CN1292686A - 调节免疫应答的传送系统 - Google Patents

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Abstract

含有结合到颗粒尺寸大于约35目的惰性粒子上的抗原的微球,用于位点－特异性释放并诱导免疫应答。免疫应答可以是全部的增强的T淋巴细胞免疫应答或选择性的应答。微球的物理和化学特征和/或施用模式可被工程化,以增加用于治疗感染性疾病癌症的TH1淋巴细胞。微胶囊化的抗原具有用于口服给药的肠溶衣。

Description

调节免疫应答的传送系统
发明领域
本发明在总体上涉及通过施用微胶囊化抗原选择和／或选择性地调节免疫应答的方法。
发明背景
免疫系统识别并区别自身物质和非自身物质，保护身体对抗非自身物质。在许多情形下，此种区别的重要性显而易见，如在自身免疫病、移植组织或器官的排斥、过敏反应、癌症和感染性疾病、和在如免疫治疗和基因治疗的治疗模型中。例如，在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和重症肌无力中，身体错误地把自身物质作为非自身物质对待，因此就破坏它自己的组份。在移植排斥反应中，通过给受体施用免疫抑制药物来阻止受体的免疫系统排斥真正的非自身物质，以使受体能够把移植的组织或器官接受为自己的。在如哮喘病、湿疹和枯草热的过敏反应中，在与抗原接触后，某些个体会马上发生免疫过敏反应。在感染性疾病中，微生物如细菌、寄生虫或病毒刺激免疫应答。微生物或其亚单位可被配制成疫苗以提供防止后续感染的预防性保护。在癌症中，与其他情形不同，免疫应答并不增长，而这种免疫应答的缺少在恶性肿瘤的不受控制的生长中有着重要作用。被称为抗原或免疫原的大量外来物质，激发出免疫应答并因而成为免疫系统的靶子。抗原的例子包括但不限于：感染性疾病因素如细菌、病毒、寄生虫和真菌，也包括螨、花粉、动物头皮屑、药物、毒物和化学物质。
免疫系统是细胞、组织和器官的复杂网络，它直接或间接地指向并最终破坏外来物质。在增强免疫应答所涉及的多种细胞中，淋巴细胞是一种有重要作用的白细胞。一种淋巴细胞是B淋巴细胞(B细胞)，它通过激起体液免疫应答而产生对抗特异抗原的抗体，来靶向并间接破坏外来物质。另一种淋巴细胞是T淋巴细胞(T细胞)，它通过激起细胞介导的免疫应答而靶向并直接杀死外来物质。有三种主要的T细胞亚型，分别为T辅助细胞、T抑制细胞和T细胞毒性细胞。T辅助细胞包括两种：TH1和TH2细胞。TH2细胞帮助B细胞激起体液免疫应答，并通过产生T细胞毒性细胞所需的生长因子帮助T细胞毒性细胞维持它们自己。TH2细胞表达CD4糖蛋白抗原。T抑制细胞阻止或抑制T辅助细胞；它们表达CD8糖蛋白抗原。T细胞毒性细胞，也被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，表达CD8糖蛋白抗原，并是T细胞的一个分支，该T细胞通过直接接触靶细胞而杀死表达特异性抗原的细胞。前-CTL是将被定型为CTL细胞谱系的T细胞，它们已经经历胸腺成熟并对某种特定的抗原有特异性，但是缺乏细胞溶解功能。CTL在以下三种情形下是重要的效应细胞：(1)非吞噬细胞的细胞内感染或并没有被吞噬作用所完全包括的感染如病毒感染；(2)由细菌如单核细胞增多性李斯特菌引发的感染；和(3)急性同种移植物排斥反应和肿瘤排斥反应。
免疫原应答在用蛋白质作为免疫原时最为可预料。在免疫治疗中，蛋白质通常是经非肠道途径施用，例如注射。由于胃中存在蛋白酶和酸、小肠中存在酶，它们可降解口服的蛋白质，因此尽管注射对于一部分患者来说不方便和不舒服，但它仍成为一种普遍的施用途径。结果显示，口服可溶解的蛋白质如典型抗原白蛋白(OVA)，可导致诱导产生免疫耐受，它以丧失抗体或T细胞对蛋白免疫原的应答为特征。然而据美国专利No．5，591，433所公开，免疫活性生物分子和其他的治疗蛋白质可口服，这是通过将蛋白质微囊化和对微球进行包衣以形成pH-敏感的肠溶衣包被的微球颗粒，来抵抗消化蛋白溶解酶和酸的作用。在上述专利中公开的微球包括与惰性颗粒连接的蛋白，惰性颗粒的颗粒尺寸为其直径约为30-35目(约600μm到约500μm)，并被对酸稳定的多聚体所包被。然而，需要的是从复杂的免疫功能中更好地选择和选择性地调节特定的免疫应答的方法，以在需求治疗的不同环境中更好地对不同的抗原刺激物产生反应。
例如，当前的肿瘤治疗包括化疗、放疗和手术切除一些或所有的实体瘤的组合。每一种治疗的机制都是以去除恶性肿瘤细胞为目标，但都以破坏非恶性细胞为其运行代价。因而，这些治疗都没有运用身体自身摧毁细胞的能力，即免疫系统和特别是细胞毒性T细胞，来杀死恶性细胞。增加免疫应答和／或选择性地刺激细胞毒性T细胞数量的方法因而是对传统治疗方法的有益的补充。并且，这样的方法可在没有化疗药物、放射或手术副作用的情形下运用。然而癌细胞却不能被免疫系统确认为外来物质，因而不能作为被摧毁的靶子。肿瘤治疗发展的一个目标就是刺激免疫系统使其对癌细胞能产生免疫应答。在三种主要的T细胞类型中，T细胞毒性细胞经常直接地指向靶子并摧毁癌细胞。因此，选择性地增加T细胞毒性细胞亚型可能是一种制约不受调节的细胞分裂的有益方法，而不受调节的细胞分裂正是癌细胞的标志。
作为另一个例子，T细胞毒性细胞也能直接靶向和摧毁细胞外感染性疾病因子和在受感染的细胞中的感染疾病因子。细胞介导的免疫包括两种类型的反应。第一种类型是巨噬细胞活化作用导致被吞噬的微生物被杀死。第二种类型是感染细胞被CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)溶解。个体间对细胞内微生物免疫应答类型的差异，例如在HIV感染中，是疾病进程和临床结果的重要决定因素。选择性地增加T细胞毒性细胞亚型可能被用来治疗感染性疾病。
因此需要能更好地调节和／或选择性地刺激免疫应答的方法和组合物。如此的方法和组合物将能在免疫治疗或基因治疗中找到广泛的用途，治疗的疾病包括过敏、感染性疾病、癌症、移植排斥和自身免疫病。如此的方法和组合物也将是对当今这些疾病的治疗方法有益的预防和／或治疗性补充。
