CN1270225A - Epo基因的电针转移技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将促红细胞生成素(Epo)基因转入骨骼肌细胞并表达Epo的新方法。该方法是将Epo基因的真核表达载体注入肌肉组织,然后于注射区域施以电针刺激,促使Epo基因进入肌细胞,表达Epo。该方法简便、安全、高效、成本低,具有良好的实际应用前景。
Description
本发明涉及一种体内基因转移技术，用于将促红细胞生成素(EPO)基因转入动物或人体肌肉组织，实现Epo的生物合成，补充体内Epo的不足或缺乏。
Epo是肾脏产生的一种蛋白类激素，具有促进红细胞生成的作用。当肾脏病变或其他原因导致Epo生成不足，便会发生贫血。此类病人需反复注射Epo或反复输血方能纠正贫血。目前临床上使用的Epo药物多是通过基因工程的办法生产，即采用基因重组的方法构建含有Epo的基因或cDNA的原核表达载体，并在原核细胞(如大肠杆菌)中表达并提取Epo。该方法涉及从成分复杂的细菌培养液中分离提取微量的Epo蛋白，生产工艺复杂，产品价格昂贵，而且，由于Epo的体内半衰期短，需反复给药方能见效，治疗费用高。
本发明的目的是提供一种合成Epo的新方法，采用Epo基因电针转移技术实现体内Epo的自我生成，工艺成本低，方法简便，药效持久。
为了实现这一目的，本发明首先构建含有Epo基因的真核表达载体，将这种载体转入大肠杆菌，扩增并提取，然后将这种载体注入骨骼肌组织，并在注射区域实施电针刺激，促使Epo基因进入骨骼肌细胞，后者便可按转入的Epo基因为模板，以肌细胞自身的蛋白合成系统合成并分泌Epo。
该方法中，从细菌培养液中分离提取的不是蛋白质而是DNA，由于DNA性质稳定，便于分离提纯，因而生产工艺简单；其次，该方法采用电针基因转移技术，简便、安全、转基因效率高，能显著提高血液Epo水平；又因骨骼肌细胞内溶酶体少，转入的DNA不容易被绛解，留存时间长(三个月以上)，因而采用骨骼肌作为接受Epo基因的靶组织可实现转入的Epo基因的持久表达，使血中Epo不断得到补充，从而避免了因Epo的血液半衰期短，需反复注射给药的缺陷，同时也就大大降低了病人的治疗费用。
本发明具体是以如下步骤实现的：①采用基因重组的方法将Epo的cDNA插入具有真核启动子(如人巨细胞病毒启动子CMV)的质粒中，构建含有Epo基因的真核表达载体(下称Epo质粒)，此Epo质粒可在原核细胞中复制，在真核细胞中表达Epo。②用Epo质粒转染大肠杆菌，扩增并大量制备Epo质粒。③向动物或人的肌肉组织注射Epo质粒。注射量依需要及个体体重而定，每针20~1000μg，注射时应注意进针的方向与肌纤维伸展的方向一致。④注射后立即在注射区域实施电针刺激：将两根电极针刺入Epo质粒注射区域，并施加方波脉冲电压。电极针的直径为0.6~1.2mm，两针的间距为5~15mm，电极针的刺入深度与注射针的刺入深度大致相同；所施脉冲参数为：波宽20~90ms，电压50~200v，频率0.5~2Hz，并可按正反两个电流方向依次给以脉冲电刺激。⑥根据需要，可以进行多部位Epo质粒注射与电针刺激操作，以增大肌肉组织Epo质粒的转移量。
实际应用举例——肾性贫血大鼠骨骼肌Epo的生物合成：采用基因重组的方法将Epo的cDNA插入具有CMV启动子的质粒pcDNA3中，构建成质粒pcDNA3/Epo；用pcDNA3/Epo转染大肠杆菌，获得含有pcDNA3/Epo的大肠杆菌株；将此菌株在LB培养液中增菌培养，采用碱裂解与离子交换层析的方法从菌体中提取pcDNA3/Epo；然后，向肾性贫血大鼠的后腿股骨肌注射pcDNA3/Epo，注射方向尽量与股骨平行，两腿肌肉分别注射100μg DNA，注射后立即在注射区域刺入两根电极针，并施加方波脉冲电刺激。电极针的直径为0.7mm，两针的间距为6mm，电极针的刺入深度与注射针的刺入深度大致相同，所施脉冲参数为：波宽40ms，电压80v，频率1Hz，每个注射部位均按正反两个电流方向依次给以4个脉冲电刺激。质粒注射后的次日大鼠注射部位的骨骼肌即开始合成并分泌Epo，之后Epo的血浆水平持续上升，约第14日达到高峰。大鼠的贫血状况于注射后的第7日即显著改善，两周后恢复正常。这种改善后的血象指标一直持续到大鼠因肾衰而死亡(1~3个月)。
Claims (3)
1、一种用于将Epo基因转入骨骼肌细胞并表达Epo的技术，其特征在于：将Epo基因注入肌肉组织，并在注射区域进行电针刺激。
2、根据权利要求1所描述的技术，其特征在于：Epo基因是含有Epo的cDNA的质粒，该质粒在Epo序列的上游具有真核启动子，可在原核细胞中复制，在真核细胞中表达Epo。
3、根据权利要求1所描述的技术，其特征在于：电针刺激是将两个电极针刺入Epo基因的注射区域，然后施加方波脉冲电刺激，脉冲电刺激的强度、频率、波宽及方向等参数可视接受基因转移的动物(包括人)的种类、基因注射量及机体Epo的需要程度等进行调节。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 99105555 CN1270225A (zh) | 1999-04-12 | 1999-04-12 | Epo基因的电针转移技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 99105555 CN1270225A (zh) | 1999-04-12 | 1999-04-12 | Epo基因的电针转移技术 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1270225A true CN1270225A (zh) | 2000-10-18 |
Family
ID=5272028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 99105555 Pending CN1270225A (zh) | 1999-04-12 | 1999-04-12 | Epo基因的电针转移技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1270225A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100374572C (zh) * | 2005-07-19 | 2008-03-12 | 北京市肿瘤防治研究所 | 一种体外培养骨骼肌表达体系 |
-
1999
- 1999-04-12 CN CN 99105555 patent/CN1270225A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100374572C (zh) * | 2005-07-19 | 2008-03-12 | 北京市肿瘤防治研究所 | 一种体外培养骨骼肌表达体系 |
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