CN104796609B - 基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法 - Google Patents

基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，首先利用计算机生成所需的最优哈达玛编码的矩阵，然后采用LED阵列作为显微镜光源，显示最优哈达玛编码图案，并用相机拍摄一系列待测样品在不同照明角度下的低分辨率显微图像，再根据最优哈达玛矩阵求解出待测样品受到单个角度照明时的低分辨率显微图像，最后利用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像。本发明既能降低相机所需的曝光时间，提高系统的图像采集速度，又能抑制噪声，提高系统采集的图像质量。

Description

基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法
技术领域
本发明属于光学成像技术，特别是一种基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法。
背景技术
在显微成像领域，更高的分辨率一直是追求的目标，但是在提高分辨率的同时存在一个关键性问题，那就是并没有随分辨率一起提高的显微镜的空间带宽积，换言之即传统显微镜存在分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾。因为，传统显微镜使用低倍物镜进行成像时视场大但是分辨率低，而使用高倍物镜进行成像时分辨率提高了但是相应的视场就会缩得很小。目前，为了突破分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾，常见的方法是采用常规显微镜系统配合高精度机械扫描和后期空域图像拼接方法将多个小视场高分辨率图像拼接融合生成一幅大视场高分辨率图像([1]孙西钊，王震，李攀，李建勋，王文合.适用于结核杆菌抗酸染色图像拼接的装置：中国，2013205777012[P].2013-09-17.)。但是由于引入了机械移动装置，所以系统成像时的稳定性和成像速度又成为一对难以调和的矛盾，提高扫描速度必将影响成像稳定性。所以，想要突破分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾又不引入了机械移动装置，必须采用近年来提出的计算成像的方法，比如基于合成孔径的成像方法。
基于合成孔径成像原理的扫描成像方法最早是由Hoppe为了研究晶体结构所提出的，并通过研究晶体和非晶体的扫描透射电子衍射显微成像，验证了此方法的有效性。Rodenburg和Faulkner等结合相位恢复算法将此方法多次改进，目前这种成像方法已在可见光域、X射线、电子显微镜等不同波段得到了实验证实，并发展出若干种技术以提高成像质量以及分辨率，该技术显示了在大幅面成像和高分辨成像方面的巨大潜力。传统的合成孔径成像技术是通过移动一个全透的小孔(或待测样品本身)使入射平面波照射到待测样品的不同部位，即由小孔控制照明光束尺寸、几何形状及位置，并利用由此得到的一系列衍射强度图样重构出待测样品的振幅与位相信息([2]王雅丽，史祎诗，李拓，等.可见光域叠层成像中照明光束的关键参量研究[J].物理学报，2013，Vol.62，No.6.064206-1-9)。合成孔径成像术的关键在于：每次照射待测样品的一个“子孔径”也就是待测样品的某一部分时，都要和至少一个其他的“子孔径”发生交叠。这样就可建立一种重构算法，在分别重构每“子孔径”的复振幅时也要同时满足其他“子孔径”衍射分布的约束，使得最后的待测样品的整体复振幅信息是所有“子孔径”的共同解，从而由各个“子孔径”拼接合成一幅大视场高分辨率的待测样品的图像。合成孔径成像术可以说是一种稳健而简约的显微成像技术，但目前最突出的问题在于其成像效率与质量之间的矛盾，因为使用合成孔径成像技术拍摄一幅完整的超分辨率的图像往往需要花费十几或数十分钟，因此如何提高成像效率就成为了合成孔径成像技术必须克服的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，既能降低相机所需的曝光时间，提高系统的图像采集速度，又能抑制噪声，提高系统采集的图像质量，以解决显微系统分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，其特征在于步骤如下：
