CN1263847C - 樱花素的生物合成及应用 - Google Patents

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Abstract

一种应用水稻无性细胞诱导全合成樱花素的方法及生物活性认定。该方法通过建立稻瘟病非亲和性的优质水稻无性细胞系，在细胞系液体条件培养增殖达到最大比重时投放1mM的Cu2+诱导合成SA，经细胞破碎、甲醇提取、乙醚萃取浓缩后定性定量SA。SA提取率＞93%，SA诱导合成量0.18g/1000ml(细胞系培养液)。该合成SA，对稻瘟菌丝生长抑制作用强、对田间稻瘟病防治效果58.5～68.2%、穗颈瘟防效35～43%，比三环唑药效提高8～12%；对大鼠经口、经皮未有中毒致死，对家兔眼粘膜仅具有极轻度刺激性，对小鼠未呈现致突变性作用。试验说明：诱导全合成SA的技术可行，合成SA有显著的预防和治疗稻瘟病效果，且环境相容，可替代毒性化学农药。

Description

樱花素的生物合成及应用
技术领域
本发明属于樱花素(Sakukranctin：SA、5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮)的生物合成及应用。
背景技术
樱花素5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮，最初是由Asahinab从樱花树皮中分离的黄烷酮类物质。日本学者Kodama O，et al(1989年)从稻瘟菌侵染的水稻叶病斑中分离出SA，视为水稻植保素(phytoalexin：PA)。SA对稻瘟菌的孢子萌发(ED50＝15)与菌丝生长(ED50＝5)均有较强的抑制活性。有报导人工合成SA或SA衍生物制备医药或农药。
发明内容
本发明的目的在于应用水稻无性细胞系诱导合成SA、测定和试验SA的抗稻瘟病活性及一级毒性。研究开发防治稻瘟病的SA生物杀菌剂。
本发明的樱花素5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮生物全合成技术路线及活性(毒力)测定(试验)：包括：
1、非亲和性优质水稻无性细胞系的建立；包括水稻愈伤组织诱导、细胞系固体继代增殖培养、细胞系液体扩大培养；
2、细胞系樱花素诱导合成：包括樱花素合成诱导子选择，樱花素诱导合成培养；
3、细胞系樱花素分离纯化；
4、所得樱花素抗稻瘟菌活性测定(抑菌试验)和田大应用试验；
5、所得樱花素一级毒性试验。
本发明的樱花素5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮生物全合成方法，其合成步骤顺序为：
一、按如下顺序建立非亲和水稻无性细胞系；
(1)通过接种水稻幼穗和种胚筛选出愈伤组织出愈率高的水稻细胞系；
(2)筛选出的水稻细胞系转移到固体继代培养基增殖继代，第二轮筛选出优质无性细胞系；
(3)应用AA培养基逐渐扩大优质无性细胞系液体培养量；
二、按如下顺序进行细胞系樱花素诱导合成，
(1)选择樱花素合成诱导子；
(2)将樱花素合成诱导子投放入步骤二的第(3)步细胞系液体培养液中诱导合成培养不少于72小时，得含樱花素细胞系粗培养液；
三、水稻无性细胞系诱导合成樱花素分离纯化，
(1)将含樱花素诱导合成细胞系粗培养液机械破碎；
(2)加70％甲醇提取，甲醇提取液蒸馏去甲醇，得含樱花素细胞系培养液提取液；
(3)用乙醚萃取步骤三的第(2)步所得含樱花素细胞系培养液提取液后，蒸馏去乙醚，浓缩得含诱导合成樱花素细胞系纯化培养液。
所述非亲和性水稻无性细胞系为华1号。
所述的细胞系固体继代增殖培养的培养基成分为萘乙酸(NAA)2.0mgL-1，2，4-氯二苯氧乙酸(2，4-D)1.0mgL-1，激动素(KT)0.2mgL-1，脂琼8mgL-1组成的继代固体培养基即MS继代固体培养基。
所述的细胞系液体扩大培养接种的培养基为AA培养基。
所述的AA培养基成分为
  成分   含量/mg·L-1   成分   含量/mg·L-1   成分   含量/mg·L-1
  CaCl2·2H2O   440   Na2MoO4·2H2O   0.25   盐酸硫胺素   0.5
  KH2PO4   170   MnSO4·4H2O   22.3   甘氨酸   75
  MgSO4·7H2O   370   CuSO4·5H2O   0.025   L-谷氨酰胺   877
  KCl   2940   ZnSO4·7H2O   8.6   L-天冬氨酸   266
  KI   0.83   Na2EDTA   37.25   L-精氨酸   228
  CoCl2·6H2O   0.025   FeSO4·7H2O   27.85   蔗糖   30000
  H3BO3   6.2   肌醇   100   pH值   5.6
