CN1304317A - 编码透明质酸合酶的核酸及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有编码酶学活性的多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)透明质酸合酶(PmHAS)的编码区域区段的核酸区段,以及该核酸区段在制备产生透明质酸合酶的重组细胞和它的透明质酸产物上的应用。透明质酸(hyaluronate)也称作透明质酸(hyalronic acid)或透明质酸(hyaluronan)。本发明还涉及PmHAS在构建用于接种的“敲除”多杀巴斯德氏菌突变菌株中的应用。本发明进一步涉及PmHAS在野外确定家畜多杀巴斯德氏菌感染的诊断检测中的应用。

Description

编码透明质酸合酶的核酸及其应用方法
相关申请的交叉引用
本申请涉及1998年4月2日申请的美国临时专利申请系列号60/080,414，发明名称为“来自多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)的独特透明质酸合酶”，该文在此提及可供参考。本申请还是1998年10月26日申请的发明名称为“透明质酸合酶基因及其应用”的美国专利申请系列号09/178,851的部分继续申请，该文在此提及可供参考。
本发明的背景
1．本发明的领域
本发明涉及来自多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)的编码透明质酸合酶的DNA序列。尤其是，本发明涉及能够被置于重组结构之中从而能够在异源宿主中表达透明质酸合酶的、来自多杀巴斯德氏菌的编码透明质酸合酶的DNA序列。本发明还涉及利用来自多杀巴斯德氏菌的编码透明质酸合酶的DNA序列的方法，所述利用方法为(1)生产具有不同大小分布的透明质酸聚合物；(2)生产掺有取代的或添加的基糖的透明质酸聚合物；(3)开发新的动物疫苗；和(4)开发新的检测或鉴定动物病原体的诊断检测。
2．背景领域的简要描述
多糖透明质酸(“HA”)或者称透明质酸(hyaluronan)是高等动物的一种基本成分，它具有结构上和识别上的功能。在哺乳动物和鸟类中，HA在皮肤、关节滑液、和眼睛的玻璃体中大量存在。某些病原性细菌，即，格兰氏阳性菌的A组和C组链球菌属和格兰氏阴性菌的Carter A型多杀巴斯德氏菌，产生细胞外含有HA的被膜，该HA与在它们的脊椎动物宿主中发现的HA分子具有相同的化学结构。这种“分子拟态”挫败了对此被膜多糖产生强抗体反应的企图。相反，其他细菌产生的具有不同结构的被膜多糖常常很快显示抗原性。这种HA被膜还表现出能帮助病原体逃避宿主的防御，包括噬菌作用。
历史上，本领域的研究人员未能克隆或鉴定出巴斯德氏菌属的透明质酸合酶(“HAS”)。来自A组和C组链球菌属的细菌HAS酶已被鉴定和克隆。来自化脓链球菌的HasA是第一个被彻底鉴定的HAS。这一整合膜蛋白利用了细胞内的UDP-GIc和UDP-GlcNAc作为其底物。新生的HA链被排出细胞膜而形成细胞外被膜。一种非洲爪蟾属的蛋白，DG42，也已被确定为一种HAS。几种人和鼠的DG42同源物，被称为HAS1、HAS2和HAS3，也已经得到了鉴定。这些已经被分子克隆的哺乳动物的酶之间在氨基酸水平上具有相当大的相似性，但是它们却位于不同的染色体上。来自多杀巴斯德氏菌的独特的HAS所具有的初级结构，并不很地相似于先前克隆的来自链球菌、PBCV-1病毒或高等动物的酶。
现已鉴定出一种带有称作A98R的ORF的病毒HAS，它与链球菌属和脊椎动物的酶具有28-30％的相同性。PBCV-1(Parameciumbursaria绿藻病毒)在刚刚感染与其绿藻相似的绿色海藻宿主之后就产生出真正的HA多糖。A98R是第一个被鉴定的能够产生碳水化合物聚合物的由病毒编码的酶。
Carter A型多杀巴斯德氏菌，作为禽霍乱的病原体，导致了美国家禽产业的巨大经济损失。无被膜的多杀巴斯德氏菌突变体在对火鸡静脉注射之后并不在血液中大量生长，而带有被膜的菌株则迅速繁殖并在1至2天内导致死亡。天然产生的无被膜的突变体菌株比野生型的毒性低105倍，但是所有遗传缺陷的特性在本发明公开的突变体(如下所述)之前还未有了解。
巴斯德氏菌细菌性病原体导致了美国农业的巨大经济损失。多杀巴斯德氏菌的细胞外被膜被认为是主要的致病因素。A型被膜有多糖构成，称作HA，该多糖与宿主体内正常的多糖相同，因而不为免疫系统察觉。这种“分子拟态”还干扰了宿主的防御，诸如噬菌作用和互补介导的溶菌作用。而且，HA不呈显著的免疫原性，因为其引物为宿主体内的正常成分。由不同的多糖构成的其他细菌的被膜却通常成为免疫系统的主要标靶。针对被膜引物产生的抗体常产生应答以清除微生物并长期免疫。
了解了对病原体毒性产生应答的因子，这为如何聪明而有效地战胜疾病提供了线索。A型多杀巴斯德氏菌中毒性因素之一就是非免疫原性HA的保护性护罩，它是宿主防御几乎无法克服的屏障。少数菌株并不显示出依赖HA被膜的保护，而是利用其它未知的因子来对抗宿主的机制。或者，这些菌株可具有更小的被膜而无法被经典的检测所探查。
对于鸡特别是火鸡，禽霍乱可以是毁灭性的。几个至1000个带有被膜的菌株就可以在24-48小时之内杀死一只火鸡。在北美禽霍乱是一种经济上极具危害性的疾病。1980年代后期进行的研究显示出了禽霍乱对火鸡产业的影响：(ⅰ)一个州每年损失$600,000,(ⅱ)治疗病禽的抗生素花费了$0.40/只，(ⅲ)禽霍乱导致的疾病占所有疾病的14.7-18％，并且(ⅳ)花费$0.12/只禽用于预防感染。
某些A型多杀巴斯德氏菌菌株导致受感染家畜的肺损伤和航运热。从而引起的体重下降会导致饲养场的严重损失。牛菌株与禽霍乱的菌株有些差异，但这种宿主偏爱上的差异的分子基础尚不清楚。猪肺炎中的一半也是由A型菌株导致的。对于D型多杀巴斯德氏菌最为了解的是它与萎缩性鼻炎的相关性，这是猪的高发疾病。
D型被膜聚合物具有一种未知的结构，显示出几种类型的粘多糖；它也同属于含有HA的聚合物家族。这种病也可由博德特氏菌Bordetella bronchiseptica引起，但病况在两种细菌都存在时更为严重。据估计F型导致了禽霍乱的大约10％。在此情况中，被膜聚合物不是HA，而是一种相关的称作软骨素的聚合物。
近来，对禽类的疾病预防主要利用两类物质：疫苗和抗生素，当然还有严格的卫生管理。第一种选择的应用是有限的，因为其血清分型很多而疫苗只能有效地对抗整个病原谱中有限的几种亚型。杀死细胞的疫苗需通过实验室精细注射而配药，获得的保护效果并不高。因此，这一途径通常用于种畜动物。更为有效的活细胞疫苗可以通过供水来提供，但是这很难对上千只的家畜群均匀地进行。此外，如果禽类受到其它的刺激或患疾病，活的“无毒”疫苗本身有时可引起疾病。这种无可预见性的最常见的原因是无毒的菌株从天然的突变体中获得了未知的或未鉴定的基因。利用反复交替施用活的和死的疫苗的方法对禽类的保护只能对付某些血清型的威胁。
第二种疾病预防的选择是抗生素。将其用以亚治疗剂量以预防感染或者对受感染家禽用以高剂量以治疗禽霍乱。带病家禽的百分比通过用药治疗可能下降，但是需要及时且大量的治疗。抗生素的迟缓用药或过早断药常常导致慢性禽霍乱和带有脓肿或伤口的家禽，从而受到谴责和商业损失。再有，由于多杀巴斯德氏菌的抗性菌株不断产生并且药物花费的高昂，这种解决办法在长远角度上不具有吸引力。此外，F型多杀巴斯德氏菌导致了北美禽霍乱的5-10％。如果它作为未来主要的病原体出现的话，直接针对A型菌株的疫苗不可能完全对这种不同的被膜类型起到保护作用。在牛和猪产业中，还没有获得完全满意的疫苗。预防性抗生素治疗可用于防止体重下降，但是这种方法是昂贵的并且受到微生物抗性的影响。
在本发明中，与生产保护性细菌HA被膜相关的酶已在基因/DNA水平上得以鉴定。对这些酶的鉴定将利于通过不伤害宿主HA生物合成的特异的抑制剂来阻断病原体的被膜合成，从而达到对疾病的治疗。例如，一种模拟用于生产HA的底物的药物或者多杀巴斯德氏菌HA合酶停止生产细菌HA多糖的调控因子。从而阻断被膜的形成。它是许多现有抗生素直接的类似物而对微生物和宿主具有不同的作用。这种方法是优选的，因为多杀巴斯德氏菌HA合酶和脊椎动物的HA合酶在蛋白质水平上很不相同。因此，很可能在反应机制上或者底物结合位点上这些酶也是不同的。
一旦揭去多杀巴斯德氏菌的保护性被膜护罩，它就成为宿主防御的明显脆弱得多的标靶。吞噬细胞易于吞噬和破坏无被膜的微生物。宿主的补体复合物抵达并破坏细菌敏感的外膜。针对新暴露的免疫原，诸如多杀巴斯德氏菌中决定体细胞血清型的脂多糖和表面蛋白，抗体更易产生。免疫应答时这些抗体能够随后更好地结合无被膜的细胞。因此，接种疫苗获得的免疫应答更为有效和经济。抑制被膜药物是对治疗禽霍乱实质性的扩充。
本发明以及A型多杀巴斯德氏菌的被膜生物合成的应用有助于对其他被膜血清型的理解。DNA探针也已经用于A型被膜基因以建立D型和F型所具有的相似的同源物。
高分子量HA还具有广泛的多种应用-范围从化妆品到眼外科。由于它高粘度的潜能和它的高度生物相容性，HA在眼外科中作为玻璃体液的替代品具有特殊的用途。HA还可通过关节内注射HA而用于治疗赛马的损伤性关节炎，用于作为润滑剂的剃须沫，并且根据它的高粘度的物理化学特性以及长时间保湿的能力而用于各类化妆品。实际上，1997年8月美国食品和药物管理局认可了通过在受影响的关节中直接注射高分子HA而在治疗严重关节炎中应用高分子HA。通常，使用越高分子量的HA越好。这是因为HA溶液的粘度随着溶液中各个HA聚合物分子的平均分子量增大而增大。不幸的是，极高的分子量的HA，如高达107，通过现有的分离方法很难获得。
为了解决这些或其他困难，需要有新的方法和构建物，能够用以生产具有一种或多种改进的特性，诸如更高纯度或易于制备的HA。尤其是，需要开发出新的方法，从而生产大量的比现有商业化可获得的HA具有更高的分子量和更纯的HA。还需要能够开发出新的方法，从而生产具有经修饰了的大小分布的HA(HAΔsize)以及具有经修饰了的结构的HA(HAΔmod)。
因此，本发明在功能上鉴定了A型多杀巴斯德氏菌的涉及被膜生物合成的基因，确定了被膜作为毒性因子在禽霍乱中的作用，并获得了涉及D型和F型被膜合成的同源基因。根据这些信息，利用“敲除”多杀巴斯德氏菌基因而不产生HAS，从而开发出疫苗。这些无被膜的无毒菌株能够用作疫苗用于禽霍乱或航运热。
本发明概述
本发明涉及新的产生HA的HAS。利用各种分子生物学技术，在禽霍乱病原体A型多杀巴斯德氏菌中发现了新的HAS基因。这种来自多杀巴斯德氏菌的新的HAS被克隆，并在其他种的细菌中显示出功能。
因此，鉴定了HA的新的来源。通过与已破坏的缺陷型的同源重组，敲除了正常的微生物基因，从而还可将PmHAS的DNA序列用于产生多杀巴斯德氏菌的减毒疫苗菌株。此外，PmHAS的DNA序列还可用于产生诊断用细菌分型探针，用于检测作为家禽、牛、羊和猪的农牧业病原体的相关的多杀巴斯德氏菌。
附图的简要描述
图1为多杀巴斯德氏菌的PmHAS和其他细菌的其他糖基转移酶的部分序列的比对。图1中PmHAS的序列是SEQ ID NO:10，图1中EpsⅠ的序列是SEQ ID NO:11，图1中Cps14E的序列是SEQ IDNO:12，图1中LgtD的序列是SEQ ID NO:13，图1中SpHasA的序列是SEQ ID NO:14，而图1中共有序列是SEQ ID NO:15。
图2为PmHAS的342-383位残基(SEQ ID NO:16)与哺乳动物UDP-GalNAc：多肽GalNAc转移酶的362-404位残基(SEQ IDNO:17)的序列比对。图2中的共有序列是SEQ ID NO:18。
图3是用PmHAS的UDP-糖类似物作的光亲和标记的放射性自显影图像。
图4是描述在PmHAS的各种Tn突变体中降低的或没有了PmHAS的光亲和标记的放射性自显影图像。
图5显示的光学显微图表明了在大肠杆菌重组体HA的产生。
图6图示了pPmHAS以及将其亚克隆进表达载体的构建过程。
图7描述了PmHAS活性的pH依赖性。
图8描述了HAS活性的金属依赖性。
图9描述了HAS活性对UDP-GlcNAc浓度的依赖。
图10描述了HAS活性对UDP-GlcA浓度的依赖。
图11是对Vmax和Km的Hanes-Woolf作图估算。
图12是Tn突变体的Southern杂交作图。
图13描述了用于对Tn破坏位点作序列分析的嵌合DNA模板。
图14是A型多杀巴斯德氏菌部分HA生物合成基因座位的图解。
图15是用A型被膜基因探针对不同被膜类型的多杀巴斯德氏菌所作的Southem杂交。
图16是以各种A型引物对A型DNA和异源DNA进行PCR的电泳图谱。
图17是A型(SEQ ID NO:5)和F型(SEQ ID NO:4)KfaA同系物和大肠杆菌(SEQ ID NO:6)的KfaA的部分序列比较。
图18是野生型HAS基因和敲除突变的基因的图解。
图19是对无被膜的敲除突变通过Southern杂交和PCR分析所作的分子生物学确认。
图20是A型和F型多杀巴斯德氏菌的序列比较。图20中的PmHAS序列是SEQ ID NO:7；PmCS序列是SEQ ID NO:8；而图20中的共有序列是SEQ ID NO:9。
图21是天然的和重组的PmHAS蛋白的Western杂交。
本发明的详细描述
在详细对本发明的至少一个实施方案进行解释之前，应当明白的是，本发明并不局限于下文所描述的或附图所展示的各个部分的构成与安排上的细节。本发明能够具有其他的实施方案或者能够以其他的方式实践或操作。而且，还应当明白的是，本文所用的措辞和术语是出于描述的目的而不能被视为限制。
本文中所用的术语“核酸区段”和“DNA区段”可以相互替换使用，它们是指从某一物种的总基因组DNA中分离出来的DNA分子。因而，本文中所用的“纯化的”DNA或核酸区段是指，含有透明质酸合酶(“HAS”)编码序列的、并且从基因组DNA中，例如，整个多杀巴斯德氏菌或者例如哺乳动物宿主基因组DNA，分离出来或纯化出来的。包括在术语“DNA区段”之中的是DNA区段和这种区段的小区段，并且还包括重组载体，其中包括，例如，质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。
类似地，含有分离的或纯化的PmHAS基因的DNA区段是指，含有基本上从其他天然存在的基因或蛋白编码序列中分离出来的HAS编码序列的DNA区段。在此方面，出于简单性考虑所用的术语“基因”是指功能性的蛋白、多肽或多肽编码单位。正如本领域人员所应当明白的，这一功能性术语包括基因组序列、cDNA序列或它们的组合。“基本上与其他编码序列分离的”是指，感兴趣的基因，在此是PmHAS，构成该DNA区段的编码区域的显著部分，并且该DNA区段不含有大部分的天然存在的编码DNA，诸如大的染色体区段或其他的功能性基因或编码区域。当然，这是指最初分离的DNA区段，并不排除后来添加的、或者人为有意在该区段中放入的基因或编码区域。