步骤一：利用计算机编程生成初始哈达玛编码矩阵；
步骤二：对初始哈达玛编码矩阵进行优化，得到最优哈达玛编码矩阵；
步骤三：采用LED阵列作为显微镜光源，显示最优哈达玛编码矩阵，并用相机拍摄待测样品在不同照明角度下的一系列低分辨率图像，再根据最优哈达玛矩阵通过解方程组求解出待测样品受到单个角度照明时的低分辨率图像；
步骤四：利用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像。
本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)本发明利用LED阵列产生不同角度的入射光照射待测样品，再用相机拍摄多幅低分辨率图像，最后采用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像，无需任何机械扫描装置，系统成像稳定性高。(2)本方法利用哈达玛矩阵来编码照明光，产生多个角度的入射光同时照射待测样品，这样既能降低相机所需的曝光时间，提高系统的图像采集速度，又能抑制噪声，提高系统采集的图像质量，所以本方法可以非常稳定并且精确的重建出大视场高分辨率图像。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法步骤流程示意图。
图2为基于合成孔径超分辨率重构算法来重构待测样品的大视场高分辨率的光强和相位分布步骤流程示意图。
图3为本发明生成的N幅最优化哈达玛编码LED图案中的一幅。
图4为测试对象为1951USAF分辨率板时相机拍摄的N幅图像中的一幅。
图5为测试对象为1951USAF分辨率板时解出的单照明角度下的N幅图像中的一幅。
图6为测试对象为1951USAF分辨率板时重构的大视场高分辨率显微图像；图6(a)是4倍物镜拍摄到的原始图像；图6(b1)是重构后的原始图像图6(a)中选框区域的高分辨率显微图像的放大图像；图6(b2)是图6(b1)中选框区域的放大图像；图6(b3)是图6(b2)中选框区域的放大图像；图6(c1)、图6(c2)、图6(c3)分别是重构前的原始低分辨率图像在图6(b1)、图6(b2)、图6(b3)图像对应位置处的插值放大图。
图7为测试对象为淋巴细胞切片时重构的大视场高分辨率显微图像；图7(a)是4倍物镜拍摄到的原始图像；图7(b1)是重构后的原始图像图7(a)中选框区域的高分辨率显微图像的放大图像；图7(b2)是图7(b1)中选框区域的放大图像；图7(b3)是图7(b2)中选框区域的放大图像；图7(c1)、图7(c2)、图7(c3)分别是重构前的原始低分辨率图像在图7(b1)、图7(b2)、图7(b3)图像对应位置处的插值放大图。
具体实施方式
结合图1，本发明首先利用计算机编程生成初始哈达玛编码矩阵。之后对初始哈达玛编码矩阵进行优化，得到最优哈达玛编码矩阵。然后采用LED阵列作为显微镜光源，显示最优哈达玛编码矩阵，并用相机拍摄待测样品在不同照明角度下的一系列低分辨率图像。再根据最优哈达玛矩阵通过解方程组求解出待测样品受到单个角度照明时的低分辨率图像。最后利用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像。具体实现步骤如下：
步骤一：利用计算机Matlab软件(或其他类似编程软件)编程生成初始哈达玛编码矩阵。生成公式为：
R＝Rand(1，N)
Rsort＝Sort(R)
W0(m，n)＝H(1，n+m-1-kN)，n＝1，...，N，m＝1，...，N
其中，R为包含有N个随机数的行向量，Rand(·)为产生随机数的函数，N表示LED的总个数，Rsort为R经过排序后由大到小排列的行向量，Sort(·)为由大到小排序的排序函数。H表示以向量Rsort中第C个元素的值为阈值，对R进行0-1阈值分割后得到的行向量，C表示每次同时点亮的LED的个数，H(1，n)表示行向量H中的第n个元素，取值范围为1-N。W0表示初始哈达玛编码矩阵，W0(m，n)为矩阵W0中第m行n列的元素，k为一个中间变量，取值为0或1。
步骤二：对初始哈达玛编码矩阵进行优化，得到最优哈达玛编码矩阵。优化的公式为：
Woptimal＝Wn，Wn-Wn-1＜ε
