CN1244694C - 牦牛血超氧化物歧化酶制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牦牛血超氧化物歧化酶及其提取纯化工艺和应用，所述的超氧化物歧化酶是将牦牛血经去血浆、洗涤、溶血、抽提去杂蛋白、分离、沉淀、透析、超滤浓缩后得到牦牛血SOD；本发明的酶总活力高达90万单位/l，平均酶比活为13000u/mg，本发明的工艺可减少SOD的酶总活损失，得率高、生产周期短、使用试剂省、操作简单；本发明可作药品、保健品和食品、化妆品添加剂用。

Description

牦牛血超氧化物歧化酶制备方法

技术领域

本发明涉及一种牦牛血超氧化物歧化酶的制备方法。

背景技术

生化药物是将生物体存在的生物活性物质用于预防、诊断和治疗疾病的一大类药物。它来源于生物体内起重要生理作用的各种生命基本物质或其衍生物。因此当机体发生疾病时，应用生化药物来纠正人体的代谢失调是比较合理的。所以生化药物在医疗上具有疗效好、毒副作用小等优点，已为世界各国所重视，并迅速发展为制药工业的一大类。近年来生化药物的资源不断扩大，从植物和微生物提取、分离的生化药物逐年增加，但动物来源的生化药物仍占很大比例。其中动物血液是数量巨大的资源，但其开发利用有限。且大部分随污水排掉，造成环境污染。利用先进的技术设备科学地分离血液的不同成分，应用于医药、食品、医疗诊断、饲料添加和其他工业生产方面，国内外都是在七十年代以后才开始发展起来的。七十年代以前国内外主要利用全血生产工业血粉作为复合饲料添加剂和工厂业粘合剂。七十年代以后。国外开始研究血液的分离技术设备，他们把着眼点放在采用现代工业先进的分离技术设备上，将血浆和红血球进行分离，得到了符合食品卫生标准的血浆蛋白，为食品工业提供了天然食品添加剂。

我国生猪生产量居世界第一位，据调查，我国年生产猪血量为63万吨，其中各肉联厂可收集猪血21万吨。近几年，我国科技工作者面对如此巨大数量的猪血资源进行了大量研究和试验已经生产出多种生化医药产品和饲料、食品添加剂。特别在医药科研方面，取得较高水平的科研成果，在某些方面，已达到了国际先进地位，诸如“2号代血浆”、“O型治疗血清”以及SOD等。

SOD是一种重要的超氧阴离子自由基清除剂，人体引起疾病、衰老等的氧自由基特别是超氧阴离子自由基均可被歧化清除，达到治疗疾病和预防衰老的目的。由于SOD的特殊作用机理，已受到国内外生化界、医药界的高度广泛重视。据报道，国外已开发的SOD有30余种，其中已完成氨基酸序列分析的达12种、在美国、西德、澳大利亚等国已有商品出售，并用于部分疾病的临床治疗。国内已开发出20多种SOD，但从实用性而言，则以动物血液最为理想：①来源丰富；②成本低廉；③提取纯化简便。经过近十年的艰苦努力，我国从牛血和猪血中提取纯化的SOD作为化妆品和食品添加剂已进入商品化阶段；作为药用酶已被卫生部新药审批委员会批准进行三期临床试验，可望于不久的将来有自己的药用SOD投放市场；人SOD已完成基因表达。这说明我国SOD的研究已进入新的时期。并且，部分研究已进入世界先进行列，同时也为我国展现了SOD的美好应用前景。

