉴定，并不一定是单个催化剂的实体组合物。这类分离自有效组合库的催化剂可以是以下催化剂，其由数条多肽链组成，通过弱相互作用(诸如以较低亚单位-亚单位亲和力为特征的蛋白质亚单位连接)维持在一起，或通过可逆的共价二硫键维持在一起，其交换速度已经通过加入氧化还原缓冲液(例如氧化的和还原的谷胱甘肽)来加速并因此连续地结合与分离。
或者，该文库的成员可以是通过二硫键连接的有机小分子的组合。
本发明还有一个实施例涉及一种样品，该样品根据本发明包括许多独立单位，其中催化剂分子和能够被催化成一种产物(第一方面步骤(ⅰ))的底物是不同的化学物质。
术语“催化剂分子和能被催化成产物(第一方面步骤(ⅰ))的底物是不同的化学物质”表示所述催化剂分子和底物分子是本质上不同的化学物质。
术语“天然聚合体分子，或非天然聚合体分子”表示这些聚合体可以是天然的，或是人工制备的。
本发明第二方面的步骤(ⅰ)之前进行的富集步骤
有些蛋白质难以在丝状噬菌体上展示。尤其大分子蛋白质或者对大肠杆菌有毒或有生长抑制效果的蛋白质通常展示效率较低，即产生的多数噬菌体颗粒表面不展示蛋白质。已有报道展示效率低至1分子目的蛋白/1000噬菌体(Jestin等，1999,Angew.Chemi.Int.Ed.，卷38，页1124-1127；Demartis等，1999,JMB，卷286，页617-633)。这类情况下，得到较高的非特异背景，因为过量的噬菌体颗粒携带编码目的蛋白质的DNA，却不在其表面展示该蛋白质。为防止此类潜在问题出现，可在目的蛋白质的C-末端偶联一种亲和力标记，此标记使显示全长标记蛋白的噬菌体可通过柱层析纯化。
其它可如此使用的非限制性亲和力标记包括：组氨酸标记(实施例9)，intein-几丁质结合域融合体(Chong等，1997，基因，卷192，页271-281)，FLAG肽(Slootstra等，1997，分子多样性(Molecular Diversity)，卷2，页156-164)，以及麦芽糖结合蛋白(Pryor和Leiting,1997，蛋白质表达与纯化，卷10，页309-319)。
因此，本发明的实施例涉及
(ⅰ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中目的催化剂分子是已经与一种亲和力标记偶联的酶或蛋白质，且其中一个可选择的步骤在步骤(ⅰ)之前进行，该可选择的步骤包括通过纯化而富集可展示(全长)酶或蛋白质的独立单位，该纯化过程中展示酶或蛋白质的单位用所述亲和力标记来分离。
(ⅱ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中展示(全长)酶或蛋白质的独立单位通过一种抗-亲和力-标记抗体柱纯化，其中展示标记酶或蛋白质的单位用标记分离。
(ⅲ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中所述亲和力标记包括与目的酶或蛋白质的C-末端偶联的6个组氨酸残基，展示(全长)酶或蛋白质的独立单位在Ni-NTA柱上纯化，或在抗-组氨酸抗体柱上纯化，所述纯化过程中展示标记酶或蛋白质的单位用标记分离。
根据本发明的方法分离目的活性催化剂的方法
活性和弱活性催化剂的分离优选涉及一个选择步骤，其中所催化的反应导致催化剂通过所述附着其上的接头-底物而释放或附着。
主要有4种方法将活性催化剂与失活的催化剂分开。ⅰ)活性催化剂可通过将产物固定到一种产物结合柱子(或更通常，通过所附着的产物)而被分离。ⅱ)失活的催化剂可通过固定在一种底物结合柱子上而除去。ⅲ)目标反应之前催化剂可以附着到支持物上；当裂解反应发生时，该催化剂从支持物释放并能够被收集。ⅳ)活性催化剂可通过与底物1(附着到催化剂)和底物2(附着到支持物)的反应将自己附着到固体支持物。
产物和底物特异性柱子可通过分别特异于产物和底物的受体分子固定产物和底物。或者，可以通过柱子上的功能基团与附着到所述催化剂的产物或底物之间的一种产物或底物特异性反应介导固定化。
分离产物或底物(及其各自的活性或失活的催化剂)的其它方法包括不同相位的分离，质谱分析，沉淀，电子或电磁分离等。特别地，可以进行各种电泳，尤其在产品的形成导致独立单位的电荷明显变化时。如在连接两种底物的连接反应中，其中一种底物带电并在底物到产物的反应之前释放至溶液中就会产生明显的电荷变化。
因此，本发明的实施例涉及
(ⅰ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中步骤(ⅱ)对目的催化剂分子的筛选，是通过特异地固定至所述产物分子而进行的；
(ⅱ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中步骤(ⅱ)对目的催化剂分子的筛选，是通过下列方案进行的：
(a)构建一种系统，其中第一方面步骤(ⅰ)的基本上每种包括底物分子和催化剂分子的独立单位均与一种基质结合而且其中所述单位在底物转化成产物时从所述基质释放；并且
(b)筛选是从所述基质释放的单位；
(ⅲ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中对目的催化剂分子的筛选(步骤(ⅱ))，是通过下列方案进行的，
(a)构建一种产物-柱，其中将与产物特异性地结合的受体置于该产物-柱的基质上；并且
(b)在该产物-柱子的一端添加含独立单位的样品并通过分离到达柱子另一端的独立单位来筛选目的催化剂分子；
(ⅵ)根据本发明第一方面的体外筛选法，其中对包含信息的实体的分离是通过物理或化学方法进行的，所述信息能用于对目的催化剂分子进行明确鉴定(步骤(ⅲ))；或者
(ⅴ)如上刚刚描述的体外筛选法，其中物理方法是电泳。
上述步骤(ⅰ),(ⅱ)，和(ⅲ)的图示说明，见图8和图2。
根据本发明第一方面步骤(ⅳ)重复步骤(ⅰ)～(ⅲ)一次或数次：
如上所述根据本发明第一方面步骤(ⅳ)术语“利用包含在步骤(ⅲ)所述实体中的信息重复步骤(ⅰ)～(ⅲ)一次或数次，以产生目的催化剂分子并构建含产生的目的催化剂分子的独立单位，然后将该独立单位作为所述重复步骤的起始物”表示所述重复可以是1次，更优选2次，更优选5次以上，还更优选10次以上，最优选25次以上。
根据本发明的最后一方面制备目的催化剂分子的方法：
如上所述，本发明的最后方面涉及一种制备目的催化剂分子的方法，该方法包括实施本发明的体外筛选方法并进行以下步骤，
(a)用适当生产方法生产所需量的上述分离的目的催化剂分子。
如上述，在根据第一方面的体外筛选法中，发明步骤(ⅲ)指：
“(ⅲ)分离一种实体，其含有允许对能多次催化底物到产物的反应的目的催化剂分子进行明确鉴定的信息，其利用该产物的一个特征。”
因此，包含在所述实体内的信息提供了通过技术人员所知的任何标准制备方案制备所述目的催化剂分子的可能性。
如果所述目的催化剂分子是如一种目的多肽，则所述标准制备方案可以是重组制备所述目的多肽的标准方案，或
如果所述目的催化剂分子是如一种目的有机分子，则所述标准制备方案可以是制备此类有机分子的标准方案。
实施例：
实施例1：包括本发明第一方面特性的一个独立单位的实例