其中，MSE表示含噪声图像相比原始图像的均方误差，trace表示求矩阵的迹，Wi-1表示第i-1次优化后得到的哈达玛编码矩阵，i为优化迭代次数，i＝1，2，3，...，表示矩阵Wi-1的转置矩阵。Γ为均方误差MSE相对哈达玛编码矩阵W的导数，表示求导，(·)-1表示求矩阵的逆矩阵。表示对原始矩阵Wi-1经过优化后得到的非整数矩阵，ones(N，1)表示包含N个1的列向量，ones(1，N)表示包含N个1的行向量。Wi表示第i次优化后得到的哈达玛编码矩阵，Round(·)表示进行四舍五入运算，Woptimal为最优哈达玛编码矩阵，矩阵中所有元素都是0或1，Wn为第n次优化后得到的哈达玛编码矩阵，ε表示优化过程中判断停止迭代的阈值。
步骤三：采用LED阵列作为显微镜光源，显示最优哈达玛编码矩阵，并用相机拍摄待测样品在不同照明角度下的一系列低分辨率图像。再根据最优哈达玛矩阵通过解方程组求解出待测样品受到单个角度照明时的低分辨率图像。求解公式为：
其中，x和y分别为图像中的x轴和y轴坐标，表示单个角度照明下的所有N个低分辨率图像中坐标为(x，y)的N个像素点灰度值所组成的列向量，为N行N列的最优哈达玛编码矩阵的逆矩阵，为相机拍摄到的多角度照明下的所有N个低分辨率图像中坐标为(x，y)的N个像素点灰度值所组成的列向量。
步骤四：利用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像。如图2所示，具体实现流程为：
第一步，从不同照明角度下的衍射图像Ip，q中选取正入射照明视角下的衍射光强图像I0，0(其中下标p，q表示LED阵列中第p行q列的LED所对应的照明角度，p，q＝-7，-6，...，6，7，下标0，0表示LED阵列中第0行0列的LED所对应的照明角度)，对它进行双线性插值计算，得到一幅高分辨率的光强图像(其中上标h表示高分辨率)，开根号求出其振幅分布然后随意构造一幅高分辨率的相位分布比如假设利用振幅分布与相位分布即可得到待测样品的高分辨率的复振幅分布对其进行傅立叶变换则可得到待测样品的高分辨率的频谱分布Fh。
第二步，使用一个圆形孔径低通滤波器，在待测样品的高分辨率的频谱分布Fh中截取一个低分辨率的“子孔径”频谱(其中上标l表示低分辨率)，该低分辨率频谱的中心位于空间频率(kp，kq)(其中空间频率kp，kq分别表示LED阵列中第p行q列的LED照明时入射光对应的x，y方向的空间频率)，圆形孔径低通滤波器的半径由物镜的数值孔径决定。对“子孔径”频谱做逆傅立叶变换求出空间频率(kp，kq)下待测样品的低分辨率复振幅
第三步，用相机实际拍摄得到的待测样品的低分辨率振幅去替换计算得到的低分辨率复振幅中的振幅部分，从而得到新约束条件下的低分辨率复振幅(其中上标c表示振幅经过替换后的结果)。然后再对其做傅立叶变换得到新约束条件下的低分辨率频谱最后用低分辨率频谱去替换第二步中圆形孔径低通滤波器位置处的高分辨率的频谱分布Fh中的“子孔径”频谱分量。
第四步，选取另一个照明角度，重复第二和第三步，直到所有N个照明角度都进行了运算，或者说频域中N个“子孔径”都完成了扫描拼接。
第五步，把第二步到第四步迭代重复计算2到3次，以保证最后合成孔径后的超分辨率光强分布和相位分布距离真实值误差足够小。迭代完成后，将最终高分辨率的频谱分布Fh变换到空域中即得到了待测样品大视场高分辨率的光强分布Ih和相位分布
为了测试基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微系统重建图像的分辨率，本发明分别选取1951USAF分辨能力测试板和淋巴细胞切片进行了合成孔径大视场高分辨率成像。实验中，使用的LED阵列包含15行15列共225个LED，并利用其产生225个不同角度的照明光，LED之间间距为3mm，发出的红光波长为632.8nm。另外，我们选取每次同时点亮的LED个数为33个。生成的最优哈达玛编码LED图案如图3所示，相机拍摄到的多角度照明下的低分辨率显微图像如图4所示，从中解出的单角度照明时的低分辨率显微图像如图5所示。如图6所示，图6(a)表示的是使用数值孔径0.1、放大倍率为4倍的物镜拍摄得到的原始图像。选取图6(a)方框中的图像直接进行放大，得到图6(c1)。从中再选择更小的区域直接进行放大，依次得到图6(c2)和图6(c3)。针对图6(a)中同样的方框中的图像进行合成孔径大视场高分辨率成像重构，可以重构出图6(b1)。从中再选择更小的区域直接进行放大，依次得到图6(b2)和图6(b3)。比较图6(b3)和图6(c3)，明显可以看出前者图像的分辨率远高于后者图像的分辨率。由此可以看出本方法合成孔径大视场高分辨率成像的优越性。
