CN1273488C

CN1273488C - 一种低免疫原性的基因改造免疫球蛋白及其应用

Info

Publication number: CN1273488C
Application number: CN 01144894
Authority: CN
Inventors: 梁瑞安
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-29
Filing date: 2001-12-29
Publication date: 2006-09-06
Anticipated expiration: 2021-12-29
Also published as: CN1429843A

Abstract

本发明公开了一种低免疫原性的基因改造免疫球蛋白及其应用。本发明所提供的低免疫原性的免疫球蛋白，含有母抗体轻链和/或重链可变区序列，该免疫球蛋白的轻链或重链可变区内，含有最少源自两个不同免疫球蛋白的FR次区带序列，而其中最少一个母FR次区带序列被与母抗体不同源的相应FR次区带所取代或置换；所述FR次区带序列为FR1、FR2、FR3或FR4；所述被选择用以置换母免疫球蛋白FR次区带的相应FR次区带选自四个成员之一。本发明经基因重组或框架置换后的免疫球蛋白所组成的抗体能保持母抗体的特异性和亲和力于三倍之内。

Description

一种低免疫原性的基因改造免疫球蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种免疫球蛋白及其应用。

背景技术

自1975年Kohler和Milstein(Continuous Cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature.1975.256：495-497)创立了B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术以来，单克隆抗体在临床诊断，治疗和预防方面的运用价值和开发前景已获得普遍肯定。但是，真正令单克隆抗体的临床应用变成主流，也不过是最近几年的事。主要问题在于大部分的单克隆抗体都是来自小鼠的B细胞杂交瘤。这些鼠源的抗体不单会在人体内引发“抗小鼠抗体”免疫反应，(Human-Anti-Mouse-Antibody(HAMA)response)，而且缺乏能引导人体自身免疫功能如补体为媒介的细胞免疫作用(Complement-Mediated Cell Cytotoxicity：CMC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity：ADCC)等等。基因工程的出现，改变了抗体临床应用的疗效和可靠性。最初出现的基因改造抗体是“人-鼠嵌合抗体”，即将鼠源单抗轻，重链可变区基因VL和VH分别与人源抗体轻，重链恒定区基因CL和CH连接形成人-鼠嵌合轻链和重链基因，并在骨髓瘤细胞，昆虫细胞，中国仓鼠卵巢细胞，转基因植物，转基因动物等表达系统中获得表达。理论上，嵌合抗体带有约70％的人源结构，大大减低其免疫原性，可供重复使用，加上其引入的Fc段能引发人体自身免疫效能，可增加人体抗病，如癌症，细菌，病毒等的免疫能力。1997年，美国食物及药品管理局(Food and DrugAdministration：FDA)首次批准了治癌的嵌合抗体Rituxan，而且获得空前成功，为抗体工程药物在医药界的广泛应用奠定了历史性的一页。由于嵌合抗体仍带有约30％(VL和VH)的鼠源结构，重复使用仍有机会会慢慢引发所谓“抗嵌合抗体”免疫反应(Human-Anti-Chime ric-Antibody(HACA)response)。为此，80年代中期，Greg Winter(Cambridge University)首次引进了“决定族互补区域(Complementarity-Determining Regions(CDR))移植”，或“人源化抗体”的概念和技术，将抗体中的人源结构由嵌合抗体内小于70％增加至人源化后的大于90％。由于鼠源部分少于10％，人源化抗体的免疫原性理论上应比嵌合抗体少，更适合大量及重复使用。

人源化的技术比嵌合抗体的制造要复杂。首先，要找到一个适合的人源V段框架(Framework)作为人源化(或CDR移植)的模板。除特别说明外，这里所指的V段框架(或框架区带)是指取自单一的免疫球蛋白的FR1，FR2，FR3和FR4(跟据Kabat分法)。最常用的人源化用轻链V段框架为REI，重链V段框架则为NEWM，EU，或KOL.直接移植鼠源的决定族互补区域(CDR)于人源的V段框架很多时会使人源化后的抗体失去原来的特异性(Specificity)和亲和力(Affinity)。在决定族互补区域移植的人源化技术中，有所谓供体和受体的分别。譬如，要被人源化的抗体(如鼠源抗体)因要提供CDR以作移植之用，是为供体抗体。被选作CDR移植用的人源框架区带模板抗体，则为受体抗体。为了维持人源化后的抗体原来的特异性和亲和力，除了CDR的移植外，往往要在人源的V段框架部分加插供体框架的氨基酸残基。不同的科研机构出版了一系列的准则，专利和文章等，以帮助决定寻找适合人源化用的V段框架区带，及选择对免疫亲和力有重要影响的鼠源框架氨基酸残基，以取代受体框架的相应残基(US 5,585,089；US5,693,762；US 5,693,761)。

一般而言，人源化免疫球蛋白是在一整个选定的人源V段框架区带插入至少一个非人源的免疫球蛋白CDR。当人源化的轻链和重链组合一起，最后的产品便是人源化抗体(Jones et al.，Nature，321：522-525，1986；Verhoven et al.，Sciernce，239：1534-1536，1988)。

人源化最主要的目的是在保持原有的特异性和对抗原的亲和力的前提下，尽量减低其免疫原性。一个成功人源化的抗体应具备以下特性：

1.大大减少，最好能完全消除在人体的免疫原性，可供多次在人体重复使用。

2.保持原有的抗原的免疫活性，包括，特异性，和亲和力等(三倍以内)。

3.能引发人体的免疫效应如补体结合，以补体为媒介的细胞毒作用(CMC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等等。

