CN1294272C - 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法 - Google Patents

制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1294272C
CN1294272C CNB028053176A CN02805317A CN1294272C CN 1294272 C CN1294272 C CN 1294272C CN B028053176 A CNB028053176 A CN B028053176A CN 02805317 A CN02805317 A CN 02805317A CN 1294272 C CN1294272 C CN 1294272C
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnesium
calcium
solution
pantothenic acid
pantothenate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028053176A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1492934A (zh
Inventor
K－U·鲍尔德纽斯
C·贝克
H-P·哈尔茨
M·洛沙伊德特
D·克莱因
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of CN1492934A publication Critical patent/CN1492934A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1294272C publication Critical patent/CN1294272C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/20—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/20—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents
    • A61N1/205—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents for promoting a biological process
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/326—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for promoting growth of cells, e.g. bone cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。

Description

制备作为动物饲料添加剂的D-泛酸和/或其盐的方法
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
作为生物合成辅酶A的原料，D-泛酸盐广泛分布于植物界和动物界中。与通过膳食消耗足量泛酸的人类不同，D-泛酸盐缺乏症状常常不仅见于植物，而且也见于动物。因此，D-泛酸盐的可利用性具有重大经济价值，特别是在动物饲料工业中。
传统上，D-泛酸盐通过化学合成由D-泛内酯和β-丙氨酸钙来制备(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工业化学大全)，第六版，1999，电子版，“维生素”一章)。D-泛内酯的制备需要经由非对映盐的复杂且经典的外消旋体拆分。由该化学合成得到的工业产物通常是D-泛酸的钙盐，即D-泛酸钙。
与化学合成相比，使用微生物的生物技术生产方法的优点在于选择性(对映体纯)生产可用于高级生物的D型泛酸。因此，如化学合成中所需的复杂的外消旋体拆分就不必要了。
已知有大量使用微生物来制备D-泛酸的发酵方法，包括EP-0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此，EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制备泛酸盐的方法，其中在发酵溶液中得到的最大D-泛酸含量为1g/l。然而，对于经济地制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂，发酵溶液中这样低的泛酸含量(即以固含量计不到10重量％)是不适用的。迄今所述方法的另一缺点在于产物从发酵培养基中的分离需要许多复杂的后处理步骤。尚不知在工业规模上经济的制备方法。
德国公开申请DE 100 16 321描述了一种制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂的发酵方法。然而，与上述制备D-泛酸的发酵方法一样，该方法的一个重大缺点在于必须将该泛酸的前体-β-丙氨酸经由发酵培养基供入微生物中以得到所需产物的经济产率。
另外，US 6,013,492和WO 96/332839描述了通过从培养基中滤除不溶性成分(例如细胞物质)，将滤液吸附到活性炭上，随后用有机溶剂、优选甲醇洗脱D-泛酸，用氢氧化钙中和以及随后将D-泛酸钙结晶而从发酵溶液中对D-泛酸进行后处理。其重大缺点在于结晶过程中损失有价值的产物以及使用从产物中难以除去且需要复杂的溶剂回收步骤的有机溶剂。
EP 0590857描述了一种制备D-泛酸的发酵方法，其中培养微生物需要供入β-丙氨酸。将该发酵溶液过滤以分离除去生物质，然后使其通过阳离子交换剂并然后通过阴离子交换剂，之后用氢氧化钙中和，蒸发浓缩，加入活性炭，再次过滤以及加入甲醇和氯化钙以结晶。所得含有泛酸钙的产物除了含有钙盐形式的D-泛酸外，还含有摩尔比为1∶1的氯化钙。降低氯化钙含量需要电渗析和随后的喷雾干燥。该方法的缺点在于：由于大量复杂的工艺步骤和有机溶剂的使用使得既不经济又不生态。
本发明的目的是提供一种含有D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂以及通过没有上述缺点的制备D-泛酸和/或其盐的改进方法来制备它的方法。出于经济上的原因，此处理想的方法是，其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外，制备其二价盐形式且尤其是碱土金属盐形式的D-泛酸是所需的，因为该泛酸的二价盐与其一价盐相比具有更低的吸湿性，因而对于进一步应用例如用作动物饲料添加剂具有不太显著的团聚趋势。
我们发现该目的通过本发明有利地实现。
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的方法，其包括如下步骤：
a)使用至少一种生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/lD-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阳离子交换剂，其中由该D-泛酸盐形成游离D-泛酸，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
在本发明方法的变体中，在步骤c)中，也可得到含有氯化钙和/或氯化镁的悬浮液。然后在随后的步骤d)中，将该悬浮液进行干燥和/或配制。
本发明方法步骤a)中的发酵使用本身已知的程序以分批、补料分批或反复的补料分批方式或连续方式进行。在这种情况下使用常规缓冲体系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸盐缓冲液将所得泛酸中和。
在本发明方法的另一变体中，在步骤a)中，通过发酵在培养基中生成至少10g/l、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/lD-泛酸盐。
对本发明而言，词语“产生”指所述生物可合成比其自身代谢需要所需量要大的D-泛酸和/或其盐。在本发明的有利变体中，所合成的D-泛酸和/或其盐的量不存在于细胞内部，但理想的是通过生物全部释放到培养基中。该释放通过本身公知的机理可以是主动的或被动的。
根据本发明，所用产生D-泛酸的生物是微生物。这些微生物根据本发明包括真菌、酵母和/或细菌。根据本发明，优选使用真菌如毛霉菌属或酵母如酵母属(Saccharomyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，在这当中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根据本发明，有利地使用棒状杆菌(coryneform bacteria)或芽孢杆菌科(Bacillaceae)。在本发明范围内优选的例如是棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Bevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)或根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。此处特别优选的例如是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、短杆菌(Brevibacterium breve)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和一组以其16sRNA表征的其它芽孢杆菌种，或Actinum mycetalis。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
此外，本发明还包括使用基因修饰生物以用于本发明制备含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂。这类基因修饰生物例如可通过化学诱变和随后使用合适的“筛选法”筛选来分离。根据本发明，称作“生产菌株”的也包括在内，它们适于制备本发明产物且在D-泛酸方向的代谢通量方面具有基因修饰，其中在D-泛酸和/或其盐经由细胞膜排出方面的修饰也包括在内。这例如可通过对所用生物的相关代谢生物合成途径中的关键位置的修饰来实现。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或异源核苷酸序列转移得到的转基因生物来合成所需产物。在这种情况下，单独和/或组合位于基因组中的和/或位于载体上的一个或多个基因可能超表达和/或去调节。