牦牛在分类学上属于牛属、牦牛亚属、牦牛种。据报道，其生理生化特征与黄牛有较大的差异。我国是世界牦牛的故乡。西部地区是牦牛的发源地和主要产区，全国牦牛总数为1300万头，占世界总数的85％以上。牦牛具有四大特点：①对高寒草原的强适应性；②具有充分发挥高寒草原土地利用率和提高其生产力与经济价值的特点；③牦牛是青藏高寒草原与邻近农牧业区交界地带与其它牛种杂交生产犏牛，发挥杂交优势的重要亲本；④牦牛是我国青藏高原农牧民的生活与经济资源。为发展我国青藏高原少数民族经济与巩固各民族的团结，必须发展牦牛及其附属犏牛业，由此可见，发展牦牛业与执行民族政策有着密切关系与重要政治意义，此是又一特点。加之我国是世界牦牛生产的主要国家，中国牦牛的兴衰与世界牦牛的兴衰紧密相关。我国党和政府对牦牛生产及其发展，给予了充分的重视和支持，1979年在农业部的领导下，成立了中国牦牛科研协作组，1980年创办了《中国牦牛》，这是世界上第一本牦牛专业杂志；1989年相继出版了两本有关中国牦牛的专著，《中国牦牛学》《中国的牦牛》。这是十分可喜的。然而，有关牦牛血液系列生化制品及其脏器的综合利用的研究却稀有罕见。尚无报导。

本发明的主要目的是为了提供一种利用牦牛血液提取具有酶总活力和酶比活高、无污染的牦牛血超氧化物歧化酶。

本发明的另一目的是为了提供一种SOD总活性损失少、平均酶活相比同类产品高1倍左右、得率高、生产周期短、使用试剂省、操作简单的牦牛血超氧化物歧化酶的提取纯化工艺。

本发明的目的还在于提供一种牦牛血超氧化物歧化酶在保健品、药品、食品、化妆品中的应用。

本发明的主要目的可通过如下措施来实现：

一种牦牛血超氧化物歧化酶由下述方法制备获得：①将牦牛血去除血浆得红血球，用红血球的2-4倍体积的盐液清洗红血球2-6次，再往红血球内加入0.5-1.5倍的水，搅拌使其溶血；②将溶血液冷却至4--4℃，加入溶血液体积的0.15-0.35倍、温度为至少-10℃、浓度为90-98％的酵和溶血液体积的0.1-0.2倍、浓度为90-98％的氯仿，混合后再稀释去除杂蛋白得蛋黄色上清液；③将醇相上清液升温至室温再加入体积比为1∶(0.5-1.5)的固体磷酸氢二钾；分离得淡蓝色上清液；④将③步最后的上清液冷却至至少0℃，再加入上清液体积的0.5-1倍、温度为至少-10℃的丙酮，然后得到沉淀物，用水溶解沉淀物，将溶解液置于透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄的缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液，⑤将淡绿色清液进行超滤即得超氧化物歧化酶。

本发明的另一目的可通过如下措施来实现：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的提取纯化工艺包括下述工艺步骤：①将牦牛血除去血浆得红血球，用红血球体积的2-4倍、0.5-1.5％的盐液清洗红血球2-6次，再往红血球内加入体积比为1∶(0.5-1.5)的水，搅拌后使其溶血；②将溶血液冷却至4--4℃，搅拌加入溶血液体积的0.15-0.35倍、温度为至少-10℃、90--98％的醇和溶血液体积的0.1-0.2倍、90-98％的氯仿，混合搅拌，再加入溶血液体积的0.1-0.2倍的水稀释，离心去除杂蛋白，得蛋黄色上清液，测定其SOD总活力；③将醇相上清液升至室温，加入上清液体积的0.5-1.5倍的固体磷酸氢二钾溶解，静置分离得上相液，上相液含有氯仿、醇和少量盐，离心上相液得淡蓝色上清液；④将③步中最后的上清液冷却至至少0℃，边搅边加入上清液体积的0.5-1倍、温度为至少-10℃的丙酮，离心后得蓝绿色沉淀，然后往沉淀物中加入沉淀物体积的0.5-1.5倍的水溶解；溶解液放透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液；⑤将淡绿色清液超滤即得牦牛血红胞超氧化物歧化酶。

