CN1274421A

CN1274421A - 生物传感器

Info

Publication number: CN1274421A
Application number: CN 99801245
Authority: CN
Inventors: 上甲茂树
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2000-11-22
Also published as: JP2000046782A; WO2000007003A1

Abstract

本发明的生物传感器如图1所示,在该生物传感器的试剂部分10是滴下含生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂、氧化还原酶、介体混合的溶液,干燥而形成的。如此构造的生物传感器,能够抑制试剂部分的厚度、提高其上承载的氧化还原酶、介体和电极4、5表面的接触紧密性,防止氧化还原酶和介体从检测部分9表面剥离和脱落。更进一步,上述添加剂因不具有氧化还原催化能力,对于酶和化学性氧化还原反应能够特异性地测定检测样品。其结果是显著提高传感器响应性能和响应重现性,使可信性高的生物传感器的实现成为可能。

Description

生物传感器

技术范围

本发明涉及所谓的电极型生物传感器，特别涉及为了提高特异性定性或定量检测样品中成分时的响应性和重现性，加检测样品的试剂部分改善了的生物传感器。

背景技术

近年来，生物传感器的开发，使检测样品无需稀释，直接给予传感器的简便检测系统成为可能。下面就以前的生物传感器技术，以葡萄糖测定为例子进行说明。

以往，作为葡萄糖的测定方法，开发了作为氧化葡萄糖的酶葡萄糖氧化酶(下面简称GOD)和氧电极或过氧化氢电极组合的生物传感器。β-D-葡萄糖和GOD反应生成δ-葡萄糖酸内酯时，氧作为电子受体生成过氧化氢。因此，在上述生物传感器中，用氧电极测定酶反应时的氧消耗量，或用过氧化氢电极测定过氧化氢生成量，即可进行葡萄糖的测定。

但是，在上述葡萄糖测定方法中，用氧电极或过氧化氢电极进行以电极方式进行测定时，强烈依赖于检测样品中溶解的氧浓度，而不能稳定地进行测定。

所以，为了解决上述问题，在上述葡萄糖测定中，不测定酶反应时的氧消耗量或过氧化氢生成量，用可以检测酶反应本身的酶反应检测试剂(下面称为介体)进行检测。其结果是，具有上述介体的生物传感器，不受溶解的氧的影响，而能够正确地测定出葡萄糖。

图1表示用介体制成的电极型生物传感器的结构。

上述生物传感器如图1(a)所示，由在绝缘性基板1上与引线2连接的测定电极(作用电极)4和与引线3连接的电极5的电极系统的检测部分9构成。此外，在上述电极系统检测部分9上，如图1(b)所示，具有由氧化还原酶和介体组成的试剂部分10。检测样品的定性或定量是从上述试剂部分10给予检测样品，然后在上述电极系统检测部分9进行测定。这样，检测样品用葡萄糖时，作为上述氧化还原酶，例如使用GOD，此外，作为介体，例如使用铁氰化钾。还有，图1(a)中，6规定了两电极4、5露出部分的面积，且两电极4、5和引线2、3的不需要部分覆盖绝缘层，7为分离层、8为盖。

上述生物传感器在酶反应时，介体的铁氰化钾作作为电子受体被消耗，此铁氰化钾的消耗量通过检测部分9的电极4、5，从引线2、3检出的电流值测得，从而可进行葡萄糖的测定。

因此，上述结构的生物传感器，具有氧化还原酶和介体时，构成检测部分9的电极4、5和试剂部分10的接触性、以及试剂部分10的均一溶解性对生物传感器的性能有很大的影响。下面，就上述生物传感器，对介体浓度和传感器应答特性的关系进行讨论。

图4为表示根据上述结构制成的葡萄糖测定用生物传感器依赖于介体浓度的传感器响应性能的图。纵轴表示各浓度的介体(铁氰化钾)作为电子受体消耗量检测出的电流值，横轴表示检测样品的葡萄糖浓度。此外，图5为表示在上述生物传感器中，依赖于介体浓度的试剂部分厚度和传感器响应重现性的图。纵轴的折线图表示试剂部分10的厚度，纵轴的直方图表示作为传感器响应重现性指标的传感器响应的变化系数(下面称为CV)。此外，横轴表示介体(铁氰化钾)的浓度。

