CN1299574C - 一种具有毒杀植物线虫活性的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有毒杀植物寄生线虫活性的化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。本发明由(Coprinus xanthothrix)4916菌株和辅料经常规发酵后分离得到1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one化合物，该化合物是一种含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31。该化合物具有显著的毒杀线虫活性，24小时对Panagrellus redivivus线虫的半致死率(ED50)为250ppm，90%致死率(ED90)为500ppm；24小时对花生根结线虫的半致死率(ED50)为250ppm，90%致死率(ED90)为500ppm；化合物与乳化剂混合可以提高杀线虫活力。本发明化合物可应用于制备杀线虫生物制剂。用本发明化合物制备的杀线虫生防制剂，具有高效、低毒、低残留等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种具有毒杀植物线虫活性的化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一种危害严重的植物病害，每年对农作物造成的损失高达1044亿美元。目前对线虫的防治仍然以化学防治为主，但由于化学杀线虫剂多数是高毒、高残留农药，对人蓄和环境造成严重的威胁，已逐步受到限制。有的品种，如溴甲烷类等已被多数国家禁用。因此，研究开发高效低毒及生物杀线虫剂已经成为农业可持续发展中重要问题。在线虫的生防研究中，目前已有直接利用菌体的第一代商品制剂问世，已在相当大的范围内推广应用。但由于产品是活菌体，受抑菌作用等因素影响，导致在不同国家不同土壤中防治效果不稳定。为此，人们更加关注线虫生防第二代产品，即具有杀线虫功能的微生物次生代谢产物的研究与开发。
在近30年的研究中，已从50多株微生物菌株中分离到90多种对线虫有活性的化合物，其结构类型多样，主要有醌类、生物碱类、萜类、肽类、吡喃类、脂肪酸类和萘类等。但由于各种原因，这些化合物中具有开发潜力的很少。因此，通过进一步筛选获得对线虫有活性的物质或组分，为研究开发新型线虫生防制剂奠定基础具有重要意义。
国内外文献检索表明，本发明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one为一新结构化合物，并未见有关活性和天然来源的报道，也未见其被用于制备杀线虫制剂应用的公开文献报道。
发明内容：
本发明的目的是从具有毒杀植物寄生线虫功能的真菌中筛选出高毒力菌株，从菌株的次生代谢产物中提取高毒力杀线虫化合物，为研究开发生物杀线虫制剂和研究开发仿生生物农药奠定基础。
本发明是这样实现的：
本发明人在前期研究中，筛选获得了具有良好杀植物寄生线虫功能的真菌Coprinus xanthothrix 4916，4916菌株已于2005年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.1519。
本发明将4916菌株采用PDA培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物经反复硅胶柱，氯仿/甲醇洗脱，得到本发明的化合物，该化合物是一种含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31，经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定为1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one，结构式为：
实验表明：1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one具有显著的毒杀Panagrellus redivivus线虫和花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)的功能，24小时对Panagrellus redivivus线虫的半致死率(ED50)为200ppm，90％致死率(ED90)为500ppm。对花生根结线虫的半致死率(ED50)为200ppm，90％致死率(ED90)为500ppm。
本发明将从Coprinus xanthothrix 4916中用现有方法分离得到的1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one作为制备杀植物线虫制剂的应用。
本发明亦可将0.5mg1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于二甲亚砜，再用Tween-20水溶液稀释，得到具杀线虫活性物质的乳浊液；乳浊液中：二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
本发明与现有的杀植物寄生线虫药相比，具有高效、低毒及低残留等优点。
具体实施方式：
本发明化合物的常规发酵生产方法：
1、将4916菌株的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，20-30℃下培养4-8天，获得试管种。
2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为：PDB培养基，自然pH。培养温度20-30℃；摇床培养，转速为100-300rpm；培养时间4-12天，待菌丝体大量产生后即可。
3、将含菌丝的发酵液低压浓缩后，用甲醇反复溶解，将溶解物合并低压浓缩后得甲醇提取物。甲醇提取物经正相硅胶柱层析，氯仿反复洗脱。活性跟踪检测所分离到的组分，将具有活性的部分合并低压浓缩，经反复硅胶柱层析，氯仿/甲醇洗脱，洗脱液经活性检测，活性部分经TLC检测(展开剂：氯仿∶甲醇5∶1；硫酸显色)，将只具有同一个单点的部位合并得到化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one。
本发明化合物对植物线虫的药效试验
1、试验用药剂：
(1)试验药剂
将前述本发明化合物溶于二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
(2)对照用药剂
用常规的方法及操作条件将未接种的发酵培养基低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物浓缩后用二甲亚砜溶解，再用无菌蒸馏水稀释，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
2、制备试验用线虫
(1)制备Panagrellus redivivus线虫
将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
(2)花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)的培养