本发明还可以通过如下措施来实现：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的应用，牦牛血超氧化物歧化酶在保健品中的应用。牦牛血超氧化物歧化酶在药品中的应用。牦牛血超氧化物歧化酶在食品中的应用。牦牛血歧化酶在化妆品中的应用。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明从大量废弃的牦牛血液中提取的超氧化物歧化酶的酶总活力高达90万单位/l，为同类产品的2-3倍；其平均酶比活为13000u/mg，为同类产品的1倍左右；本发明因从牦牛血液中提取SOD，而牦牛为青藏高原唯一无污染净区产物，因而其提取物纯净无污染。

2、本发明的提取纯化工艺严格控制提取过程中血液的PH值在5.3-7.2之间，可确保SOD的稳定性；并在工艺过程中严格控制萃取、液相分离的温度及时间，从而可避免乳化而影响分离效果，提高了SOD的平均酶活，且活力回收可达64.3％；因而本发明的SOD总活性损失少，得率高，生产周期短，使用试剂省，操作简单。

3、本发明的SOD可用作保健品、食品、药品和化妆品添加剂。

本发明还将结合实施例作进一步详述：

实施例1：

一种牦牛血超氧化物歧化酶由下述方法制备获得：①将新鲜牦牛血离心去除血浆得红血球，用红血球的2倍体积的NaCl溶液清洗红血球3次，再往红血球内加入0.5倍的无离子水，搅拌使其溶血；②将溶血液冷却至2℃，加入溶血液体积的0.2倍、温度为-11℃、浓度为94％的乙醇和溶血液体积的0.1倍、浓度为94％的氯仿，混合后再稀释去除杂蛋白得蛋黄色上清液；③将乙醇相上清液升温至室温再加入体积比为1∶1的固体磷酸氢二钾；分离得淡蓝色上清液；④将③步最后的上清液冷却至0℃，再加入上清液体积的0.7倍、温度为-11℃的丙酮，然后得到沉淀物，用沉淀物体积0.6倍的无离子水溶解沉淀物，将溶解液置于透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄的缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液，⑤将淡绿色清液进行超滤即得超氧化物歧化酶。

一种牦牛血超氧化物歧化酶的提取纯化工艺包括下述工艺步骤：①将新鲜牦牛血离心除去血浆得红血球，用红血球体积的2倍、1％的NaCl液清洗红血球3次，再往红血球内加入0.5倍的无离子水，搅拌30分钟后使其溶血：②将溶血液冷却至2℃，搅拌加入溶血液体积的0.2倍、温度为-11℃、94％的乙醇和溶血液体积的0.1倍、94％的氯仿，混合搅拌20分钟，此时溶液变得浓稠，充分搅拌，再加入溶血液体积的0.15倍的水稀释，离心去除杂蛋白，得蛋黄色上清液，测定其SOD总活力；③将醇相上清液升至室温，加入上清液体积的1倍的固体磷酸氢二钾溶解，静置5分钟，下相液含有大部分盐分，上相液含有氯仿、乙醇和少量盐分，并有棕色沉淀产生，弃去下层，收集上相并离心上相液得淡蓝色上清液；④将③步中最后的上清液冷却至0℃，边搅边加入上清液体积的0.7倍、温度为-11℃的丙酮，离心后得蓝绿色沉淀，然后往沉淀物中加入沉淀物体积的0.6倍的无离子水溶解；溶解液放透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液；⑤将淡绿色清液超滤即得牦牛红胞超氧化物歧化酶。