如何选择适当的受体V段框架区带，及决定对免疫亲和力有重要影响的鼠源(供体)框架氨基酸残基，是一门颇为复杂的学问，包括经验，反复尝试，及须借助电脑模拟等的帮助才能完成。在已知的人源化方法里，选择适当的受体人源V段框架区带，是整段的取舍(即构成V段框架区带的FR1，FR2，FR3，FR4都取自同一V段)。此法缺乏弹性，重要的是，为保持原来的特异性和亲和力而插入人源受体框架区带的鼠源供体框架氨基酸残基，很有可能会引入新的致免疫表位(ImmunogenicEpitope)。

发明内容

本发明的目的是提供一种能保持原来的特异性与亲和力、低免疫原性的免疫球蛋白。

本发明的免疫球蛋白是：一种低免疫原性的免疫球蛋白，含有母抗体轻链和/或重链可变区序列，其特征在于该免疫球蛋白的轻链或重链可变区内，最少一个母FR次区带序列被与母抗体不同源的相应FR次区带所取代或置换；所述FR次区带序列为FR1、FR2、FR3或FR4。

本发明经基因重组后(或框架置换后)的免疫球蛋白应带有源于最少两个不同的免疫球蛋白链的FR次区带序列。而这些所谓不同的免疫球蛋白链可取自同种同源的(如人源的)不同免疫球蛋白链，或不同种不同源的不同免疫球蛋白链，如人源跟其他灵长类(Primate)源的，人源跟鼠源的。本发明经基因重组或框架置换后的免疫球蛋白所组成的抗体能保持母抗体的特异性和亲和力于三倍之内。

为了保证本发明免疫球蛋白的亲和力，被选择用以置换母免疫球蛋白某FR次区带的相应FR次区带，应：

a、具有跟相应母FR次区带不少于60％的氨基酸残基序列相似度(sequencehomology)；

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的三个相应母FR氨基酸残基相似度(homology)为60％以上；

c、跟已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基，在相应的位置上，有着不少于60％相同的氨基酸残基。

被选择用以置换母免疫球蛋白某FR次区带的相应FR次区带，应：

a、具有跟相应母FR次区带不少于60％的氨基酸残基序列相似度；

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的四个相应母FR氨基酸残基相似度为50％或以上；

c、含有在相应母FR内，已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基位置上有着不少于60％相同的氨基酸残基。

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的三个相应母FR氨基酸残基相似度为60％以上或在相应位置含有保守性相似的氨基酸残基序列；

c、跟已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基，在相应的位置上，有着不少于60％相同的，或保守性相似的氨基酸残基序列。

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的四个相应母FR氨基酸残基相似度为50％

所述保守性相似的氨基酸残基为gly，ala、val，ile，leu、asp，glu、ser，thr、lys，arg或phe，tyr。

这些特别的FR氨基酸残基位置可通过电脑模拟，晶体结构，已发表过的资料，及实践经验而获得。

由于资料库内的FR序列有限，并不是每次都可找到完全附合上述条件作置换用的FR次区带。在这种情沉下，应尽可能找出最符合上述条件的FR次区带，再在相应的位置上被适当地引入母FR的个别氨基酸残基，这些被重新引入的母氨基酸残基具有如下特性：

a、在位置上与供体免疫球蛋白的CDR非常接近；

b、构成氨基酸残基的原子距所述免疫球蛋白的CDR不足4-6。

所述用以置换的某FR次区带，在相应的位置上被引入母FR或其他不同但相应FR的个别氨基酸残基，这些被重新引入的氨基酸残基具有如下特性：

a、在位置上与供体免疫球蛋白的CDR非常接近；

b、与CDR或结合点位有直接的接触，或在选作置换用的同类同源相应FR次区带的特定位置上较为典型，或在被取代的氨基酸在同源的FR相应位置上较为罕有。

所述当重链与轻链结合成框架置换抗体后，维持对抗原的特异性及保持其亲和力于10⁷M^-1与10¹¹M^-1之间。

所述免疫球蛋白为hpRFB4；它的轻链VL段的氨基酸序列是序列3，重链VH段的氨基酸序列是序列4。

本发明的另一个目的是提供低免疫原性的免疫球蛋白在制造以其为活性成分的药物中的应用，所述免疫球蛋白能减少源自母免疫球蛋白的免疫原性。

以本发明的免疫球蛋白为活性成分的药物可以在治疗患有CD22高度表达量的癌症或免疫系统疾病引起的风湿性关节炎中得到广泛应用。

本发明的免疫球蛋白既消除了抗体的免疫原性，同时又保持了原来的特异性与亲和力。本发明比已知的人源化方法简单，而且灵活性更高。

由于大部分抗嵌合抗体(HACA)或抗人源化抗体(HAHA)的反应多集中于V段的免疫表位，为方便说明起见，本发明集中以V段为例，阐释其中的原则和规范，但并不仅此为限。这些原则只作为解说之用。本发明的精神应不受其中的理论所局限。

