CN1243767C - 免疫调节性类固醇,特别是16α-溴表雄酮的半水合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有通式1类固醇即16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物以及一种或多种赋形剂的组合物,通常该组合物的含水量低于约3%。该组合物对于制备改进的药物制剂是有用的。本发明也提供一种间歇式给药类固醇化合物如16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮的类似物的方法,以及用于这种给药方案的组合物。本发明还提供使用某些类固醇以及类固醇类似物抑制病原体(病毒)复制、改善与免疫失调有关的症状并调节患者的免疫反应的组合物和方法。本发明也提供制备以及使用免疫调节组合物和制剂的方法。
Description
发明背景
本发明涉及制备和使用类固醇的方法,类固醇如16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮(16α-溴表雄(甾)酮或下文的“BrEA”)以及新型类似物。类固醇适用于一些治疗性或非治疗性用途,包括使用它们作为免疫调节剂。本发明也涉及制备此类化合物、组合物以及制剂的方法。
已经公开了BrEA以及从类固醇化合物3β-羟基雄-5-烃-17-酮(脱氢表雄(甾)酮或“DHEA”)制备BrEA(例如请参见,有机化学学报(J.Org.Chem.)1962 27:2937-38)。已经公开了制备DHEA及其它类固醇的方法以及它们的生物特性,例如请参见,美国专利USP 2833793,2911418,3148198,3471480,3976691,4268441,4427649,4542129,4666898,4956355,5001119,5043165,5077284,5028631,5110810,5157031,5162198,5175154,5277907,5292730,5296481,5372996,5387583,5407684,5424463,5461042,5478566,5506223,5518725,5527788,5527789,5532230,5559107,5562910,5583126,5585371,5587369,5591736,5593981,5610150,5635496,5641766,5641768,5656621,5660835,5686438,5696106,5700793,5707983,5709878,5710143,5714481,5728688,5736537,5744462,5753237,5756482,5776921,5776923,5780460,5795880,5798347,5798348,5804576,5807848,5807849,5811418,5824313,5824668,5824671,5827841,5837269,5837700,5843932,5846963,5859000,5872114和5872117;德国专利2035738和2705917;PCT申请WO95/21617,WO97/48367,WO98/05338,WO98/50040,WO98/50041,WO98/58650;欧洲专利EP0020029;BenDavid等,Proc.Soc.Expt.Biol.Med.,1967 125:1136-1140,Coleman等,糖尿病(Diabetes)1982 31:830,Oertel等,类固醇生物化学学报(J.Steroid Biochem.)19723:493-496,Pashko等,致癌作用(Carcinogenesis)1981 2:717-721,Schwartz等,Nutr.Cancer 19813:46-53;Dyner等,爱滋病学报(J.Acquired Immune DeficiencySyndromes)1993 6:459-465;A.A.Afanasii和Y.A.Titov,类固醇的全合成(Total Steroid Synthesis),Plenum Press,New York,1970,例如请参见p1-304。
已经公开了使用DHEA以及其它类固醇用于多种用途例如调节免疫反应,例如美国专利USP 5869090,5863910,5856340,5824668,5804576,5753237,5714481,5709878,5407684,5206008,5077284,4978532,4898694,4542129,3711606和3710795。美国专利4956355和PCT申请WO97/48367公开了使用BrEA以及某些类固醇化合物处理某些病毒或细菌感染,如人体免疫缺乏病毒(“HIV”)感染。
已经公开了类固醇化合物的多种生物作用和/或新陈代谢转换,例如Batta等,生物化学学报(J.Biol.Chem.)1986 25:127-133,Belli等,肝(Liver)1991 11:162-169,Bhattacharjee等,分析生物化学(Anal.Biochem.)1992 201:233-236,Blake等,国际肽蛋白质研究学报(Int.J.Peptide Protein Res.)1982 20:97-101,1986 25:127-133,Bonaventura,Am.J.Obstet.Gynecol.1978 131:403-409,Bucala等,类固醇生物化学学报(J.Steroid Biochem.),1986 25:127-133,Carey等,Biochem.,198120:3637-3648,Chen等,致癌作用(Carcinogenesis)1999 20:249-254,Chen等,Carcinogenesis 1998 19:2187-2193,Chow等,Antisense Res.Dev.19944:81-86,Citro等,Dis.Colon Rectum 1994 37(2 Suppl):Sl27-Sl32,Cleary,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1991 196:8-16,Cleary,Int.J.Biochem.1990 22:205-210,Crawford等,Lab.invest.1994 71:42-51,Danenberg等,Antimicrob.Agents Chemother.1992 36:2275-2279,Dotzlaw等,癌症研究(Cancer Res.)1999 59:529-532,Falany等,J.Steroid Biochem.Mol.Biol.1994 48:369-375,Faredin等,J.Investigative Dermatol.1969 52:357-361,Galigniana等,Mol.Pharmacol.1999 55:317-323,Goto等,J.Chromatogr.1983 276:289-300,Grenot,Biochem.1992 31:7609-7621,Hofbauer等,生命科学(Life Sci.)199964:671-679,Huijghebaert等,J.Lipid Res.1986 27:742-752,Hurd等,致癌基因(Oncogene)1999 18:1067-1072,Lida等,J.Lipid Res.199536:628-638,Jellinck等,Steroids 1967 10:329-346,Jonsson等,J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.1995 20:394-402,Kalimi等,Mol.Cell.