在上述生物传感器中，试剂部分10为了支承作为氧化还原酶的GOD和作为介体的铁氰化钾，将它们的混合液5微升(以下称为μl)滴在电极4、5表面上，干燥形成。

首先，图4表示，氧化还原酶(GOD)浓度以200单位/毫升(下面称为U/ml)固定，介体(铁氰化钾)浓度任意增加时和检测出葡萄糖浓度的关系。根据图4，介体浓度为25毫摩尔/升(以下简称mM)时，相关系数(r)为0.9831，如果介体浓度增加到150mM，则相关系数改善为0.9931。即，介体浓度增加时，伴随着传感器响应灵敏度的增加，葡萄糖浓度和电流值的线性相关性增加。

但是，根据图5，如果介体(铁氰化钾)浓度增加，则试剂部分10的厚度也增加。即，试剂部分10因产生隆起和凹凸化，其结果是使试剂部分10和电极4、5的接触紧密性降低。特别是介体浓度超过50mM时此现象显著(参照图中以●为节点的折线图)。此外，CV值如图中直方图所示，介体浓度为125mM以下则有5～10％程度的不稳定。更进一步，在如图4所示的传感器响应的线性相关性良好的介体浓度150mM下，CV值增加至近25％，传感器的可信性变得很差。

综上所述，对于试剂部分10，介体高浓度配比时，传感器响应性良好，但伴随着该试剂部分10的隆起或凹凸的是电极4、5的接触紧密性降低、以及局部溶解不良，从而产生使传感器性能显著降低的问题。

更进一步，试剂部分10的接触紧密性的不良化，在传感器的制作、使用、或保存期间等时候，造成试剂部分10中的氧化还原酶和介体从电极4、5表面剥离，从而使校正的试剂量产生很大的误差，使传感器响应特性显著降低。

所以，为了使生物传感器的响应性和重现性稳定化，本发明的目的在于提供抑制试剂部分的隆起和凹凸化、试剂部分上承载的氧化还原酶和介体与电极表面接触紧密性高的生物传感器。

发明的公开

根据本发明(第1项)的生物传感器，是在绝缘性基板上形成具有作用电极和参比电极的电极系统的检测部分，在此电极系统检测部分上混合氧化还原酶和酶反应检测试剂形成试剂部分，在用上述电极系统检测部分对此试剂部分上给予的检测样品进行定性或定量检测的生物传感器，其特征在于，上述试剂部分中具有包含生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂。

如此构成的生物传感器，因在上述试剂部分中，混合了含生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂，此添加剂为凝聚力很大的高分子物质，能够接触紧密性良好地承载试剂部分中的氧化还原酶和酶反应检测试剂(介体)。所以，依靠此添加剂的凝聚作用，能够抑制试剂部分中的介体浓度所致的隆起和凹凸化，使承载试剂部分的检测部分的接触紧密性升高，能够防止氧化还原酶和介体从检测部分表面剥离和脱落。其结果是具有使传感器响应性能和重现性能显著提高的效果。

本发明(第2项)的特征在于，在根据第1项记载的生物传感器中，含有上述添加剂的生物高分子蛋白质或其衍生物为不具有氧化还原催化能力的物质。

如此构成的生物传感器，作为含有上述添加剂的生物高分子蛋白质或其衍生物，因为是不具有氧化还原催化能力的物质，不会因酶和化学的氧化还原反应使检测样品的非特定成分产生氧化还原反应，所以能够只检测和特定成分反应的传感器应答。其结果是能够特异性地测定检测样品。

本发明(第3项)的特征在于，在根据权利要求1记载的生物传感器中，作为上述添加剂，使用明胶、胶原、弹性蛋白、酪蛋白、蛋白胨或它们的衍生物，或者它们的任意组合的混合物。

如此构成的生物传感器，作为添加剂，使用各种生物高分子蛋白质或其衍生物、或者它们任意组合的混合物，因此添加剂为凝聚力很大的高分子物质，能够接触紧密性良好地承载试剂部分中的氧化还原酶和酶反应检测试剂(介体)。所以，应用此添加剂的凝聚作用，能够抑制试剂部分中因介体浓度所致的隆起和凹凸化，提高承载试剂部分的检测部分的接触紧密性，防止氧化还原酶和介体从检测部位表面剥离和脱落。其结果具有显著提高传感器响应性能和重现性的效果。