目的催化剂是SNase；底物是单链寡聚核苷酸(ssDNNA)；而产物是由目的SNase裂解而来的单链核苷酸(ssDNA)。
此外，用丝状噬菌体作载体系统而用酸/碱接头作柔性接头。
相应地，本实施例中的独立单位都具有下述通式：
SNase-丝状噬菌体-酸/碱接头-ssDNA
催化剂-载体系统-柔性接头-底物
说明见图5。
本实施例中产物(即裂解后的ssDNA)的“筛选特征”在于所述产物不与基质结合而底物(ssDNA)与基质结合。
因此，本实施例中目的SNase分子通过筛选从所述基质上释放的独立单位而分离。说明见图5。
材料和方法
化合物的合成Fmoc-S-(2-硝基-4,5-二甲氧基苄基)-L-半胱氨酸1根据修改的Merrifield(6)方法合成。简述如下，605mg L-半胱氨酸(5mmol)悬浮于100mL除气后的乙醇/水(2∶1)中，再加入1.39mL三乙胺(10mmol)和1.39g 1-(溴甲基)-2-硝基-4,5-二甲氧基苯(5mmol)。该混合物在23℃氮中避光搅拌10小时后过滤。过滤的沉淀经乙醇冲洗并从乙醇/水中重结晶以获得0.95g S-(2-硝基-4,5-二甲氧基苄基)-L-半胱氨酸(3mmol)。重结晶的产物(0.8g)悬浮于20mL水中；加入0.53mL三乙胺(3.8mmol)，然后加入将0.9g 9-琥珀酸芴基甲氧基羰基酯(2.7mmol)溶于12mL乙腈的溶液，该混合物在25℃氮中搅拌10小时。混合物在1M HCl酸化的pH2-3条件下沉淀并挥发掉乙腈。在过滤板上收集沉淀并用水和乙酸乙酯冲洗以除去多余的HCl和试剂。所得粗制品1(1.13g)经过彻底的真空干燥，然后直接用于合成碱-接头肽C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLK WKLQALKK-KLAQGGC(碱基序列带下划线，光保护的半胱氨酸粗体显示)。化合物2,3和4用3′-生物素基团(BiotinTEG CPG,Glen Research)和5′-硫醇(5′-Thiol-Modifier C6,GlenResearch)在ABI DNA合成仪上合成1mmol，并从树脂洗脱(RaininMicrosorb C18柱，流速1mL/分钟；溶剂A:50mM醋酸三乙铵(TEAA)，pH7，溶剂B：乙腈，5％～50％线性梯度的溶剂B 40分钟)后通过反相HPLC纯化；硫醇上的三苯甲基保护基团按照Glen Research的方案去除。制品冻干并溶于水(1.0mM终浓度)。化合物2与碱-接头肽的连接按下述步骤进行：pH5.5的50mM磷酸钠缓冲液1mL中，2mg(415nmol)碱-接头肽与20倍摩尔过量的N,N′-二(3-maleimidopeopionyl)-2-羟基-1,3-丙二胺)(3.2mg)在4℃氮中反应10小时。化合物5用反相HPLC(Vydac RP-18柱，流速2mL/min；溶剂A:0.1％TFA水溶液，溶剂B:0.1％TFA溶于乙腈；溶剂B在35分钟内的10％～55％线性梯度)从反应混合物中纯化获得，各产品级份浓缩成大约0.3mL(OD280=6，化合物5不应浓缩成干品)。100mL(138nmol)此种溶液加入75μL水，75mL1M磷酸钠水溶液，pH7,30mL5M NaCl水溶液，和22mL(22nmoles)化合物2，该反应在23℃氮中温育10小时(应该按此顺序添加试剂以免产生沉淀)。制品的纯化使用阴离子交换剂FPLC(Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)，流速0.75mL/分钟；溶剂A:20mMTris-HCl,pH7，溶剂B:20mM Tris-HCl,pH7,2M NaCl；20％～60％线性梯度的溶剂B 7.5分钟)；制品在10％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳呈一条带。OD260=0.3～1的组分直接用于光-去保护步骤(见下)。化合物3和4与碱-接头肽的连接按下述步骤进行：化合物3和4各约200nmoles，与20倍过量的双马来酰亚胺温育在1mL含水的50mM磷酸盐缓冲液中，pH5.5,4℃反应15小时。经反相HPLC纯化和冻干后，化合物6和7的鉴别用Maldi-ToFMS法检验。然后化合物6或7(150nmols)与100nmols碱-接头-肽温育在100mL的10mM TEAA,pH6.5,100mM NaCl中，4℃反应15小时。制品经反相HPLC(Vydac RP-18柱，条件同上)纯化，冻干并用Maldi-ToF MS法分析(7)。(上述)三种偶联物的C-末端-半胱氨酸上的2-硝基-4,5-二甲氧基苄基保护基团经光分解作用去除并按照下述方式制备化合物8,9和10：对化合物8,100mL FPLC纯化的包含所保护的偶联物(见下)的组分用氩彻底除气15分钟，然后装入隔膜加盖的玻璃小瓶中照射汞灯(450W高压汞灯，Ace-Hanovia；PyrexTM filter，切掉2300nm)30分钟(8)。对化合物9和10,10nmol的偶联物溶于100mL 10mM DTT，依上述方法除气和光分解。照射30分钟后没有残留的起始物质可用Maldi-ToF MS法检出。反应混合物用HPLC分离(Vydac RP-18柱，条件同上)，各产物成份被冻干。偶联物冷冻储存，并于光-去保护后一周内使用，以确保对噬菌体的有效附着。
酸性辅助噬菌体的构建利用引物K07-NarⅠ-prim(5′-ACAACTTTCAACGGCGCCAGTTTCAGCGG-3′)通过Kunkel诱变反应(9)在M13K07辅助噬菌体(Promega)的成熟pⅢ蛋白第三与第四密码子之间引入NarⅠ限制位点，以产生NarⅠ-辅助噬菌体。用酸性质粒pCRⅡ(Ellis L.Reinherz,DanaFarber Cancer Institute,Boston)，以NarIfwd(5′-ACTACAAATTGGCGCCGCTCAGCTCGAAAAAGAGC-3′)和NarIbck(5′-AATTATAGGCGCCAGCCGGGCAACCGCCCTG AGCCAGTTCCTTTTCC-3′)为引物，经聚合酶链反应(PCR)合成编码两端均有一个NarⅠ限制位点的氨基酸GAAQLEKELQALEKENAQL EWELQALEKELAQGGCPAGA(酸性肽序列带下划线，GGC基元以黑体显示)的DNA。PCR产物经NarⅠ消化然后插入NarⅠ消化的NarⅠ-辅助噬菌体中以制备酸性辅助噬菌体。
编码葡萄球菌核酸酶pⅢ融合体和39-All Fab-pⅢ融合体的噬菌粒的构建为制备SNase-pⅢ融合体，用携带SNase基因的质粒pONF1(10)进行PCR，引物为5′-CGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCAACTTCAACTAAG3′(SfiⅠ限制位点带下划线)和5′-GCGAATTGGTGCGGCCGCTTGACCTGAATCAGCGTTG-3′(NotⅠ限制位点带下划线)。产物经SfiⅠ和NotⅠ消化然后插入SfiⅠ-NotⅠ消化的pFAB-5cHis(质粒pFAB-5c的一种衍生物(11))，以制备噬菌粒pⅡ78-6。使用噬菌粒pComb3H.DA作为阴性对照。该噬菌粒(12)携带有融合到pⅢ蛋白质上的39-All Fab抗体(13)。SNase和对照蛋白质的表达都由lac启动子启动。
