CN1308230A - 高分辨阿达玛变换显微图像分析仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种每幅图像由26万像素组成的新型高分辨、高灵敏度阿达玛变换显微图像分析仪。它含有511单元阿达玛模板和高灵敏度线阵CCD检测器,采用阿达玛变换空间多通道成像技术与显微技术相结合,可提供微小物体的图像形貌和图像定量分析结果,用于显微荧光光谱图像和显微透射光光谱图像分析,为细胞分子生物学和其他学科领域建立一种快速、灵敏、准确、适用的显微光谱图像定量分析新技术。本发明比常规图像分析仪测量精度高16倍,灵敏度比0.02Lux流明/米2(Lux)的电荷耦合器件(CCD)摄像机高,特别适用于微弱光信号检测。测量单细胞形貌及细胞荧光强度,分析结果重现性好,单次测量结果相对标准偏差,即变动系数(RSD)小于10%。
Description
本发明涉及一种高分辨率阿达玛变换显微图像分析仪,它是将511编码阿达玛变换多通道空间成像技术与显微技术相结合,以线阵CCD作为探测器,测量显微镜下,微小物体的显微荧光和显微透射光的光谱图像新仪器,是一种新型的高灵敏度、高信噪比,特别适用于对微弱显微光谱图像分析的测量仪器。它属于医学检测仪器技术领域、属于分析测试技术领域,也属于生物化学技术领域,是光调制技术、仪器制造、计算机及现代仪器分析等多种技术结合的产物。
阿达玛变换(Hadamard Transform)光谱是近三十年发展起来的一种类似于傅立叶变换(Fourier Transform)光谱的光调制技术。在测量微弱信号时,具有高信噪比、多通道成像和能量分布的优点[M.O.Harwit,N.J.A.Sloane,″Hadamard Transform Optics″,Academic:New York,1980]。阿达玛变换成像技术是国际上前沿研究课题之一。
显微技术在细胞生物学和临床医学领域中是一种最重要、最基本的技术。目前,建立在显微技术基础上,用于细胞或其他微小物体定性或定量分析的仪器有显微分光光度计、显微荧光光度计及各种显微图像分析仪。前两种仪器常被用于对细胞或其他微小物体进行定量分析,而后一类仪器则常常用于细胞或微小物体的图像形貌分析。但这些仪器对微弱光信号不灵敏,而且在定量分析速度、分析精度等方面均存在着不足之处。另外,显微分光光度计、流式细胞仪等仪器还难以同时提供分析试样的显微图像和定量分析结果。
国外曾研究过阿达玛变换编码显微拉曼成像[P.J.Treado,A.Govil,M.D.Morris,K.D.Sternitxke and R.L.Mccreery,Appl.Spectrosc.,44:1270,1990],但由于存在重现性差、装置庞大复杂等问题而停止了进一步的研究工作。迄今为止,有关阿达玛变换显微荧光光谱图像和显微透射光光谱图像技术融合为一体的仪器仅在发明人前期的发明专利[专利号:ZL94 1 07751.9;国际专利主分类号:G01N21/31,授权1998.7]有报导。ZL94 1 07751.9专利,公开了一种多功能阿达玛变换显微图像仪,由光源,荧光显微镜、图像压缩成像,阿达玛变换调制模板、单色仪、光电倍增管检测器以及计算机组成,该专利采用15×17二维模板、光电倍增管单点探测,分辨率低,每幅图像由255个像素组成。
