CN1284852C - 一种莲藕组织总rna的快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莲藕组织总RNA的快速提取方法。其步骤是：首先是对实验药品的配制及实验用品的处理；其次是取材，取莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄；第三是抽提，沉淀，离心得到总RNA；第四是总RNA的鉴定，分别用紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。根据所得数据及电泳结果，表明所得莲藕组织总RNA完整性好、纯度高并且产率高。本发明实验过程简便，操作方便、安全，结果准确、有效，重复性好，该方法也适用于富含多糖、多酚的其它物种的植物组织总RNA的提取。
Description
技术领域：
本发明涉及莲藕的基因克隆、基因功能及转基因莲藕等分子生物学实验，更具体涉及一种莲藕组织总RNA的快速提取方法，适用于莲藕等富含多糖、酚类化合物植物组织总RNA的提取。
背景技术：
莲藕是一种重要的水生经济作物，不仅可以食用，而且也是重要的观赏花卉和中草药，对它的研究已经引起人们的广泛重视。就莲藕遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态方面进行的研究，近期的研究主要是运用分子生物学的方法对其进行分子方面的研究。
植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。只有分离得到纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于Northern杂交、mRNA纯化、构建cDNA文库、通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。常用的植物组织总RNA提取方法有胍法、苯酚法、Tris-硼酸法、CTAB法、TRIzol试剂盒法等，这些方法已被广泛用于许多植物组织总RNA的提取，但有一些植物组织中内含物极为复杂，尤其是在富含多糖、酚类物质、脂肪及一些尚未能确定的次生代谢物质等情况下，不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除或抑制多糖、酚类等代谢物质的干扰是提取高质量植物RNA的成败的关键。
一般认为在某些植物组织中，或富含多糖，或富含酚类化合物，或含有某些尚无法确定的次生代谢物质，或RNase活性较高等。在完整的细胞内这些物质在空间上与RNA是隔离的，但当组织被研磨时，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。多糖形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；而酚类化合物极易被氧化为褐色物质，然后与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而分离过程中漂浮的脂肪层也不利于RNA溶液的吸取。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种莲藕组织总RNA的快速提取方法，实验过程简便，操作方便、安全，实验结果准确、有效。该方法是进行莲藕基因的克隆及功能研究、CDNA文库的构建、蛋白质体外翻译、转基因莲藕的研究等分子生物学实验的基础。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明提出的方法有如下步骤：
1.实验药品的配制与实验用品的处理：
实验药品的配制：配制RNA提取缓冲液、10M LiCl、3M NaAc、“氯仿∶异戊醇(24∶1)”等。溶液用0.1％DEPC-H2O或RNase-free-H2O配制。
实验用品的处理：器皿高温(180-200℃)连续烘烤8-12小时或用0.1％DEPC-H2O浸泡过夜后120-130℃灭菌30-60分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜。
2.取材：
莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄。
3.提取总RNA：
磨样：取新鲜材料于研钵中加入缓冲液后迅速研磨。
抽提：用“氯仿∶异戊醇(24∶1)”抽提2-3次。
沉淀：加入10M LiCl，使RNA沉淀。
清洗与保存：清洗RNA沉淀后，于-80℃～-70℃保存。
4、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定：
用两种方法检测：紫外吸收光谱检测、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
按常规方法，异硫氰酸胍、TRIzol试剂盒等(用异丙醇沉淀RNA)不能有效地排除多糖干扰，RNA沉淀所获得的沉淀物体积大，并且难溶于水，这说明异丙醇沉淀RNA时导致了多糖、酚类物质的共沉淀。本实验通过提高盐离子浓度，如缓冲液中加入高浓度的NaCl，抽提前又加入3M的NaAc，增加了Na+浓度，减少了多糖的干扰。还有“氯仿∶异戊醇(24∶1)”的反复抽提去除多糖。
β-ME不仅能打开蛋白酶的二硫键使酶失活，从而抑制酚类氧化酶和RNase的活性，也能与酚类竞争性氧化，有抗氧化作用。适当提高β-ME在提取缓冲液的终浓度，效果更好。而PVPK30中的CO＝N有很强的结合酚类化合物的能力，与其形成稳定的复合物，使之在以后的抽提步骤中被除去，缓冲液中同时使用还原剂β-ME和螯合剂PVPK30，有效地降低了酚类物质的影响。
CTAB是一种较强的去污剂，使蛋白变性的效果明显强于SDS，缓冲液中加入EDTA，能螯合Mg2+等金属离子，从而抑制各类酶的活性。Li+可将未被氧化的酚类化合物去除，也能将部分多糖留在上清液中，使RNA更易沉淀。
