CN1299114C - 中药指纹图谱的制作方法 - Google Patents

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Abstract

一种中药指纹图谱的制作方法，是一个用裂解-气相色谱-质谱联用技术来制作中药指纹图谱的方法，该方法包括下列三步步骤：1.中药材的裂解；2.GC/MS分析；3.计算机处理，获得标识混合体系的彩色二维条形码，即是使得计算机能够识别中药的指纹图谱。通过对同一药材或不同药材的标准谱图进行精确的类似度比较，根据类似度的大小，人们可对中药材进行鉴别。因而本发明制作方法可用来快速有效地鉴别中药材，控制中药材的质量，为提高中药生产现代化程度提供一个重要的手段。

Description

中药指纹图谱的制作方法
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱研究领域，具体是关于中药指纹图谱的制作方法。
背景技术
中药指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱。其质量标准并不要求图谱中的每一个组分的化学结构都清楚，也不要求对每一个组份都精确定量，但要求图谱具有“指纹”特征，即要求专属、稳定、实用。传统上，中药材主要靠外观或显微鉴别，随着现代化学分析技术的不断进步，在药典中越来越多的中药材把已知的主要成分或有药效作用的成分，作为指标成分予以检测控制。比之过去，这是很大的突破与进步。但是从中医药的观点看，指标成分的控制，难以真正控制中药功效。因为中药复方药的特点是多组分、多靶点、多途径，多组分的协同和拮抗作用。中医辩证施治用的是药味而非某个化学成分。采用指纹图谱质控技术，可以提供比单一指标成分的测定更丰富、更有用的信息，有望显著改善可控性，提高产品的现代化内涵，提高生产现代化程度。目前，美国FDA、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物协会等均接受指纹图谱的质控方法，中国药品监督管理局也颁发了《中药注射及指纹图谱研究的技术要求(试行)》。中药材、中成药指纹图谱技术已经成为牵动行业全面进步、带动中药现代化、推进中药走向世界的关键技术之一。其应用研究，对于保证中成药功效，提高中药工业整体水平，带动中药农业现代化，推进中药走向世界，具有非常重要的现实意义。在我国，指纹图谱的研究方兴未艾。随着现代分离技术的发展，中药指纹图谱的研究也由过去“四大鉴别”(基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别)方式发生了相应的变化。目前，中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为色谱法、光谱法及其他方法。光谱法包括紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、核磁共振法(NMR)等，这几种方法能够给出药效物质基础的结构信息，部分信息也可能与特定化学成分直接关联，但所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和，没有很强的指纹特征。色谱法包括薄层色谱(TLC)、液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)高效毛细管电泳(HPCE)等。TLC法操作简单、分析速度快，但该方法重复性和精密度差。HPLC法具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高等特点，但应用该方法必须对药材进行前处理，不同的处理方法所得到的指纹图谱是不一样，不能表示中药材的整体特征。气相色谱法只能用于气体、挥发性和半挥发性物质的分析，而中药材中很多化学成分是高沸点的。HPCE法则只能用于带电荷的化合物(例如蛋白质、氨基酸、黄酮等)。为了克服以上各种方法的不足之处，研究一种新的中药指纹图谱的制作方法，是很有意义的。
发明内容
本发明提供一种中药指纹图谱的制作方法，它是一个用裂解—气相色谱—质谱联用技术来制作中药的指纹图谱的方法。该方法包括下列步骤：
步骤1，中药材的裂解：取中药材粉末置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到裂解温度(350～450℃)，保持一段时间(50～100mins)，以溶剂溶解裂解产物，得试品溶液。所述溶剂是选自甲醇、乙醇或丙酮中一种或一种以上的混合物。