Biochem.1994 131:99-108,Kramer等,J.Bial.Chem.1994 269:10621-10627,LaRochelle等,Steroids 1984 43:209-217,Liao等,Carcinogenesis1998 19:2173-2180,Lillienau等,J.Clin.Invest.1992 89:420-431,Loria,心理神经内分泌学(Psychoneuroendocrinology)1997 22:S 103-S 108,Luscher等,Mol.Immunol.1983 20:1099-1105,Manna等,J.Biol.Chem.1999 274:5909-5918,Marschall等,J.Biol.Chem.1989 264:12989-12993,Medh等,Cancer Res.1998 15:3684-3693,Mohan等,Steroids 1992 57:244-247,Munoz de Toro等,J.Steroid Blochem.Mol.Biol.1998 67:333-339,Padgett等,神经免疫学学报(J.Neuroimmunol.)1998 84:61,Padgett等,Ann.N.Y.Acad. Sci.1995 774:323,Padgett等,J.Immunol.1994 153:1544-1552,Pashko等,Carcinogenesis 1984 5:463-466,Pashko等,Carcinogenesis 1981 2:717,Petrylak等,临床肿瘤学学报(J.Clin.Oncology)1999 17:958-967,Podesta等,Steroids 1996 61:622-626,Regelson等,Ann.N.Y Acad.Sci.1994 719:564,Schmassmann等,胃肠病学(Gastroenterology)1993 104:1171-1181,Schmassmann等,肝脏病学(Hepatology)1990 11:989-996,Schreiber等,柳叶刀(Lancet)353:459-461,Schreiber,Neth.J.Med.1998 53:S24-31,Schwartz等,CancerRes.1988 48:4817,Shahidi等,Biochem.Bilphys.Res.Commun.1999254:559-565,Steer等,Ann.Rheum.Dis.1998 57:732-737,Suzuki等,Steroids 1998 63:.672-677,Suzuki等,Steroids 1996 61:296-301,Swaan等,生物结合化学(Bioconjugate Chem.)1997 8:520-525,Tang等,抗癌药物综述(Anticancer Drug Res.)1998 13:815-824,Thomas等,J.SteroidBiochem.1986 25:103-108,Utsumi等,Cancer Res.1999 59:377-381,Vanden Heuvel,J.Nutr.1999 129(2S Suppl.):575S-580S,Wang等,内分泌学(Endocrinology)1998 139:3903-3912,Wong等,J.Biol.Chem.1999 274:5443-5453,Xie等,Endocrinology 1999 140:219-227,Yen等,Lipids 1977 12:409-413,Zackheim等,Arch.Dermatology 1998 134:949-954,Zhang等,生物化学生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1991 1096:179-186,Zhu等,致癌作用(Carcinogenesis)1988 19:2101-2106。
含有BrEA用于把化合物输送到细胞或细胞抽提物的组合物通常包含很多水。这种包含溶剂如二氧六环或二甲亚砜(“DMSO”),水,或一种环糊精的溶液的组合物有助于化合物到细胞的传递,例如请参见药物实验治疗学学报(J.Pharmacol Exp.Ther.)1998,285:876-83,癌症研究(Cancer Res.)1986 46:3389-95,致癌作用(Carcinogenesis)19856:333-35,1981 2:717-721,1981 2:683-86。这种组合物通常是通过注射进入动物体内,或通过加到细胞培养介质中而进入组织培养中的细胞。欧洲公开号EP429187揭示了含有DHEA或BrEA以及聚乙烯吡咯烷酮和交联聚乙烯吡咯烷酮的制剂。某些这样的组合物可能不理想或未达最佳标准的特性。例如,溶剂如二氧六环,DMSO或氯仿通常不是最好的或合适的非肠道赋形剂,特别是对于人体使用。人们需要含有BrEA或相关类固醇,并具有改进了性能的制剂,改进的性能如低毒、改进的化学稳定性或理想的适用于大规模合成的特性。
哺乳动物对于感染或其它病症的免疫响应通常具有特征为通过不同的效应细胞群介导的反应。在许多情况下,在鼠类动物体系中称为Th1的辅助T细胞会促进通常主要是细胞介导的反应的免疫效应子功能。在其它情况下,称为Th2的辅助T细胞会促进通常主要为体液反应的免疫效应子功能。通常需要有力的Th1反应以消除感染或减缓感染的进展。当患者的免疫反应倾向或主要为Th2型反应时,与Th2相关联的细胞因子倾向于在同一时间抑制免疫系统增强Th1反应的能力。这种相反的过程一般是真实存在的。当哺乳动物的免疫反应开始导致Th2反应增强时,对同样条件作出的Th1反应倾向于减弱。弱的Th1反应可能与某些感染或其它病症的进展有关,例如请参见,M.Clerici和G.M.Shearer,现代免疫学(Immunol.Today)14:107-111,1993;M.Clerici和G.M.Shearer,现代免疫学(Immunol.Today)15:575-581,1994。这些发明提供的化合物和组合物对增强Th1免疫反应有用处。
本发明的目的
本发明的组合物、制剂或方法达到以下一个或多个目的。
本发明的一个目的是提供适用于治疗或其它用途如免疫调节的新型类固醇化合物或类似物。本发明的目的还包括提供BrEA半水合物(BrEA2·H2O)、含有BrEA半水合物的组合物以及制备和使用方法。本发明的另一个目的是提供含有通式1表示的化合物并含有约3体积%或更少水的液体组合物和制剂。本发明的另一个目的是提供可作为中间体用以制备含有通式1表示的化合物的人用和兽用药物制剂。本发明的另一个目的是提供把通式1表示的化合物用于患者以增强Th1免疫反应的间歇式给药方法。进一步的目的是提供调节先天免疫或通过对患者给药通式1表示的化合物如BrEA以增强Th1免疫反应的方法。
本发明的其它目的是提供方法,通过对患者给药通式1表示的化合物如BrEA以抑制病原体如病毒在患者体内的复制。本发明的目的包括提供对改善与免疫抑制或缺乏Th1免疫反应有关的病理状况的一种或多种症状有用的通式1表示的化合物或制剂。本发明的其它目的是提供制备和使用含有通式1表示的化合物的组合物和制剂的方法。
附图简述