噬菌体颗粒的制备噬菌体颗粒按φrum等(11)的方法稍加改动后制备。简言之，大肠杆菌XL1-blue经pⅡ78-6或者pComb3H.DA转化，振荡培养于37℃含100mg/mL氨苄青霉素的2xYT肉汤中。当OD600达到0.5时，加入酸性辅助噬菌体至终浓度为1.5×108cfu/mL,37℃温育20分钟。收集细胞团并重悬浮于2xYT,100mM IPTG,100mg/mL氨苄青霉素，50mg/mL卡那霉素中，室温振荡14小时。收集细胞团，上清液中的噬菌体颗粒用PEG沉淀后，用TBS(25mM Tris-HCl,pH7.4,140mM NaCl,2.5mMKCl)重新悬浮。以大肠杆菌XL1-blue使用标准方法测定噬菌体滴度(14)。
碱-接头-底物偶联物在噬菌体上的共价附着
大约108个噬菌体颗粒在40mL缓冲液A(TBS,10mM EDTA,0.1％BSA)中，添加1mM巯基乙胺(MEA)和1nmol碱-接头-寡聚脱氧核苷(8)，或碱-接头-pTp(9)或碱-接头-pTpTp(10),37℃保温60分钟，然后用PEG沉淀2次并重悬于缓冲液A中。
噬菌体固定并从固体支持物释放大约108个，共价地附着于碱-接头-底物偶联物上的噬菌体颗粒，与50mL链抗生物素蛋白磁珠(BoehringerMannheim，生物素结合能力：1.5nmol/mL)在1mL缓冲液A中23℃温育15分钟；用含0.1％吐温20的缓冲液A洗涤8次每次1分钟，然后用缓冲液A洗涤2次每次1分钟。固定在磁珠上的噬菌体数量可测定如下，将磁珠悬浮于缓冲液A中，然后用磁珠悬浮液直接感染大肠杆菌XL1-blue并测定滴度，或将磁珠用DNA酶Ⅰ处理(1U/mL DNaseⅠ,10mM MgCl2,20mMTris-HCl,pH8,23℃15分钟)后再行感染。固体支持物上钙-依赖的释放(裂解)可检测如下，将磁珠悬浮在缓冲液B(TBS,10mM CaCl2,O.1％BSA)中，23℃温育5分钟，滴定上清液。磁珠上的钙-依赖释放(渗漏)可测定如下，将磁珠重新悬浮在缓冲液A中，23℃温育5分钟，滴定上清液。
从文库样组合中富集活性酶将显示SNase或39-All Fab的噬菌体颗粒以1∶100比率混合，将碱-接头-寡聚脱氧核苷偶联物(8)共价附着。然后将噬菌体固定在链抗生物素蛋白磁珠上，如上述以缓冲液A洗涤，在缓冲液B中保温，用上清液感染大肠杆菌XL1-blue，将细胞接种于含100ml/mL氨苄青霉素的LA平板上。随机挑选菌落用PCR或限制性酶切鉴定其是SNase菌落或者对照菌落。
结果与讨论
筛选方案为测试上述在噬菌体展示方式中指导酶的改变的策略，首先有必要开发一种将指定底物选择性附着于噬菌体展示的酶上或其附近的常用方法。重要的是，对底物的附着须使其能结合到偶联酶的活性位点上并具有生产性。而且，底物应与噬菌体共价连接以确保文库各成员之间不存在反应产物的交叉。一种可能的策略涉及用底物通过二硫键交换反应对酶或其附近的噬菌体包膜蛋白(如，pⅢ蛋白)的选择性化学修饰。例如，通过定点诱变在葡萄球菌核酸酶活性位点附近引入一个半胱氨酸残基，用该残基通过二硫键交换反应选择性地引入惟一的化学功能基团(functionality)(15)。为了在丝状噬菌体表达的蛋白质上应用该方法，首先将pⅥ,pⅦ和pⅨ包膜蛋白的3个单一半胱氨酸诱变成丙氨酸。pⅢ蛋白质上8个隐藏的半胱氨酸残基未加改变，因为它们可能形成结构上重要的二硫键(16)。不幸的是，反复经二硫键交换，或添加马来酰亚胺或烷化反应尝试对几种展示于噬菌体上的酶的活性位点附近所引入的单一半胱氨酸残基进行选择性修饰，得到的是明显非特异标记的噬菌体包膜蛋白。未找到能选择性标记含有唯一表面半胱氨酸残基的pⅢ融合蛋白的条件或试剂。可能是组成噬菌体包膜的上千蛋白质使得寻求一种化学反应太难；也有可能是，由于蛋白质生物合成内在的差错率使得半胱氨酸错误掺入的可能性在如此大的蛋白质群体中变得明显了。或者，pⅢ蛋白中的半胱氨酸残基可能易受交联试剂的影响。
为避免出现这些问题，开发了一种两步法，其中化学交联通过在修饰位点选择性形成非共价复合物而进行(图4和图5)。该复合物是包含合成的碱性肽B和酸性肽A的异二聚体螺旋，所指碱性肽BC(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGC与底物在并二聚化之前共价偶联，所指酸性肽AGAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGGCPAGA表达为丝状噬菌体之pⅢ包膜蛋白的N-末端融合体。选择所述酸性和碱性肽(带下划线)为二聚化区域是因为它们小(30个氨基酸)并极易形成稳定、平行的异二聚体螺旋结构-形成酸-酸同型二聚体和碱-碱同型二聚体的效率比形成异二聚体的低105倍(17)。合成的(B)肽与噬菌体-编码的(A)肽的异二聚体化作用应该使该结构十分接近所展示的酶，并导致每个肽上的半胱氨酸之间自发形成二硫键(图5)。三肽Gly-Gly-Cys被添加到酸性肽和碱性肽的C-末端以促进两个螺旋之间二硫键的形成(17)。底物通过柔性接头与碱性肽B共价连接以促进底物与酶的生产性结合(图4)。酸性肽A被融合到噬菌体的pⅢ蛋白而不是所展示的酶自身是出于以下缘由：(ⅰ)酸性肽序列在酶内的插入可能干扰酶的功能；(ⅱ)碱-接头-肽的柔性接头以及pⅢ蛋白的铰链区和插入pⅢ与所示酶之间的肽接头，应该允许底物相对于酶活性位点的多种可能方向；以及(ⅲ)应有可能利用携带着酸性肽突出端的单一辅助噬菌体展示多种酶-底物对，而不必给每种酶设计一个功能性连接位点。
酸性辅助噬菌体和碱-接头-底物偶联物的产生
为了将碱-接头-底物偶联物附着到噬菌体我们在M13K07辅助噬菌体的pⅢ蛋白N-末端引入了酸性肽A。该酶库与pⅢ包膜蛋白的N-末端融合；此构建体由噬菌粒携带。经过辅助噬菌体的超级感染，产生出包含了噬菌粒DNA但其外壳是由辅助噬菌体基因组编码的蛋白质组成(有一个例外)的噬菌体颗粒。例外是pⅢ蛋白，其以4～5个拷贝存在于噬菌体的一端。在噬菌体组装过程中，酶-pⅢ融合体和酸性肽A-pⅢ融合体都可生成；从典型制备物获得的噬菌体颗粒携带一个或者零个酶-pⅢ融合体外加3～5个酸性肽A-pⅢ融合体。
为了制备携带着酸性肽-pⅢ融合体的噬菌体，将编码酸性肽A的DNA(其C-末端突出端上含一个半胱氨酸残基)引入M13K07辅助噬菌体的基因Ⅲ的5′-末端。所制备的酸性辅助噬菌体颗粒以比M13K07高一百多倍的效率固定在包被着碱性肽B的ELISA-板上，表明突变辅助噬菌体在其pⅢ蛋白上携带有易接近的酸性肽突出端。同样地，包含有编码pⅢ融合蛋白的噬菌粒的大肠杆菌被酸性辅助噬菌体超级感染时，产生的噬菌体颗粒除pⅢ融合蛋白外还展示修饰的pⅢ突出端(图5)。酸性肽的插入并未显示出对滴度的改变或者显著改善辅助噬菌体的效率。
