CN1255431C - 一种制备丝素粉末的新方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备不溶性丝素粉末的新方法，涉及生物高分子材料和化妆品。通过合理调节氯化钙，水，和乙醇的摩尔比，控制对丝素蛋白的二极结构的破坏程度，在60-100℃下反应，通过将混合物透析或用水稀释的方法获得丝素蛋白沉淀，将丝素蛋白沉淀清洗干燥后，研磨制备出的丝素蛋白粉末。制备的丝素粉末不溶于水，润湿性良好，活性基团富集在表面，是应用于医用诊断检验，陶瓷，酶固定化材料，药物缓释系统等的合适材料。此方法流程短，操作简单，控制方便，使用溶剂少，不破坏丝素的一级结构，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明是制备具有良好润湿性的丝素蛋白粉末的新方法，涉及生物材料。
背景技术
丝素蛋白作为天然生物蛋白，具有优异的生物相容性和良好的机械及物理、化学性能，受到人们广泛关注。其中因为丝素对人体无毒性，易于吸收，并且表面活性基团较多，在生物材料领域中具有广泛的应用前景。而丝素粉末在分离技术，医用诊断检验，陶瓷，酶固定化材料，药物缓释系统以及化妆品方面可以广泛应用。
现有的丝素粉末的制备方法一种是将丝素溶解在CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，经透析或色谱分离制备出丝素的水溶液，然后用喷雾干燥的方法制备不溶性丝素蛋白粉末。另一种方法将丝素用强酸、强碱或酶水解降低分子量，制备低分子量的丝素粉末。还可以通过高温高压的方法制备低分子量的丝素粉末。然而现有的制备方法，均存在过程复杂，需用化学试剂众多，或存在高耗能反应，不适合大规模的生产以及成本过高。这些极大地限制了丝素粉末的应用。
本发明为解决上述问题而采用的简单方法，利用溶剂将丝素蛋白分子间的氢键作用部分分解，经透析除去其中的无机盐和有机溶剂，沉淀获得丝素固体，干燥、研磨后即可获得不溶于水的丝素粉末。这种方法操作简单，耗能少，尽可能少的使用化学试剂，条件温和，易于控制，具有重大实用价值。
丝素蛋白一般有两种结晶态，其中α-螺旋为易溶于水的，而β-折叠为不溶于水的结晶态。自然状态下丝素蛋白主要以β-折叠存在，不溶于水和其它一般溶剂，可以通过破坏丝素蛋白原有的β-折叠结构溶解在CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中。三元溶液可以渗透到丝素内部，首先破坏丝素中不定型区的氢键，然后破坏β-折叠结构，从而使丝素蛋白溶解在溶液中。溶解后再通过透析除去盐及乙醇，就获得丝素蛋白的纯水溶液。因为丝素蛋白的β-折叠结构已经基本破坏，所以丝素蛋白可以相对稳定的存在于水溶液中，最后运用喷雾干燥，将丝素溶液干燥制备出粉末或微球。在喷雾过程中丝素受到力的作用而发生取向，因此制备出的粉末为不溶于水的，主要结构为β-折叠构象。或者利用浓酸或酶将丝素蛋白部分降解，制备出的一般为溶于水的粉末。而高温高压反应更是将丝素结构完全破坏。
所有上述方法都是在将丝素蛋白的原有结构完全破坏后，再通过各种作用制备所需要的粉末。反应相对复杂。研究表明，浓盐溶液在破坏丝素蛋白的氢键结构时，首先进入到丝素的不定型区，然后才破坏丝素的β-折叠结晶结构。所以如果通过合理调整三元溶液的配比，使溶液只能完全破坏丝素的不定型区，而不能完全破坏丝素原有的β-折叠结晶区，通过透析处理，得到丝素蛋白的沉淀，干燥后研磨可获得丝素蛋白不溶于水的粉末。
本发明的目的是简化丝素蛋白粉末的制备流程，降低能量消耗，在基本不破坏丝素蛋白一级结构的基础上制备出具有良好润湿性的丝素粉末。
发明内容
本发明是这样实现的：将蚕丝脱胶后，通过调节三元溶液的配比，在一定温度下将丝素蛋白的氢键部分破坏，获得近似丝素溶液的液体。将此溶液放入透析带中，在透析过程中，因为丝素蛋白氢键只是部分破坏，还保留原来的β-折叠结构，丝素蛋白从水溶液中沉淀析出。透析出现沉淀后，将丝素沉淀清洗后放入干燥箱干燥，干燥后的丝素研磨后得到丝素粉末。
本发明的具体实现是：将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水多次洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将一定量的丝素蛋白加入到CaCl2/水/乙醇三元溶液中，氯化钙和水的摩尔比在1∶8.1-1∶15之间，氯化钙和乙醇的摩尔比在1∶2.1-1∶5之间。获得类似于溶液的混合物，将此混合物用透析带在水中透析以除去氯化钙和乙醇，在透析过程中丝素蛋白沉淀出来，透析出现沉淀后，将丝素蛋白清洗后在干燥箱中干燥，干燥的丝素蛋白研磨后即得到丝素蛋白粉末。干燥后的丝素蛋白还可以利用球磨机等设备进一步研磨，可以获得直径在5nm-100nm之间的丝素蛋白粉末，从而可以应用到需要纳米级粉末如化妆品中等。
本发明首次通过调节三元溶液的配比来部分破坏丝素的二级结构，获得需要的粉末，而不是将二级结构完全破坏再通过机械作用恢复部分的β-折叠晶体。实验流程大大简化，制备更加简单。
