CN1254380A - 大豆培养的加强接种 - Google Patents
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Abstract
本发明特别设计了帮助大豆生长的根瘤菌菌株。本发明说明了一种生产抗生素香草木樨毒素(trifolitoxin)的高拷贝质粒。该质粒宜以Sinorhizobium菌属作为宿主,该菌属能够使大豆植株形成根瘤。产生香草木樨毒素这一表型通过抑制竞争性菌株为接种菌株提供了竞争优势。为了促进大豆的生长,还在接种菌株(同一Sinorhizobium菌菌株或另一相伴香草木樨毒素抗性根瘤菌)中包括了吸收氢的能力。
Description
参见相关申请。
没有适应的。
有关联邦资助的研究或开发的声明
没有适应的。
发明背景
早已为人熟知的是，豆科植物利用与生活在形成于植株根部的根瘤中的细菌间的共生关系而能够从大气中的氮气来固定氮。目前，共生根瘤菌至少可以分成几属：例如Rhizobium，Bradyrhizobium，Sinorhizobium和Azorhizobium。以上三属根瘤菌的特征一定程度上在于能够与之形成共生成瘤关系的豆科植物的种类。大多数能够使大豆形成根瘤的细菌属于Bradyrhizobium，但是Sinorhizobium也能够使大豆形成根瘤。
虽然对根瘤菌进行的大量研究希望得到能够加强或改善豆科农作物生长的菌株，但是人们发现提高根瘤菌接种株的效率是一个难题。尤其是，例如，Bradyrhizobium japonicum目前大量存在于南北美具有大豆生产历史地区的土壤中，虽然该菌种原来仅生长在亚洲。目前的野生菌是原先给大豆田接种的菌株的后代，但是它们已经进化成能够在上述土壤和气候下生存。农田生态境中存在着这些菌株有利有弊。大量存在于大多数种植区的Bradyrhizobium菌株与特意接种的Bradyrhizobium菌株竞争对大豆根瘤的占有，虽然目前大量或天然的菌株固氮可能不很有效，但常对它们加以良好的改造，以期在其目前生存和繁殖所在的特定环境或微环境中竞争性地形成根瘤。所以，产生可真正有效用于农田接种以提高作物产量的新的改良根瘤菌，在考虑提高菌株效率的同时还要考虑提供改良或工程菌，它们所具有机制使其能够有效地与目前广泛存在于大多数豆科作物种植区的菌株进行竞争。
根瘤菌固氮过程的特征之一是产生作物副产物的氢气。对于产生并向大气释放氢气的根瘤菌来说，大量用于固氮过程的能量随H2向大气的释放而流失。但是，已经发现有些固氮菌在固氮条件下并不释放H2。这些菌株被发现表达一种吸收性氢化酶，它将氢气氧化成质子和电子。在有些菌株中，由氢化酶引发的电子转移形成一条有效节能的电子传输链，这一传输链回收了大部分原先因产生氢气而流失的能量。
在数种根瘤菌中发现存在着称为HUP的负责氢吸收的多基因。但是，许多其它根瘤菌菌株和菌种不具备这样的能力，所以与能够表达HUP的菌种相比，它们在能量利用上较为浪费。例如，在Rhizobium elti或Bradyrhizobium elkanii中还没有发现HUP阳性株。还发现，HUP阳性的Bradyrhizobium japonicum菌种在农田中很少。
有人提出，可将HUP基因导入本身不具备上述表型的根瘤菌中，提高它们的农业用途。美国专利4,567,146为此方法提出了一种方案。但是，在菌种中广泛引入具有农艺价值的吸收性氢化酶(uptake hydrogenase)表型遇到了一些障碍。其中包括：HUP阳性接种株必须能够与目前农作物区土壤中的原生菌竞争根瘤的形成。HUP表型需要有几个基因，就菌株的代谢负担而言似乎是不利的。第二个困难是这样一个现实，即本不具有这种基因的菌种存在着HUP基因表达的遗传不稳定性。例如，Lambert等，Appl.Enyiron.Microbiol.，53：422-428(1987)，能够通过与含有来自B.japonicum的hup区的粘粒克隆接合，在R.meliloti中人为表达hup。但是，这种表达在根瘤中是临时性的，因为在没有选择压力的情况下，质粒无法在细胞分裂期间正确分配。在市售接种菌中添加四环素或其它选择用抗生素来防止不正确的分配代价昂贵，不太可能有效，而且可以因为抗生素抗性而造成动物或土壤中植物病原的改性，所以是不实用的。