附图的简要说明

图1为电极型生物传感器的结构图，图1(a)为该电极型生物传感器的分解斜视图，图1(b)为构成该电极型生物传感器的检测部分的侧面图。

图2表示在根据本发明实施方案的电极型生物传感器中，试剂部分混合明胶的试剂部分厚度和传感器的响应重现性。

图3表示在根据上述发明实施方案的电极型生物传感器中，试剂部分中混合明胶的传感器的响应线性相关性。

图4表示在以往的电极型生物传感器中，依赖于介体浓度传感器响应性能。

图5表示在以往的电极型生物传感器中，依赖于介体浓度试剂部分厚度和传感器的响应重现性。

发明实施的最佳形式

下面就本发明的实施方案用图1进行说明。实施的形式

根据本发明实施方案的生物传感器，如图1所示，它和根据以往技术的有大致相同的构成，但在其试剂部分10中，具有包含生物高分子的蛋白质或其衍生物的添加剂。

作为含上述添加剂的生物高分子或其衍生物，优选使用没有氧化还原催化能力的物质，例如使用明胶、胶原、弹性蛋白、酪蛋白、蛋白胨或它们的衍生物、或者它们任意组合的混合物。

此外，作为试剂部分中所含的氧化还原酶，例如有葡萄糖氧化酶(GOD)、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、脲氧化酶、半乳糖氧化酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、抗坏血酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醇脱氢酶等。

此外，作为试剂部分中含有的介体，使用有机或无机化合物的电子受体，例如铁氰化钾等金属氰化络合物、苯醌等醌衍生物、二茂铁或二茂铁衍生物。

上述构成的生物传感器可如下所述进行制造。

首先，在聚对苯二甲酸乙二醇酯制造的绝缘性基板1上进行丝网印刷，用银糊印刷，形成引线2、3。接着，印刷导电性碳糊，在上述引线2、3上形成测定电极(作用电极)4和参比电极5构成的电极系统检测部分9。更进一步，印刷绝缘性糊，以限定两电极4、5的露出部分面积，且覆盖两电极4、5间和引线2、3的不需要部分形成绝缘层6。然后，在上述两电极4、5上滴下含有添加剂、氧化还原酶和介体的溶液，承载以后，使之干燥形成试剂部分10。最后将盖子8和分离层7如图1中虚线的位置关系进行联接，制成电极型生物传感器。

接着，就上述生物传感器的操作进行说明。

首先，将检测样品直接在检测部分9上承载的试剂部分10上加样。之后，检测样品中的成分和试剂部分10中所含的氧化还原酶发生酶反应，酶变成还原型。接着还原型酶和介体反应，酶被重新氧化，介体变成还原型。在此还原型介体上施加电压，使介体再次氧化的同时放出电子。这样放出的电子以电极4、5的电流值被测出，从而能够特异性地定性或定量检测样品中的成分。

在根据本实施方案的生物传感器的试剂部分10中，混合含有生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂，因为此添加剂是凝聚力很大的高分子物质，能够接触紧密性良好地承载试剂部分10中的氧化还原酶和介体。所以，根据本实施方案的生物传感器，在试剂部分10中，因混合含生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂，依靠此添加剂的凝聚作用，能够抑制试剂部分10的隆起和凹凸化，使承载试剂部分10的电极4、5表面接触紧密性提高，防止氧化还原酶和介体从电极4、5表面剥离和脱落。其结果是具有使上述生物传感器的响应性能和重现性显著提高的效果。

此外，作为本实施方案的生物传感器，上述添加剂所含的生物高分子物质的蛋白质或其衍生物使用不具有氧化还原催化能力的物质，不会因酶和化学性的氧化还原反应而对检测样品的非特定成分发生氧化还原反应，能够只检测和特定成分反应所对应的传感器应答。其结果是使实施生物传感器具有特异性测定检测样品的效果。

接着，就实施例用图1～3进行说明。

(1)试剂部分的调制

如图1所示的电极4、5上承载的试剂部分10，是在作为氧化还原酶的GOD 200U/ml、和作为介体的铁氰化钾150mM的溶液中，以0～3W/V％的各种比例混合添加剂明胶，将5微升这样的混合液滴在电极4、5的表面上，干燥形成。在本实施例中，使用以0～3W/V％的各种比例混合明胶的试剂部分10制得的数个生物传感器。