1951 USAF分辨能力测试板的物理参数表
具体的结果看图6(b3)，分辨能力测试板上第9组第3个元素依然能够清晰分辨，那么根据1951USAF分辨能力测试板的物理参数(见上表)，可以估算出本方法合成孔径大视场高分辨率成像的最高分辨率高于1000um/(645*2)＝0.775um。
此外，本发明对淋巴细胞切片进行了合成孔径大视场高分辨率成像，其中一组实验结果图如图7所示。图7(a)是4倍物镜拍摄到的原始图像；图7(b1)是重构后的原始图像图7(a)中选框区域的高分辨率显微图像的放大图像；图7(b2)是图7(b1)中选框区域的放大图像；图7(b3)是图7(b2)中选框区域的放大图像；图7(c1)、图7(c2)、图7(c3)分别是重构前的原始低分辨率图像在图7(b1)、图7(b2)、图7(b3)图像对应位置处的插值放大图。对比其中图7(b3)和图7(c3)可以明显看出本发明能够在低数值孔径大视场情况下实现大视场高分辨率成像。

Claims (4)

1.一种基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，其特征在于步骤如下：
步骤一：利用计算机编程生成初始哈达玛编码矩阵；
步骤二：对初始哈达玛编码矩阵进行优化，得到最优哈达玛编码矩阵；
步骤三：采用LED阵列作为显微镜光源，显示最优哈达玛编码矩阵，并用相机拍摄待测样品在不同照明角度下的一系列低分辨率图像，再根据最优哈达玛矩阵通过解方程组求解出待测样品受到单个角度照明时的低分辨率图像；
步骤四：利用频域合成孔径技术将多幅大视场低分辨率图像合成一幅大视场高分辨率图像；
在步骤四中，频域合成孔径技术实现的流程为：
第一步，从不同照明角度下的衍射图像Ip,q中选取正入射照明视角下的衍射光强图像I0,0，对衍射光强图像I0,0进行双线性插值计算，得到一幅高分辨率的光强图像开根号求出其振幅分布然后随意构造一幅高分辨率的相位分布利用振幅分布与相位分布即可得到待测样品的高分辨率的复振幅分布对其进行傅立叶变换则可得到待测样品的高分辨率的频谱分布Fh；
第二步，使用一个圆形孔径低通滤波器，在待测样品的高分辨率的频谱分布Fh中截取一个低分辨率的“子孔径”频谱该低分辨率频谱的中心位于空间频率(kp,kq)，圆形孔径低通滤波器的半径由物镜的数值孔径决定，对“子孔径”频谱做逆傅立叶变换求出空间频率(kp,kq)下待测样品的低分辨率复振幅
第三步，用相机实际拍摄得到的待测样品的低分辨率振幅去替换计算得到的低分辨率复振幅中的振幅部分，从而得到新约束条件下的低分辨率复振幅然后再对其做傅立叶变换得到新约束条件下的低分辨率频谱最后用低分辨率频谱去替换第二步中圆形孔径低通滤波器位置处的高分辨率的频谱分布Fh中的“子孔径”频谱分量；
第四步，选取另一个照明角度，重复第二和第三步，直到所有N个照明角度都进行了运算，或者说频域中N个“子孔径”都完成了扫描拼接；
第五步，把第二步到第四步迭代重复计算2-3次，以保证最后合成孔径后的超分辨率光强分布和相位分布距离真实值误差足够小；迭代完成后，将最终高分辨率的频谱分布Fh变换到空域中即得到了待测样品大视场高分辨率的光强分布Ih和相位分布
2.根据权利要求1所述的基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，其特征在于步骤一中，生成初始哈达玛编码矩阵的生成公式为：
R＝Rand(1,N)
Rsort＝Sort(R)
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W0(m,n)＝H(1,n+m-1-kN),n＝1,...,N,m＝1,...,N
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其中，R为包含有N个随机数的行向量，Rand(·)为产生随机数的函数，N表示LED的总个数，Rsort为R经过排序后由大到小排列的行向量，Sort(·)为由大到小排序的排序函数，H表示以向量Rsort中第C个元素的值为阈值，对R进行0-1阈值分割后得到的行向量，C表示每次同时点亮的LED的个数，H(1,n)表示行向量H中的第n个元素，取值范围为1-N，W0表示初始哈达玛编码矩阵，W0(m,n)为矩阵W0中第m行n列的元素，k为一个中间变量，取值为0或1。