将温室培养的带有花生根结线虫的蕃茄根用无菌水洗净，用解剖针挑取根结线虫的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml离心管中依次用4ml无菌水(三次)、1ml无菌青-链霉素双抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗涤和消毒，每一步骤均通过短暂离心(8000转30秒)除去上清液。洗涤好的虫卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小时，二龄幼虫用移液器收集于1.5ml离心管，通过短暂离心(5000转30秒)富集备用。
3、试验方法
将本发明化合物稀释为不同浓度供试药液，将药液200μl加于20孔板中，加入活线虫100-150条，置于25℃下，分别于4小时、12小时、24小时在光学显微镜下检查计算线虫的死亡率。
鉴定死亡的方法为：在处理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
死亡率％＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+存活线虫数))×100％
校正死亡率％＝样品死亡率-对照死亡率
实施例1：化合物对线虫的毒杀作用
将0.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为500ppm溶液，二甲亚砜的终浓度不超过3％。
按上述试验方法进行药效试验。列表所示为校正死亡率。
表1化合物对P.redivivus线虫的毒杀作用
| 重复次数 | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 123 | 45.5％43.7％52.1％ | 70.3％82.8％78.3％ | 92.1％92.3％88.7％ |
结果表明，本发明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one 500ppm水溶液对P.redivivus线虫的致死率在24小时达到80％以上。具有明显的杀线虫活性。
表2化合物对M.arenaria线虫的毒杀作用
| 重复次数 | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 123 | 32.1％38.8％33.6％ | 68.9％73.5％78.9％ | 91.7％88.9％94.3％ |
结果表明，本发明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one 500ppm水溶液对M.arenaria线虫的致死率在24小时达到80％以上。具有明显的杀线虫活性。
实施例2：化合物对线虫的半致死率ED50
实施例2方法同实施例1，不同之处为：将2.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于少量二甲亚砜，配制为1000ppm的水溶液，随后倍半稀释，测定半致死率(ED50)和90％致死率(ED90)，待测溶液中二甲亚砜的终浓度不超过3％。
表3化合物对P.redivivus线虫的ED50和ED90
| 浓度ppm | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 1000500250125603015 | 85.8％45.5％37.9％25.8％10.3％9.70％6.66％ | 93.7％70.3％45.4％40.7％13.3％15.6％10.8％ | 100％92.1％51.6％43.4％18.2％13.6％11.3％ |
结果表明，本发明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one在24小时对P.redivivus线虫的半致死率(ED50)为250ppm，90％致死率(ED90)为500pm。
表4化合物对M.arenaria线虫的ED50和ED90
| 浓度ppm | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 1000500250125603015 | 84.6％32.1％31.5％20.6％21.8％12.4％10.9％ | 95.7％68.9％46.5％35.7％33.3％12.9％14.5％ | 100％91.7％58.8％44.2％45.8％21.7％16.6％ |
结果表明，本发明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one在24小时对M.arenaria线虫的半致死率(ED50)为250ppm，90％致死率(ED90)为500ppm。
实施例3：化合物与乳化剂混合对线虫的毒杀作用
实施例3方法同实施例1，不同之处为：将0.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于二甲亚砜，再用0.3％浓度的Tween-20水溶液稀释，稀释浓度为500ppm，得具杀线虫活性物质的乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
表5化合物乳化制剂对P.redivivus线虫的毒杀作用
| 重复次数 | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 123 | 51.5％52.4％48.6％ | 89.8％88.3％87.9％ | 94.5％96.7％95.6％ |
结果表明，1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one与乳化剂混合后可以提高毒杀P.redivivus线虫活性，提高率为4-12％。
表6化合物乳化制剂对M.arenaria线虫的毒杀作用
| 重复次数 | 4小时 | 12小时 | 24小时 |
| 123 | 41.3％42.4％45.8％ | 79.0％78.7％76.7％ | 94.5％97.3％93.8％ |
结果表明，1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one与乳化剂混合后可以提高毒杀M.arenaria线虫活性，提高率为4-30％。
Claims (2)
1、一种具有毒杀植物线虫活性的化合物，由生产菌株和辅料经发酵培养、甲醇提取、反复硅胶柱及氯仿/甲醇洗脱工序后分离得到，其特征在于：
(1)生产菌株为Coprinus xanthothrix 4916，4916菌株已于2005年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.1519；
(2)分离得到的化合物是一种含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31，经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定为1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one，结构式为：
2、权利要求1所说化合物的应用，其特征在于：
1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one化合物作为制备杀线虫制剂的应用。
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