发明概述
本发明提供能诱导一般性或选择性免疫应答增强的方法和组合物。一种免疫原传送系统含有结合于惰性粒子上的免疫原的微球，其中惰性粒子的颗粒尺寸为大于35目。微球被施用到哺乳动物的小肠。优选地，微球通过口服施用并含有一层或多层肠溶衣，可在胶囊中被施用。在一个实施方案中，惰性粒子的颗粒尺寸为大于40目，并可是nonpareil、硅石粉、盐结晶或糖结晶。
应答可能包括TH1细胞、TH2细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)亚类数量的总体增加，或从TH2类型的应答到TH1类型应答的选择性的增强的转变，或从TH1类型的应答到TH2类型应答的选择性的增强的转变，或从前-CTL到CTL的增强的分化。免疫原可以是多肽、蛋白片段、DNA、和／或RNA，可以是基因、基因片段或疫苗。
免疫原可通过含有许多可选择性地诱导特定免疫应答的微球的剂量复合体和／或剂量组合物来施用。一定剂量的微球可含有相同的或不同的肠溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的惰性粒子核心组成和大小、或各种不同的核心组成和大小。在单一的惰性粒子或各独立的惰性粒子中，免疫原也可与一种增效试剂一起施用。如果在单一惰性粒子中与免疫原和增效试剂一同配制，施用剂量中的不同的各个惰性粒子就可能具有相同的或不同的肠溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的惰性粒子核心组成和大小、或各种不同的核心组成和大小。同样地，如果在各独立的惰性粒子中与免疫原和增效试剂一起配制，施用剂量中的各独立微球也可能具有相同的或不同的肠溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的或不同的惰性粒子核心组成和大小。
将被认识到的是，本文公开的传送系统和运用该系统的方法具有广泛的用途。本发明的这些和其他优点将要被下面的图示、详细描述和实施例进一步说明。
图示的简要描述
图1是卵清蛋白(OVA)的不同施用模式对初级淋巴细胞增殖的效果图。
图2A是淋巴增殖分析的结果图，应用含有OVA、佐剂中的OVA的微球或作为安慰剂的微球。图2B是应用非特异性促细胞分裂素刺激物伴刀豆蛋白A(ConA)的结果图。
图3A是用在体外皮下施用含有OVA和佐剂的微球进行刺激的效果图，图3B是口服含有OVA的微球的效果图。
图4是细胞毒性T淋巴细胞在不同的效应物：靶(ET)比例下的应答图。
图5表示用单克隆抗体处理以去除效应T细胞亚群后对用OVA微球免疫的小鼠肾细胞的CTL活性的作用。图5A表示在效应物对靶的比例是40∶1时的CTL活性。图5B表示在效应物对靶的比例是20∶1时的CTL活性。
本发明的详细描述术语的定义
术语免疫原或抗原在此广泛地应用，包括任何当施用于哺乳动物时能引起免疫应答的化学或生物学物质。尽管免疫原经常是蛋白质，但它也可是核酸。在本发明中，免疫原包括但不限于下列物质：过敏原蛋白和其消化片段如从豚草属、黑麦、六月草、鸭茅、黄花草、红顶草、梯牧草、黄酸模、小麦、玉米、北美艾灌丛、早熟禾、Californiaannual grass、藜、百慕大草、俄罗斯蓟、山地雪松、橡树、白蜡树、美国梧桐、枫树、榆树和其他中得到的花粉过敏原，尘土、螨、蜜蜂和其他昆虫毒物、食物过敏原、动物头皮屑、微生物疫苗，后者又包括病毒、细菌、原生生物、线虫和蠕虫疫苗和它们的多种组分如表面抗原，包括从如下列生物中得到的含有糖蛋白或蛋白质、蛋白质片段、基因或基因片段的疫苗：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、沙门杆菌菌种、志贺氏菌菌种、大肠杆菌、克雷伯氏菌菌种、变形菌菌种、霍乱弧菌、Helicobacterpylori、Pseudomonas aeruginosa、流感嗜血菌、百日咳博德特氏菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、苍白密螺旋体、和衣原体菌种、破伤风类毒素、白喉类毒素、流感病毒、腺病毒、副粘病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、乙肝病毒、疱疹病毒、狂犬病病毒、人体免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒，还有原生生物寄生虫如鼠弓形体、隆凸肺囊虫、梨形鞭毛虫、阴道梨形虫、腹球虫、肠绒毛虫、人体酵母菌、和不同种的内阿米巴、阿米巴、疟原虫、利什曼、锥虫、巴倍虫、隐担孢子、肌囊虫和Cyclospora，还有线虫和不同种类的吸虫、涤虫和内脏幼虫。
免疫原可作为治疗或预防剂施用来诱导免疫应答。在此使用时，诱导免疫应答包括激起免疫应答和调节、选择性地刺激，和／或增强总的或选择性的免疫应答。治疗免疫原在此被定义为减轻病理状况或疾病的物质。可在本发明中应用的治疗剂包括但不限于免疫原试剂和基因治疗剂。预防剂在此被定义为可阻止或减轻随后的获得性疾病或病理过程的严重性的物质。预防剂的一个例子是抵抗能带来感染性疾病的微生物的疫苗。微球制剂
当在此应用时，除非特别说明，所有的百分数都以组分重量相对于微球总重量给出。在本发明的一个实施方案中，制得免疫原的一种水溶液，它含有任选的稳定化试剂来对免疫原提供物理保护。免疫原水溶液一般是免疫原重量占微球的约0．5％到约10％，并优选1％。
稳定化试剂通常是治疗上非活性的、水溶性的糖，它可在免疫原的制剂和／或后续包被步骤中保护免疫原。稳定化试剂的例子包括乳糖、甘露醇和海藻糖。稳定化试剂以从约0．1％到约10％，并优选5％的浓度加入。如果免疫原溶液的粘度较低，可希望加入约1％到10％的聚乙烯吡咯烷酮或其他粘合剂如羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素，把免疫原结合到惰性粒子上。