根据应用原核来源所带来的某些优点，我们应当很容易地意识到从原核生物多杀巴斯德氏菌中分离HAS基因的多种优点。其中一个优点就是，通常真核的酶可能需要重要的翻译后修饰，而这只能在真核宿主中完成。这会限制获得的真核HA合酶的应用价值。而且，本领域普通的技术人员将会很容易地认识到应用原核基因时在时间和遗传操作上的其他优点。这些其他的优点包括(a)原核基因由于其较小的基因组而易于分离，并因而降低了相应的基因组文库的筛选量，和(b)原核基因的编码区域由于不含有内含子而显著小，因而易于操作。而且，如果PmHAS基因的产物(例如，酶)需要翻译后修饰，这可以在该基因所来源的相似的原核细胞环境(宿主)中更好地完成。
优选地，本发明的DNA序列进一步还包括能够使该序列在所需的重组宿主中表达的基因调控区域。当然，所用的调控区域的特性通常会根据所预定的特定用途(例如克隆宿主)而变化。
在特定的实施方案中，本发明涉及分离的DNA区段和重组载体，其中含有编码PmHAS基因的DNA序列，其氨基酸序列中含有SEQ ID NO:1所确定的氨基酸序列。而且，在另一个特定的实施方案中，本发明涉及分离的DNA区段和重组载体，其中含有编码一个基因的DNA序列，其氨基酸序列中含有HAS基因或DNA的氨基酸序列，尤其是相应于多杀巴斯德氏菌的HAS的HAS基因或cDNA。例如，当该DNA区段或载体编码一个全长的HAS蛋白，或者它是为了用于表达HAS蛋白时，优选的序列是基本上如SEQ IDNO:1所示的序列。
截短的PmHAS也属于SEQ ID NO:1所示的优选序列的定义范围之内。例如，在C末端，大约270-272个氨基酸可以从序列上去除而仍然具有功能性的HAS。本领域的普通技术人员应当理解的是，可以从PmHAS序列的任何一端进行简单的氨基酸去除。序列的截短形式只需要检查HAS活性，从而确定该截短的序列是否还能够产生HAS。
具有HA合酶活性的核酸区段可以通过本文所描述的方法来分离。术语“基本上SEQ ID NO:1所示的序列”是指，基本上与SEQ IDNO:1一部分相符而相对地几乎没有氨基酸不相同于SEQ ID NO:1所示的氨基酸，或者在生物学功能上等价于SEQ ID NO:1所示的氨基酸。术语“生物学功能等价”是本领域所很好理解的并且在本文中有进一步的详细定义的，即具有基本上SEQ ID NO:1所示的序列的基因，并且该基因与原核生物产生HA或透明质酸被膜的能力相关。
本领域中有着许多实例，实践者能够对一个核酸区段进行结构上的改变(例如，编码保守性的或半保守性的氨基酸置换)而仍然保留了它的酶学或功能活性。例如可以参见：(1)Risler等，“结构相关性蛋白中的氨基酸置换类型识别方法”分子生物学杂志，204:1019-1029(1988)[…“根据发现的氨基酸侧链的可互换性，概括出来的只有四组；(ⅰ)Ile和Val；(ⅱ)Leu和Met；(ⅲ)Lys,Arg，和Gln；和(ⅳ)Tyr和Phe.]”(2)Niefind等，“主链折叠Anoles得出的用于蛋白质建模和序列比对的氨基酸相似性系数”，分子生物学杂志，219:481-497(1991)[相似性参数可以用于设计氨基酸置换]；和(3)Overington等，“环境特异性的氨基酸置换表：”三级模板和蛋白质折叠的预测”蛋白质科学，1:216-226(1992)[“对所观察的置换从局部环境的功能上的类型的进行的分析表明，具有明显不同的类型…”可以进行相容性变化。]
这些参考文献和数不清的其他文献表明，本领域的普通技术人员，根据一个核酸序列可以进行置换而改变该核酸序列却不改变其功能。而且，经置换核酸区段可以与其未作改变的母本具有高度的相同性并保持了其酶学活性，并且还无法与之杂交。
本发明公开了编码酶学活性的来自多杀巴斯德氏菌透明质酸合酶的核酸区段-PmHAS。本领域的普通技术人员应当理解的是，置换可以对SEQ ID NO:2所列的PmHAS核酸区段进行，而不偏离于本发明的范围合权利要求的范围之外。
表A中列出了标准化的和可接受的功能上等价的氨基酸置换。表A
氨基酸组 保守性的或半保守性的置换
非极性侧链组 丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸
极性但不带电荷侧链组 甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺
带负电荷侧链组 天冬氨酸，谷氨酸
带正电荷侧链组 赖氨酸，精氨酸，组氨酸
本发明的另一个优选的实施方案是进而定义为重组载体的、编码基于SEQ ID NO:1的蛋白的纯化的核酸区段。本文中所用的术语“重组载体”是指，经过修饰而含有编码HA蛋白的核酸区段或其片段的载体。该重组载体可进一步定义为一个含有有效相连于所说的HA编码核酸序列的启动子表达载体。
本发明的进一步的优选的实施方案是一个宿主细胞，它形成含有HAS基因的重组载体的重组体。该优选的重组宿主细胞可以是原核细胞。在另一个实施方案中，该重组细胞是真核细胞。本文中的术语“工程化的”或“重组的”细胞是指其中引入有重组基因，诸如编码HAS的基因，的细胞。因而，重组细胞不同于天然存在的、不含有重组引入的基因的细胞。重组细胞因而是带有人为引入的一个或多个基因的细胞。重组引入的基因可以是cDNA基因的形式，即基因组基因的拷贝，还可以包括位置上临近于启动子的基因，而该启动子在天然情况下并不与该特定的引入基因相关。
在优选的实施方案中，HA合酶的编码DNA区段进一步还含有本领域所知的功能上作为复制起点的或称“复制子”的DNA序列，它可以通过该特定的宿主使得邻近的序列得以复制。这种起始点可用于在染色体外制备并复制连接有HA合酶DNA序列的嵌合区段或质粒。在更为优选的实例中，所用的起始点是能够在适用于生物工程应用的细菌宿主中复制的起始点。但是，出于克隆的DNA区段的多种用途考虑，可能需要变换或另外使用能被其他需要应用的宿主细胞所识别的起始点(诸如穿梭载体)。
其他的可以用于在多种高等生物中克隆或表达的复制起始点，诸如SV40，多瘤病毒，牛乳头瘤病毒的起始点的分离和应用是本领域普通技术人员所周知的。在某些实施方案中，本发明因而定义为含有HA合酶编码基因以及连有适当的复制起始点并在选定的调控区控制之下的、重组的转化载体。
因此，本领域的普通技术人员应当理解的是，根据本发明，其他的方法也可用于获得HAS基因或cDNA。例如，可以获得聚合酶链反应或RT-PCR产生的DNA片段，它含有来自多种来源的，包括Pasturellas的其他菌株或真核来源，诸如cDNA文库，全长的基因或cDNA的互补序列。实际上任何分子克隆方法都可以用于产生基于本发明的DNA片段。因此，对用于DNA分离的特定方法的唯一的基本限制就是分离的核酸分子应当编码生物学功能上等价的HA合酶。
分离出DNA之后，将其与所选择的载体连接。实际上任何克隆载体都可以用于实现本发明的优越性。通常应用的载体包括用于原核生物的质粒和噬菌体，甚至用于真核生物的病毒载体。实例包括pKK223-3,pSA3，重组λ噬菌体，SV40，多瘤病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒和逆转录病毒。但是，据信但载体能够在胚芽属或杆菌属和大肠杆菌属中都能复制时，某些优越性才能最大限度地实现。
诸如这些载体，例如Dao和Ferretti的pSA3载体或者Trieu-Cuot等的pAT19载体，可以在易于操作的宿主如大肠杆菌中进行克隆菌落的筛选，然后再转回到食品级的胚芽属或杆菌属菌株中生产HA。这些都是良性的并且研究充分的用于某些食品和生物工程产品生产的生物。其中的优点还有，可以通过基因剂量(例如，通过扩增提供额外的HA合酶基因的拷贝)和/或融合另外的基因以增强HA前体的数量从而增大胚芽属或杆菌属的合成HA的能力。也可以通过形成额外的带有HA合酶基因的拷贝，或扩增，来增大细菌原有的合成HA的能力。这种扩增可以获得质粒拷贝数多达10倍的增加，并因而增加HA合酶的拷贝数。
可以增加HA合酶基因拷贝数其他的方法还有在质粒上插入多个拷贝的基因。其他的技术还包括在染色体DNA上整合HAS基因。这种额外的扩增是尤为可行的，因为细菌的HA合酶基因的大小较小。在某些情况下，将连接了染色体DNA的载体用于转染用于克隆筛选目的的宿主诸如大肠杆菌，该载体能够在所选宿主中表达插入的DNA。
在某些其他实施方案中，本发明涉及分离的DNA区段和重组载体，其序列上含有基本上如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所用术语“基本上如SEQ ID NO:2所示的”与上文中所描述的意义相同，是指基本上与SEQ ID NO:2一部分相符，而相对地几乎没有密码子不相同于SEQ ID NO:2所示的密码子，或者在生物学功能上等价于SEQ ID NO:2所示的密码子。术语“在生物学功能上等价的密码子”是指编码相同的氨基酸，诸如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，如表A所列，并且还指编码在生物活性上相当的氨基酸。
应当理解的是，氨基酸和核酸序列可以包括附加的残基，而该序列基本上仍视如本发明公开的序列之一，诸如附加的N或C末端氨基酸或者5’或3’核酸序列，只要该序列符合上述的标准，包括在涉及蛋白表达和酶活性时仍保持了生物蛋白的活性。末端序列的添加尤其适用于核酸序列，例如，可以包括在编码序列5’或3’端两侧的各种非编码序列区域，或者包括所知的存在于基因中的各种内部序列。而且同样地，N或C末端氨基酸也可以去除残基，而该序列基本上仍视如本发明公开的序列之一，只要该序列符合上述的标准。
由于遗传密码的简并性以及保守性和半保守性替换，一个具有在约40％和约80％之间；或者更为优选地在约80％和约90％之间；或者更为优选地在约90％和约99％之间的核苷酸与SEQ ID NO:2所示的核苷酸相同的序列，就是“基本上如SEQ ID NO:2所示”的序列。基本上与SEQ ID NO:2所示相同的序列还可以在功能上定义为，能够与含有SEQ ID NO:2的互补序列在标准的或低严格性的条件下相杂交的序列。适当的标准的杂交条件为本领域熟练技术人员所熟知的，并在本文中有清楚的描述。
本文所用的术语“标准的杂交条件”是用于描述那些基本上互补的核酸片段都能形成标准的Watson-Crick碱基对所处的条件。已知的各种因素可决定结合或杂交的特异性，诸如pH\温度、盐浓度、试剂诸如甲酰胺和二甲基亚砜的存在、杂交片段的长度等等。当互补的是杂交用的短的核酸片段，例如约14至100个核苷酸之间的片段，盐和温度的优选的杂交条件包括有在1.2-1.8×HPB，于40-50℃。
自然，本发明还包括与SEQ ID NO:2所示的序列互补的，或基本上互补的DNA片段。“互补的”核酸序列是那些能够根据标准的Watson-Crick互补法则而形成碱基对的序列。本文所用的术语“互补序列”是指基本上互补的序列，它可以通过上述的核酸比较而确定，或者根据能够与SEQ ID NO:2所示的核酸片段杂交而确定。
本发明的核酸区段，不论其本身的编码序列有多长，多可以与其他的DNA序列相结合，诸如启动子、多聚腺苷酰化信号、添加的限制酶位点、多克隆位点、表位标记、多聚组氨酸区域、其他的编码片段等等，从而其总体长度可能相当可观。因此应当考虑的是，几乎任何长度的核酸片段都可以使用，而其总长度优选地限制在易于重组DNA操作中制备和使用的范围之内。
自然，还应当理解的是，本发明并不限于SEQ ID NO:1和2所示的特定的氨基酸和核酸序列。重组载体和分离的DNA片段因而可以分别不同地包括HAS编码区域本身、在基本的编码区域不带有所需的改变和修饰的编码区域、或者它们可以编码并不含有HAS编码区的较大的多肽，或编码具有不同的氨基酸序列而在生物功能上等价的蛋白或多肽。
本发明的DNA区段包括生物功能上等价于HAS的蛋白或多肽。这种序列的产生是由于在核酸序列和其编码的蛋白质中已知的天然存在的密码子冗余且功能相当性的结果。再有，
功能上等价的蛋白或多肽可以通过应用重组DNA技术而产生，可根据对所改变的氨基酸的特性的考虑而进行操作，改变蛋白结构。人为的改变可以通过应用定点诱变的技术引入，如对酶活性或对HAS的抗原性加以改进，或对HAS突变体的检测加以改进从而在分子水平上检测HA合酶的活性。
另外，HAS编码序列的特定变化可产生具有经改变的大小分布或结构配置的HA。本领域的普通技术人员能够理解的是，HAS编码序列可以经过某种操作而产生改变了的透明质酸合酶，从而能够生产具有不同的聚合物大小和/或功能的透明质酸。例如，HAS编码序列可以经过某种程度的改变从而该透明质酸合酶具有改变了的糖底物特异性，因而该透明质酸合酶能够产生出新的、掺入了不同结构的如以前并不被掺入的糖或糖的衍生物的透明质酸类聚合物。这种新的被掺入的糖可以产生出经修饰的具有不同的功能特性的透明质酸，具有更小或更大的聚合物大小/分子量的透明质酸，或者两者兼具。正如本领域的普通技术人员能够理解的，根据HAS编码序列，就可以对该HAS编码序列进行改变和/或替换，从而获得所需的特性上和/或大小上的修饰。
本文所用的术语“经修饰的结构”是指含有并未在天然存在的HA多糖中被通常发现的糖或衍生物的透明质酸聚合物。术语“经修饰的大小分布”是指合成的透明质酸分子的大小分布并未在天然的酶中被通常发现；经改造的大小可以比正常的大得多或小得多。
各种不同大小的透明质酸产物可以应用于药物转运领域，改变了结构的酶可以与改变了大小的透明质酸相结合。如果透明质酸聚合物具有大约20个单糖而且可以大量生产，就可以在血管造影和创伤治疗上具有非常巨大的潜在应用价值。小分子透明质酸寡糖的另一个特殊应用是在用于医药目的的重组人蛋白的稳定性上。这种蛋白的主要问题在于它被从血液中清除而只有很短的半衰期。非常小的分子量的透明质酸能够很好地适合于这种角色而且是非免疫原性的和生物相容性的。与药物或蛋白相结合的大分子量透明质酸可以用于定位网状内皮组织细胞系统，因为它具有透明质酸的内吞作用受体。
本领域的普通技术人员根据本发明应能够理解的是，由多种方法可以用来对透明质酸合酶所产生的透明质酸聚合物的大小范围进行调节，以获得不同的大小。首先，对产物大小的动力学控制可以通过降低温度，降低酶的所用时间和降低一种或两种糖核苷底物的浓度来改变。降低任何这些或所有的变量都将会产生较低数量和较小分子量的透明质酸产物。这类方法的不利之处在于产物的产量也会被降低，并且可能很难获在各天或各个批次之间得重复性。
第二，对该酶合成较大的透明质酸产物的内在能力的改变。对该蛋白的改变可以通过重组DNA技术来操作，包括替换、缺失和添加特异的氨基酸(或者甚至引入代谢过程中非蛋白质类的氨基酸)这类改变可以获得内在的更慢的酶，它因而能获得对透明质酸大小比通过动力学方法更具重复性的控制。最终的透明质酸的大小分布由该酶的特殊性质而确定，这基于序列中的特定的氨基酸。在链球菌的酶和真核的透明质酸合酶之间具有20％的残疾是完全保守的，在特定的位置上有一系列的氨基酸控制或极大地影响着该酶对透明质酸聚合物的大小的作用。在这些残基上的特异改变可以产生出经修饰的HAS，它能生产具有经修饰的大小分布的HA产物。对seHAS,spHAS,pmHAS，或cvHAS的遗传操作上的改变，在透明质酸被释放之前就降低了该酶所能产生的透明质酸的原有的大小，这种改变将对生产比天然酶更小的或可能更大的透明质酸提供了很有效的方法。
