CN1304412C - 抗单股正链RNA病毒人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸 - Google Patents
抗单股正链RNA病毒人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了含CpG的人工合成的脱氧寡核苷酸单链DNA，它能刺激人外周血单个核细胞(PBMC)产生抗病毒物质，这些物质可作用于细胞使其抵抗病毒尤其是单股正链RNA病毒的攻击；提供了人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的感染性疾病的治疗和预防作用。
Description
发明领域
本发明涉及人工合成的抗单股正链RNA病毒含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及抗SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒的含CpG单链脱氧核苷酸。本发明还涉及含CpG单链脱氧核苷酸对单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的传染性疾病的治疗和预防作用以及用含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的传染性疾病的技术方法和技术设想。
发明背景
近年来的研究表明，多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对人的免疫系统是危险信号，可激活多种免疫细胞启动机体的抗病毒机制。CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸。进一步的研究表明，含CpG的人工合成的脱氧核糖核酸寡核苷酸(CpG ODN)也可激活多种免疫细胞启动机体的抗病毒机制。
SARS的病原体SARS病毒是一种变异了的冠状病毒，属有包膜的单股正链RNA病毒(Christian Drosten，Identification of a Novel Coronavirus in Patients with SevereAcute Respiratory Syndrome The New England Journal Of Medicine，2003，348；19；PaulA.Rota，etal，Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe AcuteRespiratory Syndrome Science，Vol.300，Issue 5624，1394-1399，May 30，2003)。丙型肝炎的病原体丙型肝炎病毒也是一种有包膜的单股正链RNA病毒(Lindenbach，B.D.，andC.M.Rice.2001.Flaviviridae：the viruses and their replication，p.991-1041.InD.M.Knipe and P.M.Howley(ed.)，Fields virology，vol.1.Lippincott/The Williamsand Wilkins Co.，Philadelphia，Pa)。丙型肝炎病毒属黄病毒科病毒。黄病毒科的另外两种病毒，登革热病毒(Wei-Kung Wang，Su-Ru Lin，Chao-Min Lee，Chwan-Chuen King，andShan-Chwen Chang Dengue Type 3 Virus in Plasma Is a Population of Closely RelatedGenomes：Quasispecies Journal of Virology，May 2002，p.4662-4665，Vol.76，No.9)和日本脑炎病毒(Sang-Im Yun，Seok-Yong Kim，Charles M.Rice，and Young-Min LeeDevelopment and Application of a Reverse Genetics System for Japanese EncephalitisVirus Journal of Virology，June 2003，p.6450-6465，Vol.77，No.11)也都是有包膜的单股正链RNA病毒。
发明内容
发明概述
本发明的目的之一是提供人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸特别是可刺激人外周血细胞产生抗单股正链RNA病毒物质的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。优选地，本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的序列。
本发明的目的之二是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒的作用。
本发明的目的之三是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸对单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的传染性疾病的治疗和预防的作用。
本发明的目的之四是提供用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的传染性疾病的技术方法和设想。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
具体实施方式
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：
优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列：
SEQ ID NO：1
DVAX-1：5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’
其中的磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧寡核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的方法。
在预防和治疗由单股正链RNA病毒特别是SARS病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒引起的人传染性疾病时，人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的一次用药剂量为1-5000微克。
本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括单独应用或与其它抗单股正链RNA病毒药物或疫苗联合使用。