这类转基因生物可有利地含有额外的拷贝和/或基因修饰的基因，所述基因选自panB、panC、panD、panE和/或其组合和/或甚至是象panBCD操纵子那样的组织单元。另外，如EP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述，可有利地在生物中操作其它代谢途径，例如异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。结果，泛酸生物合成的支化链前体物质越发可利用。合适的话，将用于该生物合成途径的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表达。
另外，本发明还包括在所用的产生D-泛酸的生物中对天冬氨酸α-脱羧酶(panD)例如通过超表达和/或去调节进行基因修饰。
对本发明而言，词语“去调节”指在生物合成代谢途径中改变或修饰至少一个编码一种酶的基因，使得改变或修饰该酶在该微生物中的活性。优选改变至少一个编码一种生物合成代谢途径的酶的基因，使得该基因产物以更大程度形成，或者具有增加的活性。术语“去调节的代谢途径”也包括其中改变或修饰一个以上编码一种以上酶的基因以改变或修饰该一种以上酶的活性的生物合成代谢途径。
改变或修饰可包括但不限于：除去内源启动子或调节成分；同时引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子；除去调节序列以改变该基因产物的表达；改变该基因的染色体位置；改变在该基因附近或该基因内的DNA序列，例如核糖体结合位点(RBS)；增加该基因组中该基因的拷贝数或引入数目不等的质粒拷贝；修饰蛋白(例如调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活因子等)，它们在基因转录和/或在翻译得到基因产物中起着作用。这也包括所有属于现有技术的其它去调节基因的表达的可能方式，例如使用反义寡核苷酸或阻断阻抑蛋白。
去调节也可包括对例如导致除去基因产物中的反馈调节或导致基因产物的更大或更小比活性的基因的编码区的改变。
此外，对酶的基因修饰根据本发明是有利的，这些修饰影响泛酸前体的流出和/或泛酸流出产生辅酶A。编码这些酶的基因的实例是：alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
另外，基因修饰是有利的，这些修饰保证辅因子(例如亚甲四氢叶酸、氧化还原等同物等)以对于泛酸生产而言最优的量的细胞生产。
因此，β-丙氨酸有利地已经以与相应的非基因修饰生物相比增加的浓度存在于细胞中，因而不必将其作为前体加入培养基中，例如EP-A 0 590857中所要求的。其中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脱羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且，微生物中酮泛解酸还原酶(panE)的额外超表达是有利的。
根据本发明，合适的话，若合成辅酶A所需的coaA基因的活性降低或者该基因被彻底切断(例如在芽孢杆菌属种中)，则将额外有利。这是因为芽孢杆菌属除含有coaA外还含有其它提供这种酶催功能的基因(＝coaX)。该coaX基因或相应酶的活性也可改变，优选降低，或者甚至消除，条件是coaA本身仍旧具有足够的酶活性，即使是降低的酶活性，也就是说coaA的酶活性没有彻底丧失。除各种基因的超表达之外，这些基因的启动区的基因操作也是有利的，条件是该操作导致该基因产物的超表达。
在本发明实施方案中，使用根据附件(PCT/US 0025993)描述的细菌菌株，例如枯草芽孢杆菌PA 824和/或其衍生物。在另一实施方案中，根据本发明，在本发明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的微生物枯草芽孢杆菌PA 668。这些枯草芽孢杆菌PA 824和PA668菌株按如下方式生产：
从具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢杆菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)开始，通过Trp+标记(来自枯草芽孢杆菌野生型W23)转导生产PY79菌株。经典的基因工程方法(例如Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢杆菌属的分子生物学方法)(1990)(John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，英国)中所述)将ΔpanB和ΔpanE1突变引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因组DNA和枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因组DNA将所得菌株转化。所得菌株PA327具有基因型P26panBCD、P26panE1，且为色氨酸营养缺陷体(Trp-)。使用枯草芽孢杆菌菌株PA327，在10ml含有SVY培养基(将25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、2.7g/l硫酸铵加入740ml水中，将该混合物高压灭菌，然后加入200ml1M磷酸钾(pH7.0)和60ml 50％无菌的葡萄糖溶液)的培养物中，得到不超过3.0g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/l β-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生产描述在下列部分：
借助E.Coli的panBCD操纵子的序列信息(见Merkel等人，FEMSMicrobiol.Lett.，143，1996：247-252)，从枯草芽孢杆菌GP275质粒文库开始，使用经典的基因工程方法来克隆芽孢杆菌属的panBCD操纵子。为了进行克隆，使用E.coli菌株BM4062(birts)和该芽孢杆菌属操纵子靠近birA基因的信息。将该panBCD操纵子引入可在E.coli中复制的质粒中。为了改善该panBCD操纵子的表达，使用枯草芽孢杆菌噬菌体SP01(P26)的强组成型启动子，并将panB基因前面的核糖体结合位点(＝RBS)用人工RBS替换。在芽孢杆菌属中紧邻天然panB基因上游的DNA片段连接在质粒上的P26panBCD盒前面。将该质粒转化成枯草芽孢杆菌菌株RL-1(通过经典的诱变得到的枯草芽孢杆菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC6051)，基因型trpC2(Trp-))，并且通过同源重组，用P26panBCD操纵子代替天然panBCD操纵子。所得菌株称作PA221，并且具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过0.92g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/l α-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生产描述在下列部分：
利用E.Coli panE基因序列，通过类似方法克隆芽孢杆菌属panE序列。发现在枯草芽孢杆菌中存在两种同源E.Coli panE基因，称作panE1和panE2。缺失分析发现panE1基因负责90％的泛酸产生，而缺失panE2基因对泛酸产生并无重大影响。此处与克隆panBCD操纵子相似，用强组成型启动子P26代替该启动子，并用人工结合位点代替panE1基因前面的核糖体结合位点。将P26panE1片段克隆到载体中，该载体的构建使得该P26panE1片段能整合至枯草芽孢杆菌基因组中的原始panE1基因座。转化和同源重组之后所得的菌株称作PA303，并且具有基因型P26panE1。使用枯草芽孢杆菌菌株PA303，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.66g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
通过用含有P26ilvBNC操纵子和壮观霉素的标记基因的质粒将PA327转化而进一步构建所述菌株。该P26ilvBNC操纵子整合入amyE基因座中，这通过PCR来证实。将一种转化体称作PA340(基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA340，在10ml含有仅补加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过3.6g/l(24h)的泛酸滴定度；在10ml含有补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外，将去调节的ilvD盒引入菌株PA340中。为此，将含有ilvD基因的质粒在控制含有人工RBS2的P26启动子的情况下转化入PA340。通过同源重组将P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株PA374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA374，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过2.99g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中仅补加有5g/lβ-丙氨酸。
为了在不供入β-丙氨酸的情况下使用菌株PA374来产生泛酸，将编码天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD的附加拷贝引入菌株PA374中。为此，将菌株PA401的染色体DNA转化入PA374。通过在四环素上的选择得到菌株PA377。