最后，较大分子量的透明质酸可以用特异的透明质酸酶降解而获得较低分子量的透明质酸。但是这种方法实际上非常难以获得重复性，而且必须非常小心地重新纯化透明质酸以去除透明质酸酶和不需要的消化产物。
结构上修饰的透明质酸等同于通过改变所需HAS或spHAS上特定的氨基酸从而改变了透明质酸产物的大小分布。UDP-GlcNAc的衍生物，其乙酰基基团缺失或被其他的化学应用基团所替代，它特别有用。强烈的底物特异性必须依赖于那保守的20％中特定的一系列氨基酸。这些残基中的一个或多个特异的改变所产生出的功能性合酶与一个或多个底物的特异性相互作用比天然的酶更低。这种改变的酶因而可以利用其他的天然的或特殊的糖核苷来掺入所需的糖衍生物中，从而获得不同的化学特性而用于下列目的：(1)将特异药物、蛋白、或毒素共价结合于该经结构修饰的透明质酸，而用于一般或靶向药物的转运、放射学过程，等等；(2)将透明质酸本身共价胶联于其他的支持物上而形成凝胶，或其他的具有较强的物理特性的三维生物材料，和(3)将透明质酸共价胶联于一个表面而形成生物相容性的薄膜或单分子层。
本发明涉及一种新的可产生HA的HAS。利用各种分子生物学技术，从禽霍乱病原体A型多杀巴斯德氏菌中发现了新的HAS的基因。来自多杀巴斯德氏菌的此新HAS或PmHAS已被克隆并在其他种的细菌中显示出功能。此PmHAS蛋白可聚合真正的HA多糖。
转化有PmHAS的重组大肠杆菌产生的该碳水化合物可以被软骨HA结合蛋白所识别并对HA裂解酶的消化敏感。在本领域普通技术人员看来，这两种试剂都被认为是HA聚合物特异性的。而且，体外HA的合成对于UDP-GlcA和UDP-GlcNAc都需要。叠氮基-UDP-GlcA和叠氮基-UDP-GlcNAc都能够特异性地光学掺入进PmHAS，而叠氮基-UDP-Glc不能。正如在链球菌HasA和Xenopu的DG42情形一样，PmHAS这一种多肽将两种不同的糖基团转入到新生的HA链上。
许多形成被膜的格兰氏阴性菌，包括大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，和流感嗜血杆菌，拥有多组以操纵子形式调控的负责被膜生物合成的基因。这些操纵子含有多个基因，它们编码(1)糖核苷前体合成所需的酶；(2)用于外多糖聚合的糖基转移酶，和(3)用于多糖输出的蛋白。A型多杀巴斯德氏菌的HA被膜操纵子含有(1)KfaA类似物，(2)HA和酶，和(3)推测的UDP-Glc脱氢酶。多杀巴斯德氏菌的无被膜突变体H和L中的Tn916因子并不直接地整合于HAS基因，而是定位于KfaA的同源基因。
由于PmHAS存在于至少几个产生多糖所必需的基因位点上，任何一个这些被膜基因的伤害或缺损都可影响到巴斯德氏菌中HA的产生和被膜的形成。因此，通过破坏邻近的基因可以获得疫苗。例如，如果UDP-Glc脱氢酶被去除或被破坏，就不再有HA合酶的前体而不能合成HA。而且，如果Kfa或其他转移相关的基因被破坏，那么微生物就不能制造出表面HA。因此，在天然巴斯德氏菌微生物中HA合酶的产物，例如HA被膜，可以通过(a)破坏前体的形成，或(b)破坏聚合机制，或(c)破坏转移机制而被终止。
正如本领域的普通技术人员所能预计的，在氨基酸水平上，PmHAS与其他克隆的HAS并不相似。两个可能的基序，PmHAS上位于第477-480位残基的DGS(S/T)(SEQ ID NO:19)和位于第527-529位残基的DGS存在于HasA中。另一个相似的含有DGS的基序在PmHAS的第196-198位残基被重复发现。第一个基序的DG和DSD在所有HAS中是保守的。但是，在所有以前克隆的HAS发现的几个绝对保守的基序((S/G)GPLXXY(SEQ ID NO:20),GDDRXLTN(SEQ ID NO:21)，和LXQQXRWXKS(Y/F/W)RE(SEQID NO:22)在PmHAS中不存在。然而，不同的细菌糖基转移酶的比对在多杀巴斯德氏菌的HA蛋白的中央部分更为接近。这些酶已经表现出或预计能够转移GlcNAc，半乳糖，或GalNAc基团，它们大约为PmHAS大小的三分之一，并且它们氨基酸末端序列都与PmHAS多肽中部，第430-540位残基的序列相对。
PmHAS前420个残基的部分表现出与哺乳动物的UDP-GlcNAc：多肽GalNAc-转移酶的部分之间的相似性。这些发现可反映出PmHAS中的一个可能的结构域。PmHAS中后面的大约340个残基不与序列数据库中的其他条目明显相似。因此，多杀巴斯德氏菌的HAS是独特的并且极有可能是一个完全新类型HAS的原形。
PmHAS大约两倍于链球菌、病毒或脊椎动物的HAS－分别为972对417-588个残基。而且，PmHAS和其他已知的HAS疏水性作图不相似。利用TMPRED程序，该程序对于本领域的普通技术人员是易于了解的并是可以在互联网上获得的，预测出PmHAS只具有两个候选的跨膜螺旋(中心位于第170和510位残基)，而且该蛋白的两个末端都可能定位在细胞质中。在拓扑学上，这些推测暗示三分之一的这个多杀巴斯德氏菌多肽(大约340个残基)位于细胞质之外。另一方面，其他的HAS类型预测出了不同的拓扑性。
链球菌HAS的报告酶融合分析确定了在该酶中存在有不同的拓扑排列，包括(ⅰ)接近氨基酸末端的两个跨膜螺旋，(ⅱ)一个推测的细胞质结构域，和(ⅲ)在蛋白的羧基端那一半的三个膜相关的区域。膜相关的区域之间的连接环相当短(4-10个残基)；因此，该多肽链的绝大部分可能不是暴露在细胞外的。
下列详细的实验步骤和对结果的讨论，进一步确定本发明涉及一个新的且独特的PmHAS。
1．PmHAS的分子克隆
首次完成了Tn916插入诱变和探针的产生。Tn916用于破坏并标记多杀巴斯德氏菌的HA生物合成位点。Tn因子位于一个非复制的质粒上，通过电转将pAM150引入野生型形成被膜的多杀巴斯德氏菌菌株(ATCC号15742)中。斜射光目测检验初步筛选变化的菌落形态。野生型菌株形成较大的粘液状(“湿的”外观)菌落而呈现出彩色(红色和绿色)。选出较小的“干的”不带彩色的菌落并划出。利用墨水染色和显微镜进行第二次筛选确定的被膜形成状态。突变体染色体上Tn因子的位置通过Southem分析作图。
通过标记的染色体DNA直接双脱氧序列分析，获得来自几个独立筛选的突变体中被Tn破坏的位点的序列。简单地说，用HhaⅠ消化突变体染色体DNA，产生的嵌合的DNA片段，其中含有12kb的Tn916因子部分和多杀巴斯德氏菌的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳纯化。该嵌合片段作为模板，利用33P终止物和Tn916右臂末端引物(5’-gaccttgataaagtgtgataagtcc-3’(SEQ ID NO:23))进行循环测序反应。将序列数据用于设计PCR引物。利用本领域普通技术人员所熟知的Boehringer Mannheim制造的High Prime系统，将凝胶纯化的PCR-产物用地高辛标记。
下一步是分离功能性HAS位点。利用BamHⅠ酶切的Stratagene生产的λZap表达载体系统，获得Sau3A部分酶切野生型DNA的λ文库。用地高辛标记的PCR-产物进行杂交来筛选噬菌斑。用单独纯化的阳性λ克隆和ExAssist辅助噬菌体来共转染大肠杆菌XLI-Blue MRF’以产生噬菌细胞。将获得的噬菌细胞转化大肠杆菌XLOLR细胞以恢复质粒。
将该质粒转化进适合于HA多糖生产的宿主大肠杆菌K5(菌株Bi8337-41)中，该菌株生产UDP-GlcA，这是HA生物合成所需的底物，而在大多数实验室菌株中都没发现有显著水平的表达。另外，K5拥有许多其他的对于被膜多糖在大肠杆菌中转运所需的基因。用于表达研究的另一种宿主是大肠杆菌EV5，它是产生多聚唾液酸被膜的k1菌株的无被膜衍生物并拥有所有和K5同样的普通被膜多糖转运机制，但是它不具有高水平的UDP-Glc脱氢酶。
带有候选质粒的大肠杆菌转化子在完全培养基中生长，如先前所述对培养物检测HA多糖的生产，此外将细胞用8M尿素，0.01％SDS在95℃下抽提2分钟。HA检测试剂由Pharmacia Biotech公司生产，它是本领域普通技术人员所熟知的，使用了特异的HA结合蛋白来检测大于或等于0.1μg/ml浓度的HA。对多次确定的HA水平进行平均。对细菌培养物中的HA浓度对不同的细胞数进行标准化，细胞数通过测量A600值计算的，获得的数据表示为1μg/ml/A600的细菌。一种带有5.8kb的插入的质粒，pPm7A，使得大肠杆菌K5具有了生产HA的能力；只带有载体的细胞不能产生HA。一种pPm7A的截短的衍生物pPmΔ6e，它含有大约3.3kb的插入，能够在转化进大肠杆菌K5中之后指导HA的生物合成。因此，相应于pPmΔ6e的pPm7A质粒的两条链的序列被确定。发现了一个单一的完全的972个残基的ORF，被称作PmHAS，如SEQ ID NO:1所示。其相应的核酸序列如如SEQ ID NO:2所示。
然后进行了重组体多杀巴斯德氏菌的HAS的表达。利用Taq聚合酶和相应于推倒的氨基和羧基末端附近的引物(大写的密码子：有义链，5’-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAA-3’(SEQ ID NO:24)，和反义链，5’-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3’(SEQ ID NO:25)；起始和终止密码子分别为粗体字)，通过13个循环的PCR扩增出pPm7A插入中的PmHASORF。密码子2被改变了(T→C)以增加蛋白在大肠杆菌中的产量。该引物还含有EcoRⅠ和PstⅠ限制位点(斜体小写字母)以利于往表达质粒pKK223-3中的克隆(tac启动子；Pharmacia)。将获得的重组体，pPmHAS，转化大肠杆菌SURE细胞(Stratagene)，并将该菌株用作体外检测HAS的膜制备物的来源。将对数期培养物(LB培养基，30℃)用0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷诱导3小时，然后收获。将质粒转化大肠杆菌K5；对获得的菌株通过光学显微镜和浮力密度离心来检测被膜的存在。K5细菌的培养物不用常规的方法诱导，因为异丙基硫代半乳糖苷的添加不会显著地增加LB或合成培养基中HA的水平。
然后进行天然的多杀巴斯德氏菌的HAS的光亲和标记。放射性标记的UDP糖类似物，[32p]叠氮基-UDP-GlcA(3mCi/μMol)和[32P]叠氮基-UDP-GlcNAc(2.5mCi/μMol)按照文献和本领域普通技术人员所熟知的方法制备并纯化。来自多杀巴斯德氏菌野生型的膜制备物于50mM Tris,20mM MgCl2,pH7中与另一探针(终浓度20μM)一起冰上温育30分钟，然后用紫外光照射(254nm,90秒)。将蛋白用5％三氯乙酸沉淀，再进行SDS-PAGE分析。如果省略照射步骤则无放射性标记掺入。为了进行特异性对照，将10倍摩尔数过量的正常的UDP糖与探针和膜共同温育。再另一对照中还使用了[32p]叠氮基-UDP-GlcA(3mCi/μMol)。
对几个回合的诱变所产生的大约8×104的含有Tn的转化子进行菌落形态差异的扫描。通过墨水光谱分析，来自小的无色菌落(n=4)的细胞未检测到被膜(无被膜)，而来自中等大小的有色菌落的细胞(n=8)显示出具有野生型(微囊体)直径的约10-25％的被膜。无被膜的两个突变体，记作H和L，它具有作图于相同的HindⅢ或BstⅪ基因组片段的Tn因子，它以103的比率回复突变为野生型菌落形态。经Southern分析，各个回复突变体中的Tn因子从原位置上切离并重新插入到新的不同的位点上；另一方面，所有无被膜的亚克隆在原位置上保留了Tn因子。在来自突变体H细胞的膜制备物中未检测出明显的HAS活性；而从野生型细胞中获得了基本的HAS活性(分别为小于或等于0.7对120pmol转移GlcA/mg蛋白/小时)。这些发现提示突变体H和L中的Tn因子实际上导致了HA生物合称位点的被破坏。
为了获得两种无被膜突变体之间的联系，利用突变体H的破坏位点的序列所设计的引物，PmHF(5’-CTCCAGCTGTAAATTAGAGATAAAG-3’(SEQ ID NO:26))和相应于Tn916左端的引物，TnL2(5’-GCACATAGAATAAGGCTTTACGAGC-3’)，将突变体L的染色体作为模板进行了PCR。获得了特异的大约1kb的PCR产物；另外，如果替换了PmHR(PmHF的反向互补物)或Tn916的右臂引物，则不能形成PCR产物。将PCR产物用作杂交探针获得了多杀巴斯德氏菌的HAS的功能性拷贝。
筛选了大约104个噬菌斑后获得了六个杂交阳性的噬菌斑，将这些噬菌斑转成质粒。发现一个质粒，pPm7A，能够导致K5体内产生HA(20μgHA/ml/A600细菌)。带有对照质粒的大肠杆菌K5不产生HA(小于或等于0.05μg HA/ml/A600)大肠杆菌XLOLR或EV5细胞(缺少UDP-Glc脱氢酶活性)不产生HA，即使它们含有pPm7A质粒(小于或等于0.05μg HA/ml/A600)。这些遗传学证据表明pPm7A的插入并不编码功能性UDP-Glc脱氢酶。
一个截短的pPm7A质粒的衍生物，pPmΔ6e，它带有能够指导HA生物合成的最小的插入，含有单一的完整的ORF，编码一个如SEQ ID NO:1所示的972个残基的蛋白。在SEQ ID NO:1中没有明显的启动子，但有一个粗体字标记的推测的核糖体结合位点，其中心在-10至-7，由TMPRED预测的两个推测的跨模区域用下划线标出(第162-182和503-522位残基)。SEQ ID NO:1的PmHAS是链球菌HasA的两倍。该蛋白是来自多杀巴斯德氏菌的HA合酶，PmHAS。推导的Mr为111,923，计算出的等电点为6.84。SEQ ID NO:2是PmHAS的核苷酸序列。
将此PmHAS用BLASTP搜索蛋白序列数据库查询。PmHAS的中间部分(残基436-536)与来自广泛的各属的，包括链球菌属，弧菌属，奈瑟氏菌属，和葡萄球菌属，细菌的糖基转移酶最具同源性，它们形成外多糖或脂多糖的碳水化合物部分(最低概率，10-22-10-10，如图1所示，图1图示了多杀巴斯德氏菌与其他的糖基转移酶之间的比对。MULTALIN比对表明PmHAS的中间部分(残基436-536)与各种产生其他外多糖(嗜热链球菌的EpsⅠ；14型肺炎链球菌的Cps14J)或脂多糖的碳水化合物半族的酶的氨基末端最为相似。只有少数可能的实例列在图1中。化脓链球菌的HasA(残基61-168)与该列出的PmHAS区域具有有限的相似性。