本发明的目的是利用高分辨率阿达玛变换光调制技术,提供一种用于微弱显微视场特征光谱图像分析的高分辨率阿达玛变换显微图像分析仪器,为细胞分子生物学和其他学科领域建立一种快速、灵敏、准确、适用的显微光谱图像定量分析新技术。
为实现上述的目发明所采取的技术方案为:一种高分辨率阿达玛变换显微图像分析仪,包括光源、荧光显微镜、具有图像压缩成像、阿达玛变换调制以及准直、分色合为一体的光学系统部件、光电转换器以及计算机,阿达玛变换调制系采用阿达玛变换511一维编码模板;模板包含有采样/保持放大器、光电转换器为包含有16位数模转换在内的线阵CCD。
上述荧光显微镜上还可配置彩色面阵电荷耦合器件CCD、图像处理接口板,即帧存储器。
上述阿达玛变换光学系统部件由全反射三棱镜P,压缩成像透镜组L1、M1、阿达玛变换模板I及光阑、准直透镜组L2、分色光栅G、反射镜M2、柱面透镜L3构成,光压缩成像透镜组L1、M1使试样成像于模板I上,由L2复合透镜对模板I调制的光信号准直,光栅G分色,经L3柱面透镜压缩会聚进入狭缝S,由线阵CCD对阿达玛变换光谱图像完成采集工作。
本发明采用511一维编码模板,利用512个光敏单元(线阵CCD)同时进行检测,每幅图像由261632个像素组成,图像的分辨率高(比94 107751.9专利提高一千余倍),能快速、灵敏、准确地进行显微光谱图像定量分析。
与已有技术相比,本发明已达到的技术效果:
国内外目前采集光谱曲线常用线阵CCD、采集图像常用面阵CCD,发明人ZL 94 1 07751.9专利以单个检测器(光电倍增管)与15×17二维编码模板结合采集图像,获得每幅由255个像素组成的低分辨率图像。若仍然以一只光电倍增管与511×512二维编码模板结合采集图像信息,可获得每幅由26万余个像素组成的高分辨图像。但实际上这种编码模板在XY轴方向交错运动的调制精度、测量速度等方面,现有技术都难以实现。
本发明采用可作为多探头同时检测的线阵CCD与一维511编码模板结合,只需要在一个方向(X或Y轴)直线运动,利用512个光敏检测器(线阵CCD)进行并行检测,这样就可以解决机械调制精度和加快测量速度等问题了。采集的图像由261632个像素/幅组成,其分辨率比ZL 94 1 07751.9专利技术提高一千余倍。小型化的设计,使得本发明在整机体积和重量方面,减小20余倍和减轻20余倍。
本发明采用高稳定度连续光作激发光源,荧光寿命对测量没有影响;由于计算机运算速度早已超过3亿次/秒(>300M),采用模板直线运动快速采样,可避免大多数体系荧光缓慢衰减所引起的测量误差。至于那些对光特别敏感、易引起荧光衰减的体系,如某些生物试样,采用测量荧光强度随时间以线性关系减弱的荧光衰减曲线,利用计算机进行同步校正,可以很好地解决那些对光特别敏感的荧光体系因荧光衰减所引起的测量误差,进一步提高了仪器的信噪比和定量分析精度,从而在国际上首次实现了采集微小试样的高分辨阿达玛变换微弱荧光图像以及透射光图像。由于这种多通道检测方法,能同时检测光谱图像信号及背景信号的强度,因而能从光谱图像信号中同步扣除背景信号,使本方法在分析速度和分析准确度方面,明显优于常规显微光度分析和显微荧光分析方法,测光强测量精度比常用图像分析仪高16倍(其分度,图像分析仪为256单位,本仪器为4096单位),灵敏度比0.02流明/米2(Lux)的电荷耦合器件(CCD)摄像机高,特别适于微弱光信号检测。对单个细胞的荧光强度图像的分析结果重现性好,单次测量结果的相对标准偏差,即变动系数RSD低于10%。