一般而言，引致球蛋白免疫原性来自两种致免疫表位(epitope)。所谓“T细胞致免疫表位”是短的肽链，这些肽链是当球蛋白在抗原提呈细胞(Antigen Presen胞致免疫表位”是短的肽链，这些肽链是当球蛋自在抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell(APC))体内被分解时产生的，当这些肽链的序列结构吻合依附于主要组织相容性复合体MHC(Major Histocompatibity Complex)结合沟(Binding Groove)的条件时，便会被APC有效地递交往合适的T细胞，刺激T细胞的活性。若这些肽链依附于抗原提呈细胞(APC)表面的MHC II上，被刺激的T细胞会将讯息传递至B细胞，引发强烈的抗球蛋白的抗体反应。同样原理适用于嵌合抗体，或人源化抗体等的免疫球蛋白。详细地分析一般人源化抗体的V段结构，无可避免的均具有潜在免疫原性的鼠源CDR。这些CDR在结构与功能上将V段框架区带(Framework Region)分成四个次区带(Sub-regions)，分别为，FR1，FR2，FR3和FR4(Kabat et al.Sequencesof proteins of immunological interest.Maryland：US Department of Health andHuman Services，NIH，1991，USA)。由于T细胞致免疫表位是延续直线的短肽链，这些T细胞致免疫表位在每一个FR次区带的存在与否，相互之间并没有连带关系。无论这些FR次区带是来自同一个V段框架区带，或来自不同的V段框架区带，只要是人源的FR次区带，便不应引起新的或非人源的T细胞致免疫表位。而Queen的人源化方法(US5,585,089；US5,693,762；US5,693,761)为了尽量保持原有的特异性和亲和力，会在“一个选定的受体V段框架区带”引进供体框架的氨基酸残基，极有可能产生新的T细胞致免疫表位，继而引发抗人源化抗体(HAHA)的免疫反应，产生对抗由供体CDR所组成的“抗原结合位点”(Antigen-Binding Site)的抗体反应(抗独特性型抗体反应)(Anti-idiotypic response)。一般入源化的过程，在每个受体V段框架区带插入三到七个供体框架的氨基酸残基的情况非常普遍，增加了新的T细胞致免疫表位出现的可能性。

同样地，这些混杂在“受体框架区带”的供体残基，也能形成新的B细胞致免疫表位(Immunogenic B-cell Epitope)，被抗体反应所产生的抗体所确认。除少数例外，插入适当的供体框架氨基酸残基对维持原抗体的特异性和亲和力已被验证为人源化的必要手段。但若能直接植入供体CDR于受体V段框架区，却能减少，甚或免除插入任何供体框架氨基酸残基，仍能保持原抗体的特异性和亲和力，用这种方法去人源化，该较为理想。

本发明提供了一个崭新的方法，可于减少甚或消除抗体的免疫原性的同时，仍保留原抗体的特异性及维持原有对抗原的亲和力在三倍以内，同时又降低引入新的T或B细胞致免疫表位的可能。这方法不但简单，多变化，极富弹性，而且通常不用复杂的电脑模拟分析去帮助决定受体V段框架及供体残基的选择。

以一个抗体单链的V段为例，本发明提供了一套系统化的条件和守则，用“框架置换”(Framework-patching(FR-patching))的方法，去达至减少或消除抗体的免疫原性，而不需牺牲原抗体的特异性和亲和力，及其他有用的特性。以“框架置换”的方法去人源化一个鼠源，或来自其他动物的所谓“母抗体”，应先将母抗体的V段氨基酸序例依据Kabat(Kabat et al.Sequences of proteins of immunological interest.Maryland：US Department ofHealth and Human Services，NIH，1991，USA)的方法细分成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4等七个次区带。FR1，FR2，FR3及FR4组成一个结构上基本不变的框架，支撑着由CDR1，CDR2及CDR3等多变区序列所组成的三维(3-D)抗原结合位点。因母抗体(供体)的CDR1，CDR2及CDR3直接影响其特异性及亲和力，其氨基酸序列基本上不能改变。但框架的FR次区带，却可个别处理。做法是将每个母抗体FR的次区带，分别与人源抗体相应的FR次区带序列排列比较。人源抗体氨基酸的序列可在不同公开或私有的资料库找到(例如：Kabat Database；theNational Biomedical Research Foundation Protein identification Resource)。母抗体其中每一个V段里的框架区带，都可与来自单一，或多个不同人源抗体V段相应的FR次区带相互置换。尽可能的话，最好能找到与母抗体FR次区带氨基酸序列相似度最高(60％或以上的Homology)的相应人源FR次区带置换。实验证明，与CDR最接近的FR次区带氨基酸残基很有可能会与抗原或由CDRs组成的三维抗原结合位点有直接或间接的接触，从而影响到抗体的特异性和亲和力(Amit et al.，Science，233：747-753，1986)。所以在这些FR次区带内的重要局部序列的相似度(通常是最接近CDR的三到五个氨基酸残基)比FR次区带的整体相似度更为重要。以下详尽例出在框架置换技术中选择适当的FR次区带的条件，这些条件适用于重或轻链的V段的框架置换：

1.尽可能选择跟最接近母抗体CDR1三个或以上的母FR1氨基酸残基相似度(homology)(最好是100％)最高的人源FR1作置换之用；

2.尽可能选择跟最接近母抗体CDR1及CDR2三个或以上的母FR2氨基酸残基相似度(最好是100％)最高的人源FR2作置换之用；

3.尽可能选择跟最接近母抗体CDR2及CDR3三个或以上的母FR3氨基酸残基相似度(最好是100％)最高的人源FR3作置换之用；

4.尽可能选择跟最接近母抗体CDR3三个或以上的母FR4氨基酸残基相似度(最好是100％)最高的人源FR4作置换之用。

并不是每次都能找到附合上述条件的人源FR次区带。在这种情况下，可以选择在相应部位含保守性相似的FR次区带氨基酸残基，如，gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr等人源FR次区带作置换之用。

