CN1285356A - 二肽化合物、其药用盐或酯、以其为活性成分的药物组合物及其治疗和预防细胞凋亡的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了下述通式Ⅰ的二肽化合物,及其可药用的盐或酯，其中R1是N末端保护基;AA是除His,Tyr,Pro或Phe以外的任一天然或非天然α－、β－氨基酸残基;R2是H或CH2R4,R4是F、Cl、TsO－、MeO－、ArO－、ArN－、或ArS－电负性基团;R3是C1－10烷基或H。本发明还涉及以该化合物为主要成分的药物组合物,及本发明化合物及其药物组合物作为半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂在治疗与细胞凋亡有关的疾病和其它生物技术领域中的应用。
Description
本发明涉及药物化学领域中一种可用于制备治疗和预防细胞凋亡的药物组合物的二肽化合物，其可药用的盐或酯和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们通过抑制细胞凋亡，在下列疾病治疗和生物技术中的应用：治疗或改善中枢神经系统局部缺血性疾病的药物；治疗或改善由于特异基因一端三核苷酸重复引起的疾病的药物；治疗或改善由于细胞凋亡引起的肝脏坏死性疾病药物。
人体组织维持机体功能的稳定需要细胞增殖与死亡的平衡。有机体用于消除废弃细胞的过程被称为程序性细胞死亡或凋亡。这种细胞死亡过程是动物发展的一个正常方面，可以维持组织的稳态。(Glucksmann，A.，Biol.Rev.Cambridge Philos.Soc.26：59-86，1951；Glucksmann，A.，Archives de Biologie 76：419-437，1965；Ellis et al.，Development112：591-603，1991；Vaux et al。Cell 76：777-779，1994)。凋亡可以调节细胞数目，有利于形态形成，去除有害或不正常细胞以及消除已发挥功能的细胞。此外，在各种生理应激情况下，如缺氧或缺血，也会发生凋亡
当细胞发生凋亡时，细胞形态发生变化，包括细胞膜、核膜囊泡化，细胞皱缩(胞浆及核浆物质浓缩)，细胞器再分布及聚集，染色质浓缩并产生凋亡小体(Orrenius，S.，J.InternalMedicine 237：529-536，1995)。这种变化与病理因素造成的坏死是完全不同的。
凋亡是通过细胞内的自杀机制完成的(Wyllie，A.H.，in Cell Death in Biology and Pathology，Bowen and Lockshim，eds.，Chapman and Hall，1981，pp9-34)。在内、外信号的作用下，细胞内发生一系列与凋亡有关的信号传递过程，这一过程的各个环节均受到精细调节(Wylei et al.，Int.Rev.Cyt.68：251，1980；Ellis et al.，Ann.Rev.Cell Biol.7：663，1991；Thompson C.B.Science 1995，267：1456；)。凋亡细胞和凋亡小体经常在裂解前被周围的细胞或巨噬细胞识别并清除，从而避免了炎症的发生(Orrenius，S.，J.InternalMedicine 237：529-536，1995)。
在细胞凋亡信号转导途径中，半胱氨酸蛋白酶(caspase)起着关键作用。半胱氨酸蛋白酶存在于大多数细胞，通常以单链的原酶形式存在于胞浆，原半胱氨酸蛋白酶一旦激活，其酶促中心被裂解成一大一小两个亚基并重新组成一个含两个小亚基和两个大亚基的活性复合物。半胱氨酸蛋白酶可以被不同信号转导途径所激活。虽然最新的研究表明，这些途径是非常复杂的，而且有许多途径尚未完全搞清。但都是通过一系列的反应，激活一系列的半胱氨酸蛋白酶，导致这些半胱氨酸蛋白酶的水解激活和蛋白水解级联反应的起动，最终引起细胞死亡(Cryns L and Yuan J.Gene Dev.1998；12：1551)抑制半胱氨酸蛋白酶可以阻断各种机理激活的凋亡。
半胱氨酸蛋白酶是一个大家族，其中包括白介素-1β转换酶(intelukin-1β convertingenzyme，ICE)。而哺乳动物白介素-1β(IL-1β)是一种细胞因子，在多种慢性、急性炎症和自身免疫性疾病的病理过程中发挥重要作用。细胞可以产生IL-1β的前体多肽(pro-IL-1β)，但它必须经过ICE处理才能成为有活性的IL-1β，才有活性。抑制半胱氨酸蛋白酶，也就抑制了ICE，也就可以治疗或预防由于IL-1活性引起的疾病(Miura et al.，Cell 75：653-660，1993；Alnernri，E.S.et al．，Cell．87：171，1996)。
因此，半胱氨酸蛋白酶抑制剂有可能在与细胞凋亡有关的疾病以及一些炎症及自身免疫病的治疗和预防中发挥重要的作用。这是药物发展的一个新方向。目前已经有一些半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
WO93/05071给出了一些半胱氨酸蛋白酶抑制剂的结构式：
Z-Q2-Asp-Q1其中，Z是N末端保护基；Q2是0-4个氨基酸，且Q2-Asp至少是Ala-Tyr-Val-His-Asp的一部分；Q1是电负性离去基。常见的二肽是Boc-His-Asp-CH2F，Boc-Tyr-Asp-CH2F，Boc-Phe-Asp-CH2F，Ac-His-Asp-CH2F，Ac-Tyr-Asp-CH2F，Ac-Phe-Asp-CH2F，Cbz-His-Asp-CH2F，Cbz-Tyr-Asp-CH2F和Cbz-Phe-Asp-CH2F。美国专利5，585，357给出了一些半胱氨酸蛋白酶抑制剂肽酮的结构式：
其中，n是0-2个：AA代表L-Val或L-Ala；R1是带有N-苄氧羰基的基团；R8，R9，R10分别是H，小分子的烷基和其它基团。
Revesz等发表了下列三肽烷基乙酯的制备方法(Tetrahedron Lett.35：9693-9696，1994)：