所述的细胞系接种AA培养基的培养条件为：室温25℃，相对湿度80％，日光照时数12小时，培养振荡140转/分钟。
所述的无性细胞系樱花素诱导是在细胞系液体扩大培养增殖达到重量比25倍时，投放调制的稻瘟菌孢子液，诱导合成樱花素。
所述的无性细胞系樱花素诱导是在细胞系液体培养增殖达到重量比25倍时投放1mM的Cu2+、Ag+、Ca2+、k+、Mg2+、Na+，在同条件下再培养至少72小时诱导合成樱花素。
水稻无性细胞系诱导合成樱花素在抗稻瘟菌上的应用，其抑菌浓度为150～200ppm，用量为9～11.4g/亩(稻田)。
按此发明的诱导生物合成技术具有SA产率高、抑菌抗病活性强、一级毒性低等特点。生物全合成SA技术使化合物保持全活性结构，因此，诱导生物全合成SA制备粉剂对稻瘟菌有较强抑制活性，对田间稻瘟病的预防和治疗具有显著活性，对非靶标生物显示低毒或无毒。生物全合成SA的技术及应用前景看好。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明应用水稻无性细胞诱导全合成樱花素的方法及所合成樱花素的抗稻菌活性测定和一级毒性。
实施例1，非亲和性优质水稻无性细胞系建立
从稻瘟菌非亲和性的中国与日本产34个水稻品种，在指定细胞分化脱培养基L培养基(L培养基成份为2，4-D2.0mgL-1，激动素(KT)0.2mgL-1，琼脂8gL-1)和MS培养基分别接种水稻幼穗和种胚，筛选出愈伤组织出愈率(愈伤组织数/接种组织数)高的15个细胞系。
外植体诱导2～3周后，愈伤组织团生长直径约0.5cm时，将其转移到MS继代固体培养基增殖继代，间隔2～3周转换新鲜培养基。比较增殖速度、抗褐化程度及分散状况，第二轮筛选到4个优良无性的细胞系。
使用基本培养基MS的改造型AA培养基，150ml～2000ml逐渐扩大细胞系液体培养量，视细胞增殖速度(重量比)最终筛选出优质无性细胞系-华1号。华1号细胞系固体培养15天即可置于4℃冰箱保存留种，隔3个月继代一次。结果
实施例2，水稻无性细胞系SA诱导合成
华1号细胞系接种1500mlAA培养基，在室温25℃、相对湿度80％、日光照时数12小时、培养振荡140转/分钟，培养条件下增殖13天，使细胞增殖达到最大重量比(25倍)时，分别投放稻瘟菌孢子调剂和含1mM的Cu2+、Ag+、Ca2+、k+、Mg2+、Na+离子的盐液，配制成的SA生物合成诱导子。72h诱导合成SA，以SA标样对照，高压液相色譜(HPLC)检测，化学离子诱导合成SA以μg/ml(细胞培养液)表示，结果是：
  Cu2+   Na+   Ag+   Ca2+   k+   Mg2+
  180   -   -   -   12   17
认定水稻无性细胞系SA诱导合成的最佳诱导子为Cu2+，其剂量为1mM的Cu2+(诱导子在细胞系中的浓度)。
实施例3，水稻无性细胞系诱导合成SA分离纯化
SA诱导合成细胞系机械破碎，经70％甲醇提取、乙醚萃取后浓缩有机相HPLC定性定量SA。SA提取率＞93％，SA诱导合成量0.18g/1000ml(细胞系培养液液)。
实施例4，水稻无性细胞系诱导合成SA的抗稻瘟菌(病)的活性测定试验
应用培养基混药法和孔洞加药法测定，SA对稻瘟菌(pyricularia oryzae)菌丝生长抑制作用强，最佳抑菌浓度为150～200ppm。
在温室水稻接种稻瘟病前或接种后喷施95％SA200ppm，预防和治疗稻瘟病平均效果63.6％，与参比喷施75％三环唑250ppm防效57.6％相当。
在常年易发病汕优64晚稻田喷施95％SA 200ppm药液量60kg(有效含量11.4g/亩)，水稻穗颈瘟防效34.5％～64.9％，平均防效43.0％。喷施20％三环唑75g/亩(有效含量15g/亩)药效22.41％～60.82％，平均防效42.3％。按使用物有效含量计算比较，喷施SA较比喷施三环唑防效/g提高34％。
实施例5，水稻无性细胞系诱导合成SA的一级毒性试验
大鼠经口、经皮急性毒性试验：SA经口、经皮急性毒性试验的各组动物、剂量分别高达6000mg/kg体重、2000mg/kgw体重，在观察期间均未有动物中毒致死发生。SA的半数致死量(LD50)，雌鼠和雄鼠经口均＞6000，雌鼠和雄鼠经皮均＞2000。
家兔眼刺激试验：SA授药48h前各项指数结果均表示有刺激反应，48h后观察各项指数结果均为0，即SA对家兔眼粘膜属于仅具有极轻度刺激性。
小鼠致突变性试验：SA对Ames试验浓度5000μg/皿结果为阴性，对小鼠微核试验剂量达1000mg/kg体重未引起骨髓多染细胞微核率明显增高，对雄性小鼠剂量达1000mg/kg体重，也未引起睾丸精母细胞染色体畸变的细胞率增高。这些结果一致表示SA受试物未呈现有致突变性作用。
试验说明：应用非亲和性水稻无性细胞Cu2+诱导全合成SA的技术可行，生物全合成SA有显著的预防和治疗稻瘟病效果，且环境相容，可作为一种新的稻瘟病生动农药开发，替代毒性化学农药。