另外,与现有显微图像分析系统结构相同,在荧光显微镜的垂直方向上、套接照相机的位置装有摄像系统,即由彩色电荷耦合器件CCD、图像处理接口板(帧存储器)、计算机及相应图像处理软件组成显微图像分析系统。将全反射镜P移出光路,彩色电荷耦合器件(CCD)处于显微镜的垂直光路,能直接摄取微小物体的图像,以观察试样的彩色形貌。通过图像处理接口板(帧存储器)储存,并用相应软件对该图像进行处理,提取试样直观的图像信息,起着显微图像分析仪的作用。也可以通过电荷耦合器件(CCD)摄像机直接摄取X光片、照片或其他物体,从而使该仪器还具备常规图像分析仪的功能,进一步拓宽了仪器的功能和使用范围,构成一种多种功能的图像分析仪。从测量灵敏度和定量分析精度方面比较,彩色CCD系统远不及单色的阿达玛变换显微图像分析仪的性能。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
图1是本发明的结构示意图。
图2是本发明部件之间电学连接框图。
图1中,显微镜主体包括卤钨灯、透镜、聚光器构成显微镜的透射光照明系统;激发光源(高压汞灯、氙灯),及其显微镜内部的双色分束镜,全反射镜构成显微镜落射式光照明系统。视场图像经显微物镜进入阿达玛变换光学系统:P-光束转向三棱镜,L1-会聚透镜组,M1-转向全反镜,I-阿达玛变换模板,L2-准直透镜组,G-光栅,M2-转向全反镜,L3-柱面透镜,S-狭缝,由线阵电荷耦合器件C1探测。L-是彩色图像分析光学系统中的面阵C2的成像透镜,C1-线阵CCD,C2-面阵CCD,W-物镜,Z-载物台,J-聚光镜,D1、D2-电机,H-汞灯,X-卤钨灯。
图2包括如下功能电路:即由计算机1的指令通过步进电机控制器2控制模板位移电机3使阿达玛变换模板I作线性运动;计算机1通过步进电机控制器4控制光栅转动电机5使光栅G作旋转运动。由计算机1指令通过线阵CCD控制器6控制线阵C1采样;由计算机1通过面阵CCD帧存储器8控制面阵C2采样。
参见图1、图2,本发明由光源,荧光显微镜,包含有图像压缩成像、阿达玛变换调制以及准直、分色合为一体的专用光学系统,包含有采样/保持放大器、16位(bit)数模转换在内的线阵CCD探测系统,以及计算机组成,这是阿达玛变换显微图像分析仪的主体。另装有彩色面阵CCD探测器用于采集显微彩色图像。
不同部件的合理搭配,可进行阿达玛变换显微荧光和显微透射光光谱图像分析以及显微光谱分析,可开展常规彩色图像分析,使得该仪器构成一种含有多种功能的图像分析仪。
本发明的技术特征是将阿达玛变换空间多通道成像技术与显微荧光技术联用,采用511阿达玛变换序列、以掩膜刻蚀法、光刻制作的小型模板作为光学调制元件,通过计算机自动控制,对显微视场图像(光信号)进行阿达玛变换(调制)。经过调制的图像(光信号)经准直、分色选取其特征光谱,即待测试样组份的特征光谱。用线阵CCD探测检测,所获得的一组阿达玛变换电信号经数字化、解调即还原成显微视场特征光谱图像(试样中待测组份图像),精确提供显微镜下观察到的与微小物体有关的定性及定量信息,通过计算机对图像处理和统计还可得到被观察物体的更多信息。
由显微镜部件卤钨灯及聚光器等构成显微镜的透射光照明系统,由显微镜部件激发光源(高压汞灯、氙灯)、双色分束镜M、同时起着聚光器的物镜等构成显微镜的落射式照明系统。显微镜载物台上的细胞或其他微小物体在连续光的照射下(激发光或透射光)产生光信号(荧光或透射光信号),所产生的光信号由显微物镜收集。