此化合物的游离酸是一有效的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其乙酯作为相应酸的前药。
上述半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在的普遍问题是口服后在胃肠道和体内容易被水解而丧失活性。同时也有较明显的毒副作用。
本发明的目的是通过减少肽链长度来提供一类新的具有药用价值的半胱氨酸蛋白酶抑制作用的化合物。它们在胃肠道和体内更为稳定，并且对机体的毒副作用更低。
本发明进一步的目的是提供一类治疗与半胱氨酸蛋白酶导致的细胞凋亡有关的疾病的药物组合物。
本发明的另一个目的，是提供上述化合物和组合物在制备治疗与半胱氨酸蛋白酶导致的细胞凋亡有关的疾病的药物方面的用途。
本发明的细胞凋亡抑制剂是一类具有通式Ⅰ的二肽化合物，其可药用盐或酯：
其中：R1是N末端保护基；
AA是除His、Tyr、Pro、Phe以外的任何天然或非天然α-或β-氨基酸残
基；
R2是H或CH2R4，R4是选自F、Cl、TsO-、MeO-、ArO-、ArN-、ArS-的电
负性基团；
R3是C1-10的烷基或H。
作为本发明的一种优选，R1是叔-丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)、苄氧羰基(benzyloxycarbonyl)或乙酰基。
作为本发明的另一种优选，AA是Gly、Thr、Glu、Lys、Arg、Ser、Asn、Gln、Val、Ala、Leu、Ile、Met或β-Ala。
作为本发明的又一种优选，R3是H或C1-6的烷基。
作为本发明的再一种优选，R2是H或CH2F，而其中较有代表性的凋亡抑制剂如结构式Ⅱ表示：
或其可药用的盐或酯，其中AA、R1、R3的含义与结构式Ⅰ相同。R1最好是叔-丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)，乙酰基或苄氧羰基(benzyloxycarbonyl)。R3最好是H、甲基、乙基或t-丁基。AA最好是Val、Ala、Leu、Ile、Met和β-氨基酸如β-Ala。
下述是有代表性的结构式Ⅰ的凋亡抑制剂：Boc-Ala-Asp-CH2F，Boc-Val-Asp-CH2F，Boc-Leu-Asp-CH2F，Ac-Val-Asp-CH2F，Ac-Ile-Asp-CH2F，Ac-Met-Asp-CH2F，Cbz-Val-Asp-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp-CH2F，Cbz-Leu-Asp-CH2F，Cbz-Ile-Asp-CH2F，Boc-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Val-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Leu-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Val-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Ile-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Met-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Leu-Asp(OMe)-CH2F和Cbz-Ile-Asp(OMe)-CH2F。
这些化合物中有一部分具有立体异构体，包括光学异构体。本发明中包括了所有立体异构体和这些立体异构体的外消旋体混合物和内消旋体，这些混合物可根据一般的消旋体分离方法分离。
这些化合物均可按现有方法、技术进行合成。特别指出的是结构式Ⅰ或Ⅱ化合物可按下列流程中的路线合成。中介物1可通过Revesz等发表的反应得到(Tetrahedron Lett.35：9693-9696，1994)。1与氨基酸N末端保护基如Z-Val-OH反应得到亚胺2，再经Dess-Martin试剂氧化得3(Tetrahedron Lett.35：9693-9696，1994)。其后经酸催化酯水解得游离酸4，再酯化成5。
发明人发现，结构式Ⅰ或Ⅱ的化合物是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，也是很强的凋亡抑制剂，它可在各种临床条件下减缓或抑制细胞、组织或完整器官细胞的凋亡。同时，它们也是半胱氨酸蛋白酶家族成员ICE和CPP32的抑制剂，抑制由ICE和CPP32导致的一系列病理过程。
发明人发现本发明细胞凋亡抑制剂可以减缓或抑制由于局部或大面积缺血等情况引起的神经系统(脑、脊髓、外周神经系统)细胞凋亡。它们可以有效地扩大中风早期的治疗窗口，改善预后。同时，它们对难产婴儿缺氧等疾病也有治疗作用。
发明人通过Rodriguez (J.Exp.Med_184：2067-2072，1996))的小鼠肝凋亡模型测定发现，本发明细胞凋亡抑制剂可抑制因小鼠静注抗Fas抗体引起的肝和其他器官的大面积细胞凋亡，以及因此导致的动物死亡。因此他们对因此导致的肝脏坏死和其他脏器的坏死性疾病有良好的疗效。
亨亭顿氏病是由于患者相应基因发生突变，在5’端多了重复出现的CAG三核苷酸密码，这种三个核苷酸密码重复超过36次以上，在临床上可能表现为亨亭顿舞蹈病。Goldberg等近期发表的结果(Nature Genetics 13：442-449，1996)表明，这是因为多次重复出现的CAG三核苷酸密码促进CPP32水解HD基因表达产物蛋白hutingtin，导致细胞过度凋亡。发明人证明本发明细胞凋亡抑制剂可抑制CPP32的活性，从而抑制细胞凋亡，因此可预防、治疗亨亭顿氏病及其它由于有三个核苷酸重复延伸引起的功能异常。