通过例如喷雾的办法，把一种或多种免疫原和一种选择性的稳定因子结合到一种药学惰性物质(下文称为惰性粒子)上。惰性粒子可能具有多种形状如珠状、球状、粉末、晶体或颗粒。在一个实施方案中，可用一个被定义为药学惰性物质的小球微粒的nonpareil。这样的nonpareil可在商品名NuPareils(Crompton ＆ Knowles CorpMahwah，NJ)下买到。在其他实施方案中，可用硅粉、糖结晶或盐结晶。惰性粒子无论是什么形状的，都有大于35目，优选为大于40目，最优选地在45到200目之间的颗粒尺寸。
Glatt牌的粉状包衣颗粒如GPCG-1HS、GPCG-5HS、或GPCG-60HS液体床包衣机都适用于用来把免疫原包被到惰性粒子上。Wurster型的液体床包衣机的多种其他品牌(NIRO，Vector，Fluid Air，等)也适合于应用。包被条件和时间依设备和包被粘度的不同而改变；然而，包被一般地必须在温度低于50℃时进行，而优选为低于35℃，以避免蛋白质免疫原的变性。
干的免疫原-包被的惰性微粒也优选用一层或多层酸稳定多聚体包被来形成肠溶衣。这层包被致使免疫原抵抗在胃的酸性环境下的降解。并且，在小肠中适于选择性T细胞应答的特定pH条件下，改变肠溶衣的组成和／或量可容许肠溶衣溶解并因而释放出免疫原。可用与上述包被步骤相似的方式和相似的设备来制备一种或多种多聚物的包被。
肠溶衣优选为水基乳液多聚体如丙烯酸乙酯／甲基丙烯酸共聚合体，以EudragitL-30D(Huls America IncSomerset，NJ)牌出售，其分子量为约250，000，一般以30％W／V的水分散剂。使用其他多聚体包被的例子包括无溶剂的Eudragit L／S 100或羟丙甲基纤维素乙酸琥珀酸酯。肠溶衣使微胶囊化的免疫原可被口服并不被从微球中释放，直到遇到肠的特别区域。肠溶衣的化学组成可被配成在小肠最适宜选择性T细胞应答的特定pH条件下溶解放出免疫原。或者，肠溶衣可被配制为在遇到足够的机械的和／或化学的腐蚀后才释放出免疫原。
包被组分可与增塑剂联合使用以提高包被的连续性。几种周知的增塑剂可以应用，优选柠檬酸三乙基酯(Morflex IncGreensboro，NC)。尽管增塑剂可是液体，但却并不认为它们是溶剂，因为它们位于包衣里并改变自己的物理特性但却并不溶解蛋白免疫原。溶解或变性免疫原的增塑剂将不被接受。
可加入滑石粉(约3％)以阻止微粒互相粘接。也可加入消泡剂(约0．0025％)如山梨糖醇倍半油酸酯(Nikko Chemicals Co．LtdJapan)或硅酮。可加入抗静电剂(约0．1％)如Syloid 74FP(DavidsonChemical Division，Cincinnati，OH)。滑石粉、消泡剂和抗静电剂只在需要时才加入。
含有免疫原、任选的稳定剂或其他配方成分的惰性粒子被干燥，并可用上述肠溶衣包被。包被溶液是约30％到约75％的聚合体、约0％到约10％的增塑剂、约0％到约3％的滑石粉、约0％到约0．0025％的消泡剂、约0％到约3％的抗静电剂和水。一般的优选方法是在溶液中不加有机溶剂。有机溶剂能变性免疫原。增效试剂
在另一个实施方案中，可加入增效试剂以提高蛋白的免疫原性。增效试剂在此被定义为增强其他免疫原的抗原性的物质。因而增效试剂间接地刺激免疫应答。增效试剂的例子包括佐剂、生物粘接剂、粘性粘接剂和促进剂。佐剂在此定义为任何生物或化学物质，当与免疫原施用时，其能增加对抗抗原的免疫应答。其作用方式或者是在淋巴细胞暴露于抗原的部位集中抗原，或者是诱导能调节淋巴细胞功能的细胞因子。佐剂可是治疗上可接受的生物化合物、化学化合物，或者是生物化合物和化学化合物的联合。化学佐剂的例子是可水分散的无机盐如硫酸铝、氢氧化铝(alum)和磷酸铝。生物佐剂的例子外源性细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-12(IL-12)和γ干扰素(IFNγ)、微生物如BCG(bacilleCalmette-Guerin)、小棒杆菌、和百日咳博德特氏菌，细菌内毒素如霍乱毒素B(CTB)、脂多糖(LPS)、和胞壁酰二肽(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[MDP])。商业可得的佐剂如DETOX-PC也是可得的。增效试剂的另一个例子是半抗原，在此定义为其本身没有抗原性但当与高分子量载体相偶合时则具有抗原性的低分子量物质。生物粘接剂如Lycopersicon esculentum植物凝集素(番茄凝集素，LT)和粘性粘接剂如脱乙酰壳多糖-样的N-三甲基脱乙酰壳多糖氯化物与糖结合并在肠的位点-特异区形成糖聚合物。促进剂在此定义为促进吸收、运输或呈递抗原、佐剂或半抗原的配方组分，它因而促进期望的免疫应答。促进剂的例子是糖蛋白、脂蛋白、胆汁盐、饱和酸、磷脂、糖脂、甘油三酯、胆固醇、环糊精和甘油及其他。所有上述增效试剂可单独或结合、或作为共价或非共价复合物的部分被掺入进微球制剂中。
增效试剂可在包被惰性粒子之前加到水分散体或免疫原的溶液中。或者，增效试剂可加入到非免疫原结合的惰性粒子上。一般地，加入增效试剂的量为1％到10％。增效试剂可结合到与结合免疫原相同的惰性粒子上。或者，增效试剂可与第一个惰性粒子结合，免疫原结合第二个惰性粒子，这样，增效试剂就应用于与非免疫原结合的惰性粒子。作用的可能机理
当与其他T细胞类型相比时，发现从颗粒尺寸大于35目的惰性粒子得到的的微球能更促进和选择性地刺激T细胞毒性细胞。如图1所示，本发明的微球具有增效试剂样的效应并且T细胞的刺激程度随微球的惰性粒子大小的减少而增加。用含有颗粒尺寸大于35目的微球(空白方框)的卵清蛋白(OVA)经口服免疫小鼠，从中分离其肾细胞制成单细胞悬液，表明在培养中OVA特异性增殖，比用含有佐剂与OVA的颗粒尺寸小于35目的微球口服免疫的小鼠肾细胞增殖(实体方框)要多两倍，并且其增殖要比用OVA加佐剂DETOX-PC(斜线方框)经非肠道免疫的细胞的增殖多三倍。这表明，口服颗粒尺寸大于35目的微球的免疫对于抗原特异性的T细胞增殖具有增效试剂样的作用。图4显示，应用连接到颗粒尺寸大于35目的惰性粒子上的肠溶衣包被的免疫原，在选择T细胞毒性细胞应答上具有增效试剂样的作用，该作用相当于共同施用OVA和DETOX-PC佐剂得到的应答。因此，在一些情况下在微球制剂中加入佐剂如氢氧化铝(alum)或DETOX-PC或其他增效试剂，可能产生对T细胞毒性细胞群落的额外的刺激作用，因而可以较低的免疫刺激药物的起始剂量，得到相当于用较高剂量的免疫刺激药物得到的免疫应答。