阿达玛变换光学系统部件由全反射三棱镜P,压缩成像透镜组L1、M1、L2,阿达玛变换模板I及光阑,准直透镜组L2,分色光栅G,反射镜M2,柱面透镜L3构成。光压缩成像透镜组L1、M1使试样成像于模板I上,由L2复合透镜对模板I调制的光信号准直,光栅G分色,经L3柱面透镜压缩会聚进入狭缝S,由线阵CCD对阿达玛变换光谱图像完成采集工作。在光学系统部件的全反射三棱镜P下面机壳上,使用的是照相机镜头用C-Mount标准接插口,与显微镜的连接可通过标准接插口,如同更换照相机镜头一样可随意撤卸接插。
在荧光显微镜上臂标准接口处套接阿达玛变换光学系统部件,由全反射三棱镜P的位置“在”或“不在”显微镜中心光束,选择确定水平光路系统或垂直光路系统。把全反射三棱镜插入光路,光线即折转90度进入水平光路系统;把全反射镜移出光路,光线垂直向上,利用成像透镜L将视场图像聚焦于彩色电荷耦合器件(CCD)焦平面,对彩色图像完成采集工作。
采用光刻技术制作光学元件阿达玛变换模板I及光阑,即以石英或光学玻璃为基片镀金属膜,按M序列构造的S矩阵,以多层掩模刻蚀法光刻加工成511缝单元阿达玛变换循环模板,形成一系列明暗的条形码,每单元缝宽为12.5μm。其中光阑固定不动,模板根据计算机软件指令移动,对光信号进行空间调制。
阿达玛变换模板固定在机械传动装置上,该装置采用步进电机,通过涡轮将电机的转动变成线性平动,达到移动模板位移的。两只步进电机,其一用于控制模板精确移位,另一用于控制光栅光谱扫描,按照计算机软件指令完成采样全过程。
对于显微视场图像的特征光谱曲线(试样中待测组份的特征光谱)的测量,通过计算机软件控制步进电机,旋转光栅G进行光谱扫描,实时采集光谱波长与强度相关信息,通过得到的图像(试样)光谱曲线确定欲选择的图像(试样)中待测组份的特征光谱,即阿达玛变换显微图像的特征光谱。
显微镜取垂直光路,由彩色电荷耦合器件(CCD)、图像处理接口板(桢存储器)、计算机及相应图像处理软件,承担彩色显微图像分析的工作,完成常规图像分析仪的功能。
将以上部件按附图组装,即可组成多功能阿达玛变换显微图像分析仪,对显微荧光及显微透射光进行图像定量分析。
实施例1,阿达玛变换显微光谱图像分析仪。
见图1、图2。分析试样置于重庆光学仪器厂生产的研究型落射式荧光显微镜载物台上,分析试样的图像信号(透射光或荧光)由显微物镜收集,将荧光显微镜上的阿达玛变换光学系统部件全反射镜P推至光路,视场图像即折转90度,进入由会聚透镜组L1、反射镜M1、阿达玛变换模板I和光阑、准直透镜组L2、光栅G、反射镜M1、柱面透镜L3、通过狭缝S,即如图所示的阿达玛变换显微光谱图像分析仪。其中透镜组L1将显微视场像压缩,经反射镜M1清晰成像于阿达玛变换模板I平面上,固定不动的阿达玛变换光阑用来限制图像空间调制范围,移动阿达玛变换模板I即可对图像信号进行空间调制。调制的图像信号,经准直、分光、柱面透镜会聚,进入狭缝,由日本东芝TCD1208UD型或日本滨松S3904型等线阵CCD探测,完成一个完整的采样过程。对于显微视场图像特征光谱的选择,可用计算机自动控制光栅G进行光谱扫描得到光谱曲线,通过光谱曲线来确定显微视场图像的特征光谱。数字化的调制信号经快速阿达玛变换解调,还原成阿达玛变换显微光谱图像(即试样中的待测组份图像),该特征光谱图像包含两个空间维和一个光谱强度维,用自编软件对该图像进行处理以获取所需的定性定量信息。