当然，即使HUP表型可以通过基因工程引入某菌株，仍然存在着竞争性问题。为此论述过的一个方案是，通过基因工程使得根瘤菌具有某种抑制其它根瘤菌的毒素。美国专利5,183,759说明了一种经基因工程改造后产生上述毒素之一香草木樨毒素的根瘤菌。通过给根瘤菌附加香草木樨毒素的表达来提供竞争优势可能并不总是实用而有效。例如，在Bradyrhizobium属的细菌中表达香草木樨毒素就被发现很难。而相反，Bradyrhizobium属的细菌被发现对香草木樨毒素的抗性比Sinorhizobium fredii强数倍。
在考虑提供基因工程改造根瘤菌来表达氢化酶这一问题时，另一问题是对所述细菌进行的菌株改造。既然原先作物接种株的细菌已经进化成了适应农业区各种生态条件的各种菌株，所以，出于竞争原因可能必需对不同的菌株进行改造以获取新特征以用于给定国家或地区的不同农业区。所以，某特征是否易于在各种菌株中传递成为将改造过的固氮根瘤菌实际用于农田作物的一个关键问题。
发明概述
概括的说，本发明即一种经遗传改变后用作大豆接种菌的一种Sinorhizobiumfredii菌株，所述的改变是在细菌中包含一种高拷贝质粒，使细菌具有产生香草木樨毒素的表型和对香草木樨毒素的抗性。香草木樨毒素产生和抗性基因不仅包含在细菌内的高拷贝质粒上，所述质粒还具有一套分配系统确保子代菌保留香草木樨毒素产生和抗性这一特征。S.fredii菌株可以用作大豆接种菌，并能够使大豆植株形成根瘤。这些菌株产生香草木樨毒素的水平将能使改造后的S.fredii在与天然B.japonicum竞争大豆根部成瘤空间时胜出。
本发明的另一目的是赋予S.fredii工程菌改善大豆植株能量利用的能力，这是通过在S.fredii工程菌中包含或与菌株共接种以一质粒，该质粒含有能够表达某些蛋白质的基因盒，这些蛋白质使菌株能够产生氢化酶，通过氢化酶还原氢气来回收能量而不使这些能量在固氮过程中流失。
本发明还可以概括为包含以下有用结构中每一个的改良S.fredii菌：产生香草木樨毒素的结构，产生氢化酶的结构，分配基因座以确保特征不被田间菌株所丢失的结构。
通过以下具体描述，本发明的其它目的、优点和特征将变得显而易见。
附图简述
图1是本发明实施例之一中质粒操作的图示。
图2是用图1质粒进行的另一质粒操作的图示。
本发明的详细说明
根据本发明，构建了一种与豆科植物相关的根瘤菌，它们经基因工程改造后具有表达高水平香草木樨毒素的能力。如果要用来接种，这种菌株以Sinorhizobium菌为宜，但是如下文所述，它也可以是非接种用菌株。为了具有对Bradyhizobium(香草木樨毒素天然抗性更强)的竞争优势，香草木樨毒素的生产水平必需显著提高，所以，表达香草木樨毒素的基因结构以结合在高拷贝质粒中的形式进入细菌，所述的高拷贝质粒经基因工程修饰，所表达的蛋白质比处于相同菌株内的低拷贝质粒多出数倍。为了促进产生香草木樨毒素这一特征的遗传，含有香草木樨毒素产生和抗性基因元件的质粒还具有分配物质，用于确保携带了上述两种基因元件的质粒被工程菌的后代正确继承。本发明的一种S.fredii工程菌能够形成大豆根瘤，并具有对广泛存在的Bradyhizobium菌的竞争优势，这是因为其产生香草木樨毒素的水平对竞争性Bradyhizobium菌产生了毒性。