该方法与已有的提取方法相比，操作步骤简单，提取成本低，重复性好，适用性广，能快速获得高质量、高纯度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础。同时，该方法还可用于富含多糖、酚类物质和脂肪的其它物种的植物组织总RNA的提取。
附图说明：
图1为用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测莲藕的两种组织中总RNA，电泳后，用AlphalmagerTM2200成像系统拍照所记录的实验结果。
具体实施方式：
1、实验药品的配制与实验用品的处理：
(1)、实验药品的配制：
RNA提取缓冲液：2％CTAB(w/v)，2-5％PVPK30(w/v)，100mMTris-Cl(PH8.0)，25mM EDTA(PH8.0)，2M NaCl，2-5％β-ME(用时加入)
10M LiCl (用0.1％DEPC-H2O处理)
3M NaAc(PH5.2) (用0.1％DEPC-H2O处理)
96％乙醇 (用DEPC处理过的RNase-free的H2O配制)
75％乙醇 (用DEPC处理过的RNase-free的H2O配制)
“氯仿∶异戊醇(24∶1)”
(2)、实验用品的处理：
RNA提取中所有的溶液除含Tris外，均用0.1％DEPC-H2O配制，于37C温浴12小时，并经125℃灭菌30分钟；含Tris的溶液则用DEPC处理过的RNase-free的H2O，经高压灭菌后直接配制。玻璃、陶器、金属等能经高温的器皿则于180℃连续烘烤8-12小时，塑料离心管、枪头等均用0.1％DEPC-H2O浸泡过夜后125℃灭菌30分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜。
2、取材：
取温室盆栽莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄。
3、抽提，沉淀，离心得到总RNA：
(1)、磨样：RNA提取缓冲液于65℃水浴锅中温浴30分钟以上，然后在缓冲液中加入2-5％β-ME，立即取新鲜材料于研钵中快速研磨(一般0.1g新鲜材料/1mL缓冲液)。
(2)、抽提：把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，继续在65℃温浴10分钟后，加入等体积“氯仿∶异戊醇(24∶1)”，混匀，盖上盖子，上下剧烈摇动15秒，然后于4℃，12000g，离心10分钟，小心吸取上清液至一新的离心管，重复上述抽提步骤2-3次。
(3)、沉淀：取上清，加入1/4体积的10M LiCl溶液并混匀，4℃条件下过夜，或-20℃条件下放置6小时以上，使RNA沉淀，于4℃，12000g，离心20分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀，加入DEPC处理过的RNase-free的H2O重新溶解RNA，再加入1/10体积的3M NaAc，2.5体积的96％乙醇，置于-70C，30分钟，使RNA沉淀。
(4)、清洗与保存：于4℃，12000g，再次离心20分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，空气中干燥后加入DEPC处理过的RNase-free的H2O溶解RNA，保存于-70℃备用(也可直接用无水乙醇保存)。
4、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定：
(1)、紫外吸收光谱检测：用eppendorf Biophotometer紫外分光光度计测定所抽提RNA样品的A260、A280值。
(2)、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测：采用1.0％甲醛变性琼脂糖凝胶，6v/cm电压，电泳1-2小时。电泳结束后，用AlphalmagerTM2200成像系统拍照记录实验结果。
Claims (1)
1、一种莲藕组织总RNA的快速提取方法，它包括下列步骤：
A、实验药品的配制：
配制RNA提取缓冲液：2％CTAB、2-5％PVPK30、100mM Tris-Cl、25mMEDTA、2M NaCl、2-5％β-ME；
配制10M LiCl、3M NaAc、体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，溶液用0.1％DEPC-H2O或RNase-free-H2O配制；
B、实验用品的处理：器皿用高温180-200℃连续烘烤8-12小时或用0.1％DEPC-H2O浸泡过夜后120-130℃灭菌30-60分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜；
C、取材：莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄；
D、提取总RNA：
首先是磨样：将RNA提取缓冲液于65℃水浴锅中温浴30分钟，然后在缓冲液中加入2-5％β-ME，取新鲜材料于研钵中研磨；
其次是抽提：把研磨好的匀浆液移入离心管中，继续在65℃温浴10分钟后，加入等体积的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀，盖上盖子，上下摇动15秒，然后于4℃，12000g离心10分钟，吸取上清液至离心管，重复上述抽提步骤2-3次；
第三是沉淀：取上清液，加入1/4体积的10M LiCl溶液并混匀，4℃条件下过夜，使RNA沉淀；于4℃，12000g，离心20分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀；加入DEPC处理过的RNase-free的H2O重新溶解RNA，再加入1/10体积的3M NaAc，2.5体积的96％乙醇，置于-70℃，30分钟，使RNA沉淀；
第四是清洗与保存：于4℃，12000g，再次离心20分钟，弃上清，用70％乙醇清洗RNA沉淀后，于-80℃～-70℃保存。
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