合成的被底物附着的碱-接头-肽(B)由12残基(GlyGlySer)4接头和其后的构成碱性序列的30个氨基酸组成(图4)。碱-接头-肽还在N-末端和C-末端包含半胱氨酸残基，这些残基分别允许肽与底物的有效而选择性的偶联和噬菌体上二硫键的形成(图4和图5)。合成肽的C-末端半胱氨酸最初受可光化学地除去的2-硝基-4,5-二甲氧基苄基保护基团的保护。这就允许底物通过硫醇特异性反应(如，通过二硫键交换，烷基化，或者Michael加成反应)选择性地连接到N-末端半胱氨酸的游离硫醇基团上。底物连接后，C-末端半胱氨酸可被大量地光化学地脱保护以产生游离硫醇，该游离硫醇可用于与噬菌体上酸性肽突出端交联。因为底物与碱-接头-肽的这一化学连接，以及该连接物与噬菌体的交联是分别进行的，所以许多不同的试剂和反应条件可应用于碱-接头-肽与底物的偶联。此外，连接物的成分在与噬菌体交联前可被纯化并定性(如，通过质谱分析法)。
葡萄球菌核酸酶作为模式系统葡萄球菌核酸酶是一种人们十分了解的酶，该酶由一条全长为149个氨基酸的多肽组成(18)。该酶优选水解单链RNA(ssRNA)、ssDNA、和二倍体DNA上富含A、U-或者A、T-区的磷酸二酯键，以产生3′-磷酸和5′-羟基末端(18)。Ca2+为酶活性所必需，提供了调节酶反应的机制。另外，SNase已被成功地显示为噬菌体上的pⅢ融合蛋白(19)。
因为现存的任何一种试剂、抗体或受体尚无法轻易鉴别单链寡聚脱氧核甘酸与其裂解产物(互补的寡聚核甘酸将被降解)，所以一种筛选方案被开发出来，该方案中ssDNA底物经过酶的裂解导致噬菌体从固体支持物释放。此方案中，一轮筛选涉及以下步骤：ⅰ)显示SNase的噬菌体通过一个单链寡聚脱氧核甘酸附着在固体支持物上(没有灭活SNase的Ca2+存在)；ⅱ)洗涤去除未结合的噬菌体；ⅲ)添加Ca2+启动裂解反应，以及ⅳ)洗脱的噬菌体的分离。后几轮筛选过程中，洗脱条件可越来越严格，例如，更短的反应时间，更低的温度和改变的pH。噬菌体在固体支持物上的附着通过5′-生物素化寡聚脱氧核甘酸-肽B偶联物和噬菌体上酸性肽A突出端之间形成螺旋而进行，随后两肽间形成二硫键并固定在链抗生物素蛋白珠上(图4)。这一方案(其中噬菌体的通过底物附着在固体支持物上)要求酶或底物在附着到噬菌体的过程中保持非活性状态，然后通过改变反应条件被激活。这类改变可包括pH的调节，辅助因子或共同底物的添加，以及底物的光化学或化学激活。在生物分子浓缩反应时(其中键的形成导致噬菌体在固体支持物上的固定)没必要启动反应；假如活性酶是通过产物特异性的试剂、抗体或受体捕获，也没必要启动反应。
底物与噬菌体的共价附着展示SNase或一种对照蛋白(抗体39-All Fab片段)的噬菌体通过酸性辅助噬菌体的超级感染制备。为评估碱-接头-底物偶联物在噬菌体上的附着效率，将过量的对照偶联物“pTp”-肽B(化合物9)，与该噬菌体温育。碱-接头-pTp偶联物包括生物素，其后为脱氧胸嘧啶-3′,5-二磷酸(pTp)，柔性肽接头和碱性肽序列，和一个C-末端半胱氨酸。碱-接头-pTp偶联物并非溶液中野生型SNase的底物(pTp是SNase的有效抑制剂)(20)。噬菌体和底物-肽B偶联物首先与还原剂巯基乙胺(MEA)温育以还原噬菌体酸性肽或合成肽的半胱氨酸之间的二硫键。然后，MEA和游离的碱-接头-pTp通过PEG沉淀，并加入链抗生物素蛋白磁珠除去。洗涤10次后，固定的噬菌体数量通过用磁珠感染大肠杆菌XL1-blue和滴定噬菌体确定。当以此种方式测定时，对展示SNase和39-All Fab的两种噬菌体，其固定效率均约是10％(图6)。
下一步确定附着于展示SNase的噬菌体的寡聚脱氧核苷酸底物在没有Ca2+时是否稳定。碱-接头-寡聚脱氧核苷酸偶联物被附着在展示SNase的噬菌体上(有EDTA)，并且同上测定该固定效率。固定效率又是大约10％(图6)，表明附着的寡聚脱氧核苷酸底物在没有Ca2+时不被SNase裂解。假如一些噬菌体附着到磁珠时失去了感染力可能实际的固定效率要高于测定值。此观点通过添加DNaseⅠ被证实，DNaseⅠ应裂解所附着的寡聚脱氧核苷酸底物并释放所固定的噬菌体。如图6所示，大多数固定的噬菌体不具感染性，但在添加DNaseⅠ后恢复感染性，表明实际的固定效率是大约80％(图6)。假如不包括寡聚脱氧核苷酸-肽B，那么固定的噬菌体少于0.01％；假如用野生型M13K07辅助噬菌体超感染，那么固定的噬菌体约为0.3％。因此似乎按此两步方案使底物附着在噬菌体pⅢ蛋白上，是有效而高度位点特异的。
噬菌体自固体支持物上的酶依赖性裂解和富集为确定是否展示SNase的噬菌体在分子内反应中能够特异性地裂解所附着的寡聚脱氧核苷酸底物，Ca2+被添加到所固定的噬菌体中激活该酶。大约15％的噬菌体被释放(图6)，而展示Fab39-All的对照噬菌体仅仅0.2％被释放(图6)。该实验证实，SNase使噬菌体从固体支持物上裂解并释放比对照蛋白质的更为有效得多，与所预期的相同。然而，似乎在测定过程中有少量但明显的噬菌体级分从支持物渗漏(该背景渗漏在没有Ca2+时被观察到，对碱-接头-寡聚脱氧核苷酸和碱-接头-pTp偶联物都如此，对所示蛋白质都如此，图6)。Ca2+的添加导致噬菌体从支持物爆发性释放；但是，噬菌体的释放迅速降低到一个与没有Ca2+时所观察到的渗漏相当的水平。此结果证实，通过分子内的裂解活动释放入溶液的噬菌体不会因分子间裂解反应而从支持物释放其它噬菌体。因此交叉反应能力似乎不明显，即使如SNase般很活性的酶也是如此。
以上分析提示，有可能从展示失去催化活性之蛋白的噬菌体文库-样群体中富集展示SNase的噬菌体。为了对此加以测试，将展示SNase和Fab 39-All对照蛋白的噬菌体以1∶100比率混合，与寡聚脱氧核苷酸-肽B偶联物交联并固定。与Ca2+温育后，噬菌体回收率为22∶18，此结果相当于一个稍高于100的富集系数。这种程度的富集应该足以在5轮的筛选和扩增后从一个1010个成员的文库里分离一种活性催化剂。
通过减小噬菌体从支持物渗漏的背景，富集系数可能提高。该渗漏可能缘于支持物上链抗生物素蛋白的释放，或者，合成肽与噬菌体编码肽之间二硫键的还原或错误形成。我们目前还在探索这些可能性。或者，富集系数可通过增加酶-所催化的裂解反应强度而提高。在产生噬菌体的条件下，辅助噬菌体表达的pⅢ与噬菌粒表达的pⅢ融合蛋白的比率是这样：大多数噬菌体仅携带野生型pⅢ蛋白；只有少量噬菌体携带蛋白-pⅢ融合体。能够自我裂解的噬菌体数量可简单通过增加展示该酶的噬菌体数量而增加。于此间所述噬菌粒/辅助噬菌体的组合，我们估计只有大约15％的噬菌体是单价的。通过适当的载体设计和噬菌体制备，应该可能将平均展示值增加到每个噬菌体大约一个蛋白质。这应该将裂解与渗漏比值增加7倍，由此，将活性酶对失活酶的富集系数从目前的～100增加到大约700。