Claims (2)

1、樱花素5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮生物全合成方法，其合成步骤顺序为：
一、按如下顺序建立非亲和性水稻无性细胞系：
(1)将水稻幼穗和种胚分别接种到L培养基和MS培养基，筛选出愈伤组织出愈率高的水稻无性细胞系；
(2)筛选出的水稻细胞系转移到MS固体继代培养基增殖继代，第二轮筛选出无性细胞系；
(3)应用AA培养基逐渐扩大无性细胞系的液体培养量，培养增殖达到重量比25倍；
二、进行细胞系樱花素诱导合成：
在步骤一的第(3)步细胞系液体培养液中，投放1mM的Cu2+、k+或Mg2+，在同条件下再培养至少72小时诱导合成樱花素，得含樱花素细胞系粗培养液；
三、水稻无性细胞系诱导合成樱花素分离纯化：
(1)将含樱花素诱导合成细胞系粗培养液机械破碎；
(2)加70％甲醇提取，甲醇提取液蒸馏去甲醇，得含樱花素细胞系培养液提取液；
(3)用乙醚萃取步骤三的第(2)步所得含樱花素细胞系培养液提取液后，蒸馏去乙醚，浓缩得含诱导合成的樱花素细胞系纯化培养液；
其中，L培养基成份为2，4-D2.0mgL-1，激动素0.2mgL-1，琼脂8gL-1；
MS固体继代培养基成分为萘乙酸2.0mgL-1，2，4-氯二苯氧乙酸1.0mgL-1，激动素0.2mgL-1，脂琼8mgL-1；
所述的AA培养基成分为：  成分     含量/mg·L-1  成分     含量/mg·L-1 成分  含量/mg·L-1  CaCl2·2H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKClKICoCl2·6H2OH3BO3     44017037029400.830.0256.2  Na2MoO4·2H2OMnSO4·4H2OCuSO4·5H2OZnSO4·7H2ONa2EDTAFeSO4·7H2O肌醇     0.2522.30.0258.637.2527.85100 盐酸硫胺素甘氨酸L-谷氨酰胺L-天冬氨酸L-精氨酸蔗糖pH值  0.575877266228300005.6
2、如权利要求1所述的樱花素5，7-二羟基-4′-苄氧基黄烷酮生物全合成方法，其特征是细胞系接种AA培养基的培养条件为：室温25℃，相对湿度80％，日光照时数12小时，培养振荡140转/分钟。
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