本发明的化合物即使在大大超过有效剂量使用时，对实验动物和患者的行为以及整体和器官都没有毒性作用。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述通式Ⅰ化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常见的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂、如水等；填充剂如糖类，包括乳糖或蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；粘合剂如纤维素制品，磷酸钙盐如二磷酸三钙或磷酸氢钙；糊浆(玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等)；分散剂如上述各种糊精和羧甲基糊精、交连聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻朊酸及其盐藻朊酸钠；流速调节剂和润滑剂如硅、滑石、硬脂酸或其盐(硬脂酸镁、硬脂酸钙等)、聚乙烯甘油等。制备抗胃酸型糖衣制剂时，将糖溶液浓缩，这一溶液含有金合欢胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甘油及/或二氧化钛、漆用溶液和适当的有机溶剂或混合溶剂。此外，还需要加入适当的纤维素制品如乙酰纤维素邻苯二酸盐或羟丙甲基纤维素邻苯二酸盐。同时在糖衣中加入色素用来帮助识别不同的本发明化合物剂量。另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药以及局部用药等方式施用于需要这种治疗的患者。例如，局部给药、口服、非肠道给药如皮下、静注、注、腹腔注射、鞘内、颅内给药等。应当根据给药途径，将本发明化合物与成辅以赋形剂、载体、及辅助剂制成有利于发挥药效的剂型。这些药物组合物优选含有本发明化合物重量比重为0.01-99％，最优选含有重量比重为0.25-95％的活性成分。
用于口服时，可将本发明化合物制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、软胶囊和一种由甘油醇或山梨糖醇制成的增塑剂。明胶胶囊中活性成分与填料(如乳糖)、黏合剂(如糊精)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)或稳定剂等成分混合成粒。而在软胶囊中，本发明化合物溶解或悬浮与适当的溶液(如脂肪油、石蜡油)中，并含有稳定剂。
用于直肠给药时，可将本发明化合物制成栓剂。将其与栓剂基质混合。栓剂基质可以是天然或合成的甘油三酸酯或石蜡。还可以将其制成直肠型的明胶胶囊，本发明化合物与液体甘油三酸酯、聚乙烯甘油或石蜡混合。
可将可溶性的本发明化合物(如水溶性盐和碱)溶解于水中，制成水溶性盐和碱溶液等非肠道给药剂型。还可将本发明化合物悬浮于适当的注射用酯溶性溶剂中。可选用的亲酯性溶剂或媒介包括脂肪酸，合成的脂肪酸酯(如乙基油酸酯或甘油三酸酯或聚乙烯甘油-400(可溶于PEG-400))。水溶性注射悬浮液中应加入能增加悬浮液浓度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、和/或葡聚糖，及稳定剂。
可将本发明化合物制成局部应用剂型。这些剂型有霜剂、膏、洗剂、油膏或有类似载体的剂型。其中的载体包括植物油或矿物油、白凡士林(白色软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(长于C12)。应尽量选择能溶解活性成分的载体。乳化剂、稳定剂、保湿剂和抗氧化剂等可以增加药品的颜色或芳香。另外，皮肤渗透增强剂在局部用药的剂型中是必不可少的。
在局部应用的各种剂型中，除了本发明化合物之外，还可添加其它药物、生长因子、伤口密封剂、载体等。此类药物组合物用于患有烧伤的恒温动物，如人，可使伤口愈合速度明显加快。本发明化合物的药物组合物用于治疗皮肤病的剂型中还可加入一种或多种其它有效物质。例如，在药物组合物中可加入能提高皮肤细胞cAMP的化合物，如0.1-1％的腺苷和0.5-5％的罂粟碱、β-肾上腺素受体激动剂(如0.1-2％的异丙肾上腺素)、或0.1-2％的cAMP。此外还可加入一些对治疗皮肤病有效的活性成分，如0.003-0.3％的维生素A，0.1-10％维生素E及其衍生物，及抗炎药(皮质激素类如0.25-5％的氢化可的松或其乙酰酯，或0.025-0.5％的地塞米松)和角膜移植药(0.1-20％的煤焦油或0.05-2％的二羟基蒽酚)等。
除选择以结构式Ⅰ或Ⅱ为代表的化合物药用之外，还可选用其无毒盐类。具体方法是用结构式Ⅰ-Ⅱ的化合物与一可药用的无毒酸或无毒碱混合，从而得到这种药物的酸性盐或碱性盐，这些酸为氯化氢、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等。无毒碱如氢氧化钠、氢氧化钾、羟化胆碱、碳酸钠等。
除特别说明的之外，本发明化合物的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的各种剂型。
本发明各化合物的施用量可根据用药途径，患者的年龄，体重，所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-10毫克/千克体重之间。优选0.1-10毫克/千克体重之间。可以1次或多次施用。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的解说。
图1是表示二肽凋亡抑制化合物对抗Fas单克隆抗体诱导的Jurkat细胞的聚(ADP)戊糖聚合酶(poly(ADP)ribose polymerase，PARP)裂解抑制作用的示意图。
图2是表示二肽凋亡抑制化合物连续输注6小时对暂时脑缺血大鼠脑梗塞坏死的保护作用的示意图。
图3是表示二肽凋亡抑制化合物连续输注12小时对暂时脑缺血大鼠脑梗塞坏死的保护作用的示意图。
实施例1t-丁基5-F-4-OH-3-硝基戊酸酯