为了检验此间所述的筛选方案是否能用于涉及小分子底物的反应，将一种pTpTp-肽B偶联物(化合物10)附着到展示SNase或对照蛋白的噬菌体上。噬菌体经过上述富集过程，又是展示SNase的噬菌体得到富集。应用MALDI-ToF质谱分析法显示pTpTp底物在两个胸嘧啶之间的磷酸二酯键位置被裂解；没有检测到任何副产物。因此看来该方案适用于大分子和小分子两种底物。目前我们还在探索从酶库或者抗体来源库分离新催化剂的可能性。
噬菌体表达的大多数酶库要求通过一种如M13K07的辅助噬菌体进行超级感染。此间所述的筛选方案因此可直接应用于这些文库-只需将噬菌粒所编码的文库经过酸性肽辅助噬菌体超感染后制备噬菌体，并连接选取的底物到碱性肽B上。同理，该方案可应用于各种结构性的蛋白质类群。由基因组编码的蛋白质群就是这样一类群体。例如，利用这种筛选方案应该可能从基因组蛋白文库中分离出具有预定底物特异性的天然激酶。一种天然酶(以及编码它的基因)依据该酶的催化活性来分离，这类功能性的克隆方法应该适用于许多由天然酶类所催化的反应。
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18．(a)Cotton,F.A.,Hazen,E.E.,Jr.,& Legg,M.J.(1979)美国国家科学院院报76,2551-2555.(b)Tucker,P.W.,Hazen,E.E.,& Cotton,F.A.(1978)分子细胞生物化学22,67-77.(c)Sondek,J.& Shortle,D.(1990)蛋白质7,299-305.(d)Hale,S.P.,Poole,L.B.& Gerlt,JA.(1993)生物化学,32,7479-7487.(e)Hynes,T.R.& Fox,R.O.(1991)蛋白质10,92-105(f)Loll,P.J.,Quirk,S.,Lattman,E.E.& Gravito,R.M.,(1995)生物化学34,4316-4324.(g)Judice,K.,Gamble,T.R.,Murphy,E.C.,de Vos,A.M.&Schultz,P.G.(1993)科学261,1578-1581.
19．Ku,J.& Schultz,P.G.(1994)生物医学化学通讯(Biomed.Chem.Lett.)2,1413-1415.
20．Tucker,P.W.,Hazen,E.E.,Jr.& Cotton,F.A.(1979)分子细胞生物化学23,3-16.
实施例2：
一种具有糖苷酶活性的酶的优化
本实施例是图7所示筛选方案的一例。利用上述实施例1原理和技术人员的常识将具有糖苷酶活性的酶展示在丝状噬菌体表面。
底物是利用上述实施例1原理和技术人员的常识附着在丝状噬菌体表面的一种糖原接头底物。
此外，这些酶应用本领域已知常规技术通过糖原接头附着到柱上。
具有所期望催化活性的酶裂解两个糖之间的连接键，释放出附着了一个葡萄糖单位的噬菌体。然而，缓冲液中的糖原合酶将催化葡萄糖和UDP-葡萄糖的缩合，结果酶通过一糖原部分重新附着到柱上。催化效率最高的酶最快速流过柱子，可从流过柱子的第一级分收集。
实施例3：
包含本发明第一方面特征的独立单位的一个实例
下面描述底物如何附着于下述系统中的酶上：质粒-肽系统(Schatz等，1996，酶学方法，卷267，页171-191)，多核糖体-肽系统(Mattheakis等，1994，美国国家科学院院报，卷91，页9022-9026；He和Taussig,1977,核酸研究，卷25，页5132-5134)或者mRNA-肽系统(Roberts和Szostak，1997，美国国家科学院院报，卷94，页12297-12302)中。此处以mRNA-肽融合系统为例。
设计模板DNA以使mRNA-蛋白融合体的一部分mRNA成为另一种寡聚物(例如包括模板DNA上的序列5′-GCCGAAGCGCAATGAA GGGC-3′)的一个退火位点。使所需底物附着到与上述序列互补的一个DNA寡聚物(即3′-CGGCTTCGCGTTACTTCCCG-5′)上。然后在mRNA-肽融合体制备好以后，将其与底物偶联物混合，通过例如将该混合物上样于上述产物结合柱进行底物再加载筛选(见图9A)。
或者，可使连接mRNA和所编码肽的接头携带序列5′-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAACCCG-3′。然后混合底物-DNA偶联物(其中该DNA与接头中DNA互补)并进行上述底物再加载筛选(见图9B)。
实施例4
一种分泌型酶的活性的优化
本实施例是图8所示筛选方案的一例。该独立单位由细胞，附着于所述细胞表面的底物，和所述细胞产生和分泌的酶组成(图11)。底物通过一个接头附着于分泌酶的细胞表面。介质中的试剂不断地将产物(由所分泌的酶产生)转变成底物。因此，因分泌型酶的局部浓度在其分泌细胞所附底物附近远高于任何其它细胞所附底物附近，故分泌活性酶的细胞所附着的产物比分泌较低活性酶的细胞多。
底物能够以多种方式附着到细胞表面。例如，磷脂，脂肪酸，固醇或胆甾醇酯可以由目标反应的底物派生。当与细胞温育时，这些碳链轻易地定位到膜内，将底物暴露在细胞表面。或者，底物可以派生于那些与表面组分起反应的交联试剂。最后，底物可以连接到与诸如多糖或膜蛋白之类的膜成分结合的结构上(如蛋白质、抗体)。
用以下实例举例说明原理：独立单位由细胞(细菌或酵母)，所附着的底物(双链DNA带5′-突出端)，和所分泌的酶(连接酶；例如使能分泌的重组形式)组成。用限制酶(例如EcoRⅠ)作试剂。筛选在柱中进行。柱基质用带5′-突出端的双链DNA包被，该5′-突出端互补于细胞表面所暴露的突出端，而且在两个DNA片段的连接处创建一个EcoRⅠ限制位点。
DNA底物如下述附着于细胞。以含EcoRⅠ限制位点的DNA为模板，用两段引物(其中之一用N-羟基琥珀酰亚胺进行5′-衍生)进行PCR反应。大约50μg DNA产物经EcoRⅠ消化然后提纯，得到10-100个碱基对的一段双链DNA，其一端带有EcoRⅠ5′-突出端而另一端是N-羟基琥珀酰亚胺部分。该DNA与细胞混合，于指数生长期收获并重悬于适当的缓冲液中。这导致细胞表面的伯胺与该DNA的N-羟基琥珀酰亚胺部分反应。结果，该DNA共价地附着到细胞表面。
DNA柱制作如下。以含EcoRⅠ限制位点的DNA为模板，用生物素化和非-生物素化引物进行PCR反应。PCR产物经EcoRⅠ裂解，产生一个10-100个碱基对的片段。此片段与链抗生物素蛋白包被的Sepharose或Sephadex柱基质混合。
DNA包被的细胞与限制酶(EcoRⅠ)溶于适当缓冲液并上样到DNA柱，所述适当的缓冲液允许限制酶和连接酶两者都有活性(即包含ATP,pH 7-9)，以及允许连接酶的有效分泌。温度为24-37℃；流速保持在0.5mL/min以下。
分泌活性连接酶的细胞通过将细胞表面的互补DNA突出端与柱子连接而固定在柱上。连接后，EcoRⅠ就裂解DNA并因而从柱子基质上释放细胞。因此，分泌活性连接酶的细胞较缓慢地流过柱子；分泌强活性连接酶的细胞可能根本就没有流出柱子。因此，分泌最强活性连接酶的细胞从较后面的柱级分中分离，或者可以从柱子基质中洗脱，例如通过添加高浓度的DNase。