所得菌株PA377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA377，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢杆菌菌株PA401(基因型P26panD)的制备描述在下列部分：
由panBCD操纵子将枯草芽孢杆菌panD基因克隆入带有四环素标记基因的载体。将启动子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化产生含有四环素标记基因和panD基因的片段。将该片段重新连接，并转化到上述菌株PA221。将该片段整合入菌株PA211的基因组中。所得菌株PA401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA401，在10ml含有已补加有5g/l α-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已补加有5g/l D-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
从菌株PA377开始，用菌株PY79的染色体DNA的转化来产生色氨酸-原养菌株。菌株PA824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA824，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(对照PA377：不超过3.6g/l(48h))。
PA668的制备描述在下列部分：
由野生型panBCD操纵子将芽孢杆菌属panB基因克隆并插入除含有氯霉素抗性基因外还含有vpr基因座的枯草芽孢杆菌序列的载体中。
在panD基因5’端之前引入强组成型启动子P26。通过限制酶切消化得到一个含有P26panB基因、氯霉素抗性的标记基因以及枯草芽孢杆菌vpr序列的片段。将分离出来的片段重新连接并用于转化菌株PA824。所得菌株称作PA668。PA668的基因型为：P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分离PA668的两种菌落并分别称作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-2A，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-24，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/lL-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l的滴定度。
所述菌株的确切构建参见PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株PA377，在SVY培养基(25g/l Difco Veal肉浸汁，5g/lDifco酵母提取物，5g/l色氨酸，5g/l谷氨酸钠，2g/l(NH4)2SO4，10g/lKH2PO4，20g/l K2HPO4，0.1g/l CaCl2，1g/lMgSO4，1g/l柠檬酸钠，0.01g/lFeSO4·7H2O和1ml/l组成如下的痕量盐溶液：0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原养衍生物)的葡萄糖限制发酵的情况下，在酵母提取物培养基(10g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下，在36h、48h和72h内在发酵液中得到的泛酸浓度分别为20g/l、28g/l和36g/l。
通过培养基的进一步优化，使用菌株PA824，在由10g/l Difco酵母提取物、10g/l NZ胺A(Quest International GmbH，Erftstadt)、10g/l谷氨酸钠、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/lCaCl2、1g/lMgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液组成的培养基中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为37g/l(48g/l)。
通过培养基的进一步优化、通过增加发酵时间、通过工艺和菌株改进以及通过各步骤的组合可以进一步提高发酵液中泛酸的浓度。因此，通过将为上述PA824的衍生物的菌株发酵也可得到上述泛酸浓度。衍生物可通过经典的菌株发育和通过其它基因工程操作来制备。通过培养基、菌株和发酵方法的发展，可将发酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l。
本发明方法的本质优点在于发酵在培养基中进行，该培养基除含有至少一种碳源和氮源之外就不再含有其它作为起始化合物的前体。也就是说，D-泛酸的生物合成与其它前体的供入没有关系。对本发明而言，这些前体是诸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-缬氨酸和/或α-酮异戊酸和/或其混合物的物质。
在本发明方法的优选变体中，产生D-泛酸的生物的发酵在培养基中进行，该培养基含有碳源和氮源，但在发酵过程中不向其中加入或供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。也就是说，为了产生至少10g/l培养基、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸，根据本发明不需要供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
与前体的供入无关这一点尤其是本发明方法与已知方法相比的重大经济优点，因为许多前体是非常昂贵的。
然而，本发明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，因此使得通过加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐可进一步提高D-泛酸的产率。若例如假定泛酸所有的所需前体都以足量存在，则只有panD基因的活性限制泛酸产生的进一步增加，因此例如可通过加入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐将泛酸的产率再提高50％。
在本发明的有利变体中，可向培养基中加入不超过20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，以将泛酸的产率额外提高50％以上。优选向培养基中加入约15g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
根据本发明，适合用于培养基中以将上述生物发酵的碳源的实例是糖类如淀粉水解产物(单-、二-、低聚糖)，优选葡萄糖或蔗糖，以及甜菜或甘蔗糖蜜，蛋白质，蛋白质水解产物，大豆粉，玉米浆，脂肪，游离脂肪酸，从前面的发酵再循环的细胞或其水解产物，以及酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，本发明方法有利的特征在于到发酵结束时总的糖含量降至最低，因为否则的话这将由于粘连使随后发酵溶液的干燥和/或配制变得困难。根据本发明，这可通过在碳源被消耗后(在分批培养的情况下)或在碳进料被中断(在以补料分批或反复的补料分批方式的工艺工序的情况下)和/或被调节以使该碳源的浓度基本为零(在补料分批、反复的补料分批或连续工艺工序的情况下)之后继续发酵一段时间而实现。
根据本发明，这通过在中断加入碳源(例如糖溶液)之后，继续发酵直到在该发酵溶液中溶解氧浓度(pO2)为其饱和值的至少80％，优选90％，特别优选95％而达到。
根据本发明，合适的氮源的实例是氨、硫酸铵、尿素、蛋白质、蛋白质水解产物或酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，发酵培养基含有无机盐和/或微量元素，例如氨基酸和维生素。合适的发酵培养基的确切组成大量公知，并且对本领域熟练技术人员而言是可得的。
在用适合的产生D-泛酸的生物对发酵培养基进行接种(以本领域熟练技术人员公知的细胞密度)之后，合适的话加入消泡剂，培育该生物。培养基pH的任何必要调节都可使用各种无机或有机碱或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质来实现。
考虑到发酵过程中所用的缓冲体系(该缓冲体系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质)，所生成的D-泛酸取决于所用的缓冲体系而以各自的盐的形式存在于发酵溶液中。由于这种情况下，尤其是D-泛酸的一价阳离子形式的盐是不利的，因此，根据本发明，使用阳离子交换剂来制备发酵溶液。
本发明此处包括所有市购阳离子交换剂。根据本发明，适合将泛酸盐脱盐得到泛酸的阳离子交换剂是以H+形式存在的具有羧酸官能度的丙烯酸酯基酸性树脂和/或具有磺酸盐基团的聚苯乙烯树脂，例如Lewatit CNP80、CNP LF、S100、S1468和SP 112 Monopulus(Bayer，Leverkusen，德国)；Diaion PK 216(Mitsubishi Chemical Corp，东京，日本)；Amberlite 200和Amberlite 252(Rohm and Haas，Philadelphia，USA)。
优选的阳离子交换剂是基于磺化聚苯乙烯的H+形式的强酸性离子交换剂。特别优选单分散阳离子交换剂，例如Lewatit S1468。前面阳离子交换剂的列举是为了举例，不是对本发明的限制。如本领域熟练技术人员所熟悉的那样，使用无机酸可将离子交换剂在消耗之后再生成其H+形式，从而可多次使用。
使用阳离子交换剂有利地基本上完全从发酵溶液中除去一价阳离子，例如铵离子、钾离子或钠离子，使得在该溶液中由D-泛酸盐形成游离D-泛酸。根据本发明，将一价阳离子，优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量降至≤1g/kg溶液的浓度。