可以的话，最好选择在某些框架位置上，已知在三维结构内跟CDR’s或抗原结合位点很接近，或有直接交互接触的框架氨基酸残基，跟母框架在相应位置有着相同或保守性相似残基的人源FR次区带作置换之用。这些框架残基的位置，可以透过电脑模拟(computer modeling)，晶体结构(crystal structure)，其他已出版了的文章，及经验等方法找到(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901，1987；Chothia et al.，Nature342：877，1989，Tramontano et al.，J.Mol.Biol.215：175，1990，Levy et al.，Biochemistry28：7168，1989；Bruccoleri et al.，Nature 335：564，1988；Chothia et al.，Science233：755，1986)。

框架置换方法并不排除必要时在适当的框架位置上引入母框架的氨基酸残基，甚至引入其他，如不同的灵长类(primates)，老鼠等动物的FR次区带。尤其当现存的资料库不足以提供附合上述条件的人源框架次区带，本发明的主要目的是要降低，甚或消除母抗体(如，鼠源抗体)在人体的免疫原性，而不严重损坏置换后抗体的特异性，及对抗原的亲和力。在这前提下，本发明大大提高了其成功率。比起其他已知同类方法更快，更简单，更灵活，更容易掌握操作。

框架置换成功的抗体若配合了人源的恒定(C)区结构域，当附在目标抗原上，便能导引人体免疫效能，如以补体为媒介的细胞免疫毒作用(CMC)，抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等等。由于框架置换后的人源化抗体只带有少于5-10％的鼠源氨基酸残基，当注射入人体内以作检测或治疗之用，不会引起人抗框架置换抗体的免疫反应(Human-Anti-FR-patched-Antibody(HAFA)Response)。适合于重复多次使用，达至理想的疗效。非人源(如，鼠源)抗体比人源抗体在人体内的半周期相对的短很多(Shaw et al.，J.Immunol.138：4534-4538，1987)。由于框架置换后的人源化抗体几乎都是由人源抗体的序列组成，这种基因重组后的抗体在人体内的半周期应该跟自然人源抗体很近似。

在重组框架置换的免疫球蛋白，先得要依据如上所述的原则规范来设计V段基因的序列，然后再以基本的分子生物学技术把重组后的V段DNA合成(Leung et al.，Molecular Immunol.32：1413-1427，1995；Daugherty et al.，Nucl.Acid Res.19：2471-2476；DeMartino et al.，Antibody Immunoconj.Radiopharmaceut.4：829，1991；Joneset al.，op.cit.)，或以定位/寡核苷酸引导的诱变(site-or oligo-directed mutagenesis)的方法在鼠源V段的模板上把框架置换(Gillman and Smith，Gene 8：81-97，1979；Robertset al.，Nature 328：731-734)。

编码框架置换免疫球蛋白的V段基因DNA片段将接入到植有人类重链和轻链区域编码DNA的表达载体中，这些DNA表达载体适宜于在细菌内繁殖及在不同宿主细胞内表达。类似这种适宜于在一系列宿主细胞中表达的DNA表达载体很多，不用尽述。最典型的例子，是先将一个适宜的表达调控DNA序列操作地连接在编码框架置换后的免疫球蛋白的DNA片段上。再在其表达载体上，放入其它有助于真核宿主细胞内表达的调控序列，如细胞的启动子系统等等。编码框架置换免疫球蛋白轻重链的DNA序列可以并入一个单独的DNA表达载体，也可以分别并入重链和轻链DNA表达载体。对于后一种情况来说，宿主细胞必须同时并入重链和轻链DNA表达载体才能产生一个具有正确成对的重链和轻链的框架置换抗体。一般说来，每个免疫球蛋白链的N-末端，都会融合一段可容许免疫球蛋白多肽转入高尔基体(GolgiBody)的前导序列，以便于在真核宿主细胞中进行表达及分泌。一旦载体被并入到适宜的宿主中，而且宿主被培养在能够高水平表达核苷酸序列的适宜条件下，那么，正如期望的那样，就可以不断收集和纯化框架置换人源化的轻链，重链，轻重链二聚体(Fab fragments：Fab，Fab’，F(ab’)₂，etc)，或完整的抗体，结合片段，单链抗体(sFv)，二聚体(diabodies)，或其他形式的免疫球蛋白衍生物(Beychok，Cells of ImmunoglobulinSynthesis，Academic Press，NY，1979)。

众所周知，重链和轻链有着不同的恒定区域种型(重链如IgG，IgM，IgD，IgA等等，轻链如kappa及lambda)。一个特殊的同种型将具有特殊的效应子特征/功能(effector functions)，该特征/功能可被选择用于不同的目的。人类恒定区域DNA序列可以按常规方法从多种人类细胞中提取，但选用可组培繁殖的B细胞较好(Kabat op.cit.and WP87/02671)。同理，用作框架置换的母抗体CDR也可用类似方法从单克隆抗体中提取。这些抗体能够结合到预定的抗原上，如与癌细胞有关的抗原。一般来说，这些抗体都能从常用的哺乳动物身上用常规方法获得，如小鼠，大鼠，兔子或其他能够产生抗体的脊椎动物。适合提取不同的恒定区，框架段DNA，或其分泌物等的资源细胞，可从许多途径获取，如美国标准培养中心(the American Type CultureCollection)(“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”，sixth edition，1988，Rockville，MD，USA)。