图1是通过USP方法<197>获得的通过从乙醇和水中沉淀BrEA制备的BrEA半水合物的FTIR(傅立叶变换红外)光谱。图2是通过USP方法<197>获得的通过从无水甲醇中沉淀BrEA制备的无水BrEA的FTIR光谱。图3显示了通过从乙醇和水中沉淀BrEA制备的BrEAr半水合物的DSC吸热。图4显示了通过从无水甲醇中沉淀BrEAr制备的种或多种细胞因子或白介素表达的方法,此类细胞因子或白介素用于促进患者的Th2免疫反应,包括给患者用有效量的权利要求32的组合物,由此患者的Th1免疫反应得到加强,而患者的不需要的Th2免疫反应得到减弱。
实施方案包括含有通式1所表示的化合物的液体制剂、一种或多种赋形剂以及少于约3重量%的水,其中该制剂被任意置于不包含水的容器中。
另一个实施方案是一种方法,包括对患者间歇式给用通式1表示的化合物,患者具有病理状况如病毒或寄生虫感染。
还有一个实施方案是一种调节患者先天免疫Th1免疫反应或Th2免疫反应的方法,其包括对患者给用通式1所表示的化合物。
另一个实施方案在包括附带的几个实施方案以及权利要求的说明书中描述。
本发明详述
定义:如果上下文中没有另外指明或暗示,按此处所使用的来定义以下的术语。
一种“发明制剂”或“制剂”是指一种发明组合物,不进一步进行改变所存在的组分或组分比例的处理,该组合物可以经非肠道对人或动物给药。该制剂适用于人或兽医用途。
“发明组合物”是一种组合物,作为一种中间体,人们可用它来制备该发明制剂,即改变所需的组分或用量制备制剂。因此,本发明组合物包括这样的组合物,即在成为制剂之前,还需进一步的处理,如混合或加入所需量的组分。无水BrEA的DSC吸热。图5是通过从乙醇和水中沉淀BrEA制备的BrEA半水合物的XRD(粉末X射线衍射)光谱。图6是通过USP方法<197>获得的通过从丙酮和水中沉淀BrEA制备的BrEA半水合物的FTIR光谱。
本发明概述
按照本发明的目的,本发明提供BrEA半水合物,该半水合物通过参考一种或多种物理性质如熔点、红外吸收光谱或粉末X射线衍射光谱进行选择性表征。
相关的实施方案包含BrEA半水合物以及一种或多种适用于人用药物或兽用的赋形剂。另一个相关的实施方案是一种制备BrEA半水合物的方法,BrEA半水合物包括从一种包含乙醇和水的溶液中沉淀的BrEA。
发明实施方案包括一种含有通式1表示的化合物的组合物以及一种或多种非水溶液液体赋形剂,其中组合物含有少于3体积%的水,
其中,R1、R2、R3、R4、R5、R6和R10独立地为-H、-ORPR、-SRPR、-N(RPR)2、-O-Si-(R13)3、-CN、-NO2、酯、硫酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、亚硫酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、肽、醚、硫醚、酰基、硫代酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫缩醛、卤素、选择性取代的烷基、选择性取代的链烯基、选择性取代的炔基、选择性取代的芳基部分、选择性取代的杂芳基部分、选择性取代的单糖、选择性取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、聚合物,或,
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R15、R17和R18中的一个或多个为=O或=S并且不存在键连到同一个碳原子上的氢原子,或,
R3和两个R4一起包含通式2的结构,
R7为-CHR10-、-CHR10-CHR10-、-CHR10-CHR10-CHR10-、-CHR10-O-CHR10-、-CHR10-S-CHR10-、-CHR10-NRPR-CHR10-、-O-、-O-CHR10-、-S-、-S-CHR10-、-NRPR-或-NRPR-CHR10-;
R8和R9独立地为-CHR10-、-CHR10-CHR10-、-O-、-O-CHR10-、-S-、-S-CHR10-、-NRPR-或-NRPR-CHR10-,或各自不存在R8或R9,保持5元环。
R13独立地为C1-6烷基;
R16独立地为-CH2-、-O-、-S-、或-NH-;
D为杂环或包含饱和碳原子的4、5、6或7元环,其中4、5、6或7元环的1、2或3个环碳原子选择性地被-O-、-S-或-NRPR-置换;或该杂环的1、2或3个氢原子或该4、5、6或7元环的1或2个氢原子被-ORPR-、-SRPR-、-N(RPR)2、-O-Si-(R13)3、-CN、-NO2、酯、硫酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、亚硫酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、肽、醚、硫醚、酰基、硫代酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫缩醛、卤素、选择性取代的烷基、选择性取代的链烯基、选择性取代的炔基、选择性取代的芳基部分、选择性取代的杂芳基部分、选择性取代的单糖、选择性取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸或聚合物置换,或,
一个或多个环碳被=O或=S取代,
或D包含两个5或6元环,其中两个环是稠合的或通过一个或两个键连接的。
在其它的实施方案中,本发明提供通式1表示的化合物,其中R7、R8、R9中的两个或三个独立地不为-CHR10的基团,其中该化合物可选择性地存在于一种组合物中,该组合物含有一种或多种适用于人类用药或兽医用途的赋形剂。
本发明的实施方案也包括通式1表示的化合物,
其中,R1、R2、R3、R4、R5、R6和R10独立地为-H、-ORPR-、-SRPR-、-N(RPR)2、-O-Si-(R13)3、-CN、-NO2、酯、硫酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、亚硫酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、肽、醚、硫醚、酰基、硫代酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫缩醛、卤素、选择性取代的烷基、选择性取代的链烯基、选择性取代的炔基、选择性取代的芳基部分、选择性取代的杂芳基部分、选择性取代的单糖、选择性取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、聚合物,或
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R10中一个、两个或多个独立地为=O或=S,并且不存在键连到同一个碳原子上的氢,或R3、R4一起组成通式2的结构,
R7为-CHR10-、-CHR10-CHR10-、-CHR10-CHR10-CHR10-、-CHR10-O-CHR10-、CHR10-S-CHR10-、-CHR10-NRPR-CHR10-、-O-、-O-CHR10-、-S-、-S-CHR10-、-NRPR-、或-NRPR-CHR10-;
R8和R9独立地为-CHR10-、-CHR10-CHR10-、-O-、-O-CHR10-、-S-、-S-CHR10-、-NRPR-或-NRPR-CHR10-,或各自不存在R8或R9,保持5元环;
R13独立地为C1-6的烷基;