草酸(1.9毫升，21.8毫摩尔)的无水CH2Cl2溶液，冷却至-78℃，边搅拌边滴加DMSO(3.0毫升，42.3毫摩尔)的无水CH2Cl2(100毫升)溶液，并使温度保持在-50--60℃之间。搅拌5分钟，加入2-F-乙醇(1.2毫升，18.4毫摩尔)的无水CH2Cl2(10毫升)溶液，再搅拌15分钟，加入无水Et3N(13.5毫升)。反应混合物搅拌15分钟，使温度恢复至室温。再在反应体系中加入t-丁基3-硝基丙酸酯(2.87克，16.38毫摩尔)的CH2Cl2(20毫升)溶液。室温下搅拌3小时，倒入100毫升水中，分离有机相，水相用CH2Cl2萃取(50毫升×2)。所得CH2Cl2溶液用盐水洗、干燥、蒸馏。其残余物用硅胶色谱(己烷∶EtOAc，7∶3)纯化两次，得950毫克(24.5％)无色粘稠油状物。1H NMR(CDCl3)，1.450(s，9H)，2.80-2.90(m，2H)，3.12-3.20(m，1H)，4.41-4.59(m，2H)，4.57-4.59(m，1H)，4.95-5.01(m，1H)。
实施例2
t-丁基3-胺基-5-F-4-OH-3-戊酸酯
t-丁基5-F-4-OH-3-硝基戊酸酯(950毫克，4.0毫摩尔)的甲醇溶液(20毫升)加入Ra-Ni(约200毫克)，混合物在H2(30-35 psi)、室温下震荡18小时。过滤，催化剂用甲醇洗2次(10毫升×2)。反应的甲醇液蒸馏，其残余物用硅胶色谱(EtOAc-MeOH，10∶1)纯化，得840毫克(96％)黄色粘稠油状物。1H NMR(CDCl3)，1.450(s，9H)，2.12(bs，3H，OH及NH2)，2.28-2.38(m，1H)，2.47-2.57(m，1H)，3.24-3.30(m，1H)，3.54-3.76(m，1H)，4.38-4.48(m，1H)，4.54-4.61(m，1H)。
实施例3
t-丁基3-(Cbz-Val-胺基)-5-F-4-OH-3-戊酸酯
在Cbz-Val(396毫克，1.58毫摩尔)的TNF(20毫升)溶液中加入EDCl(300毫克，1.57毫摩尔)，HOBT(240毫克，1.57毫摩尔)和DMAP(129毫克，1.06毫摩尔)。所得混合物搅拌5分钟，加入t-丁基 3-胺基-5-F-4-OH-3-戊酸酯(215毫克，1.04毫摩尔)的TNF溶液(10毫升)，室温下搅拌18小时。过滤，此TNF溶液蒸馏，其残余物用硅胶色谱(己烷∶EtOAc，3∶2)纯化，得290毫克(68％)白色固体。1H NMR(CDCl3)，0.905(d，3H，J=7)，0.965(d，3H，J=7)，1.428(s，9H)，2.07-2.16(m，1H)，2.50-2.57(m，1H)，2.64-2.70(m，1H)，3.52(bs，1H，OH)，3.92-3.96(m，2H)，4.20-4.27(m，1H)，4.40(bs，lH)，4.49(bs，1H)，5.10(s，2H)，5.31-5.4(m，1H，NH)，6.86-6.93(m，1 H，NH)，7.350(s，5H)。
实施例4
Z-Val-Asp-fmkt-丁基酯
在高碘烷(485毫克，1.14毫摩尔)的CH2Cl2溶液(20毫升)中加入t-丁基3-(Cbz-Val-胺基)-5-F-4-OH-3-戊酸酯(230毫克，0.52毫摩尔)的CH2Cl2溶液(12毫升)，此白色混合物在室温下搅拌40分钟，再加入25毫升含有1.26克(8毫摩尔)Na2S2O3的饱和NaHCO3水溶液中，分离澄清的CH2Cl2相，水相用CH2Cl2萃取(2×25毫升)。所得CH2Cl2溶液用盐水洗，蒸馏，残留物用硅胶色谱(己烷∶EtOAc，3∶2)纯化，得到190毫克(83％)白色固体化合物。1H NMR(CDCl3)，0.91-0.97(m，6H)，1.415(s，9H)，2.10-2.20(m，1H)，2.70-2.77(m，1H)，2.95-3.01(n，1H)，3.98-4.06(m，1H)，4.87-5.28(m，6H)，6.95-7.01(m，1H)，7.350(s，5H)。
实施例5
Z-Val-Asp-fmkZ-Val-Asp-fmk t-丁基酯(180毫克，0.41毫摩尔)的无水CH2Cl2溶液中加入F3CCO2H(1.0毫升)，室温下搅拌40分钟，然后蒸馏。残留物用硅胶色谱(EtOAc∶MeOH，10∶1)纯化，得到120毫克(76％)白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，0.81-0.84(m，6H)，1.87-1.96(m，1H)，2.47-2.67(m，2H)，3.77-3.87(m，1H)，4.47-4.59(m，1H)，4.91-5.16(m，4H)，7.25-7.42(s，5H)，8.40-8.49(m，1H)。下列化合物可用例3-5的方法得到：
实施例6
Z-Leu-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(CDCl3)，0.87(m，6H)，1.11(m，1H)，1.47(m，1H)，1.81(m，1H)，2.7(m，1H)，2.95(m，1H)，4.10(m，1H)，4.80-5.20(m，6H)，7.31(s，5H)。
实施例7
Z-Ile-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(CDCl3)，0.85-0.96(m，6H)，1.14-1.26(m，1H)，1.422(m，9H)，1.87-2.04(m，1H)，2.70-2.77(m，2H)，2.93-3.00(m，1H)，4.02-4.13(m，1H)，4.80-5.30(m，6H)，6.96(m，1H)，7.35(s，5H)。
实施例8
Z-Ala-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，1.160(d，3H，J=7)，2.54-2.70(m，2H)，4.00(m，1H)，4.54(m，1H)，5.10-5.30(m，3H)，7.235(s，5H)，8.46-8.52(m，1H)。