尽管这些选择性刺激的准确机理尚不清楚，一个解释可能是，较小的肠抗原包被粒子可在胶囊化的抗原和位于哺乳动物消化道的适合的免疫细胞受体系统之间提供增加的接触点，特别是在集合淋巴结的扩散淋巴组织中。这些小微粒在单位重量下也可含有较高的某种制剂成分，它们中的一些可促进抗原呈递和传送。然而，其他的解释也是可能的。微球剂量
在应用中，将含有免疫原-结合的惰性粒子(惰性粒子颗粒尺寸大于35目)和用任选的增效试剂包被的肠溶衣的本发明微球，按剂量程序和组成施用以调节免疫应答，所述组成由上述尺寸和组成不同置换而成。优选微球通过管饲法或喂食来口服施用，或者也可经非肠道施用，如皮下注射。剂量可是连续的或间断的并在不同的时间和不同的配方下施用。当在此使用时，配方包括微球不同百分比的组合物和不同的生理化学组成，例如尺寸、包衣、聚合体、增塑剂、抗粘试剂、消泡剂、抗静电剂、增效试剂和赋形剂。
例如，施用的剂量可包括许多单个惰性粒子，其中每个惰性粒子含有一种或多种免疫原和增效试剂(如果加入)。如果制剂为单一惰性粒子，施用剂量中的不同的单个微球可含有相同的或不同的肠溶衣、相同或不同的多聚物、增塑剂、粘合剂、抗粘试剂、消泡剂、抗静电剂、增效试剂和赋形剂的配方，和／或相同的或不同的惰性核心组成和尺寸。或者，剂量可被配制成含有惰性粒子和一种或多种免疫原(如果加入，在各独立的惰性粒子中还有增效试剂)的联合。如果在各独立的惰性粒子中和免疫原与增效试剂一起配制，施用剂量中的各独立微球可含有相同的或不同的肠溶衣、相同或不同的多聚物、增塑剂、粘合剂、抗粘试剂、消泡剂、抗静电剂、增效试剂和赋形剂的配方，和／或相同的或不同的惰性核心组成和尺寸。这些惰性粒子的尺寸、组成、肠溶衣和配方组分的不同的排列组合可帮助施用的微球沿着肠达到抗原的选择分布和呈现。
微球可被置于凝胶胶囊中让人和动物口服。剂量将依赖于个体和治疗过程。当应用含有豚草作为抗原的本发明的微球进行治疗时，剂量将是约0．03到约35单位，以主要的过敏原蛋白Amb-a-1计，每天施用。过敏原的剂量与注射免疫治疗中应用的剂量可不同。应用
在应用中，含有肠溶衣抗原和任选的增效试剂的本发明的微球有很多用途。例如，含有糖蛋白、蛋白、蛋白片段、多肽、或来自微生物、病毒或寄生虫的基因片段微球，对于典型的用来治疗感染疾病的抗微生物、抗病毒、抗寄生虫的药剂将是有价值的预防和／或治疗辅助手段。作为另一个例子，从HER-2／neu癌基因的“自我-蛋白质”中而来的含有非决定区表面抗原决定族的肽片段可被用做本发明微球中的免疫原，来提高癌症疫苗的有效性，这是通过打断对过度表达的肿瘤蛋白质的耐受实现的。此作用将特别地有价值，因为HER-2／neu是“自我”蛋白质，并因而不引发免疫应答。通过在本发明的微球中应用含有非决定区表面抗原决定族的肽段而不是整个蛋白质(Disis等，J．Immunol1996：156，3151-3158)，一种癌疫苗能引发T细胞毒性细胞针对“自我”肿瘤抗原的应答。作为另一个例子，免疫原可是过敏原，它增加TH1型的应答并因而增加典型的TH1细胞因子的产生，如γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和白介素-2(IL-2)，它们可进一步降低在如哮喘的过敏条件下的感染。
本发明将由下述实施例做进一步的说明。
实施例1肿瘤细胞系
EL4胸腺瘤细胞系(TIB-39)从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到。细胞在培养液中的维持用RPMI1640培养基，外加10％胎牛血清(FCS)(HyClone Laboratories，Logan，UT)、15mMHEPES缓冲液，2mM谷氨酰胺、0．1mM非必需氨基酸、50单位／毫升盘尼西林，50单位／毫升链霉素、1mM丙酮酸钠(Biofluids，Rockville，MD)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma，St．Louis，MO)。抗原
纯化的鸡蛋白蛋白(OVA)(V级)从Sigma(St．Louis，MO)购买。OVA蛋白质的H-2Kb限制性肽表面抗原决定族，即OVA257-264(SIINFEKL)，在Applied Biosystem Model 432A肽合成仪上用FMOC化学合成。将冻干的产物在水中重新悬浮，浓度达2mg／ml，过滤除菌并贮于-70℃。经高效液相色谱测定，肽的纯度大于90％。
OVA蛋白被包被到惰性粒子上，用含有生物可降解的聚甲基丙烯酸共聚物(Eudragit L30D)的水肠包被系统把抗原胶囊化。惰性粒子是约45目的Nupareils。免疫
从Taconic Farm(Germantown，NY)得到六到八周龄的C57BL／6(H-2Kb)雌性小鼠。免疫小鼠，方法是通过皮下注射乳化在DETOX-PC佐剂(RIBI ImmunoChem Research，Hamilton，MT)中的30μg OVA蛋白，或者经口腔通过饲管插到喉咙后部饲喂含有200μgOVA的微球。对照组小鼠口服安慰剂微球。在第0、14和28天进行三次系列免疫。在最后一次免疫三周后处死动物。淋巴增殖