根据本发明，通过加入钙碱和/或镁碱将所得游离泛酸溶液的pH设定为3-10。pH为5-10是有利的。优选将该溶液的pH设定为5-9，特别优选6-9，非常特别优选6-8。这样得到泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液。为了中和，优选将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入该溶液中。
根据本发明，在这种情况下优选用钙碱和/或镁碱的水悬浮液中和含有游离D-泛酸的溶液。与使用相应固体的情形相比，作为使用水悬液的结果，该中和进行得更迅速，并且没有较大的pH波动。
根据本发明，本发明方法的特征在于将包含2-55重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。本发明另外还包括一种其中将包含2-65重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中的方法。在本发明的另一实施方案中，将包含2-60重量％、优选10-50重量％、特别优选20-40重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入本发明方法步骤c)的溶液中。本发明还包括一种其中将包含2-25重量％、优选10-20重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中的方法。
在另一变体中，可将酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐在随后的步骤c)中加入来自步骤b)的含有游离D-泛酸的溶液中，其中得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液。
对本发明而言，有利的是酸性无机钙盐和/或镁盐是相应的钙和/或镁卤化物。根据本发明，优选这些盐是CaCl2和/或MgCl2。对本发明而言，该酸性有机钙盐和/或镁盐例如是高度水可溶的有机阴离子的盐。优选这些盐例如是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。
在随后的步骤d)中，然后将泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液进行干燥和/或配制。
使用本身已知的方法，例如喷雾干燥、喷雾粒化、流化床干燥、流化床粒化、转鼓式干燥或旋转急骤干燥(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第六版，1999，电子版，“固体材料的干燥”一章)将所得含有D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的溶液或悬浮液干燥和/或配制。对流干燥中气体入口温度为100-280℃，优选120-210℃。气体出口温度为50-180℃，优选60-150℃。为了建立所需粒度分布和有关的产物性能，可分离出细颗粒并再循环。另外，可将粗颗粒在磨中研磨，并且同样也可再循环。
根据本发明，在上述方法中，在生产具有高生物价值的所需产物的同时，减少复杂的后处理步骤是有利的，尤其是避免使用有机溶剂。另外，根据本发明，所产生的废水量显著减少。因此这导致进一步节省复杂的后处理和处理车间。因此，本发明方法的优点在于与传统方法相比它更简单、不易出错、耗时更少、显著便宜并因而更经济。
然而，这并不排除可对本发明方法进行改变。本文开头提及的本发明的工艺步骤a)-d)可通过一个或多个本领域熟练技术人员熟悉的下列工艺步骤来补充。在这种情况下，本发明涵盖额外(操作)工艺步骤与(必需)工艺步骤a)-d)的所有可能组合。
因此，例如可通过加热(灭菌)或其它方法如巴氏消毒法或过滤除菌将来自工艺步骤a)-c)的溶液或悬浮液消毒。
在本发明方法的其它变体中，在干燥和/或配制所述溶液或悬浮液之前，可进行至少一个下列步骤和/或这些步骤的组合：生物质的溶菌和/或灭菌和/或从发酵溶液中分离除去该生物质和/或加入其它添加剂和/或优选通过除去水将该发酵溶液浓缩。
因此，本发明还涉及一种其中在发酵溶液中仍旧进行生物质的溶菌和/或灭菌或直到从该发酵溶液中分离除去该生物质之后才进行前述步骤的方法。这例如可通过优选80-200℃下的温度处理和/或优选用硫酸或盐酸的酸处理和/或优选用溶菌酶的酶催方式来进行。
在本发明的另一实施方案中，可通过过滤、分离(例如离心分离)和/或倾析从本发明方法步骤a)、b)或c)的溶液或悬浮液中除去发酵微生物的细胞。也可使步骤a)、b)或c)的溶液或悬浮液不经分离除去所存在的生物而直接通过阳离子交换剂。若在本发明方法的经由阳离子交换剂的后处理步骤(步骤b)之前没有分离除去生物质，则也可使该含有生物质的发酵溶液有利地由底部往顶部(即以与重力相反的方向)通过离子交换床。该工序当悬浮物质存在于待提纯的溶液中时通常是有利的。
从经由阳离子交换剂的后处理中得到的溶液或悬浮液可在中和之后通过合适的蒸发器如降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器或旋转式蒸发器浓缩。在其它变体中，可在进行上述本发明方法步骤d)中的溶液或悬浮液的实际干燥和/或配制之前进行浓缩。为此，将来自步骤c)的溶液或悬浮液例如在降膜式蒸发器和/或薄膜式蒸发器中浓缩。这些蒸发器例如由GIG(4800Attnang Puchheim，奥地利)、GEA Canzier(52303 Düren，德国)、Diessel(31103 Hildesheim，德国)和Pitton(35274 Kirchhain，德国)制造。
为了改善终产物的颜色性能，可进行其中将少量活性炭加入该工艺过程中所得的溶液或悬浮液中的额外过滤步骤，并然后将该含有活性炭的悬浮液过滤。或者，可使发酵过程中所得的溶液通过小活性炭床。为此所需的活性炭用量为发酵溶液重量的百分之几，并且该量凭借本领域熟练技术人员的知识和经验是已知的。这些过滤可通过在过滤之前向各溶液中加入工业助凝剂而得以简化(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930，产自BASF AG，Ludwigshafen)。
在本发明的有利实施方案中，发酵排出物(发酵液)通过加热来灭菌，然后通过离心分离、过滤或倾析除去细胞物质。在基于发酵排出物加入50-1000mg/kg、优选100-200mg/kg工业上传统的助凝剂之后，将该混合物过滤通过活性炭与砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物质的溶液。然后使该处理后的溶液通过离子交换床(H+形式)。
若在本发明的经由阳离子交换剂的后处理步骤之前没有分离除去生物质，则也可有利地使该含有生物质的发酵溶液由底部往顶部(即以与重力相反的方向)通过离子交换床。
然后，例如可通过喷雾干燥将含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液干燥。这可以并流、逆流或混合流进行。
为了雾化，可使用所有已知的雾化器，尤其是离心雾化器(雾化盘)、单流喷嘴或双流喷嘴。优选的干燥温度条件是150-250℃的塔入口温度和70-130℃的塔出口温度。然而，干燥也可在更高或更低的温度水平下进行。为了得到非常低的残留湿气，可以在流化床下游提供另一干燥步骤。
喷雾干燥也可在FSD或SBD干燥器中进行(FSD：流化床喷雾干燥器；SBD：喷雾床干燥器)，如由Niro(丹麦哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麦哥本哈根)制造的，它们是喷雾干燥器与流化床的组合。
在喷雾干燥过程中，可添加防结块剂。这可减少干燥器壁上的沉积并改善流动特性，确切地在细粒粉末的情况下。可使用的防结块剂尤其是硅酸盐、硬脂酸盐、磷酸盐和玉米淀粉。
原则上，干燥也可在喷雾的流化床中进行，在这种情况下这不仅可连续进行，还可分批进行。可将溶液或悬浮液不仅从顶部(顶部喷雾)和从底部(底部喷雾)喷雾，而且还可从侧面(侧面喷雾)进行喷雾。
本发明还涉及一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物，这种情况下它可通过如下步骤制备：
a)使用至少一种生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l、优选0g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阳离子交换剂，其中由该D-泛酸盐形成游离D-泛酸，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
在有利变体中，在步骤c)或步骤d)中，得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
在另一变体中，可将酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐在随后的步骤c)中加入来自步骤b)的含有游离D-泛酸的溶液中，其中得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液。
对本发明而言，有利的是酸性无机钙盐和/或镁盐是相应的钙和/或镁卤化物。根据本发明，这些盐优选是CaCl2和/或MgCl2。对本发明而言，该酸性有机钙盐和/或镁盐例如是易溶于水的有机阴离子的盐。优选这些盐例如是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。
在随后的步骤d)中，将泛酸钙和/或泛酸镁的溶液或悬浮液进行干燥和/或配制。
另外，本发明组合物的特征在于它包含浓度为至少1-100重量％、优选至少20-100重量％、特别优选至少50重量％的D-泛酸盐。本发明涉及一种包含D-泛酸的二价阳离子形式的盐，优选D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的组合物。根据本发明，优选特征在于D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤1g/kg的组合物。
根据本发明，通过上述方法，得到满足饲料添加剂要求的D-泛酸钙或D-泛酸镁。这些要求例如是较高含量的D-泛酸盐和与目标生物的高相容性以及高的表示本发明产物的“维生素活性”的生物价值。