实施例9
Ac-Val-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，0.80-0.84(m，6H)，1.85-1.97(m，4H)，2.56-2.75(m，2H)，4.00-4.45(m，4H)，5.00-5.30(m，2H)，7.85-8.00(m，1H)，8.53-8.60(m，1H)。
实施例10
Z-N-Me-Val-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，0.765(d，3H，J=7)，0.832(d，3H，J=7)，2.06(m，1H)，2.57-2.85(m，5H)，4.21(m，1H)，4.63(m，1H)，5.02-5.18(m，4H)，7.337(s，5H)，8.850(m，1H)。
实施例11
Z-β-Ala-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，2.30(t，2H，J=7)，2.48-2.70(m，3H，)，3.17(m，2H)，4.41-4.60(m，2H)，4.98-5.30(m，3H)，5.40(m，1H)，6.63(m，1H)，7.32(s，5H)，8.52(m，1H)。
实施例12
Z-Gly-Asp-fmk
白色固体化合物。1HNMR(DMSO-d6)，12.50(s，1H，)，8.49(m，1H，)，7.52(m，1H)，7.33(s，5H)，5.08-5.25(m，1H)，5.01(s，2H)，4.10(m，1H)，3.63(d，J=6.0 Hz，2H)，2.50-2.80(m，2H)。
实施例13
Z-Phe-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，8.60(m，1H，)，7.60(m，1H，)，7.24-7.30(m，10H)，4.92(m，3H)，4.60(m，1H)，4.28(m，1H)，2.90(m，2H)，2.70(m，2H)。
实施例14
Z-Glu-Asp-fmk白色固体化合物。1H NMR(DMSO-d6)，12.20(m，1H，)，8.48(m，1H，)，7.56(m，1H)，7.34(m，5H)，5.12(m，1H)，5.01(s，2H)，4.51(m，1H)，3.95(m，1H)，2.71(m，2H)，2.24(m，2H)，1.72-1.82(m，2H)。
实施例15
Z-Pro-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(CD3OD)，7.36-7.33(m，5H，)，5.13-5.11(m，2H，)，4.30(s，1H)，3.58-3.50(m，2H)，2.77-2.64(m，2H)，2.24(m，1H)，1.94(s，2H)。
实施例16
Z-His-Asp-fmk
白色固体化合物。1H NMR(CD3OD)，8.78(s，1H，)，7.93(s，1H，)，7.36-7.33(m，7H)，5.52(s，2H)，5.10(s，2H)，4.49(s，1H)，3.13-3.05(m，2H)，2.84(s，2H)。
实施例17
Z-Val-Asp-fmk甲酯
Z-Val-Asp-fmk(110毫克，0.28毫摩尔)的甲醇溶液(20毫升)在冰浴中冷却，缓慢通氯化氢气体，直至溶液变成强酸性。此溶液在室温下搅拌4小时，蒸馏。残留物用硅胶色谱(己烷∶EtOAc，3∶2)纯化，得白色固体化合物63毫克(55％)。1HNMR(CHCl3)，0.91-0.87(m，6H)，2.10-2.20(m，1H，)，2.81-2.88(m，1H)，3.02-3.08(m，1H)，3.675和3.682(2S，3H)，3.97-4.01(m，1H)，4.90-5.25(m，6H)，6.94-7.02(m，1H)，7.354(s，5H)。下述化合物可采用与例17相同的方法合成。
实施例18
Z-Leu-Asp-fmk甲酯
无色粘稠油状物。1H NMR(CDCl3)，0.92-0.94(m，6H)，1.25-1.80(m，4H)，2.78-2.82(m，1H)，3.00-3.05(m，1H)，3.675(s，3H)，4.15-4.20(m，1H)，4.85-5.10(m，6H)，7.10-7.20(m，1H)，7.344(s，5H)。
实施例19
Z-Ile-Asp-fmk甲酯
白色固体化合物。1H NMR(CDCl3)，0.85-0.96(m，6H)，1.14(m，1H)，1.46(s，1H)，1.87(m，1H)，1.91-2.86(m，1H)，2.88-3.02(m，1H)，3.257(s，3H)，4.68-4.06(m，1H)，4.80-5.30(s，6H)，6.99(m，1H)，7.35(s，5H)。
实施例20
Jurkat细胞的聚(ADP)戊糖聚合酶(PARP)裂解抑制作用
聚(ADP)戊糖聚合酶(PARP)的裂解现象发生于所有细胞的半胱氨酸蛋白酶级联激活通路中。因此，PARP裂解现象常作为半胱氨酸蛋白酶介导凋亡的一个生化标记。细胞保护剂减少PARP的裂解现象可以代表此药抑制半胱氨酸蛋白酶的水解能力，特别是抑制CPP32(半胱氨酸蛋白酶-3，主要的PARP裂解酶)的水解作用。Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F抑制PARP裂解的作用可用人T细胞系Jurkat细胞Fas介导的凋亡实验来检测。已知这一细胞凋亡模型至少有两种半胱氨酸蛋白酶参与：半胱氨酸蛋白酶-3(CPP32)和半胱氨酸蛋白酶-8。