最值得注意的序列相似性是DGSTD(SEQ ID NO:28)和DXDD(SEQ ID NO:29)基序。意外地，PmHAS与链球菌，病毒，或脊椎动物的HAS没有显著的全局相似性，具有的最小总概率为0.33。只有链球菌的HasA中一个较短的区域与PmHAS以可信的程度相对应，如图1所示。
PmHAS前半部分的一小片段也与哺乳动物的UDP-GlcNAc：多肽GalNAc-转移酶的部分相似，该酶启动粘液素类型蛋白的糖基化，具有的最小总概率大约为10-3，如图2。图2所示PmHAS的第342-383位残基与哺乳动物的UDP-GlcNAc：多肽GalNAc-转移酶的第362-404位残基最为相似。对于图1和图2，相同的残疾用粗体字和下划线标出，一致性的符号为！，I或V；#,N,D,E或Q中的任何一个。％,F或Y。整个序列上的酸性残基是非常保守的。
PmHAS部分ORF(27个残基)的下游与几种来自细菌的，包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、和肺炎链球菌的UDP-Glc脱氢酶的氨基末端非常相似(67-74％的相同性)。在原有的pPm7A克隆上的严重截短将预计会导致脱氢酶活性的完全丧失。PmHAS的其他的ORF(623个残基)的上游与大肠杆菌K5 KfaA蛋白非常同源，最小总概率为10-52，该蛋白据推测与被膜多糖向细胞外转运相关。
PmHAS预测的972个残基大小(112kDa)通过光亲和标记来自多杀巴斯德氏菌野生型的膜制备物而确证。将两种[32p]叠氮基-UDP-GlcA和[32p]叠氮基-UDP-GlcNAc探针以UV依赖的方法掺入到大约110kDa的蛋白中。图3是以UDP糖类似物标记的pmHAS的光亲和性。[32P]叠氮基-UDP-GlcA和[32P]叠氮基-UDP-GlcNAc与从野生性多杀巴斯德氏菌分离出的膜制备物(45μg的蛋白)一起温育并用UV光照射。10％的SDS-PAGE凝胶放射性自显影如图3所示。两种探针以UV依赖的方法光标记了大约110kDA的蛋白(“-”泳道)。为了确定光掺入的特异性，将一个平行样品同样处理，而在其反映混合物中含有10倍过量的非标记竞争物(分别为UDP-GlcNAc或-UDP-GlcA；标记为“+”泳道)。与“-”泳道相比，该条带的强度下降了。标准以kDa标出。
用相应的非标记的天然的UDP-糖前体的竞争降低了探针光掺入的程度。在平行实验中，[32P]叠氮基-UDP-Glc，正常的HA前体的类似物，不标记该110kDa的蛋白。而且，来自Tn突变体的膜制备物在该蛋白没有或者只有极低数量的叠氮基-UDP-GlcA光掺入。如图4所示，来自野生型的膜制备物(60μg的蛋白)(W)或者各种无被膜的Tn突变体(A,G,或H)被用[32p]叠氮基-UDP-GlcA光标记。约110kDa蛋白的附近的放射性自显影如图4所示。在A和G样品中未见到光掺入。H样品中的程度的光掺入是由于该突变体中发现的低比率的回复突变。在W样品中光亲和标记的蛋白的大小非常符合对克隆的PmHAS的ORF所预测的Mr。
来自含有pPmHAS质粒的大肠杆菌SURE细胞的膜，但非来自只带有pKK223-3载体的细胞的样品，当提供了两种UDP-GlcNAc和UDP-GlcA时，体外合成了HA(分别为25对小于或等于1.5pMolGlcA转移/mg蛋白/小时)。如果UDP-GlcNAc空缺或者二价金属离子被EDTA螯合，则未发现[14C]-GlcA的掺入。来自重组体HAS的HAS活性与获得自野生型多杀巴斯德氏菌膜的酶相似，因为Mn2+比Mg2+能高10倍地刺激活性。
利用标记的结合HA蛋白，通过放射测量试验还检测了重组大肠杆菌培养物中HA多糖的存在。带有pPmHAS的大肠杆菌K5产生了460μg HA/mg/A600。只带有pKK223-3载体的K5细胞未产生HA(低于或等于0.05μg HA/mg/A600)。作为对比，生长于相同的培养基中的野生型P.multoceda产生1,100μg HA/mg/A600。带有pPmHAS的大肠杆菌K5产生了如此高水平的HA，以至于它变得能够形成被膜。如图5A所示，墨水染色的重组大肠杆菌的显微照片(1000倍放大)表明，带有pPmHAS的大肠杆菌K5产生了实质性的被膜，表现为在细胞周围的白色晕轮。
该重组菌株的被膜的半径大约0.2-0.5μm(假定细菌细胞宽度为0.5μm)。该被膜可以通过用绵羊睾丸透明质酸酶或链霉菌HA裂解酶处理而去除。如图5B所示，通过简单的用链霉素HA裂解酶的处理，被膜从大肠杆菌K5(pPmHAS)细胞上被去除了。因此，PmHAS可指导HA多糖的聚合作用。
通过光学显微镜观察，天然的K5宿主菌株和含有pKK233-3载体的转化子都没有易于观察到的被膜。带有pPmHAS的K5细胞还可以通过浮力密度离心来确定形成了被膜。该重组细胞浮于58％的Percoll垫层上，而载体对照细胞或经透明质酸酶处理的重组细胞则穿过Percoll层沉淀。
大肠杆菌K5中的pPmHAS是第一个以HAS产生重组HA的生产系统；其他优化的载体和/或宿主可能会获得更高的产量，这些其他优化的载体和/或宿主也是本文所考虑应用的。本领域的普通技术人员根据本发明，就能够优化这种载体和/或宿主。
2-PmHAS的酶学特性
利用牛血清白蛋白标准，通过考马斯染料结合试验来确定蛋白。多杀巴斯德氏菌野生型(ATCC15742)，是一种高毒性的火鸡菌株，它形成非常粘的菌落，37℃保存在有氧条件下。该菌株的无被膜突变体，记作TnA，它形成较小的”干的”菌落，它是通过本文新描述的Tn916插入诱变的方法而产生的。
对从带有含hasA重组质粒的大肠杆菌中生产HA合酶的方法加以修改，从而制备多杀巴斯德氏菌总膜。将细胞强烈震荡培养至对数中期(0.4-0.8A600)，然后加入绵羊睾丸透明质酸酶(Sigma V型，20单位/mL终浓度)以去除被膜。40分钟之后将细胞在冰上冷却并离心(2000g15分钟)收集。将细胞用PBS重新悬浮并离心，洗涤两次，并将沉淀储存于-80℃。所有下列个步骤都在冰上操作，除非另有说明。
以1/400原培养物体积的比例用含有蛋白酶抑制剂抑肽素亮肽素的20％的蔗糖和30mM Tris,pH8.0重新悬浮细胞。用溶菌酶消化(加入1/10悬浮液体积的含有0.1M EDTAd的4mg/ml的酶，温育40分钟)，然后由超声波破损(功率设置3,30秒开/停的三个循环；带有微探头的Heat Systems W-380)使细胞裂解。在超声波步骤之前，在混合物中加入硫乙醇钠(0.1mM终浓度)，然后加入苯甲基硫酰氟化物。在所有操作中，PBS都含有同样浓度的新鲜配制的硫乙醇钠。
将裂解物用DNase和RNase(分别1μg/ml,4℃下10分钟)并将细胞碎片通过低速离心(10000g,1小时)去除。上清组份用PBS稀释六倍并将膜组份通过超离(100000g,1小时)收集。将沉淀反复悬浮于含有10m MgCl2的PBS中洗涤两次，然后超离。为了获得用于金属特异性研究的膜制品，在洗涤步骤中省去MgCl2而用0.2mMEDTA替代。按1-3mg/ml蛋白的浓度，用50mM Tris,pH7和0.1mM硫乙醇钠悬浮膜制备物，储存于-80℃。
将来自糖核苷前体UDP-[14C]GlcA(0.27 Ci/mmol,ICN)的放射性标记的衍生物掺入高分子产物中，从而对HA合酶活性进行常规的检测。各种试验缓冲液，图中图例所标出的，还含有0.03mM DTT。在反应混合物中加入膜并于37℃温育以起始反应(100μl终体积)。2小时后加入SDS(2％终体积)以终止反应。为了进行动力学研究，通过下行纸色谱法(Whatman 3M,65:35的乙醇/l M醋酸铵，pH5.5)分离产物与前体。在液闪计数之前，纸色谱起始点的HA多糖用水洗脱。进行该试验通常的条件是不多于5％的前体被有限数量的酶所消耗。
确定真正的HA中的掺入的对照试验包括，所需的第二种糖核苷前体空缺或者用来自链霉菌Streptomyces hyalurolyticus的特异的透明质酸酶进行消化。用Sephacryl S-200(Pharmacia)的以PBS进行凝胶过滤层析，以确定优化条件下体外形成的放射性标记的聚合物的分子量。这些样品的处理同纸色谱一样，只是在终止之后，将其于95℃加热2分钟并在上柱之前通过离心(15000g7分钟)来澄清。
用EDTA(0.2mM)螯合试验混合物存在的任何金属离子，以确定HAS活性的金属依赖性。多种二价金属离子包括Mg,Mn,Cu,Co,和Ni以它们的氯化物形式进行了测试。在保持另一个放射性前体的恒定且饱和浓度下，滴定一种糖核苷浓度，从而计算底物的Km值。为此研究，使用了UDP-[3H]GlcNAc(30 Ci/mmol,NEN)以及UDP-[14C]GlcA前体。
多杀巴斯德氏菌细胞产生了易于观察的细胞外HA被膜，并且由于链球菌的HasA是一个跨膜蛋白，因而对禽霍乱病原体的膜制备物进行了检测。在早期的试验中，如果在类似于测量链球菌HAS的活性时所用的条件下，检测HA中UDP-GlcNAc依赖的UDP-[14C]GlcA的掺入，只用超声波破碎获得的粗的膜制备物只有很低的水平(大约0.2 pmol的GlcA转移(μg蛋白)-1h-1)。来自带有重组hasA质粒的大肠杆菌的酶起初也难于分离。与这些结果相对应，用类似的方法从链球菌中可获得很容易检测得到的数量。
另一种制备方法在蛋白酶抑制剂存在下利用冰预冷的溶菌酶处理并结合超声波破碎，可以从两种格兰氏阴性菌种获得HAS活性的基本回收。利用此方法可以从野生型多杀巴斯德氏菌的粗膜中常规地获得5-10pmol的GLcA转移(μg蛋白)-1h-1的特异活性。在不存在UDP-GlcNAc时，实际上没有掺入到高分子物质中的UDP-[14C]GlcA的放射性(为利用两种糖前体的相同试验的1％以下)。提供了两种糖核苷前体条件下，从物被膜的突变体TnA中制备的膜不具有可检测得到的HAS活性。用Sephacryl S-200进行的凝胶过滤层析分析表明，主要的14C标记的体外合成的产物的分子量为＞=8×104Da，因为该物质在外水体积中被洗脱；该值相应于HA的分子至少由400各单体构成。该产物还对链霉菌的透明质酸酶消化敏感，但对链霉蛋白酶具有抗性。
HAS试验的参数可以变化，以利于多杀巴斯德氏菌获得多糖种最大的UDP-糖的掺入。链球菌HasA需要Mg2+，因此在多杀巴斯德氏菌膜的起始试验中含有该金属离子。多杀巴斯德氏菌的HAS在Tris类的缓冲液中在pH6.5至8.6下具有相对的活性，最佳为pH7，如图7所示，它描述了多杀巴斯德氏菌的HAS活性对pH的依赖性。膜催化的HA多糖中[14C]GlcA的掺入在各种pH值(50mM Tris/2-(N-(吗啉)乙磺酸，bis-Tris/HCl，或Tris/HCl；未发现大的缓冲离子特异性作用)的缓冲反应中进行测量。温育的混合物中还含有20mMMgCl2,120μM UDP-GlcA(4.5×104dpm/试验)，和300μM UDP-GlcNAc。试验中所用的最佳缓冲液pH7Tris的掺入被设为100％的活性。结果发现在中性附近具有较宽的pH适用范围。
在中性pH下的至少1小时内HAS的活性与温育时间呈线性关系。在含有50mM,pH7,Tris 20mM MgCl2的反应中加入了100mMNaCl，降低了大约50％的糖掺入，因而多杀巴斯德氏菌的酶在高离子强度下表现出较低的活性。
多杀巴斯德氏菌的HAS活性对离子强度的特异性在pH7，图8中进行了测定。图8描述了HAS活性对离子强度的依赖性。增加Mg(圆圈)或Mn(方形)离子的条件下测定了HA的产量。将用0.2mMEDTA预洗的膜(46μg蛋白)在含有金属离子的50mM,pH7,Tris,120μM UDP-GlcA(4.5×104dpm/试验)，和300μM UDP-GlcNAc的混合物中温育1小时。不含有金属离子的背景(22dpm)从每个点上减去。Mn比Mg更有效。
在存在EDTA而无离子的条件下，为检测到放射性前体掺入多糖(＜0.5％的最大信号)。在低离子浓度的测试的金属中(Mg,Mn,Co,Cu,Ni)Mn2+给出了最高的掺入率。Mg2+在高出10倍的浓度下给出相当于Mn2+的大约50％的作用。10mM的Co2+或Ni2+支持了低水平的活性(分别为1mM Mn2+的试验的20％或9％)，而提供了10mM的Cu2+的膜没有活性。实际上，混合了10mM的Cu2+和20mM Mg2+的膜制备物几乎不发生多糖中标记物的掺入(＜0.8％Mg的单独使用的值)。
在Mg2+存在下多杀巴斯德氏菌的HAS执行了起始特性。该酶对其糖核苷前体的结合亲和性通过测量表现的KM值来确定。在多糖中掺入的[14C]GlcA或[3H]GlcNAc分别在各种浓度的UDP-GlcA或UDP-GlcNAc下进行监测，分别见图9和10。
图9描述了HAS活性对UDP-GlcNAc的浓度依赖性。在含有50mM,pH7,Tris,20mM MgCl2,和800μM UDP-GlcA(1.4×105dpm的14C)的缓冲液中，将膜(20μg蛋白)与增加浓度的UDP-GlcNAc一起温育1小时。背景的放射性(相同的试验但不加入UDP-GlcNAc)从每个点上减去。滴定中HA中最高的特异性掺入率(平均大约780dpm/小时)确定为VMAX,作为标准设为100％。
图10描述了HAS活性对UDP-GlcA的浓度依赖性。与图9描述的试验向平行，在相同的通用缓冲液和试验条件下，增加数量的UDP-GlcA与1mM UDP-GlcNAc(2.7×105dpm的3H)一起温育。背景的放射性(不加入UDP-GlcNAc的试验)从每个点上减去。数据同9中一样给出。在VMAx时的特异掺入平均大约730dpm/小时。
对图11所示滴定数据利用Hanes-Woolf作图([S]/V对[S])测定出在含有Mg2+的缓冲液中，表现的KM值为UDP-GlcA的～20μM和UDP-GlcNAc的～75μM。图11描述了Hanes-Woolf作图计算的VMAX和KM。用以产生图9(方形)和图10(圆圈)的特异掺入的数据以[S]/V对[S]作图。平行的斜线代表1/VMAX，表明糖核苷前体的最大速率时相等的。X轴截距表示-KM，获得的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的KM值分别为75和20μM。
两种糖的VMAX值是相同的，因为斜率相同。对比Mg试验的结果，UDP-GlcNAc的KM值增加了25-50％，达～105，且VMAX值在Mn存在时增加了2-3倍。这些值列于表Ⅰ中。
表Ⅰ
膜的洗涤 试验离子 KM(μM) VMAX(pmol/h)
Mg  Mg  75±5 114±36
EDTA  Mg  55±25 98±1
EDTA  Mn  105±5 380±70