本发明将通过下列实施例更详细地描述，然而这些实施例不是对本发明的限制。
实施例1：
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基：
  原料   浓度[g/l]
  酵母提取物   10
  谷氨酸钠   5
  硫酸铵   8
  KH2PO4   6.7
  K2HPO4   9.8
灭菌后，额外加入下列无菌培养基成分：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   2.5
  硫酸钙   0.1
  硫酸镁   1
  柠檬酸钠   1
  FeSO4·7H2O   0.01
  痕量盐溶液   1ml
所述痕量盐溶液具有下列组成：
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为6升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入60ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD＝10)，并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993中的附件进行描述。
在47h内，加入6.5升无菌水溶液，其组成如下：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   550
  硫酸钙   0.7
  痕量盐溶液   6ml
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH调节为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵，并将该生物加热破坏。为此，将该发酵溶液灭菌45分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后，D-泛酸盐的浓度在48h后为22.8g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
将上述通过加热灭菌的且通过离心分离基本除去生物质的发酵排出物与额外的D-泛酸混合，并用25％浓度的氢氧化铵溶液(分散体)将pH设定为约7。
将所得溶液或悬浮液过滤通过砂子/活性炭的小床。滤液中D-泛酸的含量为70g/l，其中D-泛酸主要呈其铵盐形式。
借助流体静压使1000ml滤液通过250ml的玻璃柱，该玻璃柱中装有约100ml离子交换剂Lewatit S100 G1。流速控制为约20ml/min。
收集100ml流出物级分，并分析它们的pH和D-泛酸盐以及Ca2+、Mg2+、NH4+、K+和Na+离子的浓度。级分1-3以举例方式列于下表中。
  样品   体积ml   pH开始   pH结束   泛酸盐(g/l)   NH4 +   Ca2+  K+   Mg2+   Na+
  滤液   7   70   0.76％   0.11％  0.20％   0.003％   0.031％
  级分1   100   4.5   1.5   1.2   ＜1ppm   ＜0.001％  ＜0.001％   ＜0.001％   0.001％
  级分2   100   1.5   1.6   64   4ppm   ＜0.001％  ＜0.001％   ＜0.001％   0.003％
  级分3   100   1.6   2.5   68   19ppm   0.001％  ＜0.001％   ＜0.001％   0.002％
在搅拌下通过加入固体氢氧化钙将75ml含有4.8g泛酸盐的级分2的pH调节为7。然后将所得D-泛酸钙溶液或悬浮液通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥，得到8.98g D-泛酸钙含量为57％的浅棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
实施例2：
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基：
  原料   浓度[g/l]
  酵母提取物   10
  谷氨酸钠   5
  硫酸铵   8
  KH2PO4   8.4
  K2HPO4   15
灭菌后，额外加入下列无菌培养基成分：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   2.5
  氯化钙   0.1
  氯化镁   1
  柠檬酸钠   1
  FeSO4·7H2O   0.01
  痕量盐溶液   1ml
所述痕量盐溶液具有下列组成：
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为5.5升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入55ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD＝10)，并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993中的附件进行描述。
在48h内，加入6升无菌水溶液，其组成如下：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   550
  氯化钙   0.6
  痕量盐溶液   6ml
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH调节为约7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵，并将该生物加热破坏。为此，将该发酵溶液灭菌30分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后，D-泛酸盐的浓度在48h后停止时为24.1g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
将2817ml发酵罐排出物与1183ml浓度为178.9g/l的泛酸溶液混合，并用25％浓度的氨溶液中和。然后将该混合物过滤通过砂子/活性炭。滤液中D-泛酸的含量为67g/l，其中D-泛酸主要以其铵盐形式存在。
使1300ml滤液通过离子交换剂Lewatit S100 G1(H+形式)的床(体积约1升)，并用水洗涤出来。流速控制为约20ml/min。
在先流出200ml后，收集1810g洗出液。D-泛酸的含量为45g/l。存在下列离子浓度：NH4 +：66mg/kg洗出液，以及K+：＜0.001g/100g洗出液。磷含量为0.072g/100g洗出液。
在搅拌下用固体氢氧化钙将游离泛酸中和，即将pH设定为约7。
得到1840g D-泛酸钙含量为49g/l的D-泛酸钙水溶液或水悬浮液。
将该D-泛酸钙水溶液或水悬浮液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。入口温度为约200℃。出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：2％
D-泛酸钙：56.3％
铵离子：0.049％
钾离子：＜0.01％
钠离子：＜0.01％
实施例3：
在容量为300升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基：
  原料   浓度[g/l]
  大豆粉   40
  酵母提取物   5
  谷氨酸钠   5
  硫酸铵   8
  KH2PO4   10
  K2HPO4   20
灭菌后，额外加入下列无菌培养基成分：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   2.5
  硫酸钙   0.1
  硫酸镁   1
  柠檬酸钠   1
  FeSO4·7H2O   0.01
  痕量盐溶液   1ml
所述痕量盐溶液具有下列组成：
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为100升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入4升枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD＝120)，并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在1.8m3/h的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993中的附件进行描述。
在43h内，加入113升无菌水溶液，其组成如下：
  原料   浓度[g/l]
  葡萄糖   550
  氯化钙   0.6
  柠檬酸钠   2
  FeSO4·7H2O   0.02
  谷氨酸钠   5
  痕量盐溶液   1ml
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH调节为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和度的30％。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。43h后，结束发酵。通过在碟式分离机中分离将细胞除去。然后将该不含细胞的发酵溶液灭菌60分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
在细胞分离和灭菌之后，D-泛酸盐的浓度为21g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
然后，将3270ml所得发酵排出物用1750ml浓度为170g/l的泛酸钠溶液强化。然后将约7g粉末活性炭搅拌入该溶液中。为了改善该悬浮液的过滤性，将其一半与Sedipur CF 902(48g 1％浓度溶液)混合，另一半与Sedipur CL 930(30g 1％浓度溶液)混合。在简单搅拌之后，将两半都过滤通过小硅藻土床，并随后再合并。