在PARP的裂解解反应中，Jurkat细胞用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基种于6孔板中，密度500，000个/孔。培养基中加入Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F或其它待测药，37℃，CO2孵箱孵育2小时，再加入抗Fas单克隆抗体至终浓度500纳克/毫升。37℃，CO2孵箱再孵育4小时。细胞收集、离心，溶解于含有50毫摩尔/升Tris-HCl，pH7.4，150毫摩尔/升NaCl，1％NP-40，0.25％去氧胆酸钠，1毫摩尔/升EDTA及蛋白酶抑制剂的缓冲液中。用10-20微克蛋白进行7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳2-2.5小时，25 mA。将蛋白转到一PVDF膜上，以标有可见化学发光物的兔PARP多克隆抗体为探针进行杂交。图1是杂交反应的结果。
Jurkat细胞用0.5、5、50微摩尔/升的下述待测物孵育：Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物1)、BOC-Asp(OMe)-CH2F(化合物5)、Cbz-Asp-α-([2，6-dichlorobenzoyloxy]-methyl ketone)(化合物6)、Cbz-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物3)、Cbz-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物2)、Cbz-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-CH2F(化合物4)或Cbz-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F(化合物7)。随后，细胞中分别加入抗Fas抗体，Westem印迹杂交。Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物1)在50和5微摩尔/升时能完全抑制PARP裂解，甚至在0.5微摩尔/升时也有较强抑制能力。与之相反，Cbz-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物2)Cbz-Ile-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-CH2F(化合物4)和Cbz-Asp-DCB(化合物6)在50微摩尔/升时对PARP的裂解才有完全抑制作用，而在0.5、5微摩尔/升时作用很弱。BOC-Asp(OMe)-CH2F(化合物5)、Cbz-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F(化合物7)和Cbz-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物3)在5、50微摩尔/升时对PARP的裂解有完全抑制作用，而在0.5微摩尔/升时作用很弱，而在相同浓度下Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F(化合物1)仍有较强抑制作用。上述实验证明在完整细胞中Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F抑制半胱氨酸蛋白酶蛋白酶级联所需浓度要比其它已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂低10倍。
实施例21
酶活性测定
Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F及其游离酸Cbz-Val-Asp-CH2F作为CPP32、ICE、cathepsin B的抑制剂，其活性由荧光分光光度计酶活性方法测定。在昆虫宿主细胞(sf9细胞)中，以杆状病毒为载体表达含有目的基因的蛋白，从而得到CPP32及ICE两种重组蛋白。参照Wdbb，N.R.等，“Expression of proteins using recombinant Baculovirus”Techniques 2：173-188(1990)。酶活性的测定是用连有荧光离去基团的合成肽为底物。酶活性大小是用荧光强度的高低表示，即酶将合成底物水解，使之产生荧光信号，从而在荧光光度计或在酶标仪上读取荧光强度。
CPP32活性测定的缓冲液由100毫摩尔/升含有10％蔗糖的HEPES pH 7.5，1％CHAPS，5毫摩尔/升谷胱甘肽，5μM肽底物组成。肽底物包括一寡聚物，其序列为Asp-Glu-Val-Asp，其C末端连有一荧光化合物胺甲基香豆素。实验多在37℃，孵育30分钟。
表1给出了Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F和Cbz-Val-Asp-CH2F(游离酸)对CPP32和其它蛋白酶抑制的IC50。
表1 Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F和Cbz-Val-Asp-CH2F(游离酸)
对CPP32和其它蛋白酶抑制的IC50
| 酶 | Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2FIC50(μM) | Cbz-Val-Asp-CH2F(游离酸)IC50(μM) |
| CPP32ICE组织蛋白酶B因子Xa凝血酶 | 1.10.90.3>100>100 | 0.0430.02>10>100>100 |
表1的结果表明目前这些化合物对CPP32、ICE的抑制能力较好，也表明Cbz-Val-Asp-CH2F是一有效的、选择性的CPP32、ICE抑制剂。