该原理通过对已知细胞克隆的模型库中能分泌最具活性的连接酶或能表达最多连接酶的细胞进行分离而测试。
筛选的严谨度受细胞和固体支持物表面DNA片段的密度，和缓冲液中限制酶的浓度控制。在指定pH、盐和温度条件下特性有所改善的连接酶变体可以利用这种方法评估。也可进行逆试验；利用连接酶和ATP作为再加载试剂，与上述相似的条件，和分泌限制酶的细胞，有可能对裂解新目标，或在不同条件下裂解的限制酶进行分离。
实施例5：以RNA连接酶、多聚核苷酸激酶和ATP为试剂在过量低活性RNase A肽变体背景下富集磁珠上的野生型RNaseA肽
为了在合成组合化学领域测试该底物再加载原理，我们设计了一个涉及RNase A肽的简单实验。如所述(Gutte等，1971，生物化学杂志，卷246，页1922-1941)合成2个C-末端生物素化的肽(肽1和肽2)。肽1携带野生型RNase A。肽2具有与肽1相同的序列，但引入了使此肽的核酸酶活性全部或部分地消除(如用丙氨酸取代两个活性位点组氨酸H12和H119的一个或两个)的突变。RNase A肽变体在失去保护并脱离合成支持物后重新折叠，如所述(Gutte等，1971，生物化学杂志，卷246，页1922-1941)。
一个5′-生物素化的DNA/RNA杂合子(20-30个核苷酸；3′端3-10个核苷酸是核糖核苷酸，其余的是脱氧核糖核苷酸(Oligos Etc.,Inc.))，与肽1或者肽2混合，这些肽和核酸通过其生物素部分被固定到链抗生物素蛋白所包被的直径约为10-100nm的磁珠上。这类磁珠可以通过将链抗生物素蛋白固定到N-羟基-琥珀酰亚胺活化的Latex磁珠(Polysciences Inc.)上制备。
一个3′-硫醇化的DNA/RNA杂合子(20-30个核苷酸，其5′端3-10个核苷酸是核糖核苷酸，其余的是脱氧核糖核苷酸)用5′-磷酸(Oligos Etc.,Inc.)合成。硫醇化的DNA/RNA杂合子被偶联到携带活化二硫键的柱基质上(例如活化成二硫化吡啶(pyridyl-disulfide))。
现在按下述进行底物再加载实验(见图10)。携带DNA/RNA杂合子的磁珠分别与肽1或肽2混合在一种缓冲液中，该缓冲液的RNase A、RNA连接酶和多聚核苷酸激酶是有活性的(因此，该缓冲液应包括MgCl2和ATP)。在37℃将该混合物与RNA连接酶(New England Biolabs)和T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)一起上样到前述DNA/RNA-偶联的柱子上。柱子用数倍于柱床体积的同样的缓冲液洗涤，收集各级分。肽1磁珠(携带着野生型RNase A)在穿过柱子的过程中通过连接作用被固定到柱基质上，该连接作用是使附着于肽1磁珠的DNA/RNA 3′-羟基和附着于柱基质的DNA/RNA 5′-磷酸通过RNA连接酶连接。由于肽1可催化RNA，它将裂解RNA并因此释放自身，以继续它在柱子中的迁移。RNase A的裂解反应给肽1磁珠的DNA/RNA杂合子留下一个3′-磷酸，给偶联到柱子上的DNA/RNA留下一个5′-羟基。多聚核苷酸激酶催化5′-羟基和3′-磷酸分别转化成3′-羟基和5′-磷酸(Uhlenbeck,1997，化学评论(Chem.Rev.)，卷97，页371-390)。肽1磁珠和柱子上的DNA/RNA杂合子现在可进行另一个连接反应，该反应又将肽1磁珠固定到柱子基质上。应该注意的是多次转换的筛选不需要多聚核苷酸激酶，因为每个肽1磁珠都携带许多DNA/RNA杂合子。还有，注意RNA连接酶可连接DNA也可连接RNA。
肽2磁珠携带突变RNase，并将因此花费更多时间固定到柱子上。因而，经过许多轮转换后由于各自不同的催化活性，肽1磁珠将与肽2磁珠分隔开。携带着更具活性的RNase A变体的磁珠能够因此在柱子底部首先被收集，
筛选严谨度受控于固定到磁珠上的肽和DNA/RNA杂合子数量，和缓冲液中RNA连接酶、多聚核苷酸激酶和ATP的浓度。
使用非天然氨基酸用上述底物再加载筛选方案可以测定RNase A的催化机理，并有可能发现新的RNase A改良变体(Jackson等，1994，科学，卷266，页243-247)。或者，可在完全随机选择的肽文库中搜索新的催化剂。分离磁珠上具有催化活性的肽可通过如Edman降解或者质谱分析法鉴定。
实施例6：用底物直接再加载中所用的限制酶分离噬菌体上展示的活性DNA多聚酶变体
本实施例是图2所示筛选方案的一例。一种DNA引物被附着到展示DNA多聚酶的丝状噬菌体上(见图12)。使偶联DNA的噬菌体过柱，此柱子包被有一种与引物互补的DNA片段。保持过柱条件中的盐、pH和温度使两种互补链暂时地结合以形成一种DNA二倍体。该二倍体可以在结合之后迅速分开；或者，相应噬菌体上的多聚酶可以使引物延长，产生一种更稳定的复合物。后一种反应将噬菌体有效地固定到基质上。柱子缓冲液还包含一种限制酶；此限制酶的识别位点已经过挑选因而限制酶的裂解使噬菌体所附着引物的原有3′-末端再生。因此，通过该限制酶的裂解导致底物再加载。
展示大肠杆菌DNA多聚酶Ⅰ的Klenow或Stoffel片段的噬菌体颗粒按(Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)或(Pedersen等，1998，美国国家科学院院报，卷95，页10523-10528)所述制备。后一种方法涉及以酸性辅助噬菌体挽救大肠杆菌细胞，所指大肠杆菌细胞包含编码DNA多聚酶的噬菌粒。
具有序列5′-Nx-CCG-3′的一种10-80个核苷酸的DNA寡聚物(“引物”)(当使用EcoRⅠ进行筛选操作时，见下面)，通过其5′-端，按(Jestin等，1999，Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)或(Pedersen等，1998，美国国家科学院院报，卷95，页10523-10528)所述附着到噬菌体上。
具有序列3′-Ny-GGCTTAAG-Nz-5′的一种20-80个核苷酸的DNA寡聚物(“模板”)(当使用EcoRⅠ进行筛选操作时)被固定到柱子基质上。例如，该寡聚物可以在5′-端被生物素化，然后固定到链抗生物素蛋白-包被的4％琼脂糖(Sigma)，或者通过其它标准方法固定。设计“引物”与“模板”寡聚物的互补区域的长度和组成，以便在所述筛选试验的条件下获得一种引物与模板的暂时性(不稳定)二倍体(见下面)。
将附着了引物寡聚物的噬菌体(见上面)溶于适当缓冲液，并上样DNA柱，该缓冲液包括一种限制酶(EcoRⅠ),dNTPs,10-50mM NaCl,Ph7.5-9，温度25-40℃(见Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)。噬菌体通过形成引物-模板二倍体暂时固定在柱子上；假如所测试的噬菌体展示一种活性的多聚酶，那么该引物可以延伸，使复合物稳定。假如引物的延伸超过5个核苷酸，那么将创建出EcoRⅠ位点；缓冲液中的EcoRⅠ将在此位点裂解，导致噬菌体所附着“引物”的原3′-端的再生和该二倍体的不稳定。该二倍体可因此分开，而且引物退火到柱子基质所附着的另一个模板。这就构成了底物的再加载。