在它们第三次免疫后21天从免疫的动物体内取肾，通过70μm尼龙细胞过滤器(Falcon；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)机械分散细胞以得到单个细胞悬浮液。通过Ficoll-Hypaque梯度(d=1．119g／cm)离心除去死细胞和红细胞。然后把肾的单核细胞通过尼龙羊毛柱(Robbins Scientific CorpSunnyvale，CA)从收获的细胞群落富集T细胞。富集的T细胞用完全培养液(RPMI1640，辅以10％FCS、15mMHEPES缓冲液，2mM谷氨酰胺、0．1mM非必需氨基酸，50单位／毫升盘尼西林，50单位／毫升链霉素、50μM 2-巯基乙醇和1mM丙酮酸钠)清洗，并分散在96-孔平底微滴定板(Falcon；Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)上，浓度为1×105／孔。
然后在有作为抗原呈递细胞(APC)的自身同源肾细胞存在下(5×105／孔)温育淋巴细胞。接受刺激的孔含有OVA蛋白(100μg／ml)、OVA257-264肽(100μg／ml)或伴刀豆蛋白(Con A；2．5μg／ml)，对照孔只在完全培养基中含有T细胞和APC。所有培养物的最终体积为200μl，并在37℃、5％ CO2下培养2天(Con A)或5天(抗原刺激物)。在最后的18到24小时，用1μCi／孔的[3H]胸腺嘧啶(DuPont NewEngland Nuclear，Wilmington，DE)脉冲标记培养物。用PHD细胞收获器(Cambridge Technology，Cambridge，MA)收获细胞，用液闪计数器(LS 6000IC，Duarte，CA)定量测定掺入的放射性。平均三个孔的结果，报告为刺激指数(SI)，其计算公式为：
SI=被刺激的孔(cpm)／对照孔(cpm)CTL的体外刺激初级CTL培养物
从每个实验组收获肾细胞(25×106)，混合每个组三只动物的肾细胞，在25cm2垂直烧瓶中用10ml完全RPMI培养基(10％FCS、15mM HEPES缓冲液，2mM谷氨酰胺、0．1mM非必需氨基酸，50单位／毫升盘尼西林，50单位／毫升链霉素、50μM 2-巯基乙醇和1mM丙酮酸钠)温育，条件是37℃、5％ CO2，并在5μg／ml OVA257-264肽的存在下。长期CTL系
七天后收获初级CTL培养物，通过Ficoll梯度(d=1．08g／ml；Organon Teknika CorpDurham，NC)离心回收活的淋巴细胞。回收的淋巴细胞在24孔平底培养板(Corning Costar CorpCambridge，MA)上被再刺激，培养板中含有0．5×106淋巴细胞、5×106被照射(2000拉德)同源C57BL／6肾细胞、5μg／ml OVA257-264肽和10单位／ml重组人白介素-2(IL-2)(Cetus CorpEmeryville，CA)。在其后每周的再刺激中，除了肽剂量不同之外，抗原特异性的CTL再刺激都是以相同的方式进行。在8周体外刺激后，肽浓度降至2μg／ml。细胞毒性测定
进行4个小时的51Cr释放测定。靶细胞(肿瘤细胞)被用50μCiNa51CrO4／1×106细胞标记90分钟。在50μl完全RPMI培养基中标记靶细胞(1×104)，并加到96孔U-底培养板(Corning Costar Corp．)的孔中。当适合时，在加入T细胞效应剂之前，靶细胞与下列中的一种或多种在37℃、5％ CO2下温育30分钟：OVA257-264肽、抗-CD8的抗体(从2．43杂交瘤得到的上清)、或抗-CD4的抗体(从GK1．5杂交瘤得到的上清)。把效应细胞加入到50μl完全培养基的靶中。板在37℃、5％ CO2下温育4小时。在温育后，用Skatron收获器(Skatron，IncStering，VA)收获上清。用γ计数器(Beckman Instruments)定量测定放射性的释放，用下面的等式计算百分比溶解：
％比溶解=(实验(cpm)-自动释放(cpm)／最大释放(cpm)-自动释放(cpm))×100
结果报告为三个样品的平均值加减标准方差。
自动释放是从在没有T细胞效应子存在下加入了100ml培养液的孔中算出的。最大释放从加入了2％Triton X-100溶液的孔中算出的。流动血细胞记数
收获淋巴细胞，用含有Ca2+、Mg2+和5％胎牛血清(FBS)的冷Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)洗涤三次。在冰上温育细胞45分钟，或者与异硫氰酸荧光素(FITC)-偶合的抗小鼠CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD11a／CD18、和α／β T细胞受体(TCR)，或者与合适的异型对照FITC-偶合的大鼠IgG2ak、大鼠IgG2bλ、或田鼠IgG抗体(PharMingen，San Diego，CA)。然后用没有Ca2+和Mg2+的DPBS溶液洗涤两次。用本领域内的熟练技术人员熟知的流动细胞分析方法分析从10，000活细胞／样品中得到的数据，用Becton Dickinson FACscan流动细胞计数器，波长为488nm，带通道滤器为530nm。淋巴增殖分析
图2A和图2B表示淋巴增殖分析的结果。如图2A所示，为了确定用标准蛋白OVA口腔免疫能否导致细胞免疫应答的活化，用含有OVA蛋白(微球-OVA)的肠溶衣微球免疫C57BL／6小鼠，剂量分别为12．5μg／ml、25μg／ml和100μg／ml(斜线方框)。为了比较用OVA口服免疫得到的免疫应答和用同样的抗原经非肠道免疫得到的效果，OVA蛋白被分散到DETOX-PC佐剂中，并经皮下注射到第二组C57BL／6小鼠中(黑色方框)。第三组C57BL／6小鼠经口服免疫接受安慰剂微球(白色方框)。通过测量[3H]胸腺嘧啶的掺入测定淋巴细胞的增殖。
如图2A所示，经口接受100μg／ml微球-OVA的小鼠T细胞，其刺激指数为38．3，而用在佐剂中的OVA蛋白免疫的小鼠的T细胞的刺激指数为9．1。在OVA蛋白存在时自身淋巴细胞不增殖。如图2B所示，各个组的淋巴细胞对用2．5μg／ml Con A非特异分裂原刺激都表现出强的刺激指数。
实施例2