3.根据权利要求1所述的基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，其特征在于步骤二中，最优哈达玛编码矩阵的优化公式为：
<mrow> <msub> <mi>MSE</mi> <mrow> <mi>i</mi> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <mi>N</mi> </mfrac> <mi>t</mi> <mi>r</mi> <mi>a</mi> <mi>c</mi> <mi>e</mi> <mo>&amp;lsqb;</mo> <msup> <mrow> <mo>(</mo> <msubsup> <mi>W</mi> <mrow> <mi>i</mi> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> <mi>t</mi> </msubsup> <msub> <mi>W</mi> <mrow> <mi>i</mi> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mrow> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> </msup> <mo>&amp;rsqb;</mo> <mo>,</mo> <mi>i</mi> <mo>=</mo> <mn>1</mn> <mo>,</mo> <mn>2</mn> <mo>,</mo> <mn>3</mn> <mo>,</mo> <mn>...</mn> </mrow>
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Woptimal＝Wn,Wn-Wn-1＜ε
其中，MSE表示含噪声图像相比原始图像的均方误差，trace表示求矩阵的迹，Wi-1表示第i-1次优化后得到的哈达玛编码矩阵，i为优化迭代次数，i＝1,2,3,...，表示矩阵Wi-1的转置矩阵，Γ为均方误差MSE相对哈达玛编码矩阵W的导数，表示求导，(·)-1表示求矩阵的逆矩阵，表示对原始矩阵Wi-1经过优化后得到的非整数矩阵，C表示每次同时点亮的LED的个数，ones(N,1)表示包含N个1的列向量，ones(1,N)表示包含N个1的行向量，Wi表示第i次优化后得到的哈达玛编码矩阵，Round(·)表示进行四舍五入运算，Woptimal为最优哈达玛编码矩阵，矩阵中所有元素都是0或1，Wn为第n次优化后得到的哈达玛编码矩阵，ε表示优化过程中判断停止迭代的阈值。
4.根据权利要求1所述的基于最优哈达玛编码的大视场高分辨率显微成像方法，其特征在于步骤三中，根据哈达玛编码矩阵求解单个角度照明下的低分辨率图像的公式为：
<mrow> <mover> <mi>I</mi> <mo>&amp;RightArrow;</mo> </mover> <mrow> <mo>(</mo> <mi>x</mi> <mo>,</mo> <mi>y</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <msubsup> <mi>W</mi> <mrow> <mi>o</mi> <mi>p</mi> <mi>t</mi> <mi>i</mi> <mi>m</mi> <mi>a</mi> <mi>l</mi> </mrow> <mrow> <mo>-</mo> <mn>1</mn> </mrow> </msubsup> <mover> <mi>M</mi> <mo>&amp;RightArrow;</mo> </mover> <mrow> <mo>(</mo> <mi>x</mi> <mo>,</mo> <mi>y</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>
其中，x和y分别为图像中的x轴和y轴坐标，表示单个角度照明下的所有N个低分辨率图像中坐标为(x,y)的N个像素点灰度值所组成的列向量，为N行N列的最优哈达玛编码矩阵的逆矩阵，为相机拍摄到的多角度照明下的所有N个低分辨率图像中坐标为(x,y)的N个像素点灰度值所组成的列向量。
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