如前所述，病原体多杀巴斯德氏菌和S.pyogenes的HA被膜是攻击宿主防御的毒素因子。来自任何细菌来源的HA合酶都利用UDP-糖，但是它们略有在pH和金属离子依赖性和KM值方面的不同的动力学参数。两种酶都在pH7时最具活性，但是PmHAS在碱性pH方面，至少达pH8.6时表现的功能性更好。在另一方面，spHAS据报道在略酸性的pH下表现为更具活性而在pH7.4时相对不具活性。多杀巴斯德氏菌的酶在体外试验条件下利用Mn2+比Mg2+更有效率。PmHAS结合UDP-糖比链球菌HasA更为紧密。测量出的粗膜中PmHAS对于两种底物的KM值比链球菌膜上的HAS所获得的数值低2-3倍。
3．将PmHAS用于免疫接种
PmHAS的DNA序列还可以用于生产潜在的减毒疫苗多杀巴斯德氏菌菌株，这可以利用已破坏的基因通过同源重组，经过敲除正常的微生物基因而完成。此外，PmHAS的DNA序列还可以用来产生诊断细菌类型的探针，诊断作为家禽，牛，羊和猪的病原体的相关的多杀巴斯德氏菌类型。
至少有5种不同类型的细菌病原体多杀巴斯德氏菌，它们带有不同的被膜抗原。由A型菌株引发的禽霍乱或鸟类出血性败血病在家禽业中是广泛传播的具有经济危害性的疾病。禽霍乱的急性爆发常常只有当家禽突然衰竭时才被发现，而这种症状通常在死亡前几个小时才表现出来。虽然对多杀巴斯德氏菌毒性的分子机制知之甚少，但是看来病原体的毒性菌株具有多糖被膜，而它们的菌落在琼脂糖平板上表现出粘液状或“湿的”形态。白细胞很难吞噬和灭活这些细菌，而补体复合物无法结合该细菌膜以导致其裂解。Carter A型的多杀巴斯德氏菌导致了可能90-95％的禽霍乱，其主要的被膜成分是多糖HA，而HA并不触动几乎所有动物王国成员的免疫应答。即使发生了免疫应答，也还会由于禽类的自身免疫反应而产生问题。A型的多杀巴斯德氏菌菌株还明显导致了猪和牛的呼吸型出血性败血病和牛的航运热。
两种其他的多杀巴斯德氏菌被膜类型，D型和F型，被研究的很少，但是它们是北美流行的病原体。F型可以从5-10％的禽霍乱中分离出来。D型还能导致牛、羊、和猪的肺炎。对从这些家畜的肺部创口的分离物的分析，其被膜类型中25-40％是D型，其余的是A型。另外，D型菌株还与猪的萎缩性鼻炎密切相关。D型和F型菌株的被膜由不同的具有未知结构的多糖所构成，但是它们看来与脊椎动物体内普遍存在的分子软骨素相类似。软骨素总的骨架结构，重复的(β1,4)GlcA(β1,3)GlcNAc单位,与HA非常相似。因而并不奇怪，D型和F型多糖缺乏免疫原性。
通常，由于先前的感染(或免疫接种)获得的针对细菌表面成分的抗体，对于白细胞在吞噬作用中结合细菌十分重要的物质；这一特征常使免疫应答在抵抗疾病过程中极为有效。因此，由非免疫原性的聚合物构成的被膜，诸如HA或软骨素类的糖，阻断了宿主防御中所有过程。化脓链球菌，是人的病原体，也利用HA被膜作为分子“模拟物”以保护其本身不受宿主防御的攻击。无被膜的化脓链球菌突变体不能在血液中存活并且在小鼠中比野生型的毒性低100倍。许多毒性的大肠杆菌菌株拥有由其他模拟宿主分子的多糖构成的被膜而帮助细胞躲避免疫系统。所有这些病原体细菌的被膜都是进化选择的产物，为了抵抗疾病它们必须被克服。
先前的调查集中在多杀巴斯德氏菌的被膜和其在毒性中的作用上。对于A型家禽菌株，研究了野生型的形成被膜的细菌和各种无被膜形式，测试了它们在分离的宿主防御(白细胞和补体)攻击下的存活能力或者导致活禽感染和死亡的能力。无被膜的细菌通常是(a)自发产生的突变体；(b)化学诱变的突变体；或者(c)用透明质酸酶，一种特异的降解HA的酶，处理的野生型细菌。总之，被膜缺陷型A型细菌很容易被体外分离的宿主防御杀死。
火鸡的血清可杀死突变体和Haase处理的细胞，而野生型细胞却继续繁殖。还涉及补体系统，因为在与细菌一起温育之前加热或者用钙螯合剂处理血清，杀菌能力都会丢失。形成被膜的野生型细胞消耗或降低了血清中的补体水平而不被灭活，这表明该复合物与细胞结合但并不裂解它。火鸡巨噬细胞和嗜异细胞比对于野生型细胞更爱吞噬无被膜的变异体和Haase处理的细胞。
在活体动物试验中，通过LD50(例如，对50％的被测动物的致死剂量)的确定，自发的突变体比相应的野生型父本菌株具有低103-105倍的毒性。这种极大的差异表明了被膜在A型菌株的发病机制中的重要作用。在活的火鸡中该细菌的命运也依赖于被膜的形成；只有野生型细胞才能在活体内生存。注射后15-20小时，在血液中发现的野生型细胞浓度比不形成被膜的突变体高105倍。HA被膜的另一种功能是支撑并形成菌落。脊椎动物体内的某些细胞在其表面具有特异的HA结合蛋白；细菌可能可以通过这种蛋白/HA的相互作用而结合宿主。
同样，D型和F型多杀巴斯德氏菌的被膜也表现为毒性因子，它使得细菌对吞噬作用产生抗性。当用软骨素酶处理D型和F型细胞时，细菌失去了它们的被膜而更易于被体外吞噬。而且，这些聚合物不具有强免疫原性。体内测试中，形成被膜的D型菌株在猪中产生了更为严重的鼻损伤，并且在小鼠中比不形成被膜的变异体具有更低的LD50(分别为102对107-8个细胞)。
在上述的对A型和D型突变体的研究中，其缺陷的遗传学特征并不清楚，并且还没有简单的方法可以对该突变作图。特别是化学诱变，很可能在一个所给的“突变体”中有着多个突变。而且，在“无被膜的”突变体中并不表明HA的生产被彻底根除了；无法通过菌落形态、光学显微镜或者化学测试检测出的薄型被膜可能仍然存在。需要更为灵敏的辐射测量和浮力密度试验检测很小的被膜。利用这些新方法已经确认，在几种毒性试验中被报道为无被膜的菌株，实际上具有非常薄的HA被膜。因此，重要的是确定真正无被膜菌株的效果。
涉及多杀巴斯德氏菌的被膜生产的基因在历史上并不为人所知。在另一种相关属中的细菌，流感嗜血杆菌，的被膜基因座位上的几个基因曾被作图并测序，但是对该生物合成装置的分子细节并不清楚。即使在大肠杆菌这一研究深入的格兰氏阴性菌中，每一个推测的基因产物的确切功能也并为完全了解，虽然其被膜形成的位点已经被彻底作图并且也已经从多种被膜类型中获得了DNA序列。
化脓链球菌的HA生物合成位点的克隆和测序已有报道。该微生物与多杀巴斯德氏菌一样，利用HA被膜来躲避人的防御系统。该HA操纵子含有三个基因，串联排列在大约4kb的DNA上。第一个基因，hasA，编码45.1kDa的HA合酶，聚合两种糖核苷前体，UDP-GlcA和UDP-GlcNAc，形成HA多糖。第二个基因，hasB，编码45.5kDa的UDP-葡萄糖脱氢酶，转化UDP-葡萄糖(UDP-Glc)形成UDP-GlcA用于HA的生物合成。第三个基因，hasC，编码一个34kDa的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，使UTP和葡萄糖-1-磷酸形成UDP-Glc。还有一个辅助性的酶，用于形成被膜生物合成所需的UDP-糖。另一个位于染色体其他位点的“看家基因”细菌正常的代谢途径提供UDP-Glc。由于作用与细胞壁的合成，UDP-GlcNAc存在于所有的真细菌之中。因此，HA合酶和脱氢酶是异源细菌中需要用于指导HA多糖合成的仅有的两个外生蛋白。化脓链球菌的HA合酶，预计是一个带有跨膜螺旋的膜蛋白，它既聚合HA又转运生长的多糖链到细胞外部。
正如上文所讨论的，多杀巴斯德氏菌的负责被膜生产的基因已经被分离和测序。(例如见SEQ ID NO:1和2)。该基因是本发明公开和要求的一部分。正如上文所讨论的，多杀巴斯德氏菌被膜的聚合物对于宿主具有两难性。利用PmHAS基因序列的信息，重组产生的带有被“敲除”的HA合酶基因的多杀巴斯德氏菌菌株将能够破坏多杀巴斯德氏菌细菌被膜的合成。将“敲除”菌株用作疫苗将可以使宿主生物挡住该领域病原体的攻击。
如上所述，Tn916是一个多能的被证实的诱变体，可以插入到多杀巴斯德氏菌的染色体的不同的看来是近似随机的位点上。通过电转移将Tn置于一个“自杀”质粒上－例如不能在多杀巴斯德氏菌复制--引入细胞。Tn以4000次/每个生物的DNA的频率移开或者跳离质粒并进入基因组。获得的后代拥有来自Tn的四环素抗性基因并可以容易地通过药物筛选出来。
如上所述，事实上从毒性父本菌株中产生了一组独立的转座子突变体，它在被膜生物合成上有缺陷。对大约105个转化的菌落通过联合应用目测的和生物化学筛选，发现了两类被膜缺陷型，它们导致了微型被膜或者无被膜突变体。第一类(几种独立的菌株)具有非常小的HA被膜，因而称作微型被膜。形成被膜的野生型菌株在培养基平板上产生大的粘液状的，彩色的菌落，并且单个细胞形成的被膜的厚度在光学显微镜下测量大致相等与细胞体的直径。相比之下，微型被膜菌株形成较小的彩色的菌落，在平板上看上去有些干；其单个细胞的被膜厚度只有大约野生型的四分之一或更小。
四个突变体(四个独立的菌株)看来是真正的无被膜的，它们在培养基平板上形成小的、干的菌落。在光学显微镜下没检测到被膜。无被膜菌株的浮力密度，与用透明质酸酶处理而被剥去被膜得野生型粗暴相等。这些菌株还缺少了HA合酶活性；将外生性放射性标记的UDP-糖前体加入到来自这些突变体的制备物中，但没有HA多糖的形成。
两个这样的无被膜突变体，TnH和TnL，具有有趣的特性，它们以大约10-3的频率偶尔地回复突变成野生型，在培养基平板上表现出被膜表型。通过光学显微镜观察和HA多糖的放射性剂量试验真实，这种回复突变的细胞具有野生型被膜。其分子解释是Tn偶然地从被膜基因处精确地切离(没有添加或缺失碱基)并整合到染色体的其他部位。获得的形成被膜的后代在培养基平板上很容易观察。这种返祖现象是典型的遗传学证据，表明这两个菌株中的Tn曾经诱变了被膜合成所需的一个重要位点。但是，由于其相对的不稳定性，Tn-衍生的突变体对于减毒疫苗菌株是不稳定的；会以某中频率产生毒性形式。
利用Southern杂交对两种原来的无被膜突变体和形成被膜的回复突变进行Tn位点的作图。如图12，经HindⅢ或BastⅪ消化的类型证实，TnH和TnL在相同的位点上具有Tn因子。图12是Tn突变体的Southern杂交作图。将来自被膜突变体、形成被膜的回复突变、和对照的染色体DNA用HindⅢ消化。DNA用凝胶电泳分离并用于Southern杂交。由于内部插入的限制位点，Tn探针识别出每个转座子的两条带(形成一条较大的10kb和一条较小的5kb片段)。Tn探针不与来自不含有Tn的父本菌株的DNA杂交(0泳道)。还检测了来自无被膜突变体TnH(H)和TnL(L)的独立菌落的多个DNA制品或者单个形成被膜的回复突变体(划线字母表示)。除了TnL具有2个拷贝的Tn(亚培养的一个菌株含有3个拷贝)，所有突变体都具有单一的Tn插入。TnW(W)是粘液状的含有Tn的对照菌株。标出了λ/HindⅢ标准的23.1,9.4,和6.6kb(从上至下)条带的位置。
无被膜突变体H和L(没有HA合酶活性)，和一个代表性的微型被膜突变体TnD(D)中的Tn因子，作图在相同的位置。由于回复突变成粘性表型，相关的Tn因子在各种情况中都移到了新的位点。突变体中被破坏的DNA在该位点被分离并产生了被膜基因的探针。
随后的序列分析确定出TnH和TnL相隔大约1kb。在各种情况中，这些突变体的回复突变在原来的位点上失去了Tn而得到了一个新的Tn位点(如图12中，带有下划线的字母的泳道)。另外，从未发现任何微型被膜回复突变成形成被膜的形式。导致所有微型被膜突变体的Tn(以TnD代表)都作图在与TnH和TnL突变体相同的17kb的HindⅢ片段上。这些定位通过BstⅪ的作图得以确证。
在另外的无被膜的突变体TrnA和TnG中，Tn因子定位于其他不相关的基因上而HA被膜位点由于自发突变表现出无功能。这种偶发的自发突变是预料之中的；实际上，在对链球菌被膜位点的类似研究中，13个菌株中的12个是自发突变的结果。
利用Tn916的插入诱变来鉴定并克隆多杀巴斯德氏菌与HA被膜生物合成相关的DNA。为了完成这项任务，进行了三个步骤：(ⅰ)利用相应于Tn916末端DNA的一个引物对Tn插入位点的宿主DNA测序；(ⅱ)根据新的序列设计出PCR引物以扩增两个Tn因子之间的DNA片段，并(ⅲ)利用该被膜位点特异性PCR产物作为杂交探针来筛选野生型基因组在λ病毒文库中的功能性克隆。
获取临近Tn的多杀巴斯德氏菌DNA的关键步骤是运用最近DeAngelis,P.L.(1998)“多杀巴斯德氏菌中转座子Tn916的插入诱变和对破坏位点的直接测序”，微生物发病机制，中详细描述的直接测序技术，该文献在此提及可以参考。所有被膜类型的多杀巴斯德氏菌基因组都含有许多限制酶HhaⅠ的位点；因此几乎每个这样消化的DNA片段都小于7kb，如图13中0泳道所示。
图13描述了用于Tn插入位点的序列分析的嵌合DNA模板。通过这种方法，可以快速直接地获得任何被Tn916破坏的基因的DNA序列。该方法利用了Tn因子有差异的敏感性和A型多杀巴斯德氏菌基因组的限制酶HhaⅠ的位点。16kb的Tn因子只有1个HhaⅠ位点，可产生12和4kb的消化片段。因此，任何Tn因子破坏的基因都会产生另外的一个12kb的DNA。这种增加的HhaⅠ片段大小使得可以方便地通过琼脂糖电泳简单地从其余的染色体DNA中分析出Tn标记的基因。该0.7％的凝胶电泳显示出来自不含有Tn的父本菌株的(0泳道)、和几种含有Tn的突变体(Tn突变体泳道)的染色体DNA的HhaⅠ消化类型。λ/HindⅢ标准(S泳道)以kb标注。迁移至大约13-17kb的嵌合的Tn/基因组DNA片段(箭头所示)只在Tn突变体中被发现。值得注意的是L泳道有三个嵌合条带；该特殊的突变体具有三个Tn因子(见图12)。
嵌合DNA可以分离并直接用作测序模板；不需要克隆或PCR。得到的较大的嵌合DNA分子，易于从其余的较小的基因组片段中通过电泳分离出来，它可以用作循环测序反应的模板。相当于Tn916右侧末端的PCR引物指导向外延伸至被破坏的DNA。因此，突变体DNA的插入位点的序列数据可以无需PCR扩增或克隆模板DNA而常规地获得。
新的序列信息可以用于设计PCR引物用以扩增TnL和TnH突变体之间的DNA区域。将特异的1kb的产物用作杂交探针以获得A型多杀巴斯德氏菌的5.8kb的被膜生物合成操纵子部分。如图14所示，A型基因组DNA克隆的插入可以直接地指导大肠杆菌中HA的生物合成。现发现该开放阅读框编码：两个蛋白，Kps和KfaA，它们类似于大肠杆菌中表现为多糖转运的分子；一个HA合酶，它聚合HA多糖；和一个前体形成酶，UDP-普通脱氢酶。该原始质粒的缺失分析表明整个的HA合酶对于HA在异源细菌中的产生是基本的。相应与TnH和TnL的原始的Tn插入位点以星号标出。Tn插入事件看来导致了极性突变，它终止了下游HA合酶和脱氢酶基因的表达。因此，通过序列分析，发现了新的PmHAS和类似于E.coli的KfaA的、推测的多糖转运同源物的整个开放阅读框。数据还表明，一个UDP-Glc脱氢酶同源基因，它能够产生UDP-GlcA前体，和另一个转运蛋白，E.coli的Kps基因的同源基因，存在于HA合酶附近。
来自多杀巴斯德氏菌的单一的110kb的蛋白，PmHAS，指导E.coli中HA被膜的产生。带有质粒上含有PmHAS的重组细胞所产生的被膜的厚度与毒性野生型菌株的一样。根据它对特异的HA裂解酶消化的敏感性和它与选择性HA结合蛋白的作用，确定该被膜物质是真正的HA。有趣的是，PmHAS在氨基酸水平上不与其他的HAS相似。