为了便于将香草木樨毒素表型转移给菌株，最好用在Rhizobium相关菌种内稳定、以高拷贝数存在且已经包含分配元件的质粒开始。有关这种质粒之一，pUCD1002，可参见Gallie等，Plasmid，14：171-175(1985)。该质粒具有一个来自已知质粒pTAR的等位基因座，并被设计成用于农杆菌和Rhizobium。“高拷贝数”在此表示在普通培养条件下，每个细胞内存在5份以上拷贝的质粒，每个细胞10份以上则更好。
也有产生香草木樨毒素的基因结构。其中之一可参见美国专利5,183,759。为了不对宿主生物体造成危害，负责香草木樨毒素表型的基因元件必须包括香草木樨毒素产生和抗性两者。上述基因元件也可以从根瘤菌的某些菌种中直接分离得到。
本发明大豆接种菌含有提供竞争力的高拷贝香草木樨毒素产生质粒，但还可以包含有助于大豆植株生长的质粒。这第二质粒可以以同一菌株为宿主，也可以以包括在接种物内的另一菌株为宿主。为了使接种菌株具有提高大豆植株产量的能力，意在协助固氮过程的第二工程质粒编码吸收性氢化酶。
所以，本发明还包括构建吸收性氢化酶质粒，该质粒可以通过接合方便地在各种Sinorhizobium或Bradyrhizobium菌株间传递。这些吸收性氢化酶质粒赋予它们所在的菌株以提高与根瘤菌形成共生关系的豆科植物有效产量的能力。
本发明质粒的优点来自于将两种基因元件的合并。首先，质粒含有表达氢吸收或HUP表型所必需的全部基因，使得质粒所在的菌株能够从产生的氢气中回收原先在固氮过程中流失的能量。其次，质粒含有分配元件，避免了质粒在后代菌中的错误分配，由此确保子代菌细胞内的HUP表型当细菌在其整个环境中繁殖时得以保持。由此可以方便地得到稳定的Sinorhizobium菌株，它既具有竞争力，又能够提高与之有共生关系的豆科植物的有效产量。
包含HUP表型的质粒在现有文献中已经有所记载。Lambert等，Appl.Eviron.Microbiol..53：422-428(1987)说明了已知质粒pHU52。质粒HUP pHU52是一个大质粒，含有氢吸收(hup)的所有必需基因，以及利用产生的氢在植物中储存能量的基因序列。问题由此被简化为如何将其它所需的基因组份插入该质粒骨架而不干扰HUP基因的有效功能。达到这一目的的方案之一是利用pHU52中的四环素抗性基因座，即在该基因座中直接插入外源基因以确保复合HUP操纵子中的基因都不受插入的干扰。首先，这样更便于将其它所需元件，特别是编码香草木樨毒素及其抗性的基因盒和分配基因组合到质粒中，而且，可以用转座因子将该基因盒插入到摆渡性pHU52质粒内的指定基因座。
吸收性氢化酶质粒的分配操纵子也意图避免带质粒菌株无性繁殖产生的子代细胞丢失所需的表型。这一等位基因座来自大肠杆菌质粒RK2，参见Robert&Helinski Jour.Bact.，174：24：8119-8132(1992)和Sia等，Jour.Bact.，177：10：2789-2797(1995)。RK2等位操纵子含有数个基因，这些基因存在于至少2个能够有效地在质粒的宿主细胞内将质粒稳定化的操纵子中。含有RK2等位基因座的质粒在非选择性生长过程中因为存在着这样的质粒而稳定。显然，操纵子抑制无质粒分离株的生长，由此保证所有生长的子细胞都含有插入了等位基因座的完整质粒。
本发明第一个优选实施例是具有两个质粒的Sinorhizobium fredii工程菌。第一质粒是含有高水平产生香草木樨毒素以提供竞争力的高拷贝质粒。第二质粒是HVP质粒，提供吸收性氢化酶表型，帮助大豆植株的生长。S.fredii菌被优选作为这两个质粒的宿主，因为Bradyrhizobium菌一般不能很好的表达香草木樨毒素，还因为S.fredii能够形成大豆根瘤。所以，采用这种菌株能够设计出单株大豆接种菌，它将竞争力和成瘤能力结合在同一菌株内。