含有编码框架置换免疫球蛋白DNA序列的表达载体，可以游离基因(episomes)或完整地连接在宿主染色体DNA的形式，在宿主生物细胞内复制。免疫球蛋白链可操作地连接在一个含有启动子和增强子的表达调控序列上。表达载体可放入标记物基因，如四环素(tetracycline)，新霉素(neomycine)，β-内酰胺霉(beta-lactamase)等以便检测含有DNA载体成功转化的细胞(US Pat.No.4,704,362)。

细菌宿主适宜于DNA载体的繁殖，也适宜于并入的免疫球蛋白DNA的表达。例如，大肠杆菌是最常用的克隆本发明DNA序列的原核宿主。用于同样目的的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草芽孢杆菌)和其他肠道细菌(如沙门氏菌，Serratia)，以及许多假单孢杆菌属的种。在这些宿主中表达克隆序列需要宿主细胞与表达调控序列相亲和(如一个复制起始点)，而且功能启动子应包括在DNA载体上。众所周知的启动子系列实例包括，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，λ类噬菌体启动子系统等，但并不仅限于这些。这些启动子负责调控启动子系统功能基因序列下游的表达或转录，除了所有必须的基元外，还包括可选择的一个操作程序，核糖体结合序列，及其它一些转录起始和翻译必须的序列。

同样，其它的微生物如酵母也被用于表达。例如，酿酒酵母就是一个优选的宿主，它适宜于含有恰当表达调控因子的表达载体，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，一个复制起始点，终止序列，和其它一些期望的类似组分。

无脊椎动物起源的真核细胞也可以利用。如昆虫细胞、hi-5、SF9、SF21。含有方便克隆位点，启动子，终止序列等的适宜的表达载体对于在可商业化购买到的宿主细胞中高效表达是非常重要的(Invitrogen，San Diego，CA)。

应当优选的是用哺乳动物的组织培养细胞来表达和生产本发明的多肽(Winnacker，“From Genes to Clones，”VCH Publisher，NY，NY，1987)。最常用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary(CHO))细胞系，多种COS细胞系，HeLa细胞系，骨髓细胞系如SP2/0细胞系，NS0细胞系，YB2/0细胞系等，以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞。这些细胞系能够在恰当的位点进行正确的糖基化，如在重链CH2功能区的297氨基酸位点，而且能够分泌全长的免疫球蛋白，这些对于本发明的免疫球蛋白是必须的。和其它宿主细胞的表达载体相似，一个真核细胞的表达载体应包括恰当的表达调控序列，其中包括启动子(如那些从免疫球蛋白基因获得的基因，金属硫蛋白基因，SV40，腺病毒，巨细胞病毒，牛乳头瘤病毒等)，增强子(常常具有一个前导序列来引导表达的多肽到高尔基体并输出)，DNA有意义片段(如重链和轻链上的编码和表达调控序列)，一个终止密码子，以及其他一些加工信息位点(如核糖体结合位点，RNA剪接位点，一个聚腺苷酸化序列，和转录终止序列)，以及一个选择标记物(如突变体Dhfr，谷氨酰胺合成酶(GS)，潮霉素，新霉素)(“GeneAmplifica tion in mammalian cells”，Marcel Dekker Inc.，NY，NY，1993)。

对于引导含有DNA有意义片段的载体进入宿主细胞，暂时的或稳定地并入宿主细胞基因组，已有建立了一个多血症方法和许多众所周知的方法。这些方法包括氯化钙转染法，磷酸钙处理法，电穿孔法，脂质转染法等(Maniatis et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1982)，但并不仅限于这些。恰当的表达载体是否并入宿主细胞将在选择压力下通过载体上的选择标记在第一批生长细胞上得以证实。检测分泌的蛋白质，如含有两对重链和轻链的整个抗体，或本发明的其他免疫球蛋白形式，则通过标准的程序如ELISA和蛋白质印迹法(Western)进行。表达蛋白质的纯化可根据完善标准的程序进行，包括硫酸氨沉淀法，亲和柱法，柱层析法，电泳法等(R.Scopes，“Protein Purification”，Springer-Verlag，NY，1982)。对于用药来说，90-95％物质均一纯度的免疫球蛋白较好，98-99％或更高物质均一纯度的免疫球蛋白更好。一旦纯化，部分达到或达到期望的均一度，多肽就可用于治疗(包括体外)或用于研发和生产分析过程，免疫荧光染色等(Immuno logical MethodsVols I and II，Lefkovits and Pemis，eds.，Academic Press，New York，NY，1979 and 1981)。

本发明所指的抗体可以单独用于以抗体为基础的治疗，也可以与其它治疗模式合用。例如，免疫球蛋白可用于被动免疫，清除不需要的细胞或抗原，如通过补充调节溶胞作用，所有这些都没有与许多前抗体有关的物质副免疫反应(如过敏性休克)。

本发明描述的抗体临床上最好是在50mg至400mg/m²的剂量范围内以它们裸露的形式(裸抗体)进行治疗，可在损伤部位局部给药，也可以皮下给药，静脉给药，肌内给药等。多种剂量不同间隔时间的给药方式将被采用以达到理想的治疗或诊断效果，如，可以每周给药，一周一次，连续4周。本发明所获得的抗体可以与不同的治疗模式合用，例如化学治疗药物(如CHOP，Dox，5-Fu等)，放射治疗，放射免疫治疗，疫苗，酶(enzyme)，毒素或免疫毒素，或从本发明获得其他抗体等。本发明的抗体，如果是抗肿瘤的特应抗体，可用作肿瘤疫苗以诱导Ab3来对抗肿瘤抗原。无数众所周知的其他试剂或试剂的复合物也都可以利用。