为了获得稳定的同基因多杀巴斯德氏菌突变体，运用了用于P.haemolytica诱变的方法。制备了用于通过HA合酶双交叉而靶向灭活的敲除盒。将无启动子的氯霉素抗性基因(cat)插入整个PmHAS开放阅读框的中间(XhoⅠ位点)，并克隆进质粒(pKK223-3)，它不能稳定地在多杀巴斯德氏菌中复制。将该质粒转化到形成被膜的野生型菌株中并将细胞在含有氯霉素的培养基平板上培养。当整合到靶基因上时，完整的PmHAS蛋白不再形成。Cat基因由内源的被膜基因启动子转录；下游基因UDP-葡萄糖脱氢酶会受到影响。因而形成了真正的同基因突变体。
分离出了三个同基因的无被膜的突变体。这三个突变体中的任何一个在光学显微镜和墨水染色下都未检测到被膜。HA合酶在DNA和生化水平上都被破坏了。见表Ⅱ。通过利用针对PmHAS酶的一部分的抗体进行的Western杂交分析，该无被膜的敲出突变体缺少了在野生型父本中存在的约110Kda的条带，PmHAS酶。结合表Ⅱ中的数据(缺少多糖的产生)，在该敲除菌株中未发现功能性的PmHAS。
某些区域在各种被膜类型的基因中是普遍或相似的。这表现在如15所示的对D型和F型DNA的Souther杂交分析中。如图15所示，将来自A,F,或D型菌株的染色体DNA用HindⅢ或者EcoRⅠ消化(对于每个探针分别为右和左泳道)并用于Southem杂交。利用地高辛标记的PCR产物探针，它相应于kfaA同源序列(K)或者HA合酶(H)基因的区域，检测其他被膜类型(标有星号的条带)细菌的同源序列。在F和D型中都显示出了KfaA的同源序列。一个非常相似的合酶同源序列在F型中被发现，而在D型中却没有。该探针适合于筛选文库。λ/HindⅢ标准以kb标注。
F型具有与两种探针都相似的区域，而D型只与转运蛋白探针相似。以几套相应与A型序列的引物进行PCR，扩增出D型或F型基因组DNA，如图16所示。图16描述了用A型引物进行异源DNA的PCR。利用相应于A型菌株的kfaA同源基因(A图)或者HA合酶基因(B图)的各种引物对，扩增来分离自几种带有不同被膜类型的其他多杀巴斯德氏菌菌株的基因组DNA。用Taq酶进行了四十个循环(94℃，30秒；42℃，30秒；72℃，60秒)的聚合酶链反应。
将反应混合物在1％的琼脂糖凝胶上分离并用溴乙啶染色(泳道：A,A型；D,D型；F,F型；0，无模板对照)。标准(S)为100bp梯带，1和0.5kb的条带用箭头标出。P-Ⅰ引物对得出了所有三种被膜类型的产物，但是D型产物比其他的产物小。P-Ⅱ和P-Ⅲ引物对只扩增出A型和F型。相反，P-Ⅳ和P-Ⅴ引物对只扩增出A型。这表明A型和F型被膜基因位点之间比与D型更为相似。P-Ⅰ引物对的PCR产物可用作良好的杂交探针用于其他类型的被膜基因位点。
并非所有引物的联合都能和异源模板DNA产生PCR产物。扩增出了F型0.2-1kb的、编码HA合酶或者被膜聚合物转运类似物的基因部分。还扩增出了D型基因组的1kb的编码转运蛋白的区域。几种PCR产物的序列分析揭示出了同源但是有差别的序列。总体上，这些数据提示A型和F型菌株之间最为相关而与D型并不相似。A型和F型KfaA同源基因与E.coli的KfaA的序列比较如图17所示。以P-Ⅰ引物对(见图16)扩增F型DNA所产生的PCR产物进行凝胶纯化并用原始的一个引物测序。发现A型和F型序列在氨基酸水平上非常相似；蛋白序列的部分比对显示在此区域中这两个序列大部分相同而带有一些错配(图17中差异用下划线标出)。总体上，多杀巴斯德氏菌序列与E.coli的可能作用于多糖转运的KfaA蛋白具有相当的同源性(图17中相同的残基以粗体字标出)。这些PCR产物还可用作杂交探针，从D型或F型基因组文库中获得功能性的被膜基因位点。克隆的DNA还用于构建基因敲除的质粒：其中，获得的突变体菌株可用于毒性试验或者疫苗。
多杀巴斯德氏菌的细菌被膜的产生涉及至少下列的步骤：(ⅰ)糖核苷前体的合成；(ⅱ)前体聚合形成被膜多糖；和(ⅲ)被膜组装时，多糖向细胞外空间的输出或转运。当然可能存在调控基因或因子控制着酶的水平或酶的活性，但是焦点集中在这个途径中主要的结构酶。在E.coli中候选的编码此过程的2型被膜基因都定位于细菌染色体的单一位点上。产生不同结构的被膜的E.coli菌株具有上面(ⅰ)和(ⅱ)两步中不同的酶，但是在(ⅲ)步中看来都共同拥有普遍的转运/输出机制。
在化脓链球菌中已经发现，单个的完整的膜酶聚合前体糖，而且也转运HA多糖穿过膜。A型多杀巴斯德氏菌具有四个不同的基因于这三个细菌被膜产生的生物合成步骤相关。(见图14)。多杀巴斯德氏菌多糖转运子与E.coli.的同源物在蛋白水平上的相似型提示，一些其他的被膜基因的总体功能可能也与这两个种相似。
被膜作为毒性因子在禽霍乱中的作用已经被确认。为了防止在细菌被膜和毒性的研究中的差错和危险，对确认的突变体与野生型菌株进行了比较。具有被破坏了的被膜基因的同基因A型突变体进行测试，检测它体外防止预先存在或预先免疫宿主，以及体内感染活家禽的能力。按照本发明所述的方法生成稳定的同基因突变体。利用在质粒上的被破坏了的PmHAS基因(见图18)和同源重组技术，产生出一种重组的多杀巴斯德氏菌菌株，它丧失了产生透明质酸被膜的能力。该菌株进而在DNA和生化水平上都进行了分析。我们通过Southern杂交和PCR分析发现，功能性HA合酶基因被缺陷的含有cat盒插入的基因所替换了。(见图19)。
对基因破坏的确定如图19所示。图A为Southern杂交分析。各个菌株的染色体DNA经HindⅢ消化，在0.7％的琼脂糖凝胶上分离，并转移到硝化纤维膜上。将印渍与多杀巴斯德氏菌的HAS基因探针杂交。检测出两条带是由于PmHAS基因内部的HindⅢ位点产生的。M泳道是粘型转化子；KO泳道是无被膜的敲除突变体；P泳道为父本菌株。670bp的cat盒的加入导致了KO泳道中上方条带的大小位移(用箭头标出)。
图19B为PCR分析。利用一对位于PmHAS的XhoⅠ位点两侧的寡核苷酸引物，经过35个循环的PCR，扩增出来自各个菌株的细胞裂解物的DNA。来自正常的野生型基因的扩增物的长度为650bp。将PCR反应在1％的琼脂糖凝胶上分离并用溴乙啶显色。M泳道是粘型转化子；KO泳道是无被膜的敲除突变体；P泳道为父本菌株。C泳道为克隆的PmHAS质粒对照；而S泳道为分子量标准。敲除突变体模板产生的PCR产物为大约1300bp(用箭头标出)；该条带由670bp的cat盒和来自PmHAS的650bp组成。在敲除菌株的反应中未检测出野生型扩增物，因此发生了由双交叉介导的同源重组。
而且，利用对HA聚合物敏感的放射化学试验，发现该突变体菌株不生产HA，表Ⅱ列出了各个菌株的HA生产。
表Ⅱ
菌株 HA多糖(纳克/ml每OD600)
P=野生型父本 1,200
M=粘型转化子 1,200
KO=无被膜的敲除突变体 ＜=0.05
表Ⅱ所列的菌株为各个菌株的过夜培养物，利用上文概述的特异性放射化学试验检测其中HA聚合物的存在。培养物以分光光度法定量，数据以600nm处1.0个吸收值的培养物中HA的浓度而表示。野生型父本或粘液状的、形成被膜的转化子合成了基本数量的HA。相反，无被膜的敲除突变体未产生可检测到的HA(KO)。因此，被膜在毒性中的作用得到了确证。所用的形态学方法也可以用于构建多杀巴斯德氏菌的其他突变体，本领域的普通技术人员根据本发明所公开的方法就可以完成此项任务。
动物测试比较了该突变体对互补的突变体对照和野生型A型多杀巴斯德氏菌的体内病原型。将A型多杀巴斯德氏菌的敲除菌株ATCC 15742，(它能导致禽霍乱)，运至位于Ames,Iowa的USDA研究站进行毒性测试。利用靶向同源重组，敲除菌株的被模合成已经被破坏，该敲除菌株预计毒性低1000倍。
进行了毒性测试以检测该KO菌株作为疫苗菌株的安全性。将火鸡蛋在清洁的环境下孵化并饲养至2周大。对该家禽注射不同浓度的细菌(野生型或者该敲除菌株)。通过显微镜计数和培养后菌落计数对细菌进行计数。对动物进行肌肉注射并将其置于生物密封围栏中。获得了被接种的家禽(6或7只一组，每只的微生物剂量范围从80至107个细菌，以10倍梯度递进)。6天内检测其总体表现、活力和病态程度。死亡的或濒死的家禽进行尸体解剖检查损伤、脓肿和组织衰竭的存在。
体内实验的结果总结在表Ⅲ中。
表Ⅲ
菌株 每次注射的细胞数 发病率
野生型 8×103  43％
野生型 860  17％
突变体w/HAS敲除 1×107  0％
这种类型的实验的目的在于确定由于病原体被膜形成而感染的总体趋势。每个实验中，白色火鸡通过肌肉注射一定量的细菌而接种。计量火鸡的病症和死亡并制成表以比较突变体的相对毒性。还进行了保护性试验，以确定被免疫的火鸡是否能够在野生型毒性菌株的攻击下存活。
还制备了感染牛和兔的A型敲除菌株。进行了体内测试以确定这两种敲除菌株的病原性，并进行了保护性试验，以确定被免疫的动物是否能够在野生型毒性菌株的攻击下存活。
进行了两主要类型的保护性实验。首先进行被动免疫。用潜在的疫苗KO菌株感染一只鸡，接种大约1-2周后获取其血清(带有保护性抗体)。将该血清或进而纯化的抗体给一普通的鸡注射。用野生型菌株攻击该鸡。该鸡如果获得了保护性抗体就能够在其他致死的野生型菌株攻击下存活。
第二，进行了自动免疫。在此情况下，用潜在的疫苗KO菌株感染同样的鸡，并在几周后用通常致死剂量的野生型菌株来攻击该鸡。此时检测抗体介导的和细胞介导的免疫。
根据本发明可以预计，由于其多糖相近的结构类似性，不同的被膜形成类型的多杀巴斯德氏菌的被膜基因位点具有相似性。本发明还涉及同源的F型多杀巴斯德氏菌基因(“PmCS”)。PmCS序列的信息如SEQ ID NO:3所示。F型基因与A型基因具有大约85％的相同性，其序列对比如图20所示。通过Southern杂交和PCR分析，在DNA水平上还发现了在克隆的A型被膜基因和D和F型基因组的某个区域之间的这种同源性，如图15,16,17所示。对F型基因组DNA在λ噬菌体上的文库进行筛选，分离出该同源的被膜位点。还将对D型基因组DNA在λ噬菌体上的文库进行筛选，以分离出同源的被膜位点。本领域的普通技术人员能够理解的是，可以以A和F型所用的同样的方法确定出D型基因位点。A和F型PmHAS具有89％的相似性。
利用PCR产物的杂交探针，图16，根据HAS同源物和Kfa的同源物，获得了F型多糖合酶基因。利用来自F型菌株的基因组DNA和来自Kfa和合酶区域的适当的引物，产生了一个3kb的扩增产物。将其用地高辛标记并用于获得克隆，并随后获得来自F型菌株的基因组DNA的λZAP表达文库(如对A型克隆所述的)的一个质粒。对此阳性杂交克隆测序。对于A型HA合酶基因，PmHAS，通过E.coli中在pKK223-3(Pharmacia)载体上的表达来检测其功能。发现该酶如期地在体外将UDP-GlaNAc和UDP-GlaA掺入到高分子量的聚合物软骨素分子中。
用抗体和Western杂交分子检测被膜多糖合酶。针对相应于合酶中共有的同源区域(12-20个氨基酸残基)的一个合成的多肽生产出抗体。Westem杂交确定了A型和F型多杀巴斯德氏菌都具有免疫反应活性的、经SDS-PAGE确定的110kDa的蛋白。
图21是天然的和重组的PmHAS蛋白的Western杂交分析。将E.coli中产生的天然的PmHAS和不同的重组截短的PmHAS衍生蛋白在SDS-PAGE凝胶上进行比较。对于重组样品，将总裂解物(T)，膜(M)，和细胞质(C)用于抗PmHAS抗体的Western杂交。在天然的多杀巴斯德氏菌中发现的原始的蛋白(Pm,W泳道；用箭头标记)迁移至约110kDa处；敲除疫苗菌株(KO菌株)则失去了这条带。天然的PmHAS和在羧基端缺失了一部分的重组体形式(PmΔCC)都具有HA合酶活性。其他截短的结构没有活性。
4．PmHAS在诊断中的应用
本发明还涉及生产有用的探针，以利于本领域中对A,D,和F型多杀巴斯德氏菌或P.haemlytica的鉴定。对动物中存在的特定菌株的诊断目前是通过血清学、凝聚作用、或者限制酶切分析后的DNA指纹法来确定。前两种方法问题在于常常产生错误的鉴定，并且非常依赖于分型抗血清的来源。Carter A,D,和F型的被膜血清学方法并不使用抗体，因为这些聚合物是极低免疫原性的。实际上常规使用的是利用酶解和吖啶黄的细胞絮凝的实验室试验。DNA指纹法是精确的，但是它需要备档大量的类型菌株的广泛资料。几套被膜特异性引物就可以用于快速地进行这些流行病学研究，在半天之内以少量的操作而无需亚培养，通过快速的简便的PCR分析来鉴定平原性分离物。一旦病原体被鉴定出来，就可以做出有根据的决定来选择抗生素和疫苗。
由于当前分型方法中的问题，显然可以利用被膜DNA的信息快速确定多杀巴斯德氏菌类型。杂交或者基于PCR的分型都可以因其实用、灵敏和快速而被考虑。一个特殊的实施方案中，适当标记的合酶DNA的探针(或者扩展到被膜类型中不同的被膜基因位点)，由于其具有独特性的优点，在适当的杂交条件下可以具有非常好的性能(例如，互补基因和探针的杂交产生出信号，而来自其他被膜类型的不相同的基因则不杂交而不会获得信号)。在另一个特殊的实施方案中，设计出能够区分被膜类型的PCR引物。正确大小的扩增产物表明特定的被膜类型；无扩增产物则表明另一种有差异的被膜类型。
在本领域当前的情况下，可以考虑在一个反应中应用几对PCR引物，产生有差别的不同大小的几条带。这种多重方法可以是多个反应同时进行。关于不同被膜的生物合成酶，尤其是该合酶的基因位点的DNA序列信息，可以使这些测试快速地区分不同的病原体菌株。
因此，很清楚的是，在本发明中提供了一个分离的并测序了的PmHAS和一种完全满足上述的目的和优点的方法，它可用于制造和利用PmHAS和多杀巴斯德氏菌的敲除菌株。虽然本发明结合特殊的实施方案进行了描述，但是显然对于本领域的熟练技术人员来说可以有许多变换和修改。因此，处于后文权利要求所确定的精神和范围之内的所有这些修改与变化，都包括在本发明之中。