当然，要求用于Sinorhizobium菌的质粒带有具有竞争力的应用起源(application origin)，并具有能够在质粒所插入的细菌宿主内表达的基因元件。因为在说明构建该质粒时的全部基因元件都来自根瘤菌，只有等位基因座例外，所以以上所述在操作上不成问题。已经证明，RK2等位基因座在根瘤菌中有效。
据估计，接种了S.fredii工程菌的大豆植株在实地试验中的产量可能不及最好的Bradyrhizobium japonicum菌株。如果这种可能性被证明成立，本发明的另一方案将氢吸收质粒与后文pTEXHCP之类高拷贝香草木樨毒素质粒一同使用，但是质粒被用在不同的菌株内。已经证明，当香草木樨毒素敏感株与香草木樨毒素抗性株混合在接种物中时，非成瘤性产香草木樨毒素菌株能够限制敏感柱的根瘤形成。Triplett&Barta，Plant Physiol.，85：335-342(1987)。在此，高拷贝产香草木樨毒素质粒将被引入大豆内的非成瘤性菌株内，例如非成瘤性Sinorhizobium菌或Rhizobium etli，然后将该菌株与后文pHVPAR之类作为氢化酶吸收质粒宿主的香草木樨毒素抗性Bradyrhizobium japonicum菌株一起用作接种物。接种物中的产香草木樨毒素菌株将抑制香草木樨毒素敏感性竞争菌，同时，B.japonicum占据根瘤并促进大豆植株的生长。所以，该方案也是将高拷贝产香草木樨毒素质粒与氢化酶吸收表型相结合，只是，它使用不同的菌株来达到相同的目的。
实施例
构建本发明质粒是从构建意在提供Sinorhizobium菌香草木樨毒素表型的高拷贝质粒开始的。如图1所示，该过程由合并pTEX24和pUCD1002两质粒开始。质粒pTEX24含有一段7.142kb片段，该片段含有在宿主菌内产生和抗香草木樨毒素必需的完整序列。pUCD1002是意欲用于农杆菌和Rhizobium宿主的高拷贝质粒。用Xho I消化pTEX24得到含有完整的香草木樨毒素表型基因结构的线性质粒。然后将这段10.1kb的插入片段连接到一段7.6kb的质粒pUCD1002的HindIII片段中。然后将两质粒末端截平，再连接起来。所得的结构被称为pTFXHLP。所得的结构以每细胞约30份的高拷贝数存在，所以使得香草木樨毒素的产生比过去所有结构高约5倍。该结构能够提供Sinorhizobium菌或Rhizobium菌突出的香草木樨毒素产生水平。该结构就是将被插入Sinorhizobium大豆接种菌株内负责香草木樨毒素产生的高拷贝质粒。
要开始构建吸收氢化酶质粒，需从质粒RK2(参见Weinstein等，J.Bacteriol.，170：7486-7489(1992))中分离一段32kb的等位基因座。RK2的这段等位基因座由质粒内两个差异转录的操纵子所编码的5个基因在细胞分裂时加强了完整的质粒分配。两操纵子各编码一种相互独立的确保质粒稳定性的机制。第一操纵子parCBA具有解离酶机制，而parDE操纵子则具有一种毒素，被称为parE和抗毒素(parD)机制。不论有否含3.2kb区域的转录子，等位基因座都赋予质粒稳定性，而且证明在根瘤发育过程中为Sinorhizobium meliloti提供完整质粒稳定性。
必需找出一种可行的方法将这段3.2kb的等位基因座插入到pHU52中。为此，最可行的方法被认为是将等位基因座插入转座子重复序列中。然后，等位基因座可以转移到pHU52上的四环素抗性基因座中。同时提供转座酶可以保证等位基因座在插入pHU52后不转移到该质粒之外。此外，因为选用的Tn3转座子还含有卡那霉素抗性，所以可以用卡那霉素选择在扰乱了四环素抗性后挑选pHU52。至此，可转移等位基因座构建完整。等位基因座向pHU52内的转移完成。