步骤2，GC/MS分析：取试品溶液，注入色谱仪，色谱条件为：石英毛细管柱(例如DB35MS，DB5MS，HP-50，HP-1MS等)，柱温35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃，He流速为1.2ml/min。质谱的条件为：EI源，轰击电压70eV，扫描范围25-450amu。
步骤3，计算机处理：利用本申请人已经申请的《彩色二维标识码产生方法以及用途》发明专利(申请号为：02136018.9)，按照计算机处理流程图(见图11)对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，即是中药的指纹谱图。
计算机处理步骤包括：首先，试品导入GC/MS分析仪器测试得到的复杂混合物体系的分析数据，经过数据抽提与数据变换方法处理后得到与混合物分离相关的数据与后续的检测信息、然后再采用数据压缩与二维彩色码生成算法处理，就获得标识该混合体系的二维彩色条形码。
本发明的分析数据的导入可采用美国国家标准局(MST)的AMDIS Analysis工具软件或其它功能相同的软件。
本发明的数据抽提与数据变换方法处理包括：数据的冗余度分析、预处理与特征抽提。该数据抽提与数据变换方法被集成在一个称作CISOC-EXTRACT的软件中。
本发明的二维彩色码生成方法包括：首先把用第一种分析方法得到的数据(如色谱分析得到的保留指数)用从深蓝色经黄色、绿色直到浅蓝色、白色这样渐变的调色板表示于Y轴方向或圆轴方向，数据值所对应的颜色，通过对调色板的线性插值得到，数据值(如色谱数据的保留指数据)越大，对应的颜色越接近浅蓝色或白色，相当于物体与观察视点的距离越远，反之，数据值(如色谱数据的保留指数)越小，对应的颜色越接近深蓝色，对应于物体与观察视点的距离越近，介于两者之间的数据值则分别对应于相应的颜色。第二种分析方法检测得到的数据(例如质谱信息)则置于X轴方向或圆周方向。选择颜色的方法如下：依序从分析数据中每次读取三个字节，每个字节的数值分别转换成对应于调色板的红色、绿色和蓝色。X和Y方向(或圆周方向和圆轴方向)的基色相结合就调配出彩色的二维条形码。该彩色二维条形码生成方法已集成在一个称作CISOC-2DCC的软件中。
采用本发明方法进行中药指纹图谱的制作，较之其它方法有着显著的优点。首先在采用本发明方法进行指纹图谱制作时，是将中药材打碎后直接进行中药材裂解-色谱—质谱快速高效指纹图谱的分析，这样需对中药材进行前处理，这样能够反映中药材的整体特征，而不是某一部位或某—萃取方法(如乙醇提取物等)的特征。然后该方法利用了气相色谱法的高分离效果，我们采用了石英毛细管柱，柱长达30m，大大提高了分离效果，特别适用于复杂混合物的分析，而中药材含有成千上百种化合物，采用该方法就能得到更多的信息。而且在质谱方面我们采用了EI源，利用质谱的标准谱库(我们仪器有NIST和Willey谱库，约40万张标准谱图)检索，它能够确定特征峰的结构，这是目前其他任何方法都未能实现的。最后，我们利用了IT模型对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，使得计算机能够识别中药的指纹图谱，因而能够对同一药材或不同药材的标准谱图进行精确的类似度比较。根据我们的试验结论，同一药材几次重复试验的类似度是大于0.7，而不同药材或不同产地的同一药材的指纹图谱的类似度则是小于0.7。因而根据类似度的大小，我们可以对中药材进行鉴别。而传统方法得到的中药材的指纹图谱，电脑不能识别，只能根据专家对不同药材的指纹图谱进行反复比较，然后做出判断，这样工作量庞大而且容易造成人为的误差。因而本发明制作的中药指纹图谱可用来快速有效地鉴别中药材，控制中药材的质量，为提高中药生产现代化程度提供一个重要的手段。
附图说明
图1为5份同一红景天制得的二维条形码指纹图谱。
图2为5份同一红景天指纹图谱类似度的比较图。
图3为5份同一蛇床子制得的二维条形码指纹图谱。
图4为5份同一蛇床子指纹图谱类似度的比较图。
图5为5份同一细辛制得的二维条形码指纹图谱。
图6为5份同一细辛指纹图谱类似度的比较图。
图7为5份同一柴胡制得的二维条形码指纹图谱。
图8为5份同一柴胡指纹图谱类似度的比较图。
图9为5份同一木香制得的二维条形码指纹图谱。
图10为5份同一木香指纹图谱类似度的比较图。
图11为本发明制作方法中步骤3计算机处理流程图。
具体实施方式
实施例1红景天的彩色二维条形码指纹图谱的制作
红景天(Rhodiola)是中药中的常用品种，在藏药中的应用也很广泛。红景天以根茎入药，性味甘、涩、寒，用于活血止血、清肺止咳，外用治疗跌打损伤等。