使1800ml所得的D-泛酸含量为65.4g/l的滤液通过离子交换剂LewatitS100 G1(H+形式)的床(体积1升)，并用水洗涤出来。流速为约20ml/min。
在先流出250ml(丢弃)后，收集2.2升洗出液，并通过加入20％浓度的氢氧化钙水分散体(石灰乳)将pH设定为约7。将该洗出液通过纸滤器而再次过滤，取样后得到2174g作为滤液的D-泛酸钙含量为58g/l的D-泛酸钙水溶液或水悬浮液。
随后在Niro Minor实验室喷雾干燥器中进行喷雾干燥。入口温度为约185℃，出口温度为约95℃。使用双流喷嘴在2巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：1.4％
D-泛酸钙：63.2％
铵离子：0.043％
钾离子：＜0.01％
钠离子：＜0.01％
实施例4：
在容量为20升的装有搅拌器和气体引入装置的发酵罐中，将200g大豆粉、50g 50％浓度的酵母提取物、25g谷氨酸钠、40g硫酸铵和5ml消泡剂Tego KS911与3.9升去离子水混合，并将这些内容物在121℃下灭菌30分钟。
然后加入溶液1、2、3和4。
溶液1按如下制成：将12.5g葡萄糖、0.5g CaCl2·2H2O和5gMgCl2·6H2O溶解在100ml去离子水中，并无菌过滤。
溶液2按如下制成：将25ml柠檬酸亚铁溶液(200g/l柠檬酸钠、2g/lFeSO4·7H2O，无菌过滤)与5ml痕量盐溶液(0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5gH3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升，无菌过滤)混合。
溶液3按如下制成：将87.5g葡萄糖与水共同构成500ml，并灭菌。
溶液4按如下制成：将25g KH2PO4、50g K2HPO4、25g NaH2PO4和50g Na2HPO4与水共同构成500ml，并灭菌。
向该混合培养基(加入所有溶液之后的体积：5升)中，加入100ml枯草芽孢杆菌PA668-2A的接种培养物(OD＝9.5，在SVY培养基(SVY培养基：25g Difco Veal肉浸汁、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸钠、2.7g(NH4)2SO4的740ml水溶液，灭菌；加入200ml无菌的1M K2HPO4(pH7)和60ml无菌的50％葡萄糖溶液(终体积1升))中)，并将该培养物于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照US 60/262,995中的附件进行描述。
在48h内，加入约3.5升无菌的葡萄糖水溶液。该溶液按如下制成：将5kg葡萄糖·H2O和3.6g CaCl2·2H2O与1.2kg去离子水混合，并灭菌30分钟。然后，加入9ml痕量盐溶液(组成见上)和37.5ml柠檬酸亚铁溶液(组成见上)。然后加入60ml无菌过滤的375g/l谷氨酸钠溶液。
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的20％。通过随时加入消泡剂Tego KS 911以控制起泡。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。然后结束发酵。通过离心分离将细胞除去。上清液中残留细胞通过加热灭菌而破坏。通过沉积出来表明已破坏。在分离和灭菌之后，D-泛酸盐的浓度为35.8g/l。按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
实施例5：
将1000ml来自实施例4的经离心分离的物质用合成的泛酸钠强化成70g/l，并由顶部往底部泵送通过其中装有约1000ml离子交换剂LewatitS100 G1的1000ml玻璃柱。流速控制为约20ml/min。
从流出物中收集250ml级分，并分析它们的pH和D-泛酸盐以及Ca2+、Mg2+、NH4 +、K+和Na+离子的浓度。级分1-3以举例方式列于下表中。
样品   体积ml pH   泛酸盐(g/l) NH4 + Ca2+ K+ Mg2+ Na+
  滤液   7   70   0.48％   0.01％   0.57％   0.003％   0.51％
  级分1   250   2.05   34.1   ＜0.01％   ＜0.01％   0.0005％   ＜0.01％   0.0004％
  级分2   250   1.94   55.2   ＜0.01％   ＜0.01％   0.0005％   ＜0.01％   0.0003％
  级分3   250   1.91   61.7   ＜0.01％   ＜0.01％   0.004％   ＜0.01％   ＜0.0003％
在搅拌下通过加入固体氢氧化钙将250ml级分2的pH调节为7。产生白色沉淀，并将其在加入Sedipur CF902后过滤除去。然后将所得滤液通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥，得到25g泛酸盐含量为55％的浅棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
实施例6：
将1000ml来自实施例5的经强化的离心分离的物质由底部往顶部泵送通过离子交换剂Lewatit S100 G1(H+形式)的床(体积约1升)。然后用水洗涤。流速控制为约20ml/min。
在先流出500ml后，收集1750g洗出液。D-泛酸盐的含量为35g/l。该洗出液中存在下列离子浓度：NH4 +：＜0.01％，Na+：0.0064％，K+：0.006％，PO4 3-：0.29％，SO4 2-：0.1％和Cl-：0.043％。
在搅拌下用固体氢氧化钙中和该游离泛酸，即将其pH设定为约7。
得到约1800g泛酸盐含量为约35g/l的D-泛酸钙水悬浮液。
将该D-泛酸钙水悬浮液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。入口温度为约200℃，出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：2％
D-泛酸盐：56.3％
铵离子：0.03％
钾离子：＜0.015％
钠离子：＜0.019％
钙离子：9.5％
实施例7：
将3270ml实施例4中得到的发酵排出物用1750ml泛酸盐浓度为125.6g/l的泛酸钠溶液强化。然后将约7g粉末活性炭搅拌入该溶液中。为了改善该悬浮液的过滤性，将其一半与Sedipur CF 902(48g 1％浓度溶液)混合。在简单搅拌之后，将两半都过滤通过小硅藻土床，并随后再合并。
使1000ml所得的D-泛酸含量为66.5g/l的滤液通过离子交换剂LewatitS100G1(H+形式)的床(体积1升)。将其用水洗涤出来。流速为约20ml/min。
在先流出500ml(丢弃)后，收集2升洗出液，并通过加入20％浓度的氢氧化钙水分散体(石灰乳)将pH设定为约7。将该洗出液通过纸滤器再次过滤，取样后得到约1960ml作为滤液的D-泛酸盐含量为16g/l的D-泛酸钙水溶液或水悬浮液。
随后在Niro Minor实验室喷雾干燥器中进行喷雾干燥。入口温度为约185℃，出口温度为约95℃。使用双流喷嘴在2巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：1.4％
D-泛酸盐：51％
铵离子：0.01％
钾离子：0.012％
钠离子：0.01％
钙离子：7.7％
实施例8：
以与实施例4相似的方式，在使用菌株PA668-2A的另一发酵中，得到泛酸浓度为22g/l的发酵液。
将1000ml经离心分离的物质用泛酸钠强化成70g/l，并使其通过离子交换剂Amberlite 200(H+形式)的床(体积约1升)，并用水洗涤出来。
在先流出500ml后，收集2000ml洗出液。D-泛酸含量为32.6g/1。该洗出液中存在下列离子浓度：NH4 +：＜0.01％，Na+：0.0062％，K+：0.00045％，PO4 3-：0.06％，SO4 2-：0.06％和Cl-：0.02％。为了再生，将该离子交换柱首先用1000ml 1N的氢氧化钠溶液和2500ml水冲洗。然后将该离子交换剂用1000ml 10％浓度的盐酸再生，并然后将该柱子用2500ml水洗涤至中性。
在搅拌下用固体氢氧化钙中和该游离泛酸，即将其pH设定为约7。
得到约2000g泛酸盐含量为27.35g/l的D-泛酸钙水悬浮液。
将该D-泛酸钙水悬浮液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。入口温度为约200℃，出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：1.7％
D-泛酸盐：64.6％
铵离子：0.08％
钾离子：0.006％
钠离子：0.086％
钙离子：6.5％
实施例9：
以与实施例4相似的方式，使用菌株PA668-2A在40h发酵中得到发酵液。通过离心分离除去该发酵液中的生物质，泛酸浓度为42.9g/l。使1000ml该未灭菌的发酵液通过离子交换剂S1486(H+形式)的床(体积约1.0升)，并用水洗涤出来。流速调节为约20ml/min。
在先流出500ml后，收集2100ml洗出液。D-泛酸的含量为19.2g/l。为了再生，将离子交换柱首先用1000ml 1N的氢氧化钠溶液和2500ml水冲洗。然后将该离子交换剂用1000ml 10％浓度的盐酸再生，并然后将该柱子用2500ml水洗涤至中性。
在搅拌下用固体氢氧化钙中和该游离泛酸，即将其pH设定为约7。得到约2000g D-泛酸钙水悬浮液，并将该悬浮液灭菌60分钟。通过沉淀出来表明已成功破坏。
将该D-泛酸钙水悬浮液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。入口温度为约200℃，出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：2.6％
D-泛酸盐：8.5％
铵离子：＜0.01％
钾离子：0.003％
钠离子：0.016％
钙离子：0.61％
实施例10：
向2305ml从实施例4得到的D-泛酸含量为35.8g/l的经离心分离的物质中，加入895ml泛酸盐含量为158.6g/l的泛酸钠溶液。使1000ml该培养液通过离子交换剂Lewatit S100 G1(H+形式)的床(体积1升)，并用水洗涤出来。流速为约20ml/min。