D为杂环或包含饱和的碳原子的4、5、6或7元环,其中该4、5、6或7元环的1、2或3个环碳原子选择性被-O-、-S-或-NRPR-置换,或该杂环的1、2或3个氢原子或该4、5、6或7元环的1或2个氢原子被-ORPR-、-SRPR-、-N(RPR)2-、-O-Si-(R13)2-、-CN、-NO2、酯、硫酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、亚硫酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、肽、醚、硫醚、酰基、硫代酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫缩醛、卤素、选择性取代的烷基、选择性取代的链烯基、选择性取代的炔基、选择性取代的芳基部分、选择性取代的杂芳基部分、选择性取代的单糖、选择性取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、聚合物取代,或,
一个或多个环碳被=O或=S取代,
或D包含两个5或6元环,其中两个环是稠合的或通过一个或两个键连接的,其中R7、R8、R9中的一个、两个或三个不是-CHR10-。
其它实施方案包括加强一种或多种细胞因子或白介素的表达的方法,此类细胞因子或白介素用于促进患者的Th1免疫反应;或减弱一“赋形剂”是指一种成分或组分,在与本发明组合物或制剂的其它组分的相容性方面是可接受的,并且对于要接受给药的病人或动物完全无害。作为此处所使用的“赋形剂”包括液体如苯甲酸苄酯、棉籽油、N,N-二甲基乙酰胺、C2-12醇(如乙醇)、甘油、花生油、聚乙二醇(PEG)、维生素E、罂粟籽油、丙二醇、红花油、芝麻油、大豆油和植物油。此处使用的赋形剂选择性不包括氯仿、二氧六环、植物油、DMSO或这些物质的混合物。赋形剂包含一种或多种典型用于药物制剂技术的成分,如填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂。
“患者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴(cynomologous monkeys)、蛛猴和短尾猿如猕猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、美洲旱獭、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和野生动物包括母牛、马、猪、鹿、美洲野牛、水牛、猫科如家猫、犬类如狗、鸟类如鸡、鸸鹋、鸵鸟以及鱼类如鳟鱼和鲑鱼。患者包括前述的如所有的上述动物的任何子集,但不包括一个或多个群或物种如人类、灵长类或啮齿类。
“通式1表示的化合物”或“通式1表示的一种化合物”这样的表达是指发明组合物或制剂,其中存在一种或一种以上通式1所表示的化合物,典型为1、2、3或4种,通常为1种。
这里使用的“烷基”是指连接的正链、仲、叔或环碳原子,即直链的、支链的或环状的。如果没有另外指明,烷基基团或烷基部分中的碳原子数为1-约20,如C1-8烷基是指含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基部分。烷基的例子包括甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基,-CH(CH3)2)、1-丁基(正丁基)、2-甲基-1-丙基(异丁基,-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(仲丁基,-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(叔丁基,-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
“链烯基”是指连接的正链、仲、叔或环碳原子,其中存在一个或多个双键(如-CH=CH-),典型为1、2或3个,通常为1或2个。如果没有另外指明,链烯基基团或部分的碳原子数目为2-约20,如C1-8链烯基是指链烯基部分包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子。
“炔基”是指连接的正链、仲、叔或环碳原子,其中存在一个或多个叁键(如-C≡C-),典型为1、2或3个,通常为1个。如果没有另外指明,炔基基团或部分的碳原子数目为2-约20,如C1-8炔基是指炔基部分包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子。
“芳基”是指苯基或萘基。
“取代的烷基”、“取代的链烯基”或 “取代的炔基”是指烷基、链烯基或炔基具有连接到碳原子上的取代基或间断碳原子链的取代基。取代基包括醚(-O-)、酮(-C(O)-)、-ORPR、-C(O)ORPR、-C(O)O-C(S)ORPR、-C(S)O-、-OC(O)-、-C(O)H、-OCH2-、-OCH2CH2-、-OCH2O-、-OCH2CH2O、-NRPR、-N(RPR)2、-NHRPR、-NHC(O)-、-CH2-NRPR-、-CH2-NHRPR、-CH2NHC(O)-、-C(O)NH-、-C(O)NHRPR、-OC(O)NRPR-、-OC(O)NHRPR、-NRPRC(O)NRPR-、-NRPRC(O)NHRPR、-NRPRCH2-、-NRPRCH2CH2-、-S-、-SRPR、-S(O)-、-S(O)(O)-、-S(O)ORPR、-S(O)H、-CN、-NO2、卤素和这些基团的组合,其中RPR独立地为氢、保护基团或两个RPR一起为保护基团。当存在一个以上的取代基时,可独立地选择取代基。含有取代基的链烯基和炔基,典型的是在碳原子上取代,该碳原子是一个或多个除去双键的亚甲基部分,如至少被一个、两个或多个-CH2-分离的部分。
杂环:举例来说,“杂环”或“杂环的”包括但不限于Paquette,LeoA的《现代杂环化学原理》(Principles of Modern HeterocyclicChemistry),特别是第1、3、4、6、7和9章;《杂环化合物化学,系列专题论文》(The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series ofMonographs)(John Wiley & Sons,New York,1950至今),特别是第13、14、16、19和28卷;以及美国化学会志(J.Am.Chem.Soc)1960,82:5566中所述的内容。
举例来说,杂环的例子包括但不限于吡啶基、噻唑基、四氢苯硫基、硫氧化的四氢苯硫基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基、吲哚基、二氢吲哚基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-硫二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、氧杂蒽基、吩噁噻吩基(phenooxathiinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁啉基、吡嗪基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酚嗪基、1,5-二氮杂萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔啉基、咔啉基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱、吩噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红基(isatinoyl)。