图3为使用40×物镜时,所获得的两个玉帘花粉细胞的阿达玛变换显微光谱图像,花粉未用任何荧光探针试剂染色,由于其细胞壁含荧光物质,因此在强激发光(蓝紫光)照射下可发出较明亮的荧光(530nm)。图3(a)为其自发荧光图像,图3(b)为在相同波长下获取的透射光图像。两附图均清晰可见花粉细胞壁,其图像的清晰度(信噪比)是令人满意的。图像中的每一像素代表的实际空间尺寸(即空间分辨率)取决于物镜的放大倍率和成像效果,测量与计算结果表明,使用40×物镜时,空间分辨率可达0.6μm/pixel。
实施例2:人乳腺癌细胞荧光图像及细胞核形貌和DNA含量定量分析。
取乳腺肿瘤穿刺液直接涂片,以正常人外周静脉血淋巴细胞或乳腺肿瘤标本中的正常上皮细胞为标准二倍体细胞,以吖啶橙(AO,50μg/mL,含1%Triton X-100)为细胞DNA荧光探针,用阿达玛变换显微光谱图像分析仪测定人乳腺肿瘤细胞的DNA含量(倍性),每个患者最少分析20个肿瘤部位细胞,每个细胞测两个定量数据:细胞核DNA含量(用任意单位为单位)和形貌(测量面积,用像素为单位)。测量数据说明,阿达玛变换光谱图像能正确反映细胞的基本荧光分布,得到定量的荧光强度及分布信息。与标准细胞比较,可明显发现细胞核DNA倍性和面积与正常细胞之间的差别,可鉴别出正常细胞、病变细胞及癌变细胞。测量数据直方图,直观地为临床医学诊断提供肿瘤的性质、癌变的恶性程度等方面极有用的信息。
实施例3:对细胞周期非特异性药物进行抗癌药物初步筛选。
以人外周静脉血淋巴细胞或鼠肝细胞为材料,用荧光探针AO(吖啶橙)示踪判断药物能否进入细胞核及其与核DNA的结合能力,提出一种以细胞核DNA为靶点的细胞周期非特异性药物进行抗癌药物初步筛选的新方法,具体做法是以荧光探针AO标记人外周静脉血淋巴细胞或鼠肝细胞,用阿达玛变换显微荧光图象分析仪检测单细胞细胞核的AO-DNA复合物在发射峰值530nm处的荧光强度。以药物对细胞DNA-AO复合物荧光抑制率((F0-F)/F0×100%)的高低,即药物与细胞DNA的相互作用能力强弱,作为初筛判断的依据。若荧光抑制率达到50%,即可判断此药物具有一定的抗癌活性。实例取用已知的CDDP、丝裂霉素C、HN2等抗癌药物测试,其结果与药物的作用原理相符。此法对干扰生物大分子DNA合成的细胞周期特异性抗癌药物不敏感。在体外无活性的一些细胞周期非特异性抗癌药物,表现为荧光抑制率很低,都不是本方法筛选的对象。
Claims (3)
1,一种高分辨阿达玛变换显微图像分析仪,它包括光源,荧光显微镜、具有图像压缩成像,阿达玛变换调制以及准直,分色合为一体的光学系统部件、光电转换检测器以及计算机,其特征是阿达玛变换调制采用511一维编码模板;光电转换检测器为包含有采样/保持放大器和16位数模转换在内的线阵CCD。
2,按权利要求1所述的分析仪,其特征是在荧光显微镜上配置彩色电荷耦合器件CCD,图像处理接口板,即帧存储器构成通用彩色显微图像分析仪。
3,按权利要求1或2所述的分析仪,其特征是阿达玛变换光学系统部件由全反射三棱镜P,压缩成像透镜组L1、M1,阿达玛变换模板I及光阑,准直透镜组L2,分色光栅G,反射镜M2,柱面透镜L3构成,光压缩成像透镜组L1、M1使试样成像于模板I上,由L2复合透镜对模板I调制的光信号准直,光栅G分色,经L3柱面透镜压缩会聚进入狭缝S,由线阵CCD对阿达玛变换光谱图像完成采集工作。
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