在先流出500ml(丢弃)后，收集2升洗出液。该洗出液的D-泛酸盐含量为25.3g/l。基于泛酸，加入1当量呈氯化钙形式的钙离子。
随后，在Niro Minor实验室喷雾干燥器中进行喷雾干燥。入口温度为约185℃，出口温度为约95℃。使用双流喷嘴在2巴压力下进行雾化。水含量通过Karl-Fischer法测定。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量％表示)：
水含量：2.1％
D-泛酸盐：50％
铵离子：＜0.01％
钾离子：0.015％
钠离子：＜0.01％
钙离子：8.0％

Claims (40)

1.一种制备D-泛酸和其盐的方法，包括如下步骤：
a)使用至少一种选自枯草芽孢杆菌PA824的生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阳离子交换剂，其中由该D-泛酸盐形成游离D-泛酸，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，生成D-泛酸和其盐，含量为至少10g/l培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述含量为至少20g/l培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述含量为至少40g/l培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述含量为至少60g/l培养基。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，将一价阳离子的含量降至≤1g/kg溶液的浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述一价阳离子为铵离子、钾离子和/或钠离子。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，将溶液的pH设定为5-10。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，将溶液的pH设定为5-9。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述pH为6-9。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述pH为6-8。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中为了中和，将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入步骤c)的溶液中。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-55重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
15.如权利要求14所述的方法，其中将包含10-50重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
16.如权利要求15所述的方法，其中将包含20-40重量％的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
17.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-65重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
18.如权利要求17所述的方法，其中将包含10-50重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
19.如权利要求18所述的方法，其中将包含20-40重量％的碳酸钙的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-60重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
21.如权利要求20所述的方法，其中将包含10-50重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
22.如权利要求21所述的方法，其中将包含20-40重量％的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
23.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含2-25重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
24.如权利要求23所述的方法，其中将包含10-20重量％的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤c)的溶液中。
25.如权利要求1或2所述的方法，其中将酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐在步骤c)中加入所述含有游离D-泛酸的溶液中。
26.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，酸性无机钙盐和/或镁盐是相应的卤化物。
27.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，酸性无机钙盐和/或镁盐是CaCl2和/或MgCl2。
28.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，酸性有机钙盐和/或镁盐是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。
29.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)或d)中，加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
30.一种用作动物饲料添加剂的组合物，其中它通过如下步骤制备：
a)使用至少一种选自枯草芽孢杆菌PA824的生物，该生物产生D-泛酸，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阳离子交换剂，其中由该D-泛酸盐形成游离D-泛酸，
c)加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10，得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液，以及
d)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液进行干燥和/或配制。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
32.如权利要求30或31所述的组合物，其中在步骤c)中，加入酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐，其中得到含有泛酸的多价盐的溶液。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述多价盐为泛酸钙和/或泛酸镁。
34.如权利要求30或31所述的组合物，其中在步骤c)中，所加入的酸性无机钙盐和/或镁盐是钙和/或镁的卤化物。
35.如权利要求30或31所述的组合物，其中在步骤c)中，所述酸性无机钙盐和/或镁盐是CaCl2和/或MgCl2。
36.如权利要求30或31所述的组合物，其中在步骤c)中，所述酸性有机钙盐和/或镁盐是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。
37.如权利要求30或31所述的组合物，包含浓度为1-50重量％的D-泛酸盐。
38.如权利要求37所述的组合物，包含浓度为20-50重量％的D-泛酸盐。
39.如权利要求37所述的组合物，包含浓度为1-20重量％的D-泛酸盐。
40.如权利要求30或31所述的组合物，其中D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤1g/kg组合物。
CNB028053176A 2001-02-21 2002-02-20 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法 Expired - Fee Related CN1294272C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10108225A DE10108225A1 (de) 2001-02-21 2001-02-21 Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
DE10108225.8 2003-02-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1492934A CN1492934A (zh) 2004-04-28
CN1294272C true CN1294272C (zh) 2007-01-10

Family

ID=7674922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028053176A Expired - Fee Related CN1294272C (zh) 2001-02-21 2002-02-20 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法

Country Status (20)

Country Link
US (1) US7781192B2 (zh)
EP (1) EP1362117A2 (zh)
JP (1) JP2004529626A (zh)
KR (1) KR20030075203A (zh)