举例来说但不限于这些例子,碳键合的杂环键合在吡啶的2、3、4、5或6位,哒嗪的3、4、5或6位,嘧啶的2、4、5或6位,吡嗪的2、3、5或6位,呋喃、四氢呋喃、噻吩、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位,噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位,异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4、或5位,氮丙啶的2或3位,氮杂环丁烷的2、3或4位,喹啉的2、3、4、5、6、7或8位,异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。更典型地,碳键合的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
举例来说但不限于这些例子,氮键合的杂环键合在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯烷、3-吡咯烷、咪唑、咪唑烷、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位,异吲哚或异二氢吲哚的2位,吗啉的4位以及咔唑或β-咔唑的9位。氮键合的典型的杂环包括1-氮丙啶基(aziridyl)、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
“杂芳环”是指一个芳环或两个或多个含有一个或多个芳环的稠环,其中单环或稠环包含1、2、3个或更多个杂原子,杂原子通常为氧(-O-)、氮(-NX-)或硫(-S-),其中X为-H、一个保护基团或C1-6烷基,通常为-H。例子如对杂环所描述的例子。
此处使用的“醇”,通常用于赋形剂,是指一种醇,其含有C2-12烷基部分,其中一个氢原子被一个羟基置换。醇包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇、环己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇和正癸醇。醇中的碳原子可以是直链的、支链的或环状的。醇包括前述的任何子集,如C2-4醇(具有2、3或4个碳原子的醇)。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“保护基”是指一种基团,它防止它所连接的的原子发生不需要的反应。例如对于-ORPR,RPR可以是氢或用于保护羟基中氧原子的保护基,而对于-C(O)-ORPR,RPR可以是氢或羧基保护基,对于-SRPR,RPR可以是氢或用于保护硫醇中的硫的保护基,而对于-NHRPR或-N(RPR)2,RPR可以是氢或用于保护一级胺或二级胺的氮原子保护基。在通式1表示的化合物中存在羟基、胺以及其它的活泼基团,如R1或R2。这些基团可能需要保护以避免在分子的其它部位发生的反应。这些用于保护氧、硫或氮原子的保护基团通常用于防止与亲电化合物发生的不需要的反应,如在类固醇化学中使用的酰化作用。
“酯”是指包含-C(O)-O-结构的部分。此处使用的酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子(如约2-20个碳原子)以及0-约10个独立选择的杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-C(O)-O-结构如有机部分-C(O)-O-类固醇或有机部分-O-C(O)-类固醇,如在R1或R2位置连接到通式1所表示的类固醇核上。有机部分通常含有上述的任何一个或多个有机基团,如C1-20烷基部分、C2-20链烯基部分、C2-20炔基部分、芳基部分、C2-9杂环及其取代衍生物,如包含1、2、3、4个或更多个取代基,这些取代基可独立地选择。在这些有机部分中氢或碳原子的典型的取代基包括1、2、3、4或多个,通常为1、2或3个-O-、-S-、-NRPR-(包括-NH-)、-C(O)-、=O、=S、-N(RPR)2(包括-NH2)、-C(O)ORPR(包括-C(O)OH)、-OC(O)RPR(包括-O-C(O)-H)、-ORPR(包括-OH)、-SRPR(包括-SH)、-NO2、-CN、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)-O、-O-A8、-S-A8、-C(O)-A8、-OC(O)-A8、-C(O)-O-A8、=N-、-N=、=N-OH、-OPO3(RPR)2、-OSO3H2或卤素部分或原子,其中每个RPR为-H、独立地选择的保护基团或两个RPR一起组成保护基,且A8是C1-8烷基、C2-8链烯基、C1-4炔基、C1-4烷基-芳基(如苄基)、芳基(如苯基)或C0-4烷基-C2-9杂环。取代基可独立地选择。有机部分包括通过变量R4限定的化合物。很显然,有机部分不包括不稳定的部分,如-O-O-,除了可以把这种不稳定的部分用作过渡物质制备具有足够化学稳定性的化合物,用于此处所述的一种或多种用途。人们通常可以利用以上列举的取代基如-O-或-C(O)-置换一个或多个碳原子,或用如卤素、-NH2或-OH置换一个或多个氢原子。
“硫酯”是指包含-C(S)-O-结构的部分。此处使用的硫酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子(如约2-20个碳原子)以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-C(S)-O-结构如有机部分-C(S)-O-类固醇或有机部分-O-C(S)-类固醇,在R2位置连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“硫缩醛”是指包含-C(O)-S-结构的部分。此处使用的硫缩醛的典型情况是包含具有约1-50个碳原子(如约2-20个碳原子)以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-C(O)-S-结构如有机部分-C(O)-S-类固醇或有机部分-S-C(O)-类固醇,在R2位置连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“磷酯”或“磷酸酯”是指包含-O-P(ORPR)(O)-O-结构的部分,其中RPR为氢(-H)、保护基或上述酯中所述的有机部分。此处使用的磷酸酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-P(O)(O)-O-结构如有机部分-O-P(O)(OH)-O-类固醇,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“硫代磷酸酯”是指包含-O-P(SRPR)(O)-O-结构的部分,其中RPR为氢(-H)、保护基或上述酯中所述的有机部分。