Cbz-Val-Asp-CH2F对重组半胱氨酸蛋白酶3、6、7、8(来源于PharMington，a Becton divisioncompany，San Diego，CA)的抑制能力是用Ac-DEVD-AMC测定的。每次实验所用酶量如下：1纳克半胱氨酸蛋白酶3，15纳克半胱氨酸蛋白酶6，2 ng半胱氨酸蛋白酶7，60纳克半胱氨酸蛋白酶8。反应在96孔板中进行，反应半胱氨酸蛋白酶缓冲液(20毫摩尔/升PIPES，100毫摩尔/升NaCl，10毫摩尔/升DTT，1毫摩尔/升EDTA，0.1％CHAPS，10％蔗糖，pH 7.2)，当加入10 μM Ac-DEVD-AMC(购于Quality Controlled Biochemicals，Inc.Hopkinton，MA)时反应开始。Cbz-Val-Asp-CH2F分成从30 pM-10μM 12个浓度梯度，并与重组半胱氨酸蛋白酶于37℃孵育30分钟。酶标仪中读取数据(激发波长355 nm，发射波长460 nm)。数据用GraphPrism软件分析，总结于表2。
表2.Cbz-Val-Asp-CHaF作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的效能
| 半胱氨酸蛋白酶-3 | 半胱氨酸蛋白酶-6 | 半胱氨酸蛋白酶-7 | 半胱氨酸蛋白酶-8 | |
| IC50(nM) | 19.8 | 18.4 | 6.8 | 7.2 |
表2结果表明Cbz-Val-Asp-CH2F是已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂中抑制能力最强的化合物。
表3给出了多种合成的二肽抑制剂对半胱氨酸蛋白酶-3抑制的IC50。结果表明Z-Val-Asp-CH2F在所有被测化合物中作用最强。
表3.二肽抑制剂对半胱氨酸蛋白酶-3抑制的IC50
化合物 半胱氨酸蛋白酶-3 IC50Z-L-Val-Asp-fmk 0.04Z-L-Leu-Asp-fmk 0.2Z-L-Ile-Asp-fmk 0.7Z-L-Phe-Asp-fmk 0.4Z-Gly-Asp-fmk 1.9Z-L-Ala-Asp-fmk 0.6Z-β-Ala-Asp-fmk 3.5Ac-L-Val-Asp-fmk 0.25Z-L-Glu-Asp-fmk 14.2Z-L-Lys-Asp-fmk.TFA 1.6Z-N-Me-L-Val-Asp-fmk 1.3Z-L-Pro-Asp-fmk 0.41Z-L-His-Asp-fmk 0.77
实施例22
Cbz-Val-Asp-CH2F在小鼠肝凋亡模型中的抗凋亡活性
Rodriguez的小鼠肝细胞凋亡模型可用于测定凋亡抑制剂的体内活性。在这个模型中，小鼠静脉注射抗Fas抗体可以迅速引起肝和其它器官的大面积细胞凋亡，导致器官衰竭和死亡。这个模型可以很好的测定凋亡抑制剂的效能。
Cbz-Val-Asp-CH2F对静脉注射Fas抗体诱导的小鼠死亡具有保护作用。用雌性SwissWebster小鼠，16-20克，进行实验。用80μl PBS溶解6微克纯化的仓鼠抗小鼠Fas抗体，静脉注射，诱导细胞凋亡。
Cbz-Val-Asp-CH2F溶解于50毫摩尔/升Tris中，用HCl调pH至8.5，浓度范围0.25-10毫克/千克，注射时1-2.5μl/克体重。小鼠共分5组，每组6-8只，每只小鼠注射6微克Fas抗体。抗体注射5分钟后，注射Tris缓冲液为对照或含有0.25、0.5、1、10毫克/千克Cbz-
Val-Asp-CH2F的Tris缓冲液。3小时后，计算成活率。
表4给出了给予不同浓度的Cbz-Val-Asp-CH2F后小鼠的成活率。
表4给予不同浓度的Cbz-Val-Asp-CH2F后小鼠的存活率。
(％) 对照 0.25毫克/ 0.5毫克/ 1毫克/ 10毫克/
千克/i.v. 千克/i.v. 千克/i.v. 千克/i.v.
1小时 0 100 88 100 100
3小时 - 25 28 29 100
表4结果表明Cbz-Val-Asp-CH2F在很大浓度范围内对Fas诱导的凋亡都有很强的抑制作用。1毫克/千克能完全保护小鼠注射Fas抗体1小时后的致死性，甚至在0.25毫克/千克时仍有100％的保护作用。与之相反，对照组在注射抗体1小时后小鼠均死亡。Cbz-Val-Asp-CH2F在24小时后仍有相当的保护作用(存活率28％)。
同时我们观察了Fas诱导肝细胞凋亡后血清中肝药酶浓度及Cbz-Val-Asp-CH2F对肝药酶水平的抑制作用。小鼠注射Fas抗体(2微克)，随后静脉注射Cbz-Val-Asp-CH2F，或溶剂作为对照。3小时后，小鼠用3％的氟烷麻醉，从眼中取血用于血清酶含量测定。实验结果表明Fas抗体注射后血清中SGOT和SGPT水平比正常动物高几千倍(以Tris缓冲液为对照)。加入所示的各种剂量抑制剂后，抑制了SGOT和SGPT水平的增高，即Cbz-Val-Asp-CH2F在保护肝细胞的同时提高了小鼠的成活率。这种结果提示降低肝药酶SPGT和SGOT的水平与Cbz-Val-Asp-CH2F的保护作用可能是有关部门的。
以上实验结果证明，小鼠肝细胞凋亡模型中，Cbz-Val-Asp-CH2F在体内具有很好的疗效。
实施例23
大鼠局部脑缺血模型中Cbz-Val-Asp-CH2F的神经保护作用1)手术准备：雄性Fischer-344大鼠，重200-240克。手术前用含有3％氟烷的30％氧气和
70％空气的混合气体麻醉动物。手术过程中氟烷水平降至1.5％。手术包括以下几个内容：
(a)静脉导管的植入：从左股静脉插入一灌有溶剂的导管直至下腔静脉，此导管用于给药。
(b)动脉导管的植入：股动脉插入一导管用于测量缺血、给药、动脉再灌时的血压和其它
生理指标，如pO2、pCO2、pH、血糖、血细胞比容。动、静脉导管均应固定于背部以免