应用方式包括粘膜(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)表面应用，滴眼，皮下、肌肉注射应用，胃肠应用，腹腔应用，静脉注射等常用的方式应用。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法。在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制备
采用固相亚磷酰胺三酯法合成人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。
1、试剂和材料：
三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四种核苷酸单体、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等
2、方法：
脱保护基
用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
活化
将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
连接
亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
封闭
缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
氧化
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成；全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成。
实施例2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗单股正链RNA病毒SARS病毒的作用
1、人外周血单个核细胞的分离
(1)、材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
灭活胎牛血清：胎牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％胎牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
(2)、方法：
将肝素抗凝的人外周血沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与肝素抗凝外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心，1,000xg 15-20min，离心后管内液体分为3层，用吸管吸取白色云雾层液体带，置入另一管中。
加入等倍体积的Hank’s液(无血清)，混匀，800-1,000xg，离心15min，弃上清。用Hank’s液离心洗细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入2ml 10％FCS RPMI1640完全培养液，重悬细胞。
取一滴细胞悬液稀释后做细胞计数。数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
2、获取CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清
将含人外周血PBMC的10％FCS RPMI1640完全培养液接种于12孔培养板，每孔2ml，细胞浓度为4×106细胞/ml，加滤过除菌的CpG ODN(DVAX-1)，终浓度分别为25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml和3.13μg/ml。设培养液对照(不加CpG ODN)。37℃、5％CO2条件下培养48小时，收集上清，置-20℃备用。
3、抗SARS病毒实验
本实验在中国疾病预防控制中心病毒预防控制所完成。
(1)、材料：
非洲绿猴肾传代细胞(VERO E6)：中国疾病预防控制中心病毒预防控制所。冠状病毒
Sino-5分离株(SARS病人急性血清04号标本)：由北京佑安门医院提供，中国疾病预防控制中心病毒预防控制所鉴定保存。
阳性对照药物：远策素(重组人干扰素α2b)，100万IU/支，文号：国药准字S19990013，批号：000503A，北京远策药业有限责任公司出品。
(2)、方法
将VERO E6细胞接种于96孔培养板，细胞的浓度为4×105/ml，37℃、5％CO2培养24小时，吸弃培养液。加入100TCCID50冠状病毒Sino-5分离株病毒，37℃、5％CO2培养2小时，弃掉病毒液。加入CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清，每孔100μl，设两个复孔。设重组人干扰素α2b和培养基对照，细胞对照和病毒对照，37℃、5％CO2培养6天。在显微镜下观察细胞病变(CPE)，出现25％病变记“+”，出现26~50％病变记”++”，出现51~75％病变记”+++”，出现76~100％病变记”++++”。在观察CPE结束后，每孔加100μL0.5％结晶紫染色液(结晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50ml无水乙醚，3ml甲醛，47ml蒸馏水中)，37℃、5％CO2培养15分钟。流水冲洗。每孔加入100μl脱色液(乙二醇单甲醚50ml，蒸馏水50ml)。室温振荡2小时后，用ELISA检测仪测OD(492nm)值。
(3)、结果
●CPE法实验结果：
25μg/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶160对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
12.5/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
6.25/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶40对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
重组人干扰素α2b：在稀释到5万单位以上对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果。
不含CpG ODN的培养基上清对照冠状病毒(Sino-5分离株)没有抑制效果。
●结晶紫染色法实验结果：
25μg/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
12.5/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
6.25/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶20对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果
重组人干扰素α2b：在稀释到5万单位以上对冠状病毒(Sino-5分离株)有抑制效果。