此外，本发明的抗体还可用在不同的药物组分中。这些抗体可以裸露的形式使用，也可作为下列成分的结合蛋白质：药物，放射性核素，毒素，细胞因子，可溶性因子，激素，酶类(如羧酸酯酶，核糖核酸酶)，肽类，抗原(作为肿瘤疫苗)，DNA，RNA，或其他任何具有特殊治疗功能的效应分子，这些治疗功能与抗体部分有关(作为目标抗原或作为运输工具)。而且，抗体或抗体的衍生物，如本发明的抗体片段，单链Fv，双抗体等可用于其它功能部分的融合蛋白，例如，一个不同发明的抗体或抗体衍生物(如双特异性抗体)，毒素，细胞因子，可溶性因子，激素，酶类，肽类等。拥有一般生物技术的人，可以此发明为本而引伸到其它药物组合形式使用。

框架置换抗体也可应用在体外如抗原测量之用。

下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳在还原与非还原的情况下分析被纯化后的嵌合(cRFB4)与框架置换(hpRFB4)抗体。

图2为用流式细胞术分析方法鉴定嵌合抗体cRFB4与框架置换抗体的曲线。

图3为嵌合抗体(cRFB4)与框架置换抗体对人非何杰金淋巴癌Raji细胞亲和力之比较

具体实施方式

抗体RFB4为一抗CD22的鼠源抗体(Li et al.，Cell Immunol.118：85，1989)。本发明以此为例说明框架置换的方法和概念。

实施例1、人源框架次区带以作RFB4抗体轻链(VL)框架置换的选择

下面的序列是鼠源RFB4的VL氨基酸序列，框框内的氨基酸为决定互补区序列。

D I Q M T Q T T S S L S A S L G D R V T I S C

W Y Q Q K P D G T V K L L I Y

G V P S R F S G S G S G T D Y S L T I S N L E Q E D F A T Y

F C

F G G G T K L E I K

按照Kabat的方法细分为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个FR次区带的选择，都会基于上述的原理，根据Kabat的资料库(Kabat et al.，op.cit)将鼠源VL的FR次区带序列与相应人源的FR次区带比较，如下面的序列所示，是鼠源RFB4轻链VL段内的FR次区带序列跟相应但不同的人源FR次区带序列(斜体)的比较，框框内为决定互补区序列。

----------------------------------------FR3-------------------------------------------

G V P S R F S G S G S G T D Y S L T I S N L E Q E D F A T Y

(WES)

G V P S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P E D F A T Y

------- |--------------FR4--------------

F C

F G G G T K L E I K

F (RZ) F G G G T K V E I K

a.FR1：人源JOH的FR1段不单跟鼠源FR1的次区带氨基酸序列相似度最高，且其最接近CDR1的整串八个氨基酸跟相应的母氨基酸序列是一样的。JOH的FR1会用来置换鼠源RFB4FR1；

b.FR2：同理，人源Vd’CL的FR2序列跟鼠源RFB4的FR2序列最相似。重要的是，超过四个最接近CDR1和CDR2的氨基酸是跟鼠源抗体相应部位的序列相同的。Vd’CL的FR2会被用作置换之用；

c.FR3：人源WES的FR3段选为置换鼠源FR3之用。FR3次区带是众框架次区带中最长的一段。WES的FR3除了跟鼠源RFB4轻链FR3序列相似度高外，其处于CDR2和CDR3两旁的序列是相同的；

d.FR4：同理，人源RZ的FR4段选为置换鼠源FR4之用。

下面的序列展示了根据以上所述的方法设计出的RFB4框架置换VL段的最后序列。它包含了人源JOH的FR1，人源Vd’CL的FR2，人源WES的FR3，和人源RZ的FR4，把原来鼠源RFB4的VL段的相应FR次区带替换掉。这里面并没有插入任何鼠源的框架残基。框框内为决定互补区序列。粗体残基展示人源FR次区带与相应鼠源母FR次区带间不同的氨基酸。

D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I S C

W Y Q Q K P G K A P K L L I Y

G V P S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P E D F A T Y

F C

F G G G T K V E I K

实施例2、人源框架次区带以作RFB4抗体重链(VH)框架置换的选择：

下面的序列是鼠源RFB4的VH氨基酸序列。框框内的胺基酸为决定互补区序列。

E V Q L V E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F A F S

W V R Q T P E K R L E W V A

R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L

K S E D T A M Y Y C A R W G

Q G T L V T V S A

按照Kabat的方法细分为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。如下面的序列所示，是鼠源RFB4重链VH段内的FR次区带序列跟相应但不同的人源FR次区带序列(斜体)的比较，框框内为决定互补区序列。每个FR次区带的选择，都会基于上述的原理，跟据Kabat的资料库(Kabat et al.，op.cit)将鼠源VH的FR次区带序列与相应人源的FR次区带比较。

-----------------------FR1---------------------------------

E V Q L V E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F A F S

(EIK)

E V Q L V E S G G G L V - P G G S L R L S C A T T G F A F S

(RF)