影响动物运动。(c)腹腔内植入一温度传感器测量大鼠体温。2)生理参数：手术过程中使大鼠体温维持在37.5℃。缺血后，用温度传感器每5分钟测定一次体温。手术过程中，静脉给药后，缺血1、2、3、4h后测定动物血压。其它生理指标如pO2、pCO2、pH、血糖、血细胞比容在动脉栓塞和再灌时测定。3)暂时局部缺血模型：手术准备之后，作一个颈部前正中切口以暴露双侧的颈总动脉。右侧颈总动脉用4-o丝质结扎线永久结扎，而左侧颈总动脉用无创性的动脉钳夹住。在右眼外眦和外耳道连线的中点，作一个垂直于此连线的1cm长的切口。切除其下的颞肌，利用解剖显微镜，在直视下，于颧弓与鳞骨融合处的嘴侧2-3毫米处钻孔，暴露大脑中动脉。钻孔是在持续生理盐水灌注下完成的。切开硬膜，于鼻缝处暴露大脑中动脉。在大脑中动脉跨过鼻缝时，用一个科德曼氏微动脉钳(1号)暂时夹闭它。在解剖显微镜下，证实灌流阻断。钳闭切口，结束麻醉，待动物苏醒后数分钟内将其放入笼中。在夹闭大脑中动脉2.5小时后，将这些处于暂时缺血状态的大鼠再次麻醉。在证实大脑中动脉确实阻断以后，移去大脑中动脉与左颈总动脉上的手术钳，可见大脑中动脉的血流再灌注。关闭切口，返回大鼠笼中。需短期恢复的大鼠被允许存活24小时。所有动物均被深度麻醉至易于死亡的状态。移出脑，作2毫米厚的冠状面切片，并置于TTC中。梗死组织是苍白色的，与相邻的存活组织有显著不同。皮质和皮质下层组织的梗死面积是用成像软件分析的，而梗死的体积是将各层面的测量值乘以已知厚度并相加而计算出的。4)统计分析：每个剂量组的实验组和对照组的所有生理参数、体温和皮质梗塞体积均进行统计分析。统计时选用Sigmastat软件。非配对数据用Student的t检验，多组间比较选用ANOVA方差分析。p值＜0.05具有显著性意义。用SigmaPlot v 2.01软件做图。
Cbz-Val-Asp-CH2F的神经保护作用是用两种Fischer-344大鼠暂时缺血模型进行实验的。大鼠缺血10分钟后，给予Cbz-Val-Asp-CH2F 20毫克/千克，随后连续输注，5毫克/千克/小时。实验1中连续输注6小时，而在实验2中连续输注12小时。
两组实验中均发现Cbz-Val-Asp-CH2F能显著减小皮质梗塞体积：图2和图3分别给出实验1和实验2的结果。由图2可知，连续输注Cbz-Val-Asp-CH2F 6小时使皮质梗塞体积减少46％(p＜0.05)；而由图3可知，连续输注12小时可使皮质梗塞体积减小57％(p＜0.05)。在给药过程中血压、血气或体温均没有显著变化。以上实验结果表明Cbz- Val-Asp-CH2F具有很好的耐受性，对大鼠的暂时局部大脑缺血具有保护作用。
实施例24 Cbz-Val-Asp-CH2F的急性毒性试验
将大鼠分为三组，其中两组分别静脉注射5毫克/千克/天、20毫克/千克/天(在小鼠肝炎模型中，静脉注射20毫克/千克的剂量至少是最低有效剂量的20倍)的Cbz-Val-Asp-CH2F，一组为溶剂对照。连续注射14天，动物处死，分析血中化学组成、酶、血细胞等变化，用组织病理学方法研究机体器官的形态改变。
经过以上几个方面的毒理学研究，在血浆中最高药物浓度达＞50微克/毫升的条件下，给药组和对照组的任一参数均未发现病理学改变。
基于上述研究结果，Cbz-Val-Asp-CH2F目前已知的肽类半胱氨酸蛋白酶抑制剂中最安全的药物之一。
Claims (11)
1．一种具有下述通式Ⅰ的二肽化合物、其可药用的盐或酯其中：R1是N末端保护基；
AA是除His、Tyr、Pro、Phe以外的任何天然或非天然α-或β-氨基酸残
基；
R2是H或CH2R4，R4是选自F、Cl、TsO-、MeO-、ArO-、ArN-、ArS-的电
负性基团；
R3是C1-10的烷基或H。
2．根据权利要求1所述的二肽化合物、其可药用的盐或酯，其中R1是叔-丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)、苄氧羰基(benzyloxycarbonyl)或乙酰基。
3．根据权利要求1所述的二肽化合物、其可药用的盐或酯，其中AA是Gly、Thr、Glu、Lys、Arg、Ser、Asn、Gln、Val、Ala、Leu、Ile、Met或β-Ala。
4．根据权利要求1所述的二肽化合物、其可药用的盐或酯，其中R2是H或CH2F。
5．根据权利要求1所述的二肽化合物、其可药用的盐或酯，其中R3是C1-6的烷基或H。
6．根据权利要求1-5所述的二肽化合物、其可药用的盐或酯，其为下列化合物中的一种，Boc-Ala-Asp-CH2F，Boc-Val-Asp-CH2F，Boc-Leu-Asp-CH2F，Ac-Ile-Asp-CH2F，Ac-Met-Asp-CH2F，Cbz-Val-Asp-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp-CH2F，Cbz-Leu-Asp-CH2F，Cbz-Ile-Asp-CH2F，Boc-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Val-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Leu-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Val-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Ile-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Met-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Leu-Asp(OMe)-CH2F和Cbz-Ile-Asp(OMe)-CH2F。
7．用于治疗和预防细胞凋亡的药物组合物，其中含有治疗有效剂量的如权利要求1-6中的任何一项二肽化合物和药学上可接受的载体。
8．权利要求1-6中的任何一项的二肽化合物在制备细胞凋亡药物中的应用。
9．根据权利要求8所述的二肽化合物的应用，用于制各治疗或改善中枢神经系统局部缺血性疾病中的细胞凋亡药物。
10．根据权利要求8所述的二肽化合物的应用，用于制备治疗或改善由于特异基因一端三核苷酸重复引起的疾病的细胞凋亡药物。
11．根据权利要求8所述的二肽化合物的应用，用于制备治疗或改善与细胞凋亡有关的肝脏坏死性疾病的细胞凋亡药物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |