CN1297994A

CN1297994A - 生产食用、药用真菌菌粉和真菌多糖的方法

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Publication number: CN1297994A
Application number: CN 00123386
Authority: CN
Inventors: 曹文伟; 王竞; 周定; 刘永宏
Original assignee: Zeng Wenwei
Current assignee: Zeng Wenwei
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2001-06-06
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: CN1236048C

Abstract

一种生产食用、药用真菌菌粉和真菌多糖的方法。主要是直接采用玉米酒精废糟液做培养基生产一级液体种子,并直接用酒精废糟液做培养基进行真菌接种、深层发酵、培养菌丝体,然后利用菌丝菌粉和发酵液提取真菌多糖。该发明既彻底解决了酒精厂排放废水的污染,又使生产食、药用真菌菌粉和真菌多糖的成本大大降低,并能进行工厂化生产,具有显著的经济效益和社会效益。

Description

生产食用、药用真菌菌粉和真菌多糖的方法

本发明属于酒精废糟液综合利用领域。主要是以生产酒精的废糟液为原料，经深层液体发酵的方法来培养生产各种食用和药用真菌菌粉及真菌多糖。

酒精废糟液(Vinasse)是发酵法生产酒精的副产品，是一种高浓度有机废水，我国每年的排放量达1500万吨以上，这不仅是资源的极大浪费，同时也严重污染了环境。酒精废糟液富含可供多种食用、药用真菌生长、代谢所需要的营养物质，如氮源、碳源、无机盐及维生素等。以其为培养基，发酵培养香菇、平菇、木耳、银耳、猴头菇等食用真菌和灵芝、云芝、冬虫夏草等药用真菌，可将菌丝体制备成菌粉，也可从菌丝体和发酵液中提取真菌多糖。

本发明的目的就是为了更好地利用酒精废糟液(主要是玉米酒精废糟液)而提供一种酒精废糟液生产食、药用真菌菌粉和真菌多糖的方法。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

一、本发明使用的菌种和菌种扩培的方法

(1)本发明使用的菌种：灵芝、云芝、黑木耳、香菇、双孢菇、平菇、猴头菇、金针菇等食用、药用真菌菌种均来源于山东省金乡县食用菌研究所和辽宁省朝阳市食用菌研究所。

(2)菌种扩大培养的方法：

A、斜面菌种的制备与处理：斜面菌种培养基采用PDA综合培养基(马铃薯200克、白糖20克、琼脂20克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、水1000毫升)，接种后于25-30℃下培养10-15天。食、药用真菌菌种在斜面培养基上附着能力很强，如果铲下后直接置于培养基中，上摇床培养，则易形成大菌块，甚至只有一个大菌块，不利于进一步培养。所以在接入一级斜面菌种前要对一级斜面菌种进行破碎(使用接种针进行手工破碎)，破碎处理后，菌种接入新的液体培养基后能漂浮于液体表面，菌种分散性好、发菌点多，使菌种量及菌球密度增加。

B、一级液体种子(摇瓶种子)的制备：

采用的培养基是：玉米酒精废糟液滤液，其PH值为5.5-6.5。其制备方法是在容积是250毫升的三角瓶内，装量70-90毫升的培养基，灭菌后冷却至30℃时接入斜面菌种，接种量为8-12％，先于28℃条件下静置24小时后置于摇床上160-180rpm，28℃振荡培养48-72小时。

二、本发明使用的发酵培养基及生产食、药用真菌菌丝体和菌粉的方法

(1)发酵培养基及发酵条件

Ⅰ、采用玉米酒精废糟液滤液，其PH值为6.0。

Ⅱ、常规灭菌后，按10％的接种量接种至种子扩培罐(种子扩培罐除培养时间为2-3天与发酵罐4-5天不同外，其余均与发酵罐培养条件相同)；采用通风搅拌发酵罐0-12小时，搅拌速度为80-100rpm，通气为0.5∶1vvm；12-72小时搅拌速度为120-140rpm，通气为0.5∶1vvm；72-144小时搅拌速度为160-200rpm，通气为0.5∶1vvm。气升式反应器通风搅拌的条件为0-12小时0.25∶1vvm；12-72小时0.5∶1vvm；72-144小时0.75∶1vvm。两者的培养温度均为25-28℃。

(2)食用、药用真菌菌粉制备

发酵终结后，将发酵液通过板框过滤器，收集滤并，然后通过干燥机60-80℃干燥，并粉碎或制成颗粒，即为菌粉。本发明的菌粉收率可达1.03-1.15％。

三、本发明提取真菌多糖的方法

(1)从发酵液中提取食、药用真菌多糖的方法：

Ⅰ、发酵液浓缩的方法：本发明采用薄膜浓缩的方法对发酵液进行浓缩；超滤膜选择MWCO10000的聚砜不对称膜(PS-1)，操作压力0.2MPa，料液温度为20-30℃，循环速度0.22m/s左右，在此条件下超滤200min，通量和截留率分别稳定在9.11/m²·h和96％左右，多糖收率为92.6％。

超滤器的计算公式：

T c_{1} - c_{2} = \frac{c_{2} c_{1} v_{1}}{c_{1} c_{2}} \cdot \frac{k_{1} + k_{2} c}{jo k_{1} + (jo k_{2 - 1}) c} dc

可根据上述公式对超滤器选型。

Ⅱ、乙醇提取食、药用真菌多糖的方法：取发酵液的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，醇析24hr，醇洗后真空干燥至恒重，或含水量不超过10％。干燥温度为60-78℃。干燥后粉碎包装，即为食、药用真菌多糖(粗糖)。

(2)从菌丝体中提取食、药用真菌多糖的方法：

一般从菌丝体中提取食、药用真菌多糖，菌丝体不需要干燥，而是从板框过滤器上收滤菌并(湿菌体直接提取食、药用真菌多糖)，本发明主要采用酶·水联合提取法，即湿菌丝体用胶体磨等通用匀浆设备匀浆后，加5倍水升温至45℃，加入0.5％纤维素酶+0.5％蛋白酶作用60分钟，随即升温至90℃，浸提60分钟重复三次，再经板框过滤收集滤液，经薄膜浓缩和2-3倍体积的酒精沉淀、干燥、粉碎等程序，收集真菌多糖。

本发明除上述方法外，还可采用下述方法：

Ⅰ、热水浸提，即加水3倍，提取温度80-90℃，提取2次，第一次为3小时，第二次为1.5-2小时，乙醇沉淀倍数2-3倍。

Ⅱ、碱提取，即浓度0.1N、1.0N的NaOH溶液与菌丝3∶1混合，分别在15℃和60℃提取120分钟和240分钟，两次重复。

Ⅲ、酸提取，即浓度1.5％、3％的三氯乙酸溶液与菌丝3∶1混合，分别在15℃和60℃提取120分钟和240分钟，5℃提取240分钟和24小时，两次重复。

Ⅳ、水碱联合提取，即菌丝匀浆后，加入5倍水，90℃提取180分钟，残渣用1.0N NaOH15℃提取120分钟，两次重复。

多糖的测定：

溶剂提取后，取一定量提取液(中和后适当浓缩)加入3倍95％乙醇，醇析24小时，醇洗后溶剂溶解，以苯酚硫酸法测定。

多糖提取率(EX)：

匀浆：研磨法。

本发明具有如下优点：

1、找到了利用酒精废糟液生产高附加值的新途径。

2、生产食、药用真菌菌粉和真菌多糖后的酒精废糟液无任何污染，可重新用于生产、生活。

下面对本发明做进一步说明：

1、酒精废液处理的国内外情况

发酵法生产酒精是各国生产酒精采用的主要生产方法，生产中产生大量废液，每生产一吨酒精要排放10-15吨废液。至1990年止，我国每年排放的酒精废液量达1500万吨以上，再加上液态白酒厂(车间)的排放量，估计每年可达4000万吨。这不仅浪费了大量粮食，同时也严重污染了环境，如谷物原料的废液中的COD值高达40000-50000mg/l，BOD₅达20000-30000mg/l。糖蜜酒精废液的数值就更高，一般COB值50000-80000mg/l，BOD₅30000-50000mg/l。

酒精废液中含有丰富的营养物质，如粮食酒精废液中，含有蛋白质、纤维素、聚戊糖、灰分、脂肪、焦糖、丰富的B族维生素和生长素；糖蜜酒精废液中除含丰富的碳源、氮源和磷源外，富含钾盐、钙盐等。酒精废液的主要组成如表1所示。

表1 酒精废液的组成

组分	玉米酒精废液	糖蜜酒精废液
组分	玉米酒精废液	糖蜜酒精废液	BOD(mg/l)	15000-25000	50000-60000
固形物(％)	7.5	8.5	BOD(mg/l)	15000-25000	50000-60000
固形物(％)	7.5	8.5	糖类(％)	0.5	0.9
蛋白质(％)	2.3	0.8	糖类(％)	0.5	0.9
蛋白质(％)	2.3	0.8	灰分(％)	1.5	2.5
维生素	较多	较多	灰分(％)	1.5	2.5

2、国内外综合利用酒精废液的几种主要方法：

①生产(SCP)饲料。

②生产全价干饲料(DDGS)。

③沼气发酵。

从现有的资料未发现国内外有利用酒精废液生产食用、药用真菌菌粉及真菌多糖的报道。

附图说明：

图1是本发明的工艺流程简图

图2是本发明的提取工艺流程图

实施例1

玉米酒精废糟液液体深层发酵生产灵芝菌粉和灵芝多糖的方法：

一、玉米酒精废糟滤液的制备

收集新鲜的酒精废糟液，通过卧式离心机(四川江北机械厂产WL450)离心，固液分离，取分离液经过板框过滤机过滤，收集滤液，即为酒精废糟液滤液。

二、灵芝发酵的工艺条件和发酵工艺

1、灵芝发酵的工艺条件：(1)斜面培养菌株：灵芝Ganoderma lucidum 903保藏菌种，购自山东省金乡县食用菌研究所。培养基：PDA马铃薯琼脂培养基，25×250mm试管接种0.3cm²保藏菌种，25-28℃培养10天左右，0-4℃保藏备用。(2)摇瓶培养：培养基为玉米酒精废糟液滤液，将其PH值调至5.5-6.5，250ml三角瓶装量为70ml；750ml三角瓶装量为100-120ml，1.1kg/cm²，蒸汽压力下灭菌30分钟，冷却后每瓶接入斜面菌种，先于28℃下静置24小时后，置于摇床上160-180rpm，28℃振荡培养48-72小时。(3)种子罐培养：培养液配方同摇瓶培养基，即完全使用玉米酒精废糟液滤液，调PH为6.0。常规消菌后冷却至28℃，按10％的接种量接入摇瓶种子液。采用通风搅拌发酵罐，0-12小时转数为80-100rpm，通气量为0.5∶1vvm；12-72小时转数为120-140rpm，通气量为0.2∶1vvm；72-96小时转数为160-200rpm，通气0.5∶1vvm，培养温度保持在28℃±1℃。(4)发酵罐发酵：培养基为100％玉米酒精废糟液滤液，PH调至6.0左右，待发酵罐空消后，将培养基打入发酵罐中，装量为罐体积的70％，于1.2kg/cm²蒸气压实消60分钟，冷却至28℃后，按10％的接种量将种子罐的种子液压入发酵罐中，发酵温度控制在25-28℃，搅拌速度和通气量均与种子罐的控制条件相同，发酵时间为96-120小时。

2、灵芝的发酵工艺路线

三、灵芝菌粉的生产

发酵终止后，将发酵液打入到贮罐Ⅰ中，再将贮罐Ⅰ中的发酵液泵入板框过滤机，滤液流入不锈钢贮槽中，再通过计量泵打入酒精发酵车间的配料罐中做为拌制水使用。过滤完毕，收集滤并，利用干燥机60℃-80℃干燥，再粉碎即为灵芝菌粉。

四、灵芝多糖的提取

1、从发酵液中提取灵芝多糖

(1)发酵液浓缩：采用超滤的方法进行浓缩，利用内压式中空纤维膜组件(由中科院大连化物所提供)聚砜膜不对称膜(PS)截留分子量10000，压力调整通过调节泵的转速和控制阀门来实现。超滤浓缩灵芝发酵液的适宜条件是，操作压力0.2MPa，料液温度为20-30℃，循环速度为0.22m/秒，多糖收率为92.6％。利用此法可将发酵液浓缩5倍。

(2)乙醇提取灵芝多糖(粗多糖)

一定体积浓缩液和其3倍体积的95％酒精混合，醇析24小时；醇析液通过离心，上清液打入蒸馏塔，进行酒精蒸馏，回收酒精备用。收集沉淀，用丙酮洗涤，再经真空干燥，粉碎即为脱外灵芝多糖(粗多糖)，其纯度可达到36％以上。

2、从菌丝体中提取灵芝多糖(粗多糖)

利用玉米酒精废糟液进行灵芝的液体深层发酵生产灵芝菌粉的方法在本实施例的二、三部份已全面阐述。从菌丝体中提取多糖可用灵芝菌粉也可以用湿菌丝体直接提取。

从菌丝体中提取灵芝多糖系采用酶水联合提取法，即：湿菌丝体[或灵芝菌粉加入1∶78(菌粉∶水)的水，浸泡1小时]采用胶体磨等通用匀浆设备，匀浆后加5倍(V/V)水，升温至45℃后，加入0.5％纤维素酶+0.5％蛋白酶并作用60分钟，随即升温至90℃，浸提60分钟，再经板框过滤收集滤液，上述过程重复二次，将两次滤液合并，经膜深缩、醇析、干燥、粉碎等程序，形成灵芝多糖(胞内粗多糖)的产品(具体的膜浓缩、醇析、干燥、粉碎等操作方法均与本实施例的四．1的部分“从发酵液中提取灵芝多糖完全一致。)本发明从灵芝菌丝体中提取灵芝多糖其收率可达1000-1465mg/kg湿菌体。

五、玉米酒精废液中含有丰富的碳源、氮源、B族维生素及生长素。其中废液滤液含总糖0.6-0.7％，总氮0.36-0.45％，维生素及无机盐含量如表2所示。

表2 玉米酒精废液滤液中维生素和无机盐含量及代谢功能

维生素无机盐	含量(％)	代谢功能
维生素无机盐	含量(％)	代谢功能	V_B1	1.2×10^-5	构成脱羧酶，转醛酶，转酮酶的辅基，与a-酮酸的氧化脱羧，酮基转移有关
V_B2	2.28×10^-5	黄素核苷FMN和FAD的前体，它们构成黄素蛋白的辅基，转移氢	V_B1	1.2×10^-5	构成脱羧酶，转醛酶，转酮酶的辅基，与a-酮酸的氧化脱羧，酮基转移有关
V_B2	2.28×10^-5	黄素核苷FMN和FAD的前体，它们构成黄素蛋白的辅基，转移氢	泛酸	4.36×10^-5	辅酶A的前体，乙酰载体的辅基，转移酰基，参与糖和脂肪酸的合成
烟酸	2.4×10^-4	NAD和NADP的前体，是脱氢酶的辅酶，参与递氢过程及氧化还原反应	泛酸	4.36×10^-5	辅酶A的前体，乙酰载体的辅基，转移酰基，参与糖和脂肪酸的合成
烟酸	2.4×10^-4	NAD和NADP的前体，是脱氢酶的辅酶，参与递氢过程及氧化还原反应	V_B6	1.75×10^-5	磷酸吡哆醛是氨基酸，消旋酶，转氨酶和脱羧酶的辅基
叶酸	1.1×10^-6	参与碳基的转称，与合成嘌吟，嘧啶，核苷酸，氨基酸有关	V_B6	1.75×10^-5	磷酸吡哆醛是氨基酸，消旋酶，转氨酶和脱羧酶的辅基
叶酸	1.1×10^-6	参与碳基的转称，与合成嘌吟，嘧啶，核苷酸，氨基酸有关	V_E	1.12×10^-4	参与氧化还原反应
胆碱	9.6×10^-3	参与脂肪代谢	V_E	1.12×10^-4	参与氧化还原反应
胆碱	9.6×10^-3	参与脂肪代谢	生物素	1.1×10^-6	各种羧化酶的辅基，在氨基酸，脂肪酸及糖代谢中起作用
P	0.026	核酸，磷酸和辅酶的成份	生物素	1.1×10^-6	各种羧化酶的辅基，在氨基酸，脂肪酸及糖代谢中起作用
P	0.026	核酸，磷酸和辅酶的成份	S	0.0074	含硫氨基酸及含硫维生素的成份
K	0.035	果糖激酶等的辅因子，维持电位差和渗透压	S	0.0074	含硫氨基酸及含硫维生素的成份
K	0.035	果糖激酶等的辅因子，维持电位差和渗透压	Mg	0.013	许多酶的辅因子

由表2可知，玉米酒精废液滤液完全可以满足灵芝深层培养时的营养需求，而且废液中还有一定量的有机酸、甘油、乙醇及脂类等物质，其中有机酸能够防止因糖的利用引起的PH过速下降，且可促进糖类的利用和菌体的生长；脂类不仅可作为碳源，而且可起消泡作用。另外废液本身具有一定的粘度，在菌丝体生长过程中形成一定的剪切作用，有利于菌球的形成，从而提高菌丝得率。因此利用玉米酒精废液深层培养灵芝菌不仅具有可行性，而且具有一定的优越性，从而使废物有利于资源化。

利用废液与合成培养基深层培养灵芝的实验结果比较如表3所示(均为三个重次)。

表3 不同培养基对GL-903生长的影响

培养基	废液滤液(添加2％蔗糖)	蔗糖酵母粉培养基	蔗糖蛋白胨培养基
培养基	废液滤液(添加2％蔗糖)	蔗糖酵母粉培养基	蔗糖蛋白胨培养基	菌丝得率(％)	0.93	0.76	0.75
胞外多糖(g/l)	0.82	0.63	0.65	菌丝得率(％)	0.93	0.76	0.75
胞外多糖(g/l)	0.82	0.63	0.65	胞内多糖(g/kg菌体)	0.66	0.53	0.52

(培养条件：180rpm，28℃，80ml/250ml，接种量6.0％，96hr)

由表3可知，利用玉米酒精废液培养灵芝菌，无论是菌丝得率，还是胞内、外多糖均高于合成培养基，这可能与废液中含有丰富的维生素有机酸及氨基酸有关。小松信彦等的研究结果表明，V_B1分子中的嘧啶环及谷氨酸是裂褶菌多糖合成的促进因子。浜田信威证实，茁霉多糖的生产可通过在培养基中添加V_B1而增加，醋杆菌多糖可通过添加琥珀酸而提高。另外据WP.weisrock报道，柠檬酸、琥珀酸和a-酮戊二酸均能促进黄原胶的产生。

因此，玉米酒精废液不仅对灵芝生长具有优越性，而且对灵芝胞内、外多糖积累也同样具有优越性。

实施例2

玉米酒精废糟液液体深层发酵生产香菇菌粉和香菇多糖的方法。

一、玉米酒精废糟滤液的制备，同实施例1。

二、香菇发酵的工艺条件和发酵工艺：

1、香菇发酵的工艺条件：(1)斜面培养：菌株：香菇Lentinus.edodes LE-1保藏菌种，购自山东省金乡县食用菌研究所。培养基：PDA马铃薯琼脂培养基。25×250mm试管接种0.2cm²保藏菌种，24-26℃培养8-10天，0-4℃保藏备用。(2)摇瓶培养：培养基为玉米酒精废糟液滤液，将其PH调至6.0-6.5，250ml三角瓶装量为70ml；750ml三角瓶装量为100-120ml，1.1kg/cm²蒸汽压力下灭菌30分钟，冷却后每瓶接入斜面菌种，先于25℃下静置24小时后，置于摇床160-180rpm，25℃振荡培养5天。(3)种子罐培养：培养液配方同摇瓶培养基，调PH至6.0，常规灭菌后冷却至26℃，按10％的接种量接入摇瓶种子液。采用通风搅拌发酵罐；0-12小时，转速为40-60rpm，通气量为0.5∶1vvm；12-72小时转速为60-80rpm，通气量为0.5∶1vvm；72-120小时转速为80-100rpm，通气量为0.5∶1vvm。培养温度保持在25-28℃。(4)发酵罐发酵：培养基为100％玉米酒精废糟液滤液，PH调至6.0左右，待发酵罐空消后，将培养基打入发酵罐中，装量为罐体积的70％，于1.2kg/cm²蒸汽压实消60分钟。冷却至26℃后，按10％接种量将种子罐的种子液压入发酵罐中。发酵温度控制在25-26℃，搅拌速度和通气量均与种子罐的控制条件相同，发酵时间为5-6天。

2、香菇发酵的工艺路线

三、香菇菌粉的生产与实施例1完全相同。

四、香菇多糖的提取与实施例1大体相同。

Claims

1、生产食、药用真菌一级液体种子的方法，其特征在于生产一级液体种子，即摇瓶种子的培养基是玉米酒精废糟液滤液，其PH值为5.5-6.5。

2、根据权利要求1所说的方法，其特征在于制备一级种子的方法是：

在容积是250毫升的三角瓶内，装量70-90毫升的培养基，灭菌后冷却至30℃时接入斜面菌种，先于28℃条件下静置24小时后置于摇床上，以每分钟160-180转速度，温度28℃，振荡培养48-72小时。

3、酒精废糟液深层发酵生产食、药用真菌菌丝体及菌粉的方法，其特征在于发酵培养基是玉米酒精废糟液滤液，其PH值为6.0。

4、根据权利要求3所说的方法，其特征在于发酵条件是：

常规灭菌后，按10％的接种量接种至种子扩培罐，种子扩培罐除培养时间为2-3天与发酵罐4-5天不同外，其余均于发酵罐培养条件相同，采用通风搅拌发酵罐0-12小时，搅拌速度为每分钟80转，通气为0.5∶1vvm；12-72小时，搅拌速度为每分钟120-140转，通气为0.5∶1vvm；72-144小时，搅拌速度为每分钟160-200转，通气为0.5∶1vvm；气升式反应器通风搅拌条件为0-12小时，0.25∶1vvm；12-72小时，0.5∶1vvm；72-144小时，0.75∶1vvm，两者的培养温度为25-28℃。

5、根据权利要求3所说的方法，其特征在于真菌菌粉的制备：

发酵终结后，将发酵液通过板框过滤器，收集滤并，然后通过干燥机60-80℃干燥，并粉碎或造粒，即为菌粉。

6、从酒精废糟液深度发酵液中提取真菌多糖的方法，其特征在于：

a、发酵液浓缩的方法：采用薄膜浓缩的方法对发酵液进行浓缩，超滤膜选择MWC010000的聚砜不对称膜PS-1，操作压力0.2MPa，料液温度为20-30℃，循环速度0.22米/秒左右，在此条件下超滤200分钟，通量和截留率分别稳定在9.11/平米·小时和96％左右，

超滤器选型的计算公式：

T c_{1} - c_{2} = \frac{c_{2} c_{1} v_{1}}{c_{1} c_{2}} \cdot \frac{k_{1} + k_{2} c}{jo k_{1} + (jo k_{2 - 1}) c} dc

b、乙醇提取真菌多糖的方法：取发酵液的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，醇析24小时，醇洗后真空干燥，干燥温度为60-78℃，干燥后粉碎即为多糖，也称粗糖。

7、从菌丝体中提取真菌多糖的方法，其特征在于采用酶、水联合提取法：湿菌丝体用胶体磨等通用匀浆设备匀浆后，加5倍水升温至45℃，加入0.5％纤维素酶+0.5％蛋白酶作用60分钟，随即升温至90℃，浸提60分钟重复二次，再经板框过滤收集滤液，经薄膜浓缩和2-3倍体积的酒精沉淀，干燥，粉碎等程序，收集真菌多糖。