1.红景天中药材的裂解：称取长白山产中药材粉末1.0140g，置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到350℃保持100mins，然后冷却至室温，以1∶1乙醇—丙酮溶解裂解产物，得试品溶液。
2.气相色谱质谱联用分析：吸取1ul试品溶液注入色谱仪，按常规气相色谱法测定，得GC/MS谱图。气相分析条件为：Agilent 6890型气相色谱仪，5973N型质谱仪，DB35ms石英毛细管柱，柱温为在35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃，He流速为1.2ml/min。质谱的条件为：EI源，轰击电压为70eV，扫描范围为25-450amu。
3.计算机处理：按照上述计算机处理流程图对GC/MS数据进行如下处理，得到二维条形码，即是红景天的二维条形码指纹图谱。
计算机处理步骤包括：首先，导入分析仪器测试得到的复杂混合物体系的分析数据，经过数据抽提与数据变换方法处理后得到与混合物分离相关的数据与后续的检测信息、然后再采用数据压缩与二维彩色码生成算法处理，就获得了标识该混合体系的二维彩色码。本发明的分析数据的导入可采用美国国家标准局(NIST)的AMDIS Analysis工具软件或其它功能相同的软件。在采用AMDISAnalysis软件时，通过打开GC/MS仪器测试的样品数据(后缀为SMS的文件)，再选用Analyze/Analyze GC/MS Data命令进行数据分析，得到标记峰位的GC/MS谱。然后把每个峰位的MS数据另存为后缀名为msp的文本文件。直到把所有对应峰位的MS谱导出来为止。然后应用CISOC-EXTRACT软件提取有用的信息(包括保留指数据信息、质谱信息)，并产生一个后缀名为GSM的文本文件(包含全部的保留指数据信息以及质谱信息)。这个文本文件已包含了产生彩色二维标识码的全部信息。此时可采用彩色二维标识码产生软件CISOC-2DCC，找开前面生成的后缀名为GSM的文件，就自动得到彩色二维条形码。
4.重现性试验：取5份同1红景天中药材，按照上述方法分析测试，比较其类似度。结果见图1与图2。从图2的类似度比较图可以看出，类似度大于0.7，表明该测定方法有很好的稳定性。
实施例2蛇床子的彩色二维条形码指纹图谱的制作
蛇床子为伞形科植物蛇床(Cnidium monnieri(L)Cuss.)的干燥果实。其性辛、苦、温，有小毒。主要用于温肾壮阳，燥湿，祛风，杀虫。
1.蛇床子中药材的裂解：称取浙江产中药材粉末1.0140g，置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到450℃保持50mins，然后冷却至室温，以1∶1甲醇—丙酮溶解裂解产物，得试品溶液。
2.气相色谱质谱联用分析：吸取1ul试品溶液注入色谱仪，按常规气相色谱法测定，得GC/MS谱图。气相分析条件为：Agilent 6890型气相色谱仪，5973N型质谱仪，DB5MS石英毛细管柱，柱温为在35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃，He流速为1.2ml/mvn。质谱的条件为：EI源，轰击电压为70eV，扫描范围为25-450amu。
3.计算机处理：
按照上述计算机处理流程图对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，即是蛇床子的二维条形码指纹图谱，计算机处理步骤同实施例1。
重现性试验：取5份同一浙江产蛇床子，按照上述方法进行分析测试，比较其类似度。结果见图3与图4：从图4类似度比较图可以看出，类似度大于0.7，表明该测定方法有很好的稳定性。
实施例3细辛的彩色二维条形码指纹图谱的制作
细辛(Asarum heterotropoides Fr.Schmidt)是中药中比较常用的一味药，其性辛、温，归心、肺、肾经。主要用于祛风散寒、温肺化饮。
1.细辛中药材的裂解：称取毫州产中药材粉末1.0140g，置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到400℃保持70mins，然后冷却至室温，以1∶1乙醇—丙酮溶解裂解产物，得试品溶液。
2.气相色谱质谱联用分析：吸取1ul试品溶液注入色谱仪，按常规气相色谱法测定，得GC/MS谱图。气相分析条件为：Agilent 6890型气相色谱仪，5973N型质谱仪，DB35ms石英毛细管柱，柱温为在35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃。He流速为1.2ml/min质谱的条件为：EI源，轰击电压为70eV，扫描范围为25-450amu。