此处使用的硫代磷酸酯的典型情况是包含氢原子、具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-P(O)(O)-O-结构如有机部分-O-P(O)(SH)-O-类固醇,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“膦酸酯”是指包含-P(ORPR)(O)-O-结构的部分,其中RPR为氢(-H)、保护基或上述酯中所述的有机部分。此处使用的膦酸酯的典型情况是包含氢原子、具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-P(ORPR)(O)-O-结构即有机部分-P(ORPR)(O)-O-类固醇或类固醇-P(ORPR)(O)-O-有机部分,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“次膦酸酯”是指包含-P(ORPR)-O-结构的部分,其中RPR为氢(-H)、保护基或上述酯中所述的有机部分。此处使用的次膦酸酯的典型情况是包含氢原子、具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-P(ORPR)-O-结构即有机部分-P(ORPR)-O-类固醇或类固醇-P(ORPR)-O-有机部分,在位置R1-R6、R10、R18、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“硫酸酯”是指包含-O-S(O)(O)-O-结构的部分。此处使用的硫酸酯的典型情况是包含氢原子、具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-S(O)(O)-O-结构如有机部分-O-S(O)(O)-O-类固醇,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“亚硫酸酯”是指包含-O-S(O)-O-结构的部分。此处使用的亚硫酸酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-S(O)-O-结构如有机部分-O-S(O)-O-类固醇,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“硫缩醛”是指包含-S-C(O)-结构的部分。此处使用的硫缩醛的典型情况是包含具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过结构-S-C(O)-如有机部分-S-C(O)-类固醇或类固醇-S-C(O)-有机部分,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。该有机部分如上述对酯的描述。
“酰胺”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-C(O)-NRPR-部分的有机部分,通常含有1或2个,其中RPR为-H或保护基,通常为-H。在某些实施方案中,-C(O)-NRPR-基团在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到类固醇核上,即有机部分-C(O)-NRPR-类固醇或类固醇-C(O)-NRPR-有机部分。
“醚”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-O-部分的有机部分,通常含有1或2个。在某些实施方案中,-O-基团在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到类固醇核上,如有机部分-O-类固醇。
“硫醚”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-S-部分的有机部分,通常含有1或2个。在某些实施方案中,-S-基团在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到类固醇核上,如有机部分-S-类固醇。
“酰基”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-C(O)-基团的有机部分。在某些实施方案中,-C(O)-基团在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到类固醇核上,如有机部分-C(O)-类固醇。
“硫代酰基”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-C(S)-基团的有机部分。在某些实施方案中,-C(S)-基团在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到类固醇核上,如有机部分-C(S)-类固醇。
“碳酸酯”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-O-C(O)-O-基团的有机部分。此处使用的碳酸酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-C(O)-O-结构如有机部分-O-C(O)-O-类固醇,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。
“氨基甲酸酯”是指上述酯中所述的含有1、2、3、4或更多个-O-C(O)-NRPR-结构的有机部分,其中RPR为氢(-H)、保护基或上述酯中所述的有机部分。此处使用的氨基甲酸酯的典型情况是包含具有约1-50个碳原子以及0-约10个杂原子(如O、S、N、P、Si)的有机部分,其中有机部分通过-O-C(O)-NRPR-结构如有机部分-O-C(O)-NRPR-类固醇或类固醇-O-C(O)-NRPR-有机部分,在位置R1-R6、R10、R15、R17或R18连接到通式1所表示的类固醇核上。
此处使用的“单糖”是指具有实验式(CH2O)n的多羟基醛或酮,其中n为3、4、5、6或7。单糖包括开链和闭合链形式,但通常为闭合链形式。单糖包括呋喃己糖和呋喃戊糖如2’-脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、其2’-和3’-脱氧衍生物及2’,3’-二脱氧衍生物。单糖也包括核糖的2’,3’-二脱氧二脱氢衍生物。单糖包括葡萄糖、果糖、甘露糖、艾杜糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、阿卓糖、塔罗糖、海藻糖、赤藓糖、苏糖、来苏糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘油醛、二羟基丙酮及其一元脱氧衍生物如鼠李糖的D-、L-和DL-异构体。单糖被选择性保护或部分保护。