Q V Q L V E S G G G V V Q P G R S L R L S C A A S G F S F S

(WAS) E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F S

|-------------FR2--------------------|

W V R Q T P E K R L E W V A

(WAS) W V R Q A P G K L E W V A

|--------------FR3---------------|

R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L

(GAL) R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L

|--------------FR3----------------| |------

K S E D T A M Y Y C A R W G

R V E D T A L Y Y C A R (DOB) W G

|----------FR4------------|

Q G T L V T V S A

Q G T L V T V S T

Q G T L V T V S S

a.FR1：这里有三个人源FR1序列跟鼠源RFB4之VH的FR1序列非常接近。它们分别是，EIK，RF-SJ1，和WAS。虽然EIK的FR1跟鼠源FR1最相似，且最近CDR1的五个残基序列都是相同的，但EIK的序列缺失了在位置十二的残基，可能会影响合成后抗体的免疫特异性和亲和力。最后选择了WAS的FR1作置换之用，理由如下：1、除了位于28的残基外(此残基是第三最接近CDR1的氨基酸)，一整段十一个最接近CDR1的氨基酸序列与鼠体的是一样的。2、在WAS位置28，Serine取代了鼠体的Alanine，但Serine被认为是加了-OH的Alanine，属于保守性相似。3、很多与鼠体不同的人源残基，结构上非常接近或相似，如位置5的Valine与Leucine，位置13的lysine与glutamine，位置19的lysine与arginine，和位置28的alanine与serine。结论是，WAS的FR1会用来置换鼠源RFB4FR1；

b.FR2：同理，跟据FR2序列的相似度，人WAS的FR2会被用作置换之用；

c.FR3：GAL的FR3有着跟CDR2和CDR3邻近区段最高的相似度，所以被选作FR3置换之用；

d.FR4：有很多的人FR4跟最接近鼠CDR3的FR4段序列相同，人DOB的FR4选为置换鼠源FR4之用。

下面的序列展示了根据以上所述的方法设计出的RFB4框架置换VH段的最后序列。它包含了人源WAS的FR1，人源WAS的FR2，人源GAL的FR3，和人源DOB的FR4，把原来鼠源RFB4之VH段的相应FR次区带替换掉。这里面并没有插入任何鼠源的框架残基。框框内为决定互补区序列。粗体残基展示人源FR次区带与相应鼠源母FR次区带间不同的氨基酸。

E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F S

W V R Q A p G K G L E W V A

R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L

R V E D T A L Y Y C A R

W G

Q G T L V T V S S

实施例3、框架置换VL基因的合成：

框架置换VL氨基酸序列按哺乳动物细胞常用的密码子被转化成序列1的DNA序列。整段的DNA序列被分为N端与C端两部分(N-terminal half and C-terminalhalf)。N端与C端两部分可通过SpeI限制切点连成完整的VL基因序列。

N端部分的合成如下：

化学合成的N端有意链寡核苷酸(N-terminal sense-strand oligonucleotide)含有108个碱基，编码第11至46的VL氨基酸

[5’CTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTCACCATTAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAGGCTCCGAAACTC3’]会作为聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction：PCR)的模版。

用以PCR的5’引物

[5’GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTG GGAGAC3’]和3’引物[5’ATAT ACTAGTGTAGTAGATCAGGAGTTTCGGAGCCTTACC3’]寡核苷酸会以N端有意链寡核苷酸为模版，用基本PCR方法扩增整段N端双链。

同理，整段C端双链可用化学合成的C端有意链寡核苷酸(编码第59至98的VL氨基酸)[5’CCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGAATTTACTCTCACCATTAGCTCCCTGCAGCCAGAAGATTTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTC3′]为模版，配合相应的5’引物[CTAC ACTAGTATATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT]和3’引物[TTTGATTTCCACCTTGGTGCCTCCACCGAACGTCCACGGAAGCGTATT]，用基本的PCR方法扩增。

PCR扩增后的N端与C端双链可通过SpeI限制切点连成完整的VL基因序列1。

实施例4、框架置换VH基因的合成：

框架置换VH氨基酸序列按哺乳动物细胞常用的密码子被转化成DNA序列2。整段的DNA序列被分为N端与C端两部分(N-terminalhalf and C-terminal half)。N端与C端两部分可通过KpnI限制切点连成完整的VH基因序列。

N端部分的合成如下：

整段N端双链可用化学合成的N端有意链寡核苷酸(N-terminal sense-strandoligonucleotide)含有111个碱基，编码第14至50的VH氨基酸[5’CCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTATCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCACCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATAC3’]作为模版，配合相应的5’引物[5’GAAGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGG3’]和3’引物[5’GTAGGT GGTACCACCACCACTACTAATGTATGCGACCCACTCCAGCCC3’]，用基本的PCR方法扩增。

同理，整段C端双链可以化学合成的C端有意链寡核苷酸(编码第68至111的VH氨基酸)[5’TTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGTGGAGGACACAGCCTTATATTACTGTGCAAGACATAGTGGCTACGGTAGTAGCTACGGGGTTTTGTTTGCT3’]为模版，配合相应的5’引物[5’GGT GGTACCACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAT3’]和3’引物[5’TGAAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAACAAAACCCCGTAGCT3’]，用基本的PCR方法扩增。