展示更有效的多聚酶的噬菌体将较慢速通过柱子。因此，展示更有效的多聚酶的噬菌体被收集在后面的那些柱子级分中。
此方案可以用于多聚酶变体的分离，该变体以修饰过的核苷酸作为底物，或者以携带非天然核苷酸或修饰过的核苷酸的模板作为模板。或者，此方案可以利用展示限制酶的噬菌体，和多聚酶作为缓冲液中再加载试剂。这就可能允许发掘具有新的特异性的限制酶。
实施例7：用底物直接再加载中所用的限制酶分离噬菌体上展示的活性DNA多聚酶变体。本实施例通过电泳分离所述更有效的多聚酶。
本实施例中一种DNA引物被附着到展示DNA多聚酶的丝状噬菌体上。使偶联DNA的噬菌体与单链DNA长分子(其包含一个与引物互补的区域)混合然后上样至电泳凝胶。设计该互补区域的长度和组成以使两个互补链在电泳条件下形成暂时的DNA二倍体复合物(见图13)。该二倍体可能在形成后迅速分开；或者，展示在相应噬菌体上的多聚酶可能将引物延伸，产生一种更稳定的复合物。后一种反应将使DNA片段有效地附着到噬菌体上，因而影响其在电场中的迁移率。电泳缓冲液还包含一种高浓度的限制酶；该限制酶的识别位点选定在一个位置以便通过该限制酶的裂解使噬菌体所附着引物的原有3′-端再生，并使复合物不稳定。因此，该限制酶的裂解导致底物再加载。
展示大肠杆菌的DNA多聚酶Ⅰ的Klenow或Stoffel片段的噬菌体颗粒按(Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)或(Pedersen等，1998，美国国家科学院院报，卷95，页10523-10528)所述制备。后一种方法涉及以酸性辅助噬菌体挽救大肠杆菌细胞，所指大肠杆菌细胞包含编码DNA多聚酶的噬菌粒。
具有序列5′-Nx-CCG-3′的一种10-80个核苷酸的DNA寡聚物(“引物”)(当使用EcoRⅠ进行筛选操作时，见下面)，通过其5′-端附着到噬菌体上，参照(Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)或(Pedersen等，1998，美国国家科学院院报，卷95，页10523-10528)所述。
具有序列3′-Ny-GGCTTAAG-Nx-5′的一种100-1000个核苷酸的单链DNA(当使用EcoRⅠ作为限制酶时)按照标准方法被制备。例如，可以利有用正向引物(5′-生物素-N-CCGAATTC-N-3′)和反向引物进行PCR反应，模板上具有相隔100-1000个碱基对的两种引物的退火位点。生成的PCR产物被固定到链抗生物素蛋白磁珠上，非-生物素化的链在高pH下被洗脱。所洗脱的链具有3′-N-GGCTTAAG-N-5′序列，长度为100-1000个核苷酸。
设计“引物”与“模板”寡聚物的互补区域(Nx和Ny)的长度和组成，以便在所述筛选条件下获得一种引物与模板的暂时的(不稳定的)二倍体(见下面)。
将附着了引物寡聚物的噬菌体(见上面)溶于适当缓冲液，并上样至电泳凝胶，该缓冲液包括一种限制酶(EcoRⅠ),dNTPs,10-50mM NaCl,pH6-9，温度25-40℃(见Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127)，和上述100-1000个核苷酸的单链DNA。该100-1000个核苷酸DNA分子的浓度在凝胶中可以是0.1-10μM，在缓冲液中是0.01-1μM。噬菌体将暂时形成引物-模板二倍体；假如所测试的噬菌体展示一种活性的多聚酶，那么该引物可以延伸，使复合物稳定。假如引物的延伸超过5个核苷酸，那么将创建出EcoRⅠ位点；缓冲液中的EcoRⅠ将在此位点裂解，导致噬菌体所附着“引物”的原3′-端的再生，和该二倍体的不稳定。该二倍体可因此分开，而且引物退火到另一个模板。这就构成了底物再加载。
展示一种有效多聚酶的噬菌体将更有效地形成稳定的二倍体，并因此(由于DNA片段所添加的电荷和质量)迁移有别于展示无效的多聚酶的噬菌体。此原理用多聚酶变体的小型模板库测试。
此方案可以用于多聚酶变体的分离，该变体以修饰过的核苷酸作为底物，或者以携带非天然核苷酸，或修饰过的核苷酸的模板作为模板。在逆设计中，此方案可以利用展示限制酶的噬菌体和多聚酶作为缓冲液中再加载的试剂进行。这就可能允许发掘具有新的特异性的限制酶。
实施例8：一种具有连接酶活性的脱氧-核酶的优化
本实施例中，一种具有RNA-连接活性的基于脱氧-核糖核苷酸的催化剂通过RNase和多聚核苷酸激酶再加载的底物被优化。
按照标准方法制备和折叠由脱氧-核酶的几种变体组成的模板库。然后，由5′-端为20-40个脱氧-核糖核苷酸和3′-端为一个核糖核苷酸组成的DNA/RNA杂合子，通过其DNA部分退火到所指脱氧-核酶上(所设计的DNA/RNA杂合子具有互补于脱氧-核酶上一个扩增-引物退火位点的序列；二倍体的形成因此应该不干扰所指脱氧-核酶的活性)见图14。
脱氧-核酶-寡聚核苷酸复合物上样到附着了一种20-40个核苷酸的DNA/RNA杂合子的柱子上，该杂合子的5′-端核苷酸是一个核糖核苷酸，其余为脱氧-核糖核苷酸。该杂合子以3′-端附着到柱子上。柱缓冲液包含RNase，多聚核苷酸激酶，ATP,pH6-9的缓冲液，MgCl2，外加其它成分，这些成分为连接酶、RNase和多聚核苷酸激酶的活性以及有效退火所必需。温度保持在20-40℃，缓冲液流速低于0.5mL/min。
活性连接酶通过DNA/RNA杂合子3′-和5′-端的连接被固定到柱子上。RNase将裂解所形成的二-核糖核苷酸；此反应产生3′-磷酸和5′-羟基。多聚核苷酸激酶除去3′-磷酸并引入5′-磷酸。这就是底物再加载步骤，而且DNA/RNA杂合子现在能够被脱氧-核酶再次连接在一起。收集物中更有效的连接酶能够从后面的级分收集到。这类筛选使得改进核酶的活性成为可能，这些酶的活性一般相当弱，通常约1/分钟。
实施例9：展示His-标记的蛋白质的噬菌体的预富集
有些蛋白质难以展示在丝状噬菌体上。尤其，大分子蛋白质或者对大肠杆菌有毒或有生长抑制效果的蛋白质常展示效率较低，即所产生的噬菌体颗粒表面多数不携带pⅢ-融合体。已报道展示融合蛋白的噬菌体其展示效率低至1/1000(Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.，卷38，页1124-1127；Demartis等，1999,JMB，卷286，页617-633)。这类情况下，得到较高的非特异背景，因为携带编码pⅢ融合体之DNA，却不在其表面展示该融合体噬菌体颗粒过量。为防止此类潜在问题出现，我们在pⅢ包膜蛋白与酶之间插入了一种组氨酸标记，此标记使展示His-标记蛋白的噬菌体通过Ni-NTA柱层析纯化。其它可以通过类似方式予以使用的组氨酸标记见下述，包括intein-几丁质结合域融合体(Chong等，1997，基因，卷192，页271-281)、FLAG肽(Slootstra等，1997，分子多样性(Molecular Diversisity)，卷2，页156-164)、以及麦芽糖结合蛋白(Pryor和Leiting,1997，蛋白质表达与纯化，卷10，页309-319)。