CN (1) CN1294272C (zh)
AU (1) AU2002250976A1 (zh)
BR (1) BR0207475A (zh)
CA (1) CA2439012A1 (zh)
CZ (1) CZ20032236A3 (zh)
DE (1) DE10108225A1 (zh)
EE (1) EE200300404A (zh)
HU (1) HUP0303216A3 (zh)
IL (1) IL157472A0 (zh)
IN (1) IN2003CH01298A (zh)
MX (1) MXPA03007385A (zh)
NO (1) NO20033704L (zh)
PL (1) PL367284A1 (zh)
RU (1) RU2003128529A (zh)
SK (1) SK10442003A3 (zh)
WO (1) WO2002066663A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10344200A1 (de) * 2003-09-22 2005-05-04 Basf Ag Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement
DE102005056668A1 (de) 2005-11-28 2007-05-31 Basf Ag Fermentative Herstellung organischer Verbindungen
EP2723878B1 (en) * 2011-06-21 2020-05-20 DSM IP Assets B.V. Vitamin b5 production
EP3692159A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Metabolic Explorer Method for producing organic acid salts from fermentation broth
CN108440332A (zh) * 2018-03-30 2018-08-24 安徽省恒锐新技术开发有限责任公司 D-泛酸钙母液的回收方法
EP3820585B1 (en) * 2018-07-10 2022-11-02 Givaudan SA Improvements in or relating to organic compounds

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590857A2 (en) * 1992-09-25 1994-04-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of D-pantoic acid and D-pantothenic acid
CN1187854A (zh) * 1995-04-21 1998-07-15 武田药品工业株式会社 生产d－泛酸钙的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB562267A (en) 1941-08-08 1944-06-26 Hoffmann La Roche Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid
DE4025962A1 (de) 1990-08-16 1992-02-20 Basf Ag Verfahren zur gewinnung von pantolacton und (beta)-alanin aus mutterlaugen der calcium-d-pantothenat-herstellung
EP0493060A3 (en) 1990-12-25 1993-04-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof
SK30598A3 (en) 1995-09-13 1999-01-11 Takeda Chemical Industries Ltd Process for producing d-pantoic acid and d-pantothenic acid or salts thereof
CN1323171C (zh) 1997-10-04 2007-06-27 德古萨股份公司 天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备方法和该方法用的添加剂
AT407050B (de) 1997-12-29 2000-11-27 Chemie Linz Gmbh Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure
DE19846499A1 (de) 1998-10-09 2000-04-20 Degussa Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen
DE19855313A1 (de) 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
ES2188442T3 (es) * 1999-05-05 2003-07-01 Degussa Aditivos para piensos que contienen d-acido pantotenico y/o una de sus sales, y procedimiento para su preparacion.
MXPA02003017A (es) 1999-09-21 2004-09-06 Basf Ag Metodos y microorganismos para la produccion de panto-compuestos.
DE10021515A1 (de) * 2000-05-03 2001-11-08 Degussa Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure
HUP0301095A3 (en) * 2000-09-20 2004-04-28 Basf Ag Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
DE10108223A1 (de) 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
JP4377930B2 (ja) 2007-06-21 2009-12-02 本田技研工業株式会社 車体パネル

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590857A2 (en) * 1992-09-25 1994-04-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of D-pantoic acid and D-pantothenic acid
CN1187854A (zh) * 1995-04-21 1998-07-15 武田药品工业株式会社 生产d－泛酸钙的方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL157472A0 (en) 2004-03-28
WO2002066663A2 (de) 2002-08-29
AU2002250976A1 (en) 2002-09-04
DE10108225A1 (de) 2002-10-10
CA2439012A1 (en) 2002-08-29
HUP0303216A3 (en) 2011-04-28
WO2002066663A3 (de) 2003-08-28
EE200300404A (et) 2003-12-15
US7781192B2 (en) 2010-08-24
NO20033704L (no) 2003-10-13
MXPA03007385A (es) 2003-12-04
RU2003128529A (ru) 2005-04-20
BR0207475A (pt) 2004-07-06
CN1492934A (zh) 2004-04-28
KR20030075203A (ko) 2003-09-22
SK10442003A3 (sk) 2004-02-03
CZ20032236A3 (cs) 2003-11-12
EP1362117A2 (de) 2003-11-19
IN2003CH01298A (en) 2005-11-25
JP2004529626A (ja) 2004-09-30
US20040048344A1 (en) 2004-03-11
PL367284A1 (en) 2005-02-21
HUP0303216A2 (hu) 2003-12-29
NO20033704D0 (no) 2003-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100889434B1 (ko) 메티오닌 생산 방법
CN100543143C (zh) 提高泛酸产量的方法
CN1256314A (zh) 通过在微生物中扩增pand基因制备d-泛酸的发酵方法
CN101353672A (zh) 由木质纤维素制备含糖水解产物的方法
CN1294272C (zh) 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法
CN1294271C (zh) 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法
CN1294273C (zh) 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法
CN1496406A (zh) 制备作为动物饲料添加剂的d-泛酸和/或其盐的方法
CN1531398A (zh) 含有d-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂、其改进的生产方法及其应用
CN1529760A (zh) 提高泛酸盐生产的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070110

Termination date: 20160220