PCR扩增后的N端与C端双链可通过KpnI限制切点连成完整的VH基因序列2。

实施例5、框架置换抗体的表达

合成后的框架置换VL和VH段被克隆至俱有人源轻链和重链恒定区的表达载体内。载体配有适合的选择标记(selectable marker)。被线化(linearized)的载体会用来转染鼠SP2/0细胞。在本实施例中，用的选择标记是DHFR，转染的方法是电穿孔法(electroporation)，转染后的细胞放在含有氨甲碟吟(Methotrexate)的培养基内。能够在选择培养基生存的细胞被ELISA测验有否分泌人源抗体。阳性抗体分泌细胞被扩大生长在500毫升的滚动培养瓶(roller bottles)。培养液中的抗体可用Protein A层析柱纯化，纯化后的抗体用reducing和non-reducign SDS-PAGE电泳方法分析，如图1所示，带1为cRFB4(还原)、带2为hpRFB4(还原)、带3为分子量标记物、带4为cRFB4(非还原)、带5为hpRFB4(非还原)。框架置换RFB4抗体被定名为hpRFB4，其特异性与亲和力初步以FACScan(Becton Dickinson，Bedford，MA)流式细胞术去评估。人何杰金淋巴瘤Raji细胞(5×10⁵)先与1ug的hpRFB4或cRFB4混于100ul含有1％FCS，0.01％叠氮钠(sodium azide)的PBS(PBS-FA)液内，置于4℃内三十分钟。处理过后的Raji细胞先用PBS洗三次，以清除没有附在Raji细胞多余的抗体。附在Raji细胞上的抗体则可以用二十倍稀释含有FITC-缀合物的羊抗人IgG1 Fc段抗体，用FACScan去量度，如图2所示，曲线1是cRFB4、曲线2是十倍稀释的hpRFB4、曲线3是一倍稀释的hpRFB4。框架置换RFB4抗体(hpRFB4)会跟嵌合抗体(cRFB4)比较亲和力，方法是用定量含有FITC-缀合物的鼠源RFB4(Ancell Corporation，Bayport，MN)跟不同浓度的hpRFB4或cFB4混合，再加入人何杰金淋巴瘤Raji细胞，用流式细胞术(flow cytometry)分析比较hpRFB4和cRFB4相互之间的亲和力。如图3所示，横坐标是竞争物的浓度(微克/毫升)，纵坐标是能抑制竞争抗体与Raji细胞结合的百分比，结果显示框架置换后的RFB4抗体跟嵌合RFB4抗体的亲和力相同。

序列表

<160>4

<170>

<210>1

<211>321

<212>DNA

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>1

gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagagtcacc 60

attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

ggtaaggctc cgaaactcct gatctactac actagtatat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagaa tttactctca ccattagctc cctgcagcca 240

gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagg tggaaatcaa a 321

<210>2

<211>369

<212>DNA

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>2

gaagtgcagc tgctggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaggctc 60

tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccaggca 120

ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat 180

ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcaaatga acagtctgag ggtggaggac acagccttat attactgtgc aagacatagt 300

ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360

gtctcttca 369

<210>3

<211>107

<212>PRT

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser

20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln GLn Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

80 85 90

Gly Asn Thr Leu Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys

107

<210>4

<211>123

<212>PRT

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser

20 25 30

Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr

50 55 60

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

65 70 75

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser

95 100 105

Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

110 115 120

Val Ser Ser

123

Claims

1、一种低免疫原性的免疫球蛋白，含有母抗体轻链和/或重链可变区序列，其特征在于该免疫球蛋白的轻链或重链可变区内，含有最少源自两个不同免疫球蛋白的FR次区带序列，而其中最少一个母FR次区带序列被与母抗体不同源的相应FR次区带所取代或置换；所述FR次区带序列为FR1、FR2、FR3或FR4；所述被选择用以置换母免疫球蛋白FR次区带的相应FR次区带选自下述四个成员之一：1)满足下述所有条件的FR次区带：

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的三个相应母FR氨基酸残基相似度为60％以上；

c、跟已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基，在相应的位置上，有着不少于60％相同的氨基酸残基；

2)满足下述所有条件的FR次区带：

c、含有在相应母FR内，已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基位置上有着不少于60％相同的氨基酸残基；

3)满足下述所有条件的FR次区带：

c、跟已知或可能与CDRs或抗原结合位点接近，甚至有接触的母FR氨基酸残基，在相应的位置上，有着不少于60％相同的，或保守性相似的氨基酸残基序列；

4)满足下述所有条件的FR次区带：

b、跟母抗体任何一个CDR最接近的四个相应母FR氨基酸残基相似度为50％或以上，或在相应位置含有保守性相似的氨基酸残基序列；

2、根据权利要求1所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白，其特征在于：所述保守性相似的氨基酸残基是gly，ala、val，ile，leu、asp，glu、ser，thr、lys，arg或phe，tyr。

3、根据权利要求1或2所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白，其特征在于：所述用以置换的FR次区带，在相应的位置上被引入母FR的个别氨基酸残基，这些被重新引入的母氨基酸残基具有如下特性：

a、在位置上与供体免疫球蛋白的CDR接近；

b、构成氨基酸残基的原子距所述免疫球蛋白的CDR不足4-6。

4、根据权利要求1或2所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白，其特征在于：所述用以置换的FR次区带，在相应的位置上被引入母FR或其他不同但相应FR的个别氨基酸残基，这些被重新引入的氨基酸残基具有如下特性：

a、在位置上与供体免疫球蛋白的CDR接近；

b、与CDR或结合点位有直接的接触，或在选作置换用的同类同源相应FR次区带较为保守，或在被取代的氨基酸在同源的FR相应位置上较为罕有。

5、根据权利要求1或2所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白，其特征在于：所述当重链与轻链结合成框架置换抗体后，维持对抗原的特异性及保持其亲和力于10⁷M^-1与10¹¹M^-1之间。

6、根据权利要求1或2所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白为hpRFB4；它的轻链VL段的氨基酸序列是序列3，重链VH段的氨基酸序列是序列4。

7、权利要求1-6中所述的一种低免疫原性的免疫球蛋白在制造以其为活性成分的药物中的应用，所述免疫球蛋白能减少源自母免疫球蛋白的免疫原性。