选择性取代的烷基、选择性取代的链烯基、选择性取代的炔基、选择性取代的芳基部分和选择性取代的杂环是指这样的一些取代基,包括C1-20烷基部分、C2-20链烯基部分、C2-20炔基部分、芳基部分、C2-9杂环或任一种的取代衍生物。这些有机部分的典型的取代基包括以下基团的1、2、3、4或更多个,通常为1或2个:-O-、-S-、-NRPR-、-C(O)-、-N(RPR)2、-C(O)ORPR、-OC(O)RPR、-ORPR、-SRPR、-NO2、-CN、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)-O、-O-A8、-S-A8、-C(O)-A8、-OC(O)-A8、-C(O)-O-A8、=N-、-N=、-OPO2RPR、-OSO3H或卤素部分或原子,其中RPR选择性为-H、保护基团或两个RPR一起组成保护基,且A8是C1-8烷基、C1-8链烯基、C1-8炔基、C1-4烷基-芳基(如苄基)、芳基(如苯基)或C1-4烷基-C1-5杂环。取代基可独立地选择。此处所述的有机部分以及此处所述的其它有机部分不包括不稳定的部分,如-O-O-,除了可以把这种不稳定的部分用作过渡物质制备具有足够化学稳定性的化合物,用于此处所述的一种或多种用途。
选择性取代的“单糖”包括任意C3-C7糖的D-、L-或DL-构型,如赤藓糖、甘油、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、葡萄糖胺、N-乙酰基神经氨糖酸、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺,其一个或多个羟基被选择性取代。合适的取代基包括氢、保护的羟基、羧基、叠氮基、氰基、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-O-C2-6链烯基、-S-C2-6链烯基、选择性保护的胺、选择性保护的羧基、卤素、硫醇或保护的硫醇。单糖间包括寡糖的键合为α或β。
选择性取代的“寡糖”包括互相之间共价键合的两个、三个、四个或更多任意C3-C7糖。键合的糖可能具有D-、L-或DL-构型。合适的糖和取代基如单糖所述。寡糖与类固醇间的键合为α或β,与单糖间包括寡糖的键合一致。
核苷包括3TC、AZT、D4T、ddl、ddC、G、A、U、C、T、dG、dA、dT和dC。
聚合物包括生物适合的有机聚合物,如一系列PEG和聚羟烷基聚合物。
PEG是指含有约20-约2000000个键连的单体的聚乙二醇,典型具有50-1000个键连的单体,通常含有100-300个。聚乙二醇包括含有各种键连单体数目的PEG,如PEG20、PEG30、PEG40、PEG60、PEG80、PEG100、PEG115、PEG200、PEG300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG4600、PEG5000、PEG6000、PEG8000、PEG11000、PEG12000、PEG2000000及其混合物。
氨基酸:“氨基酸”是指包含任何天然存在的或合成氨基酸残基的氨基酸部分,即任何含有至少一个羧基和至少一个通过一个、二个、三个或更多碳原子直接连接的氨基残基,典型的情况是通过一个α碳原子连接。位于羧基和氨基基团之间的插入结构的种类和特性有很多种结构,包括此处所描述的那些。通常通过氨基连接到类固醇上的氨基酸具有足够多的构象和长度,使其能够自动催化氨基酸-类固醇键的水解和类固醇的释放。当在体内产生游离的羧基时可以发生这些过程,游离的羧基是通过脱酯作用、脱酰胺基作用或包含氨基酸的氨基和类固醇之间的键合的前体的解肽切割产生的。氨基酸的羧基或氨基与类固醇之间的键合的水解也可以通过化学或酶活性发生,例如酯酶切割或非酶水解。
一般来说,与本发明化合物中使用的残基相对应的氨基酸是天然存在的并且其本身并不具有显著的药物活性。但是,通过使用非天然存在的氨基酸残基,也可以获得最佳的药物动力学活性(基本上完成了对末端酰胺或酯键的水解)。当氨基酸残基为甘氨酰基时,插入结构可以是象亚甲基这样的简单结构,或用于其它α氨基酸的取代的亚甲基。该结构通常在氨基酸的羧基碳和胺氮之间的直接键合中包含最多约5个碳原子或杂原子。因此,氨基酸可以包含插入的亚乙基、亚丙基、亚丁基或亚戊基基团或其取代类似物,这样的类似物例如氧酯或醚,其中氧置换了碳,并且当合适时置换氢。这种插入结构的一个例子是-CH-OC(R22)(R23)-,其中R22和R23为独立选择的氢或上述酯中所述的有机部分。在某些实施方案中,R22和R23中的一个为氢,另一个为C2-20有机部分。有机部分的典型情况是包含具有约1-20个碳原子以及独立选择的0、1、2、3、4或5个杂原子的有机部分,杂原子通常选自氧、氮、硫和磷。当期望更快的水解时,通常使用更少的插入原子,尽管更大的结构是适宜的,如果例如这些更大的结构具有足够的易弯曲性或具有允许羧基的位置接近氨基酸-类固醇键的构象。
通常R22为-H、甲基或羟甲基,一般为-H,而R23是天然存在的氨基酸的一个侧链或基团。氨基酸侧链包括类似物,其中侧链为与天然化合物对应的C1-15同系物,如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或其取代衍生物,例如烷基、醚或烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基)的取代衍生物。一般来说,对于含有羧基的侧链,如果侧链羧基的碳原子被5个或更少原子连接到N原子,那么羧基就会被选择性地通过如酯化作用或酰胺基化作用保护,其中酯键或酰胺键在体内可以水解。R22也可以与R30一起形成脯氨酸残基(-CH2-)3。因此,R23一般为侧基如-H、-CH3、-CH(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CHCH2-CH2-CH3、-CH2-C6H5、-CH2-CH2-S-CH3、-CH2OH、-CH(OH)-CH3、-CH2SH、-CH2-C6H4OH、-CH2-CO-NH2、-CH2-CH2-CO-NH2、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH、-(CH2)4-NH2和-(CH2)3-NH-C(NH2)-NH2。R23也可以包括3-胍基丙基、苄基、4-羟苄基、咪唑-4-基、吲哚-3-基、甲氧苯基和乙氧苯基。最佳的R30基团通过使用常规分析可以方便地选择。
一般来说,氨基酸残基具有如下面的通式所示的结构。通常n为1或2,R22为-H,R23为包含以下一个或多个基团的部分:氨基、羧基、酰胺、羧酸酯、羟基、C6-C7芳基、醚(-O-)、硫醚(-S-)、正、仲或叔烷基(C1-C6)、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基、亚砜和磷酰基。R22和R23取代基可以具有多种结构,包括此处所列举的,如酯、醚或碳酸酯。
当氨基酸残基包含一个或多个手性中心时,其D-、L-、内消旋体、苏式或赤式(当合适的时候)外消旋体或其混合物都属于本发明的范围。通常来讲,如果期望依赖非酶水解方法,D异构体也可以使用。另一方面,L异构体可能更通用,因为它们易于进行非酶以及潜在目标酶水解,并且在胃肠道中它们可以更有效地被氨基酸或二肽输送系统输送。