不含CpG ODN的培养基上清对冠状病毒(Sino-5分离株)没有抑制效果。
上述结果表明，CpG ODN(DVAX-1)刺激的人外周血单个核细胞诱导上清中含抗单股正链RNA病毒SARS病毒的物质；CpG ODN(DVAX-1)可通过刺激细胞产生抗病毒物质发挥抗单股正链RNA病毒SARS病毒的作用。
实施例3、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗单股正链RNA病毒登革热病毒的作用
1、人外周血单个核细胞的分离
同实施例2。
2、获取CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清
同实施例2。
3、抗登革热病毒实验
(1)、材料：
登革热病毒(D2V strain NGC)：用C6/36昆虫细胞(ATCC)制备。
Vero细胞：来自美国ATCC。
10％FCS RPMI1640完全培养液：同实施例2。
(2)、方法
将200μl VERO E6细胞悬液接种于96孔培养板，细胞的浓度为4×105/ml，37℃、5％CO2培养24小时，吸弃培养液。加入100TCCID50登革热病毒，37℃、5％CO2培养2小时，弃掉病毒液。加入CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清，每孔100μl，设三个复孔。设细胞对照和病毒对照，37℃、5％CO2培养8天。在显微镜下观察细胞病变(CPE)，出现25％病变记“+”，出现26-50％病变记”++”，出现51-75％病变记”+++”，出现76-100％病变记”++++”。
(3)、结果(CPE法)
25μg/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对登革热病毒有抑制效果
12.5/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对登革热病毒有抑制效果
6.25/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶40对登革热病毒有抑制效果
不含CpG ODN的培养基上清对登革热病毒没有抑制效果。病毒对照的细胞全部发生病变。
上述结果表明，CpG ODN(DVAX-1)刺激的人外周血单个核细胞诱导上清中含抗单股正链RNA病毒登革热病毒的物质；CpG ODN(DVAX-1)可通过刺激细胞产生抗病毒物质而发挥抗单股正链RNA病毒登革热病毒的作用。
实施例4、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗单股正链RNA病毒日本脑炎病毒的作用
1、人外周血单个核细胞的分离
同实施例2。
2、获取CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清
同实施例2。
3、抗日本脑炎病毒实验
(1)、材料：
日本脑炎病毒：长春生物制品研究所。
BHK-21细胞：来自内蒙生物制药厂。
10％FCS RPMI1640完全培养液：同实施例2。
(2)、方法
将200μl BHK-21细胞悬液接种于96孔培养板，细胞的浓度为4×105/ml，37℃、5％CO2培养24小时，吸弃培养液。加入100TCCID50日本脑炎病毒，37℃、5％CO2培养2小时，弃掉病毒液。加入CpG ODN(DVAX-1)刺激人外周血PBMC培养上清，每孔100μl，设三个复孔。设细胞对照和病毒对照，37℃、5％CO2培养4天。在显微镜下观察细胞病变(CPE)，出现25％病变记“+”，出现26-50％病变记”++”，出现51-75％病变记”+++”，出现76-100％病变记”++++”。
(3)、结果(CPE法)
25μg/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶160对日本脑炎病毒有抑制效果。
12.5/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶80对日本脑炎病毒有抑制效果
6.25/ml CpG ODN(DVAX-1)刺激(48小时)人PBMC培养上清稀释到1∶40对日本脑炎病毒有抑制效果
不含CpG ODN的培养基上清对日本脑炎病毒没有抑制效果。病毒对照的细胞全部发生病变。
上述结果表明，CpG ODN(DVAX-1)刺激的人外周血单个核细胞诱导上清中含抗单股正链RNA病毒日本脑炎病毒的物质；CpG ODN(DVAX-1)可通过刺激细胞产生抗病毒物质而发挥抗单股正链RNA病毒日本脑炎病毒的作用。
序列表
<110>长春华普生物技术有限公司
<120>抗单股正链RNA病毒人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸
<160>107
<170>Patent In version 3.1
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>1
tcgtcgggtg cgacgtcgca ggggg g 26
Claims (7)
1.人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，其具有SEQ ID NO：1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸用于制备诱生细胞产生抗单股正链RNA病毒物质的制品的用途。
3.根据权利要求2的用途，其中所述单股正链RNA病毒是变异的冠状病毒或黄病毒科病毒。
4.根据权利要求3的用途，其中所述变异的冠状病毒是SARS病毒。
5.根据权利要求3的用途，其中所述黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒、登革热病毒或日本脑炎病毒。
6.根据权利要求1所述的寡核苷酸，它的磷酸二酯键是非硫化、部分硫化或全部硫化的。
7.生产权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸的方法为人工合成的方法，所述的人工合成的方法是固相亚磷酸酰胺三酯法。
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2003
- 2003-09-05 CN CNB031562248A patent/CN1304412C/zh not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
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| CN1526719A (zh) * | 2003-03-05 | 2004-09-08 | 长春华普生物技术有限公司 | 增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸 |
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