(2)试剂部分厚度、传感器响应重现性

图2为表示具有混合明胶的试剂部分10的葡萄糖测定用生物传感器的试剂部分10的厚度和传感器响应重现性的图。纵轴的折线图表示试剂部分10的厚度，纵轴的直方图表示作为传感器响应重现性指标的传感器响应的变化系数(下面简称CV)。此外，横轴为添加剂(明胶)的浓度。

由图2，试剂部分10的厚度，如图中折线图所示，和试剂部分10所混合的明胶浓度相关。其特性是，如果明胶浓度增加则试剂部分10的厚度降低。即，对于试剂部分10，明胶浓度增高能够抑制隆起，也减轻凹凸化。

更进一步，对于试剂部分的厚度，150mM铁氰化钾滴下形成的试剂部分10在未混合明胶时，厚度约为540微米，如果混合约0.25W/V％的明胶，则厚度抑制在约260微米左右。和以往实施例的图5相比，此结果和未混合明胶时铁氰化钾75mM以下的试剂部分厚度相当。

此外，对于CV值(％)，如图5所示，未混合明胶时150mM铁氰化钾滴下形成的试剂部分10的CV值为20％以上。但是，图2的直方图所示，明胶约1.5W/V％程度混合时，CV改善至5％，更进一步，明胶2.0W/V％以上混合时，CV值达到2％，可见得到稳定。

(3)传感器响应性能

图3表示具有混合明胶的试剂部分10的葡萄糖测定用生物传感器的响应性能。纵轴为介体(铁氰化钾)作为电子受体消耗量所检出的电流值，横轴检测样品的葡萄糖浓度。此外，各折线图表示在图2中的试剂部分10未混合明胶(0.00W/V％)、以0.50W/V％、1.00W/V％、2.00W/V％、或2.75W/V％比例混合明胶时检测出的葡萄糖浓度和电流值的关系(传感器响应性能)。

根据图3的葡萄糖浓度和电流值的关系，当明胶以2.0W/V％以上的程度混合时，葡萄糖浓度和电流值之间得到极高的线性相关性。相关系数(r)在未混合明胶时为0.9931，以2.75W/V％混合明胶时，相关系数改善至0.9996，其直线斜率与未混合明胶时相比也显著增加。

还有，明胶自身没有催化氧化还原活性是众所周知的事实，所以图3所示的电流值增加是电极4、5和试剂部分10之间的接触紧密性改善所引起的。

从以上的实施例可见，上述生物传感器，在电极4、5表面上滴下5微升以1.5-3.0W/V％混合明胶的试剂部分用溶液，干燥形成试剂部分10，可以实现传感器响应性能和响应重现性很高的生物传感器。

还有，上述实施例所示的生物高分子物质、酶、或试剂等的混合量、传感器的承载量及方法等只是一个例子，对于本发明的生物传感器，其混合量、比例及方法等并没有特殊的限定，可根据目的而改变。

产业上的利用可能性

如上所述，本发明的生物传感器涉及对于临床检验、食品、环境、工业生产过程等具有广泛用途的所谓电极型生物传感器，该电极型生物传感器使直接将检测样品作用于传感器的简便测定系统成为可能，更进一步，为精度良好地测定检测样品，它能够抑制试剂部分的厚度、提高试剂部分和电极表面的接触紧密性。这样就能够将传感器响应性能和响应重现性显著提高，实现具有更高可信性的生物传感器。

Claims

1.一种生物传感器，是在绝缘性基板上形成具有作用电极和参比电极的电极系统检测部分，在此电极系统检测部分上设置混合氧化还原酶和酶反应检测试剂的试剂部分，以上述电极系统检测部分对此试剂部分上给予检测样品进行定性或定量检测，其特征在于，在上述试剂部分中，具有包含生物高分子蛋白质或其衍生物的添加剂。

2.根据权利要求1记载的生物传感器，其特征在于，上述添加剂中所含的生物高分子蛋白质或其衍生物不具有氧化还原催化能力。

3.根据权利要求1记载的生物传感器，其特征在于，上述添加剂采用明胶、胶原、弹性蛋白、酪蛋白、蛋白胨或它们的衍生物、或者它们任意组合的混合物。