3.计算机处理：
按照上述计算机处理流程图对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，即是细辛的二维条形码指纹图谱。计算机处理步骤同实施例1。
4.重现性试验：取5份同一毫州产细辛，按照上述方法进行分析测试，比较其类似度。结果见图5与图6：从图6的类似度比较图可以看出，类似度大于0.7，表明该测定方法有很好的稳定性。
实施例4.柴胡的彩色二维条形码指纹图谱的制作
柴胡(Bupleurum chinense DC.)是用于治疗感冒的最常见的中药，其性苦、温寒。主要用于治疗感冒发烧，寒热往来，胸协胀痛等。
1.柴胡中药材的裂解：称取甘肃产中药材粉末1.0140g，置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到350℃保持100mins，然后冷却至室温，以1∶1甲醇—丙酮溶解裂解产物，得试品溶液。
2.气相色谱质谱联用分析：吸取1ul试品溶液注入色谱仪，按常规气相色谱法测定，得GC/MS谱图。气相分析条件为：Agilent 6890型气相色谱仪，5973N型质谱仪，DB35ms石英毛细管柱，柱温为在35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃，He流速为1.2ml/min质谱的条件为：EI源，轰击电压为70eV，扫描范围为25-450amu。
3.计算机处理：按照上述计算机处理流程图对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，即是柴胡的二维条形码指纹图谱。计算机处理步骤同实施例1。
4.重现性试验：取5份同一甘肃产柴胡，按照上述方法进行分析测试，比较其类似度。结果见图7与图8：从图8的类似度比较图可以看出，类似度大于0.7，表明该测定方法有很好的稳定性。
实施例5.木香的二维彩色指纹图谱的制作
木香为菊科植物木香(Aucklandia lappa Decne)的干燥根。其性辛、苦、温。主要用于泻痢后重，食积不消，不思饮食。
1.木香中药材的裂解：称取四川产中药材粉末1.0140g，置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到450℃保持50mins，然后冷却至室温，以1∶1甲醇—丙酮溶解裂解产物，得试品溶液。
2.气相色谱质谱联用分析：吸取1ul试品溶液注入色谱仪，按常规气相色谱法测定，得GC/MS谱图。气相分析条件为：Agilent 6890型气相色谱仪，5973N型质谱仪，DB35ms石英毛细管柱，柱温为在35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃。He流速为1.2ml/min质谱的条件为：EI源，轰击电压为70eV，扫描范围为25-450amu。
3.计算机处理：按照上述计算机处理流程图对GC/MS数据进行处理，得到二维条形码，即是木香的二维条形码指纹图谱。计算机处理步骤同实施例1。
4.重现性试验：取5份同一四川产木香，按照上述方法进行分析测试，比较其类似度。结果见图9与图10：从图10的类似度比较图可以看出，类似度大于0.7，表明该测定方法有很好的稳定性。

Claims (2)

1、一种中药指纹图谱的制作方法，其特征在于它是一个用裂解一气相色谱-质谱联用技术来制作中药指纹图谱的方法，该方法包括下列步骤：
步骤1，中药材的裂解：取中药材粉末置于裂解器中，以CO2置换裂解器中的空气，加热到350-450℃，保持50-100mins，以溶剂溶解裂解产物，得试品溶液；
步骤2，GC/MS分析：取试品溶液，注入色谱仪，色谱为：石英毛细管柱，柱温35℃保留5分钟，然后以每分钟15℃的速率升到250℃，He流速1.2ml/min，质谱为：EI源，轰击电压70eV，扫描范围25-450amu；
步骤3，计算机处理步骤包括：首先，试品导入GC/MS分析仪器测试得到的混合物体系的分析数据，经过数据抽提与数据变换方法处理后得到与混合物分离相关的数据与后续的检测信息、然后再采用数据压缩与二维彩色码生成算法处理，就获得标识该混合体系的彩色二维条形码。
2、如权利要求1所述的制作方法，其特征在于步骤1中所述溶剂是选自甲醇、乙醇或丙酮中一种或一种以上的混合物。
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