本发明通过改变三元溶液的配比来制备不溶于水的丝素粉末，条件温和，流程简单，关键技术在于：
1.合理调节氯化钙，水和乙醇的摩尔比例，氯化钙，水和乙醇的摩尔比例控制在1∶8.1～1∶15之间，氯化钙和乙醇的摩尔比控制在1∶2.1-1∶5之间，控制对丝素蛋白二级结构的破坏程度，获得大小合适的粉末。
2.控制三元溶剂在60～100℃范围中反应，得到类似于凝胶和溶液中间状态的混合物。
3.用透析带透析或蒸馏水稀释可以得到丝素蛋白沉淀。
4.丝素蛋白沉淀再清洗干燥、研磨后获得丝素粉末。
对于丝素粉末的制备，由于丝素蛋白特有的二级结构，和良好的强度和韧性，无法通过机械作用直接对脱胶丝素处理获得粉末。考虑到自然存在的丝素蛋白主要为β-折叠结构，并含有具有一定取向的不定型区，当三元溶液进入到丝素蛋白内部时，首先是破坏规整性较差的不定型区，然后才破坏β-折叠结晶区的氢键，所以通过调节三元溶液的配比，可以控制溶液对丝素二级结构的破坏程度，获得所需结构。对三元溶液的配比，合适的比例为氯化钙和水的摩尔比在1∶8.1到1∶15之间，氯化钙和乙醇的摩尔比在1∶2.1到1∶5之间，配比的改变可以决定对二级结构的破坏程度，从而进一步决定丝素粉末的直径大小。对于作用温度，以原有的溶解丝素的温度为标准，设定在60-100℃之间，丝素加入后同溶液相互作用，溶液变为类似为凝胶和溶液的中间结构，将此混合物用水稀释或用透析带透析三天获得丝素蛋白沉淀。将丝素蛋白沉淀在干燥箱中干燥后，研磨可以获得丝素蛋白粉末。
制备出的丝素粉末用红外光谱，X射线衍射，以及表面电镜来测定粉末的结构和大小。X射线衍射结果表明丝素中的主要结晶态为β-折叠，红外结果表明粉末为β结晶和不定型结构共存。这说明溶剂没有完全破坏β-折叠区，从而使丝素粉末可以不溶于水，又由于溶液破坏了丝素蛋白中不定型区的氢键，在水相中，为降低表面活化能，不定型区都趋向于粉末的表面，从而使丝素粉末具有良好的润湿性和生物化学反应性，这为丝素粉末应用于医用诊断检验，陶瓷，酶固定化材料，药物缓释系统等提供了有利条件。
本发明的优点是：不需要对丝素二级结构完全破坏，基本不需机械仪器处理，流程简单，易于控制，制备粉末均匀，尽可能地减少了溶剂的使用。本发明对丝素蛋白粉末在相关领域的使用提供了进一步的便利条件，具有重大的实用价值。
以实施例进一步说明本发明
实施例1：
将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克丝素蛋白加入10毫升的CaCl2/水/乙醇三元溶液中，其中氯化钙和水的摩尔比为1∶8.1-1∶12，氯化钙和乙醇的摩尔比为1∶2.1-1∶3，将混合物加热到60-100℃，获得类似于凝胶和溶液中间状态的混合物，将混合物用透析带透析三天，将透析过程中沉淀出的丝素蛋白清洗干燥后研磨，制备出丝素蛋白粉末。
实施例2
将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克丝素蛋白加入10毫升的CaCl2/水/乙醇三元溶液中，其中氯化钙和水的摩尔比为1∶9-1∶15，氯化钙和乙醇的摩尔比为1∶2.1-1∶5，将混合物加热到60-100℃，获得类似于凝胶和溶液中间状态的混合物，将混合物用透析带透析三天，将透析过程中沉淀出的丝素蛋白清洗干燥后研磨，制备出丝素蛋白粉末。
实施例3
将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克丝素蛋白加入10毫升的CaCl2/水/乙醇三元溶液中，其中氯化钙和水的摩尔比为1∶8.1-1∶12，氯化钙和乙醇的摩尔比为1∶2.1-1∶3，将混合物加热到60-100℃，获得类似于凝胶和溶液中间状态的混合物，将混合物用水稀释，将稀释过程中沉淀出的丝素蛋白清洗干燥后研磨，制备出丝素蛋白粉末。
实施例4
将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克丝素蛋白加入10毫升的CaCl2/水/乙醇三元溶液中，其中氯化钙和水的摩尔比为1∶9-1∶15，氯化钙和乙醇的摩尔比为1∶2.1-1∶5，将混合物加热到60-100℃，获得类似于凝胶和溶液中间状态的混合物，将混合物用透析带透析三天，将透析过程中沉淀出的丝素蛋白清洗干燥后研磨，制备出丝素蛋白粉末。
Claims (1)
1.一种不溶性丝素粉末的制备方法，其特征在于：将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，获得纯的丝素蛋白，1g纯丝素蛋白中加入10毫升的CaCl2/水/乙醇三元溶液中，调节三元溶剂中氯化钙、水和乙醇的摩尔比例，氯化钙与水的摩尔比控制在1∶8.1-1∶15之间，氯化钙和乙醇的摩尔比控制在1∶2.1-1∶5之间，通过控制对丝素蛋白二级结构的破坏程度，得到类似于凝胶和溶液中间状态的混合物，用透析带透析或蒸馏水稀释可以得到丝素蛋白沉淀，清洗干燥后经研磨获得丝素粉末。
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