CN1257904A - 酶促化学发光反应的新型增强剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶促化学发光反应新型增强剂的用途。该增强剂的发现可以导致一类具有类似结构的增强剂的开发和应用。随着这类增强剂的使用,为辣根过氧化物酶的测定及其酶标记物的化学发光酶免疫分析提供了新的测定体系。该增强剂易溶于水,不同于酚类等有机物质需溶解于有机溶剂,这在测定、保存和试剂盒开发中具有特殊的优势。利用四苯硼钠作增强剂的化学发光反应体系测定甲状腺素、胰岛素和三碘甲腺原氨酸。
Description
本发明属于酶促化学发光反应增强剂的用途。
由发光剂，氧化剂和催化剂组成的发光体系很久以来一直被广泛应用于诸多领域，近年来，随着化学发光免疫分析技术的发展，基于HRP催化鲁米诺-H2O2化学发光体系的化学发光酶免疫分析技术发展很快，但HRP直接催化的灵敏度很低，无法用于检测微量的蛋白及核酸。直至八十年代中后期，人们陆续发现了二类可以达到增强其发光增强的物质，才使这项技术迅速地应用到基因分析及免疫检测领域，一类是6-羟基苯并噻唑及其衍生物，它们当中有些本身就是荧光物质，如萤火虫荧光素等。另一类是具有对位取代基的酚类，如对碘苯酚，对苯基苯酚等。这两类物质的增强发光作用极高，而且还可大大降低氧化剂与发光剂等单独作用时出现的本底发光，同时可将发光时间延长至几小时。因此它们被广泛地应用到免疫化学发光分析中。
英国Wolfson研究室发现了一系列的化合物能够增强HRP催化鲁米诺化学发光，且发光信号稳定。这一成果于80年代末开始应用，所用的增强剂有荧光素，噻唑，对碘苯酚等。专利：87-251511(Phenols asenhancers of the chemiluminescent)，90-101018(Chemiluminescenceenhancer)，对碘苯酚增强化学发光测定HRP及其标记物灵敏度很高，使用最多。这些增强剂都具有类似的结构，即具有几个取代基团的芳香环化合物。
本发明的目的是提供酶促化学发光反应的新型增强剂。该增强剂在结构和特性方面不同于目前普遍采用的增强剂，是由中心原子硼及四个苯环配位所组成。
本发明提供的酶促化学发光反应的新型增强剂具有如下基本结构：
其中，R＝H，F，Cl，Br，I，NO2，羟基，烷基，烷氧基；M＝Na+，K+。四苯硼钠纯物质为无色结晶，易溶于水而形成澄清的无色溶液。由于其具有多个苯环形成离域大π键，使电子传递更加容易。因此将其用作HRP催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应的增强剂。在探讨四苯硼钠的增强发光机理时发现，采用四苯硼钠为增强剂的体系的发光光谱及发射光谱与无增强剂体系的一致，但反应的激发光谱发生了改变。同时为了比较，也测定了对苯基苯酚的发光光谱、发射光谱和激发光谱。
已有专利报道过的各种不同的增强剂体系，他们虽然在增强效果上各不相同，但他们的激发光谱，发射光谱和发光光谱性质基本相似，这是由于他们的增强发光作用的机理相同。四苯硼钠与上述体系虽然其发光光谱和发射光谱具有相同的特征，但激发光谱明显不同，说明了其激发发光过程具有不同的历程，这归结为结构上的不同即四苯硼纳具有多个苯环形成的共轭大π键，使电子传递更加容易。
增强剂四苯硼钠的最佳浓度，增强化学发光作用，介质对增强发光的影响以及发光反应体系的最适鲁米诺浓度和过氧化氢浓度为：四苯硼钠的最佳浓度在0.1-60mmol/L之间，pH值在7.0-9.0范围内，鲁米诺浓度在1×10-3-1×10-5mmol/L，过氧化氢浓度在10-2-10-4mmol/L时发光取得最大。
四苯硼钠类增强剂可应用于辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应体系。使用四苯硼钠作为增强剂设计了用于免疫化学发光分析的试剂盒，其中包括鲁米诺，过氧化氢，四苯硼钠，包被有抗体的酶联反应板，标准抗原，酶标抗体或酶标链酶亲和素，生物素化抗体等。
这种新的增强剂的发现，可以导致一类具有类似结构的增强剂的开发和应用。随着这类增强剂的使用，为辣根过氧化物酶的测定及其酶标记的化学发光酶免疫分析提供了新的测定体系。该增强剂易溶于水，不同于酚类等有机物质需溶解于有机溶剂，这在测定、保存和试剂盒开发中具有特殊的优势。
本发明提供的实施例如下：
实施例1：利用四苯硼钠作为发光反应增强剂测定甲状腺素(T4)。
1).包板：用纯化的T4抗体包被微孔反应板，制成固相抗体。
用0.1mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液将T4抗体稀释到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃过夜。次日用0.01mol/LpH7.4 PBS洗涤三次，加0.01mol/LpH7.4 PBS，37℃封闭30min，用0.2mol/L pH8.6硼酸-硼砂缓冲液洗涤3次备用。
2).测定：将板用洗涤液洗3次，甩去余液。在对照孔，标准孔和待测样品孔分别加入空白液，标准液和待测样品50μl，标记物100μl.充分摇匀37℃1小时，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鲜配制的鲁米诺工作液50μl，过氧化氢50μl，四苯硼纳50μl。立即置于发光分析仪上检测发光强度，测量时间约1秒。测定灵敏度为4.0μg/dL。
实施例2：利用四苯硼钠作为发光反应增强剂测定胰岛素。
1).包板：用纯化的豚抗胰岛素抗体包被微孔反应板，制成固相抗体。
用0.1mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液将豚抗胰岛素抗体稀释到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃过夜。次日用0.01mol/L pH7.4PBS洗涤三次，加0.01mol/LpH7.4 PBS，37℃封闭30min，用0.2mol/LpH8.6硼酸-硼砂缓冲液洗涤3次备用。
2).测定：将板用洗涤液洗3次，甩去余液。在对照孔，标准孔和待测样品孔分别加入空白液，标准液和待测样品50μl，标记物100μl.充分摇匀37℃ 1小时，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鲜配制的鲁米诺工作液50μl，过氧化氢50μl，四苯硼纳50μl。立即置于发光分析仪上检测发光强度，测量时间约1秒。测定灵敏度为0.1ng。
实施例3：利用四苯硼钠作为发光反应增强剂测定三碘甲腺原氨酸(T3)
1).包板：用纯化的T3抗体包被微孔反应板，制成固相抗体。
用0.1mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将T3抗体稀释到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃过夜。次日用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤三次，加0.01mol/L pH7.4 PBS，37℃封闭30min，用0.2mol/L pH8.6硼酸-硼砂缓冲液洗涤3次备用。
2).测定：将板用洗涤液洗3次，甩去余液。在对照孔，标准孔和待测样品孔分别加入空白液，标准液和待测样品50μl，标记物100μl.充分摇匀37℃ 1小时，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鲜配制的鲁米诺工作液50μl，过氧化氢50μl，四苯硼纳50μl。立即置于发光分析仪上检测发光强度，测量时间约1秒。测定灵敏度为25ng/dL。
Claims (2)
1.一种酶促化学发光反应的新型增强剂，其特征在于具有如下结构：
其中，R＝H，F，Cl，Br，I，NO2，羟基，烷基，烷氧基；M＝Na+，K+。
2.如全利要求1所述的新型增强剂，其特征在于四苯硼钠用于酶促化学发光反应增强剂。
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