实施例2：

一种牦牛血超氧化物歧化酶由下述方法制备获得：①将新鲜牦牛血离心去除血浆得红血球，用红血球的4倍体积的NaCl溶液清洗红血球4次，再往红血球内加入1倍的无离子水，搅拌使其溶血；②将溶血液冷却至0℃，加入溶血液体积的0.3倍、温度为-10℃、浓度为96％的乙醇和溶血液体积的0.2倍、浓度为96％的氯仿，混合后再稀释去除杂蛋白得蛋黄色上清液；③将乙醇相上清液升温至室温再加入体积比为1∶1.5的固体磷酸氢二钾；分离得淡蓝色上清液；④将③步最后的上清液冷却至-2℃，再加入上清液体积的1倍、温度为-10℃的丙酮，然后得到沉淀物，用沉淀物体积1倍的无离子水溶解沉淀物，将溶解液置于透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄的缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液，⑤将淡绿色清液进行超滤即得超氧化物歧化酶。

其制备工艺与例一同，其反应条件为本实施例的条件。

实施例3：

一种牦牛血超氧化物歧化酶由下述方法制备获得：①将新鲜牦牛血离心去除血浆得红血球，用红血球的3倍体积的NaCl溶液清洗红血球5次，再往红血球内加入1.5倍的无离子水，搅拌使其溶血；②将溶血液冷却至-2℃，加入溶血液体积的0.35倍、温度为-13℃、浓度为98％的乙醇和溶血液体积的0.15倍、浓度为98％的氯仿，混合后再稀释去除杂蛋白得蛋黄色上清液；③将乙醇相上清液升温至室温再加入体积比为1∶0.5的固体磷酸氢二钾：分离得淡蓝色上清液；④将③步最后的上清液冷却至-4℃，再加入上清液体积的0.5倍、温度为-12℃的丙酮，然后得到沉淀物，用沉淀物体积1.5倍的无离子水溶解沉淀物，将溶解液置于透析袋中相对于2.5mm、PH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄的缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液，⑤将淡绿色清液进行超滤即得超氧化物歧化酶。

其制备工艺与例一同，其反应条件为本实施例的条件。

应用实施例1：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的应用是将牦牛超氧化物歧化酶用在保健品中，以牦牛血SOD为主配以红景天可制成保健品，其中SOD的添加量为3万单位/30ml。

应用实施例2：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的应用是将牦牛血超氧化物歧化酶用在药品中，将牦牛血SOD为主配以冬虫夏草，可用于抗衰老、抗老年痴呆症等，SOD的添加量为15000u/ml。

应用实施例3：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的应用是将牦牛血超氧化物歧化酶用在食品中，以食品基料为主添加牦牛血SOD，其添加量为3万单位/30ml。

应用实施例4：

一种牦牛血超氧化物歧化酶的应用是将牦牛血超氧化物歧化酶用在化妆品中，以化妆品基料为主添加牦牛血SOD，其添加量为5000u/20g。

Claims (1)

1、一种牦牛血超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于包括下述工艺步骤：①将牦牛血除去血浆得红血球，用红血球体积的2-4倍、0.5-1.5％的盐液清洗红血球2-6次，再往红血球内加入体积比为1∶(0.5-1.5)的水，搅拌后使其溶血；②将溶血液冷却至-4-4℃，搅拌加入溶血液体积的0.15-0.35倍、温度为至少-10℃、90-98％的醇和溶血液体积的0.1-0.2倍、90-98％的氯仿，混合搅拌，再加入溶血液体积的0.2倍的水稀释，离心去除杂蛋白，得蛋黄色上清液，测定其SOD总活力；③将乙醇相上清液升至室混，加入上清液体积的0.5-1.5倍的固体磷酸氢二钾溶解，静置分离得上清液，上相液含有氯仿、醇和少量盐，离心上相液得淡蓝色上清液；④将③步中最后的上清液冷却至至少0℃，边搅边加入上清液体积的0.5-1倍、温度为至少-10℃的丙酮，离心后得蓝绿色沉淀，然后往沉淀物中加入沉淀物体积的0.5-1.5倍的水溶解；溶解液放透析袋中相对于2.5mM、pH7.6的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液透析，离心透析液得淡绿色清液；⑤将淡绿色清液超滤即得牦牛血红胞超氧化物歧化酶。