SEQ ID NO:1+1→1                M N T L S Q A I K A Y N S N D Y Q18    L A L K L F E K S A E I Y G R K I V E F Q I T41    K C Q E K L S A H P S V N S A H L S V N K E E64    K V N V C D S P L D I A T Q L L L S N V K K L87    V L S D S E K N T L K N K W K L L T E K K S E110    N A E V R A V A L V P K D F p K D L V L A p L133    P D H V N D F T W Y K K R K K R L G I K p E H156    Q H V G L S I I V T T F N R P A I L S I T L A179    C L V N Q K T H Y P F E V I V T D D G S Q E D202    L S P I I K Q Y E N K L D I R Y V R Q K D N G225    F Q A S A A R N M G L R L A K Y D F I G L L D248    C D M A P N P L W V H S Y V A E L L E D D D L271    T I I G P R K Y I D T Q H I D P K D F L N N A294    S L L E S L P E V K T N N S V A A K G E G T V317    S L D W R L E Q F E K T E N L R L S D S P F R340    F F A A G N V A F A K K W L N K S G F F D E E363    F N H W G G E D V E F G Y R L F R Y G S F F K386    T I D G I M A Y H Q E P P G K E N E T D R E A409    G K N I T L D I M R E K V P Y I Y R K L L P I432    E D S H I N R V P L V S I Y I p A Y N C A N Y455    I Q R C V D S A L N Q T V V D L E V C I C N D478    G S T D N T L E V I N K L Y G N N P R V R I M501    S K P N G G I A S A S N A A V S F A K G Y Y I524    G Q L D S D D Y L E P D A V E L C L K E F L K547    D K T L A C V Y T T N R N V N P D G S L I A N570    G Y N W P E F S R E K L T T A M I A H H F R M593    F T I R A W H L T D G F N E K I E N A V D Y D616    M F L K L S E V G K F K H L N K I C Y N R V L639    H G D N T S I K K L G I Q K K N H F V V V N Q662    S L N R Q G I T Y Y N Y D E F D D L D E S R K685    Y I F N K T A E Y Q E E I D I L K D I K I I Q708    N K D A K I A V S I F Y P N T L N G L V K K L731    N N I I E Y N K N I F V I V L H V D K N H L T754    P D I K K E I L A F Y H K H Q V N I L L N N D777    I S Y Y T S N R L I K T E A H L S N I N K L S800    Q L N L N C E Y I I F D N H D S L F V K N D S823    Y A Y M K K Y D V G M N F S A L T H D W I E K846    I N A H P P F K K L I K T Y F N D N D L K S M869    N V K G A S Q G M F M T Y A L A H E L L T I I892    K E V I T S C Q S I D S V P E Y N T E D I W F915    Q F A L L I L E K K T G H V F N K T S T L T Y938    M P W E R K L Q W T N E Q I E S A K R G E N I961    P V N K F I I N S I T L *972SEQ ID NO:2+1→-18  ATTTTTTAAGGACAGAAAATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGCATATAACAGCAATGACTATCAA52  TTAGCACTCAAATTATTTGAAAAGTCGGCGGAAATCTATGGACGGAAAATTGTTGAATTTCAAATTACC121  AAATGCCAAGAAAAACTCTCAGCACATCCTTCTGTTAATTCAGCACATCTTTCTGTAAATAAAGAAGAA190  AAAGTCAATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAAAAAAATTA259  GTACTTTCTGACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAATAAATGGAAATTGCTCACTGAGAAGAAATCTGAA328  AATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGATTTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTA397  CCTGATCATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAGCGAAAGAAAAGACTTGGCATAAAACCTGAACAT466  CAACATGTTGGTCTTTCTATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCC535  TGTTTAGTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGGAAGAT604  CTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAGACAAAAAGATAACGGT673  TTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGATTACGCTTAGCAAAATATGACTTTATTGGCTTACTCGAC742  TGTGATATGGCGCCAAATCCATTATGGGTTCATTCTTATGTTGCAGAGCTATTAGAAGATGATGATTTA811  ACAATCATTGGTCCAAGAAAATACATCGATACACAACATATTGACCCAAAAGACTTCTTAAATAACGCG880  AGTTTGCTTGAATCATTACCAGAAGTGAAAACCAATAATAGTGTTGCCGCAAAAGGGGAAGGAACAGTT949  TCTCTGGATTGGCGCTTAGAACAATTCGAAAAAACAGAAAATCTCCGCTTATCCGATTCGCCTTTCCGT1018  TTTTTTGCGGCGGGTAATGTTGCTTTCGCTAAAAAATGGCTAAATAAATCCGGTTTCTTTGATGAGGAA1087  TTTAATCACTGGGGTGGAGAAGATGTGGAATTTGGATATCGCTTATTCCGTTACGGTAGTTTCTTTAAA1156  ACTATTGATGGCATTATGGCCTACCATCAAGAGCCACCAGGTAAAGAAAATGAAACCGATCGTGAAGCG1225  GGAAAAAATATTACGCTCGATATTATGAGAGAAAAGGTCCCTTATATCTATAGAAAACTTTTACCAATA1294  GAAGATTCGCATATCAATAGAGTACCTTTAGTTTCAATTTATATCCCAGCTTATAACTGTGCAAACTAT1363  ATTCAACGTTGCGTAGATAGTGCACTGAATCAGACTGTTGTTGATCTCGAGGTTTGTATTTGTAACGAT1432  GGTTCAACAGATAATACCTTAGAAGTGATCAATAAGCTTTATGGTAATAATCCTAGGGTACGCATCATG1501  TCTAAACCAAATGGCGGAATAGCCTCAGCATCAAATGCAGCCGTTTCTTTTGCTAAAGGTTATTACATT1570  GGGCAGTTAGATTCAGATGATTATCTTGAGCCTGATGCAGTTGAACTGTGTTTAAAAGAATTTTTAAAA1639  GATAAAACGCTAGCTTGTGTTTATACCACTAATAGAAACGTCAATCCGGATGGTAGCTTAATCGCTAAT1708  GGTTACAATTGGCCAGAATTTTCACGAGAAAAACTCACAACGGCTATGATTGCTCACCACTTTAGAATG1777  TTCACGATTAGAGCTTGGCATTTAACTGATGGATTCAATGAAAAAATTGAAAATGCCGTAGACTATGAC1846  ATGTTCCTCAAACTCAGTGAAGTTGGAAAATTTAAACATCTTAATAAAATCTGCTATAACCGTGTATTA1915  CATGGTGATAACACATCAATTAAGAAACTTGGCATTCAAAAGAAAAACCATTTTGTTGTAGTCAATCAG1984  TCATTAAATAGACAAGGCATAACTTATTATAATTATGACGAATTTGATGATTTAGATGAAAGTAGAAAG2053  TATATTTTCAATAAAACCGCTGAATATCAAGAAGAGATTGATATCTTAAAAGATATTAAAATCATCCAG2122  AATAAAGATGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCCCAATACATTAAACGGCTTAGTGAAAAAACTA2191  AACAATATTATTGAATATAATAAAAATATATTCGTTATTGTTCTACATGTTGATAAGAATCATCTTACA2260  CCAGATATCAAAAAAGAAATACTAGCCTTCTATCATAAACATCAAGTGAATATTTTACTAAATAATGAT2329  ATCTCATATTACACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGGCGCATTTAAGTAATATTAATAAATTAAGT2398  CAGTTAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATGACAGCCTATTCGTTAAAAATGACAGC2467  TATGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAACACATGATTGGATCGAGAAA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Claims (85)

1．一种包括编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
2．如权利要求1所述的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
3．如权利要求1所述的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
4．一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段能够与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相杂交。
5．一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相比具有半保守型或保守型氨基酸密码子的改变。
6．一种选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体的重组载体，其中该重组载体还进一步包括具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
7．如权利要求6所述的重组载体，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
8．如权利要求6所述的重组载体，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
9．如权利要求6所述的重组载体，其中该质粒进一步包括表达载体。
10．如权利要求9所述的重组载体，其中该表达载体含有有效相连于酶学活性的多杀巴斯德氏菌透明质酸合酶编码区域的启动子。
11．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是一个用重组载体转化的原核细胞，其中该重组载体包括具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
12．如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
13．如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
14．如权利要求13所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞产生透明质酸。
15．如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的结构的透明质酸聚合物。
16．如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的大小分布的透明质酸聚合物。
17．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞是一个用重组载体转染的真核细胞，其中该重组载体包括具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
18．如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
19．如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
20．如权利要求19所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞产生透明质酸。