用肠溶衣包被的微球-OVA经口服免疫小鼠的CTL免疫应答产生抗原-特异性T细胞系。通过口服微球或(作为对照)皮下注射DETOX-PC佐剂的乳化物用OVA免疫小鼠，从小鼠中纯化肾细胞，在OVA257-264肽、经照射的同源肾细胞作为APC和IL-2存在的情况下体外培养。在体外刺激(IVS)的七天循环中维持细胞系。细胞系以抗原-依赖方式溶解靶细胞的能力被用四小时51Cr释放测定五天来评价。在这些测定中，EL4(H-2Kb)细胞系用做靶细胞。在测定中加入T细胞效应子之前，EL4细胞与OVA257-264肽被预先脉冲标记。所有数据都是20∶1的比例。
如图3A和图3B所示，在IVS只三个循环之后，抗原-特异性溶解的出现是显然的。图3A表明从经皮下注射乳化在DETOX-PC佐剂中的OVA免疫的小鼠中得到的细胞效应子。图3B表明从经口服微球-OVA免疫的小鼠的T细胞效应子。黑色圆圈代表用25μg／ml OVA257-264CTL表面抗原决定族肽预脉冲标记EL4细胞。空白圆圈代表没有脉冲标记的EL4细胞。
在IVS三个循环之后，抗原-特异性的溶解是明显的，在此时间点，非特异性的EL4细胞的溶解也可察到。在IVS六个循环后，非特异性的EL4细胞溶解就显著地降低(约10％到20％)。在IVS八个循环之后，两个细胞系都得到较高的(约50％到约60％)抗原特异性溶解和较低的(少于10％)非特异性溶解。
如图4所示，从免疫动物中得到的CTL细胞系的强度用效应子∶靶的比例的函数表示。EL4细胞与25μg／ml OVA257～264肽被预先脉冲标记。黑色圆圈代表微球-OVA。黑色四方体代表在DETOX-PC佐剂中乳化的OVA。十字代表安慰剂微球体，空白三角代表非肽脉冲的EL4细胞的非特异性的51Cr摄入。两种细胞系都可通过一个范围多种效应子∶靶比例滴定。当被施以安慰剂微球的动物中的肾细胞在与实验细胞相同条件下被培养的时候，它们在体外不能被激活以识别肽脉冲标记的靶细胞。这个观察也表明实验细胞系在经口服或肠道用OVA免疫后通过体内活化得到它们的抗原特异性，而并非是体外培养的结果。
为验证从各个免疫动物中得到的细胞系以CD8+T细胞依赖方式溶解肿瘤细胞，做了抗体封闭实验。图5A和图5B表明抗原-特异靶细胞溶解的CD8+T细胞依赖性。图5A显示应用OVA257-264标记的EL4细胞在40∶1的效应子∶靶比例下一个4小时的51Cr释放测定，以确定观察的靶细胞被从经皮下注射佐剂中的OVA免疫的动物中得到的CTL系溶解CD8+T细胞的依赖性。图5B显示应用OVA257-264标记的EL4细胞在20∶1的效应子∶靶比例下一个4小时的51Cr释放测定，以确定观察的靶细胞被从经口服微球-OVA免疫的动物中得到的CTL系溶解CD8+T细胞的依赖性。
如图5A和图5B所示，在4小时51Cr释放测定中，从杂交瘤GK1．5、分泌的抗-CD4抗体或者杂交瘤GK2．43、分泌的抗-CD8抗体中得到的上清，在它们加入到OVA257-264标记的EL4靶细胞之前就与T细胞温育。在抗CD8抗体存在的情况下，抗体-特异性肿瘤细胞溶解被抑制。相反地，抗-CD4抗体的存在导致T细胞介导的抗原-特异性细胞溶解的较少抑制(约1％到10％)。当T细胞与含有抗-CD8抗体的2．43杂交瘤的上清预温育时，两种T细胞系的溶解活性都被消除。T细胞与含有抗CD4抗体的GK1．5杂交瘤上清的预温育不带来此细胞系溶解活性的较大降低。
FACS分析
可通过流动细胞记数分析OVA-衍生的细胞系上存在T细胞表面标记物。表1表明在八个IVS循环之后T细胞系的表型特征。细胞系从小鼠的肾细胞中得到，小鼠如上所述通过微球-OVA或佐剂中的OVA免疫。表1
    细胞决定子     ％阳性细胞(平均荧光密度)
CD3CD4CD8CD2CD28CD11a/CD18α/β TCR  卵清蛋白-DETOX-PC     微球卵清蛋白
    95．55(23．32)57．69(62．37)49．68(138．16)78．82(19．98)12．98(32．01)99．58(157．77)64．34(16．53)     99．18(77．94)8．02(52．63)92．69(174．30)69．14(26．37)60．99(18．38)98．22(89．00)77．33(21．78)
如表1所示，两种细胞系都有多于95％的T细胞，它们以CD3细胞表面分子来鉴定。从用佐剂中的OVA免疫的小鼠中得到的培养淋巴细胞中衍生得到的T细胞系含有49．6％的CD8+T细胞，从经口服微球-OVA免疫的小鼠中得到的培养的淋巴细胞衍生得到的细胞系含有92．7％的CD8+T细胞。表明除了整和分子CD11a／CD18之外，两种细胞系都表达辅刺激分子受体CD2和CD28。从两组免疫的动物中得到的培养的T细胞也表达α／β T细胞受体。这些数据帮助表明，用蛋白抗原OVA通过口服微球免疫活化的T细胞在表型上与用同样的抗原经非肠道免疫活化得到的结果是相似的。
本发明的微球调节免疫应答。应答可包括一般的促进产生TH1细胞、TH2细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)亚类，或从TH2类型的应答促进转变为TH1类型的应答，或从TH1类型应答促进转变为TH2类型的应答，或促进的前-CTL到CTL的分化。免疫原可是肽、蛋白质片段、蛋白质、DNA、和／或RNA，也可是基因、基因片段或疫苗。治疗或预防制剂包括免疫原、免疫治疗制剂或基因治疗制剂，或者单独使用或者联合使用，它们可以肠微胶囊化的组分与具有大于35目的惰性粒子结合的形式经口服方式传送，并以底物珠子、颗粒、粉末、或晶体的形式存在。
将可期望在此公开的传送系统的组成和方法能在较为宽广的条件下被用做治疗或预防。因而，本发明的实施例只是发明人优选的实施例，它们并不在任何意义上具有限制作用。对这些实施例的多种改变、修饰或变更都可进行，而并不被认为偏离了本发明的精神和随后的权利要求的范围。

Claims (33)

1．在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括将含有连接到惰性粒子上的免疫原的微球施用到所说哺乳动物的小肠，其中所说惰性粒子的颗粒尺寸大于35目。
2．权利要求1的方法，其中所说的微球经口服施用，所说的微球包括肠溶衣包被的微球。