展示脂肪酶-His6-pⅢ或纤维素酶-His6-pⅢ融合蛋白的噬菌体的Ni-NTA柱纯化
Ni-NTA旋转柱(Qiagen Spin Kit)用600μL“50mM磷酸钠缓冲液pH8,300mM NaCl,1mM咪唑，0.05％BSA”(700G离心2分钟)平衡。400μL噬菌体样品(大约1012个噬菌体颗粒)加入100μL“250mM磷酸钠缓冲液pH8,1.5M NaCl,0.25％BSA”和4μL 100mM咪唑，此溶液上样到预平衡过的柱子中，200G离心4分钟。柱子用600μL“50mM磷酸钠缓冲液pH8,300mM NaCl,20mM咪唑，0.05％BSA”洗涤2遍(分别用200G离心4分钟和700G离心2分钟)。然后用3x333μL“50mM磷酸钠缓冲液pH8,300mM NaCl,250mM咪唑，0.05％BSA”(700G,2分钟)洗脱这些噬菌体，所得999μL洗脱液经过PEG沉淀并重新悬浮于400μL“50mM磷酸钠缓冲液pH 8,300mM NaCl,1mM咪唑，0.05％BSA”。该溶液上样到一个新的旋转柱，重复上述步骤，但将最后的PEG沉淀物溶解在50μL TE缓冲液pH8。这种方法将展示His-标记蛋白的噬菌体富集大约500倍。

Claims (27)

1．一种从催化剂分子库体外筛选感兴趣的催化剂分子的方法，该催化剂分子与所述库中其他催化剂分子比较具有相对更有效的所需特异性催化活性并且其中所述体外筛选的方法特征在于，其在目的催化剂分子被最终收集以前允许多次催化活性转换(即，底物到产物的催化活性转换)，并且其中所述方法包括以下步骤，
(ⅰ)放置含数个独立单位的样品，所述样品包括以独立单位形式提供的催化剂分子库，所述独立单位包含具有以下通式的第一类独立单位：
C-S，
其中C表示催化剂分子，而S表示能所述催化剂分子库中至少一种催化剂催化成产物的底物，并且因此能获得含有以下通式的第二类独立单位：
C-P，
其中C如上定义，而P第一类独立单位的底物S经催化而转化来的产物分子；并且
(a)该底物S以一种可使所述独立单位内催化剂与底物之间发生催化反应的构像附着于催化剂上；并且
(b)该底物与催化剂的附着特性使得可利用该产物的特点分离一种实体，该实体包含对能催化底物分子到产物分子之反应的催化剂分子进行明确鉴定所需的信息；
前提是，目的催化剂分子表现其所需催化活性，且所述方法特征在于所述样品还处于使目的催化剂产生的产物与将其转换回底物S的一种或者多种试剂接触的条件下；
(ⅱ)通过筛选一或多个含该产物分子的独立单位而筛选目的催化剂；并且
(ⅲ)利用该产物的特点分离一种实体，该实体包含对能多次催化底物到产物之反应的目的催化剂分子进行明确鉴定所需的信息；和任选地
(ⅳ)利用包含在步骤(ⅲ)所述实体中的信息重复步骤(ⅰ)～(ⅲ)一次或多次，以产生目的催化剂分子，并构建含该目的催化剂分子的独立单位，然后用该独立单位作为所述重复步骤的起始物。
2．权利要求1的方法，其中权利要求1步骤(ⅰ)的独立单位是一个生物学上可扩增的独立单位。
3．权利要求1的方法，其中权利要求1步骤(ⅰ)的独立单位是一个生物学上可扩增的独立单位，并且所述底物和所述催化剂分子都附着于所述生物学可扩增之独立单位的表面。
4．在先权利要求之任一的方法，其中步骤(ⅰ)所述独立单位包括以下结构：催化剂分子-柔性接头-底物。
5．在先权利要求之任一的方法，其中权利要求1步骤(ⅰ)所述独立单位包括以下结构：催化剂分子-载体系统-底物，或更优选以下结构：催化剂分子-载体系统-柔性接头-底物。
6．权利要求2和4的方法，其中权利要求2所述生物学可扩增之独立单位中含有的权利要求4所述载体系统是一种噬菌体。
7．权利要求4的方法，其中所述的载体系统是珠子颗粒。
8．权利要求1至7中任一项的方法，其中所述催化剂分子库是天然或非天然肽或多肽的库，优选酶库。
9．权利要求8的方法，其中所述库是包括各具多种不同酶活性的多肽的库。
10．权利要求8的方法，其中所述库是包括衍生自一或多种多肽前体的多肽变体的库，其中所述多肽前体显示密切相关的酶活性。
11．权利要求8至10中任一项的方法，其中所述库是包括混合的/重组的/掺杂的多肽的库。
12．权利要求1至7的方法，其中所述催化剂分子库是天然或非天然核酸的库。
13．权利要求12的方法，其中所述库是包括具有许多不同催化活性的核酸的库。
14．权利要求12的方法，其中所述库是包括衍生自一或多种核酸前体的核酸变体的库，其中所述核酸前体显示密切相关的催化活性。
15．权利要求12至14中任一项的方法，其中所述核酸库是包括混合的/重组的/掺杂的核酸的库。
16．权利要求1至7中任一项的方法，其中所述催化剂分子库是包括天然多聚体分子，或非天然多聚体分子，或有机小分子，或无机小分子或所述分子的混合物的库。
17．权利要求16的方法，其中所述库由组合化学方法制备。
18．在先权利要求之任一的方法，其中催化剂分子和能被催化成(权利要求1步骤(ⅰ)之)产物的底物是不同的化学物质。
19．权利要求1的体外筛选法，其中目的催化剂分子是已偶联亲和标记的酶或蛋白质，且其中可在权利要求1步骤(ⅰ)之前实施一可选步骤，该可选步骤包括通过纯化而浓缩展示(全长)酶或蛋白质的独立单位，纯化时展示酶或蛋白质的单位利用亲和标记分离。
20．权利要求19的体外筛选法，其中展示(全长)酶或蛋白质的独立单位通过抗-亲和-标记抗体柱纯化，其中展示标记酶或蛋白质的单位利用标记分离。
21．权利要求19的体外筛选法，其中亲和标记包括偶联到目的酶或蛋白质C-末端的6个组氨酸残基，而展示(全长)酶或蛋白质的独立单位在Ni-NTA柱或抗-组氨酸抗体柱上纯化，其中展示标记酶或蛋白质的单位利用标记分离。
22．在先权利要求中任一项的体外筛选法，其中对权利要求1步骤(ⅱ)中目的催化剂分子的筛选，是通过所述产物分子的特异性固定实施。
23．在先权利要求中任一项的体外筛选法，其中对权利要求1步骤(ⅱ)中目的催化剂分子的筛选按下述方案进行，
(ⅰ)构建一个系统，其中权利要求1步骤(ⅰ)中含底物分子和催化剂分子的独立单位基本上每个都结合至基质，并且当底物转换成产物时该单位从所述基质上释放；并且
(ⅱ)筛选从所述基质上释放的单位。
24．在先权利要求中任一项的体外筛选法，其中对权利要求1步骤(ⅱ)中目的催化剂分子的筛选按下述方案进行，
(a)构建一个产物-柱，其中将特异性结合产物的受体沿产物-柱的基质安放；并且
(b)在产物柱一端加入独立单位之样品，并通过分离最后到达柱子另一端的独立单位而筛选目的催化剂分子。
25．权利要求1的体外筛选法，其中对包含能明确鉴定(权利要求1步骤(ⅲ)之)目的催化剂分子所需信息的实体的分离通过物理或化学方法实施。
26．权利要求25的体外筛选法，其中物理方法指电泳。
27．一种产生目的催化剂分子的方法，其包括实施权利要求1至18之任一项的体外筛选方法，并包括以下步骤，
(a)通过适当的生产方法产生适当量的所述分离之目的催化剂分子。
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