图2中的质粒pTR102含有等位基因座。用BamH1和Kpn1消化质粒pTR102，回收得到一段含有等位基因座的3.2kb片段。如Breil等，J.Bacteriol.，178：4150-4156(1996)所述，将该3.2kb片段连接到质粒pHoKmGUS的钝端单一ClaI位点。新形成的质粒称为pHoKmPAR，含有改性Tn3转座子。然后用转座子，并同时使用质粒pSshe的转座酶，将PAR基因座跳转到pHU52内的四环素抗性基因座中。所得的组合质粒pHUPAR将为该质粒的各种宿主菌提供氢循环和完整质粒稳定性。质粒pHUPAR可以接合到各种Sinorhizobium菌株中，在田间提高共生效率的同时加强占据根瘤的竞争力。
可以通过实地试验来证明成功获得了包含诸如pHV52和pTFXHCP之类以Sinorhizobium.fredii为宿主的质粒的大豆接种菌，试验将显示，接种了这种菌株的大豆植株和植株群其产量高于没有接种的植株或植株群。
为了方便本发明优选实施例的实施，质粒pTFXHCP和pHVPAR的样品已经在位于Rockvill，Maryland的美国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为98421(pTFXHCP)和98420(pHVPAR)。
Claims (14)
1.一种根瘤菌，它具有：
含有为菌株提供产香草木樨毒素表型所必需的基因组份和不使质粒在细胞分裂过程中丢失的分配基因座的重组质粒，所述质粒以每细胞5拷贝过量存在，因该质粒所产生的香草木樨毒素足以抑制其它竞争性根瘤菌的生长。
2.根据权利要求1所述的细菌，它是Sinorhizobium fredii菌株。
3.根据权利要求1所述的细菌，它是Rhizobium菌株。
4.根据权利要求1所述的细菌，它还包含为其提供产生氢化酶吸收表型的第二质粒。
5.根据权利要求4所述的细菌，所述的第二质粒还具有一个分配基因座。
6.一种大豆接种物，它包含权利要求1所述的细菌。
7.一种Sinorhizobium fredii工程菌，它包含；
第一质粒，该质粒含有为所述菌株提供香草木樨毒素产生和抗性表型所必需的基因组份和使得第一质粒不在细胞分裂时丢失的分配基因座，第一质粒使得该菌株比香草木樨毒素敏感株更具竞争力；和
第二质粒，该质粒含有为所述菌株提供产生吸收氢化酶表型和使得第二质粒不在细胞分裂时丢失的另一不同的分配基因座，第二质粒使得该菌株能够在大豆根瘤形成时回收固氮过程中生成的氢作为能源。
8.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述的第一质粒具有pTF24的香草木樨毒素基因座。
9.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述第一质粒中分配基因座来自pTAR。
10.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述的第一质粒是pTFXHCP。
11.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述的第二质粒具有pHU52质粒的hup+基因座。
12.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述的第二质粒具有RK2质粒的par基因座。
13.根据权利要求7所述的Sinorhizobium fredii工程菌，所述的第二质粒是pHUPAR。
14.一种大豆接种物，它包含载体和权利要求7所述的菌株。
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