3．权利要求1的方法，其中所说的微球通过凝胶胶囊施用。
4．权利要求1的方法，其中所说的免疫原从由下列物质组成的组中选取：肽、蛋白质片段、蛋白质、基因、基因片段、DNA、RNA和其组合。
5．权利要求1的方法，其中所说的免疫原是疫苗。
6．权利要求1的方法，进一步包括施用连接到惰性粒子上的增效试剂，其中所说的惰性粒子选自免疫原-结合的惰性粒子和非免疫原-结合的惰性粒子。
7．权利要求1的方法，其中施用多个微球，以诱导免疫应答。
8．权利要求7的方法，其中所说的多个微球包含选自由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子组成、不同的肠溶衣、不同的配方和其结合所组成的组中的组合物。
9．权利要求1的方法，其中所说含有所说的免疫原的微球诱导T淋巴细胞数目的增加。
10．权利要求9的方法，其中所说含有所说的免疫原的微球诱导细胞群落的增加，所述细胞选自TH1淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和它们的组合。
11．权利要求1的方法，其中所说的惰性粒子的颗粒尺寸大于约40目。
12．权利要求1的方法，其中所说的免疫原被包含在惰性粒子上，所述惰性粒子从由nonpareil、硅粉、盐结晶和糖结晶组成的组中选择。
13．减轻哺乳动物中癌症的方法，包括将含有结合到惰性粒子上的免疫原的微球施用到所说哺乳动物的小肠，所说的惰性粒子的颗粒尺寸大于约35目。
14．权利要求13的方法，其中所说的微球经口服施用，所说的微球包括肠溶衣包被的微球。
15．权利要求13的方法，其中所说的微球通过凝胶胶囊施用。
16．权利要求13的方法，其中所说的免疫原从由肽、蛋白质片段、蛋白质、基因、基因片段、DNA、RNA和它们的组合所组成的组中选择。
17．权利要求13的方法，其中所说的免疫原是疫苗。
18．权利要求13的方法，进一步包括施用结合到惰性粒子上的增效试剂，所说的惰性粒子选自免疫原-结合的惰性粒子和非免疫原结合的惰性粒子。
19．权利要求13的方法，其中施用多个微球，来选择性地诱导免疫应答。
20．权利要求19的方法，其中所述的多个微球具有选自由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子组成、不同的肠溶衣、不同的配方和其结合所组成的组中的组合物。
21．权利要求13的方法，其中所说含有所说的免疫原的微球诱导T淋巴细胞数目的增多。
22．权利要求21的方法，其中所说含有所说的免疫原的微球诱导细胞群落的增加，所述细胞选自TH1淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和它们的组合。
23．权利要求13的方法，其中所说的惰性粒子的颗粒尺寸大于约40目。
24．权利要求13的方法，其中所说的免疫原包含在惰性粒子上，所述惰性粒子从由nonpareil、硅粉、盐结晶和糖结晶组成的组中选择。
25．在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括给所说的哺乳动物经口服施用含有肠溶衣包被的含有蛋白免疫原的惰性粒子的微球，所说的惰性粒子的颗粒尺寸大于约40目。
26．权利要求25的方法，进一步包括施用结合到惰性粒子上的增效试剂，所说的惰性粒子选自免疫原-结合的惰性粒子和非免疫原结合的惰性粒子。
27．权利要求25的方法，其中施用多个微球，以选择性地诱导免疫应答。
28．权利要求27的方法，其中所说的微球具有从由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子组成、不同的肠溶衣、不同的配方和其结合所组成的组中选择的组合物。
29．权利要求25的方法，其中所述免疫应答包括T淋巴细胞群落的增加。
30．权利要求29的方法，其中所述免疫应答包括细胞群落的增加，所述细胞选自TH1淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和它们的组合。
31．含有包含在惰性粒子上的免疫原和肠溶衣的微球，所说的惰性粒子的颗粒尺寸大于约35目。
32．权利要求31的组合物，它被包含在胶囊中。
33．权利要求31的组合物，进一步含有增效试剂。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828432B2 (en) 1996-10-28 2014-09-09 General Mills, Inc. Embedding and encapsulation of sensitive components into a matrix to obtain discrete controlled release particles
EP1065936B1 (en) 1998-03-23 2009-08-05 General Mills, Inc. Encapsulation of components into edible products
US6908757B1 (en) 1998-03-26 2005-06-21 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
CZ2002171A3 (cs) 1999-07-22 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Proteinázový konjugát, čistící prostředek a prostředek osobní péče
MXPA02000840A (es) 1999-07-22 2002-07-30 Procter & Gamble Variantes de proteasa de subtilisina que tienen substituciones de aminoacidos en regiones de epitopes definidas.