21．如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的结构的透明质酸聚合物。
22．如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的大小分布的透明质酸聚合物。
23．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞经电转移将一个重组载体引入该重组宿主细胞，其中该重组载体包括具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
24．如权利要求23所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
25．如权利要求23所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
26．如权利要求25所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞产生透明质酸。
27．如权利要求23所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的结构的透明质酸聚合物。
28．如权利要求23所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的大小分布的透明质酸聚合物。
29．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一重组载体转导，其中该重组载体包括具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
30．如权利要求29所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶。
31．如权利要求29所述的重组宿主细胞，其中该纯化的核酸区段包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
32．如权利要求31所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞产生透明质酸。
33．如权利要求29所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的结构的透明质酸聚合物。
34．如权利要求29所述的重组宿主细胞，其中该酶学活性的透明质酸合酶能够产生具有经过修饰的大小分布的透明质酸聚合物。
35．一种纯化的组合物，其中该纯化的组合物包括来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶多肽。
36．一种纯化的组合物，其中该纯化的组合物包括具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多肽。
37．一种检测DNA种类的方法，包括以下步骤：
获得DNA样品；
将该DNA样品与纯化的SEQ ID NO:2的核酸区段接触；
使该DNA样品与该纯化的核酸区段杂交从而形成杂交复合物；并
检测该复合物。
38．一种检测表达编码多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶的mRNA的细菌细胞的方法，包括以下步骤：
获得细菌细胞样品；
将来自该细菌细胞样品的至少一种核酸与SEQ ID NO:2的纯化的核酸区段接触；
使该至少一种核酸与该纯化的核酸区段杂交从而形成杂交复合物；并
检测该复合物，其中存在该复合物则表明细菌菌株表达编码多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶的mRNA。
39．一种生产透明质酸的方法，包括以下步骤：
将一种具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段引入一个宿主生物内，其中该宿主生物含有编码产生UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的酶的核酸区段；
在培养基中培养该宿主生物以分泌透明质酸；并
回收分泌的透明质酸。
40．如权利要求39所述的方法，其中回收透明质酸的步骤包括从培养基中抽提分泌的透明质酸。
41．如权利要求40所述的方法，进一步包括纯化抽提出的透明质酸的步骤。
42．如权利要求39所述的方法，其中在培养宿主生物的步骤中，该宿主生物分泌具有经过修饰的结构的透明质酸。
43．如权利要求39所述的方法，其中在培养宿主生物的步骤中，该宿主生物分泌具有经过修饰的大小分布的透明质酸。
44．一种药物组合物，包括一种预选的药物和一种有效剂量的由来自多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶生产的透明质酸。
45．如权利要求44所述的药物组合物，其中该透明质酸是由SEQ ID NO:1的多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶所生产的。
46．如权利要求44所述的药物组合物，其中该透明质酸的分子量是经过修饰的，因而产生出能够逃避免疫反应的经修饰了分子量的药物组合物。
47．如权利要求44所述的药物组合物，其中该透明质酸的分子量是经过修饰的，因而产生出能够在对于该经修饰了分子量的药物组合物具有亲和力的患者中，靶向定位于特异的组织或细胞类型的经修饰了分子量的药物组合物。
48．一种纯化的并分离的编码酶学活性的透明质酸合酶的核酸序列，该核酸序列选自由下列组成的一组之中：
(a)SEQ ID NO:2的核酸序列；
(b)与SEQ ID NO:2的核酸序列互补的核酸序列；
(c)能够与SEQ ID NO:2的核酸序列杂交的核酸序列；
(d)能够与SEQ ID NO:2的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。
49．一种纯化的并分离的、基本上由编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的核酸序列组成的核酸区段。
50．一种原核或真核宿主细胞，其以可使之表达透明质酸的方式用权利要求1,2或3所述的分离的核酸区段转化或转染。
51．一种分离的核酸区段，其基本上由编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的核酸序列组成，具有为SEQ ID NO:2的核酸区段的充分复制物的核酸区段，从而具有编码来自多杀巴斯德氏菌的透明质酸合酶的生物学特性。
52．如权利要求51所述的cDNA序列。
53．一种原核或真核宿主细胞，其以可使之表达透明质酸的方式用权利要求51的核酸区段转化或转染。
54．一种具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段能够与SEQ ID NO:2的核苷酸序列杂交。
55．一种具有编码来自多杀巴斯德氏菌的酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段选自下列组成的一组之中：
(A)相应于SEQ ID NO:1的核酸区段；
(B)SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(C)能与(A)或(B)所定义的核酸区段或其片段杂交的核酸区段；
(D)除根据遗传密码的简并性，或编码功能上等价的氨基酸之外，仍能与(A)、(B)或(C)所定义的核酸区段杂交的核酸区段。
56．一种生产多杀巴斯德氏菌疫苗的方法，其中的步骤包括：
-在一个非复制质粒上产生一个被破坏的被膜基因盒；
-将该被破坏的被膜基因盒引入一个具有染色体基因的巴斯德氏菌菌株中；
-以该被破坏的被膜基因盒对该巴斯德氏菌菌株染色体基因重组从而产生突变巴斯德氏菌菌株；
-筛选该突变巴斯德氏菌菌株；并
-筛选出适当的突变菌株用作疫苗。
57．一种活的减毒的多杀巴斯德氏菌疫苗，其选自下列一组之中：
-带有至少一个被破坏的被膜基因的巴斯德氏菌菌株；
-带有被破坏的被膜基因座的巴斯德氏菌菌株；
-带有被破坏的多糖生物合成基因的巴斯德氏菌菌株；
-带有被破坏的多糖合酶基因的巴斯德氏菌菌株；和
-带有被破坏的HA合酶基因的巴斯德氏菌菌株。
58．一种在牲畜中检测多杀巴斯德氏菌感染的方法，其中的步骤包括：
-提供能够与从动物中获取的细菌样品的DNA抽提物相杂交的一个被膜基因探针或探针的混合物；
-将该被膜基因探针与该细菌样品在杂交反应箱中温育；并
-提供一个能够区分细菌样品之间互补性的杂交检测系统。
59．一种在牲畜中检测多杀巴斯德氏菌的诊断试验，包括：
-能够从来自动物的样品中扩增细菌样品的DNA抽提物的一对被膜基因引物或引物对混合物；
-利用该被膜基因的PCR引物和细菌样品进行温度循环PCR从而获得扩增产物的设施；和
-检测该扩增产物的设施；和
-将该扩增产物划分到被膜特异的分组中的设施。
60．如权利要求1所述的纯化的核酸区段，其中该纯化的核酸区段编码SEQ ID NO:3的多杀巴斯德氏菌的软骨素合酶。
61．一种包括编码透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
62．一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
63．一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的纯化的核酸区段。
64．一种重组载体，其中该重组载体进一步包括一个具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
65．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一种重组载体转化，其中该重组载体包括一个具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
66．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一种重组载体转染，其中该重组载体包括一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
67．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞电转移引入了一种重组载体，其中该重组载体包括一种具有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
68．一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞用一种重组载体转导，其中该重组载体包括一种具带有编码酶学活性的透明质酸合酶的编码区域的核酸区段。
69．一种组合物，其中该组合物包括透明质酸多肽。
70．一种组合物，其中该组合物包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。
71．一种检测DNA种类的方法，其中包括以下步骤：
将样品与一种核酸区段接触；
使该DNA样品与该核酸区段杂交从而形成杂交复合物。
72．一种检测表达编码透明质酸合酶的mRNA的细菌细胞的方法，包括以下步骤：
将来自该细菌细胞样品的至少一种核酸与一种核酸区段接触；
使该至少一种核酸与该核酸区段杂交从而形成杂交复合物。
73．一种生产透明质酸的方法，包括以下步骤：
将一种具有编码透明质酸合酶的编码区域的核酸区段引入一种宿主生物内；并
在培养基中培养该宿主生物以分泌透明质酸。
74．一种药物组合物，包括一种药物和一种有效剂量的由透明质酸合酶生产的透明质酸。
75．一种编码透明质酸合酶的核酸序列，该核酸序列选自由下列组成的一组之中：
(a)SEQ ID NO:2的核酸序列；
(b)与SEQ ID NO:2的核酸序列互补的核酸序列；
(c)与SEQ ID NO:2的核酸序列杂交的核酸序列；
(d)与SEQ ID NO:2的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。
76．一种包括编码透明质酸合酶的核酸区段的核酸区段。
77．一种宿主细胞，其以可使之表达透明质酸的方式用权利要求1,2或3所述的核酸区段转化或转染。
78．一种核酸区段，其包括编码透明质酸合酶的核酸区段，具有为SEQ ID NO:2的核酸区段的充分复制物的核酸区段，从而具有编码透明质酸合酶的生物学特性。
79．一种宿主细胞，其以可使之表达透明质酸的方式用权利要求78所述的核酸区段转化或转染。
80．一种具有编码透明质酸合酶的编码区域的核酸区段，其中该核酸区段能够与SEQ ID NO:2的核酸序列杂交。
81．一种具有编码透明质酸合酶的编码区域的核酸区段，其中该核酸区段选自下列组成的一组之中：
(A)相应于SEQ ID NO:1的核酸区段；
(B)SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(C)与(A)或(B)所定义的核酸区段或其片段杂交的核酸区段；
(D)除根据遗传密码的简并性，或编码功能上等价的氨基酸之外，与(A)、(B)或(C)所定义的核酸区段杂交的核酸区段。
82．一种产生疫苗的方法，其中的步骤包括：
-在一种非复制质粒上产生一种被破坏的被膜基因盒；
-将该被破坏的被膜基因盒引入一种具有染色体基因的细菌菌株中；
-以该被破坏的被膜基因盒对细菌染色体基因重组从而产生突变体细菌菌株；
-筛选该突变体细菌菌株；并
-筛选出适当的突变体菌株用作疫苗。
83．一种选自下列一组之中的疫苗：
-带有至少一种被破坏的被膜基因的细菌菌株；
-带有被破坏的被膜基因座的细菌菌株；
-带有被破坏的多糖生物合成基因的细菌菌株；
-带有被破坏的多糖合酶基因的细菌菌株；和
-带有被破坏的HA合酶基因的细菌菌株。
84．一种检测细菌感染的方法，其中的步骤包括：
-提供能够与从动物中获取的细菌样品的DNA抽提物相杂交的一种被膜基因探针或探针混合物；
-将该被膜基因探针与该细菌样品在杂交反应箱中温育；并
-提供一种能够区分细菌样品之间互补性的杂交检测系统。
85．一种检测细菌的诊断试验，包括：
-能够从来自动物的样品中扩增细菌样品的DNA抽提物的一对被膜基因引物或引物对混合物；
-利用该被膜基因的PCR引物和细菌样品进行温度循环PCR从而获得扩增产物的设施；和
-检测该扩增产物的设施；和
-将该扩增产物划分到被膜特异的分组中的设施。
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