AU5928100A (en) 1999-07-22 2001-02-13 Procter & Gamble Company, The Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions
US6946128B1 (en) 1999-07-22 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected epitope regions
JP2004504264A (ja) * 2000-01-07 2004-02-12 ユニバーシティ　オブ　シンシナティ Ｔｈ１又はｔｈ２リンパ球に制御される免疫応答の選択的活性化
US7892586B2 (en) 2001-02-22 2011-02-22 Suzanne Jaffe Stillman Water containing soluble fiber
US8178150B2 (en) 2000-02-22 2012-05-15 Suzanne Jaffe Stillman Water containing soluble fiber
US6468568B1 (en) 2000-06-16 2002-10-22 General Mills, Inc. Oligosaccharide encapsulated mineral and vitamin ingredients
US6436453B1 (en) 2000-06-16 2002-08-20 General Mills, Inc. Production of oil encapsulated minerals and vitamins in a glassy matrix
AU2001294250A1 (en) * 2000-10-16 2002-04-29 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Medicinal compositions quickly disintegrating in the oral cavity and process forproducing the same
US8076113B2 (en) * 2001-04-02 2011-12-13 Danisco Us Inc. Method for producing granules with reduced dust potential comprising an antifoam agent
BR0208531A (pt) * 2001-04-02 2004-09-14 Genencor Int Grânulo com potencial de pó reduzido
KR20050044523A (ko) * 2001-11-19 2005-05-12 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 입자 형태의 약제학적 조성물
US20040043070A1 (en) * 2002-05-14 2004-03-04 Ayres James W. Hot melt coating by direct blending and coated substrates
KR100530369B1 (ko) * 2002-05-27 2005-11-22 이영환 항암물질에 나노입자를 결합시킨 주사 제형의 약물 시스템
US20070141071A1 (en) * 2003-05-14 2007-06-21 Oregon State University Hot melt coating by direct blending and coated substrates
BRPI0512210A (pt) * 2004-06-18 2008-02-19 Unilever Nv composição, composição farmacêutica, composição cosmética, alimento, e, método para produzir uma camada contìnua de uma pluralidade de cristais de sal
ATE465809T1 (de) * 2004-10-14 2010-05-15 Unilever Nv Verfahren zum kristallwachstum
US7803413B2 (en) 2005-10-31 2010-09-28 General Mills Ip Holdings Ii, Llc. Encapsulation of readily oxidizable components
WO2007112747A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Curalogic A/S Immunogen combinations
JP5570989B2 (ja) * 2007-08-31 2014-08-13 アムジエン・インコーポレーテツド 固体タンパク質製剤
CH701350A1 (it) * 2009-06-24 2010-12-31 Artcell Invest Ltd Metodo per il trattamento dell'arterosclerosi.
EP2515661A4 (en) * 2009-12-23 2013-11-13 Vaxgene Corp IMMUNE PROTECTION THROUGH ORAL ADMINISTRATION OF MINI-CAPSULES WITH RECOMBINANT LACTOCOCCUS LACTIS
EP2718331B1 (en) 2011-06-13 2017-08-02 Rival S.E.C N,n,n-trialkylpolymers, methods of their preparation and uses thereof
CN118045170A (zh) 2015-06-12 2024-05-17 瓦克萨特公司 用于rsv和诺如病毒抗原的小肠递送的制剂
US20220331770A1 (en) * 2021-04-13 2022-10-20 Illumina Cambridge Limited Compositions, systems, and methods of making and using encapsulated lyophilised microspheres

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1037792A (en) * 1964-03-13 1966-08-03 Konditerskaja Fabrika Im Marat Enteric coated oral vaccines for intestinal infections
US5417986A (en) * 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
JPH07116057B2 (ja) 1988-05-11 1995-12-13 理化学研究所 免疫増強剤及び強化抗原
EP0590060B1 (en) * 1991-06-21 1997-09-17 University Of Cincinnati Orally administrable therapeutic proteins and method of making
SG52402A1 (en) 1992-12-22 1998-09-28 Univ Cincinnati Oral administration of immunologically active biomolecules and other therapeutic proteins
JPH08510639A (ja) 1993-04-19 1996-11-12 メディソーブ・テクノロジーズ・インターナショナル・リミテッド・パートナーシップ 細胞取込みと遺伝子発現の促進と標的化をもたらす接合体と核酸のカプセル化
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique

Also Published As

Publication number Publication date
US6328967B1 (en) 2001-12-11
JP2002506019A (ja) 2002-02-26
NO20004523L (no) 2000-11-03
AU2993099A (en) 1999-09-27
EP1061903A1 (en) 2000-12-27
NO20004523D0 (no) 2000-09-11
AU748882B2 (en) 2002-06-13
CA2322472A1 (en) 1999-09-16
NZ506479A (en) 2004-12-24
US20020034514A1 (en) 2002-03-21
PL342936A1 (en) 2001-07-16
WO1999045904A1 (en) 1999-09-16

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