合适的氨基酸残基的例子包括以下内容:甘氨酰基;氨基多羧酸,如天冬氨酸、β-羟基天冬氨酸、谷氨酸、β-羟基谷氨酸、β-甲基天冬氨酸、β-甲基谷氨酸、β,β-二甲基天冬氨酸、γ-羟基谷氨酸、β,γ-二羟基谷氨酸、β-苯基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、3-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸和2-氨基癸二酸;氨基酸酰胺如谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基;多氨基或多碱单羧酸,如精氨酸、赖氨酸、β-氨基丙氨酸、γ-氨基三丁酸甘油酯、鸟氨酸、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、5-羟基-2,6-二氨基己酸(通常为羟基赖氨酸,包括同分异构的羟基赖氨酸)和二氨基丁酸残基;其它碱性的氨基酸残基如组氨酸基;二氨基二羧酸,如α,α’-二氨基丁二酸、α,α’-二氨基戊二酸、α ,α’-二氨基己二酸、α,α’-二氨基庚二酸、α,α’-二氨基-β-羟基庚二酸、α,α’-二氨基辛二酸、α,α’-二氨基壬二酸和α,α’-二氨基癸二酸残基;亚氨基酸,如脯氨酸、4-或3-羟基-2-吡咯烷羧酸(通常为羟基脯氨酸,包括同分异构的羟基脯氨酸)、γ-甲基脯氨酸、2-哌啶酸、5-羟基-2-哌啶酸、-N([CH2]nCOORPR)2(其中n为1、2、3、4、5、或6,RPR为-H或保护基)和氮杂环丁烷-2-羧酸残基;一或二烷基氨基酸(通常为C1-C8支链或正链的),如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、烯丙基甘氨酸、三丁酸甘油酯、正缬氨酸、正亮氨酸、heptyline、α-甲基丝氨酸、α-氨基-α-甲基-γ-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-6-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-ε-羟基己酸、异戊酸、α-甲基谷氨酸、α-氨基异丁酸、α-氨基-二乙基乙酸、α-氨基-二异丙基乙酸、α-氨基-二正丙基乙酸、α-氨基-二异丁基乙酸、α-氨基-二正丁基乙酸、α-氨基-乙基异丙基乙酸、α-氨基-正丙基乙酸、α-氨基-二异戊基乙酸、α-甲基-天冬氨酸、α-甲基-谷氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸;异亮氨酸、同分异构的异亮氨酸、叔亮氨酸、β-甲基色氨酸和α-氨基-β-乙基-β-苯基丙酸β-苯基丝氨酸基;α-氨基-β-羟基脂肪酸,如丝氨酸、β-羟基亮氨酸、β-羟基正亮氨酸、β-羟基正缬氨酸和α-氨基-β-羟基硬脂酸残基;α-氨基、α-、γ-、6-或ε-羟基酸,如高丝氨酸、γ-羟基正缬氨酸、δ-羟基正缬氨酸和ε-羟基正亮氨酸残基;刀豆氨酸基和副刀豆氨酸基;γ-羟基鸟氨酸;2-氨基己糖酸,如D-氨基葡萄糖酸或D-氨基半乳糖酸残基;α-氨基-β-硫醇,如青霉胺、β-硫醇正缬氨酸或β-硫醇三丁酸甘油酯残基;其它含硫的氨基酸残基包括半胱氨酸;高胱氨酸;β-苯基蛋氨酸;蛋氨酸;L-半胱氨酸亚砜的S异构体;2-硫组氨酸;胱硫醚;和半胱氨酸或高胱氨酸的硫醚;苯丙氨酸、色氨酸和环取代的α氨基酸,如苯基或环己基氨基酸、α-氨基苯基乙酸、α-氨基环己基乙酸和α-氨基-β-环己基丙酸;苯丙氨酸的类似物和衍生物包括芳基、低级烷基、羟基、胍基、氧烷基醚、硝基、硫或卤代苯基(例口酪氨酸、甲基酪氨酸和邻氯、对氯、3,4-二氯、邻、间或对甲基、2,4,6-三甲基、2-乙氧基-5-硝基、2-羟基-5-硝基和对硝基苯丙氨酸);呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基嘌呤或萘基丙氨酸;和色氨酸的类似物或衍生物,包括犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、2-羟基色氨酸和4-羧基色氨酸残基;α-氨基取代的氨基酸残基,包括肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、N-苄基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-苄基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-苄基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸和N-苄基缬氨酸;以及α-羟基氨基酸和取代的α-羟基氨基酸残基,包括丝氨酸、苏氨酸、同分异构的苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基。
上述的任何一种或其它已知的氨基酸很适合在本发明中使用。典型的氨基酸能够自催化氨基酸-类固醇键的水解。因此,它们通常包含或者基于体内进行水解包含游离的羧基或氨基。
所述的还有疏水氨基酸,如一或二烷基或芳基氨基酸,环烷基氨基酸等。这些氨基酸残基与R29-R34(R31-R34在下文中定义)一起,通过调节通式1或通式2表示的化合物的亲油性,能够有助于细胞透过性。通常这些残基并不含有巯基或胍基取代基。
肽:R1-R4的1、2、3或更多个可以包括“肽”,即如上定义的两个或更多个氨基酸。通常这些氨基酸通过正肽键即-CO-NH-在邻近的氨基酸残基之间连接起来。肽包括二肽(二聚物)、三肽(三聚物)、4、5、6、8、10或15个残基的短肽,以及更长的具有约100个或更多残基肽或蛋白质。本发明包含肽的化合物可以用作免疫原、前体药物或用于其它类固醇衍生物的合成前体。在一个实施方案中,肽在其连接第一个和处于类固醇残基末端的下一个残基之间的肽键处含有一个解肽酶的切割位置。这种切割位置通过酶识别结构例如被水解酶如位于血浆或细胞中的肽酶识别的特殊残基选择性地位于侧面。
解肽酶是众所周知的,特别是包括羧基肽酶。羧基肽酶通过除去C-末端残基来消化多肽,且在许多情况下对于特殊的C-末端序列它们具有专一性。这种酶及其底物的要求通常也是公知的。例如,一个具有给定残基对和游离羧基终端的二肽通过其α-氨基共价键合到类固醇核上。人们期望肽会被合适的二肽酶、蛋白酶或通过化学水解切割,这样就使得最邻近的氨基酸残基的羧基自催化切割酰胺化键。
合适的二肽基团的例子如下表所示(通过其单字母符号指明)。
符号
1字母符号YGFMAS | 3字母符号TyrGlyPheMetAlaSer | 氨基酸酪氨酸甘氨酸苯丙氨酸蛋氨酸丙氨酸丝氨酸 |
ILTVPKHQEWRDNC | IleLeuThrValProLysHisGlnGluTrpArgAspAsnCys | 异亮氨酸亮氨酸苏氨酸缬氨酸脯氨酸赖氨酸组氨酸谷氨酰胺谷氨酸色氨酸精氨酸天冬氨酸天冬酰胺半胱氨酸 |
二肽AA,AR,AN,AD,AC,AE,AQ,AG,AH,AI,AL,AK,AM,AF,AP,AS,AT,AW,AY,AV,RA,RR,RN,RD,RC,RE,RQ,RG,RH,RI,RL,RK,RM,RF,RP,RS,RT,RW,RY,RV,NA,NR,NN,ND,NC,NE,NQ,NG,NH,NI,NL,NK,NM,NF,NP,NS,NT,NW,NY,NV,DA,DR,DN,DD,DC,DE,DQ,DG,DH,DI,DL,DK,DM,DF,DP,DS,DT,DW,DY,DV,CA,CR,CN,CD,CC,CE,CQ,CG,CH,CI,CL,CK,CM,CF,CP,CS,CT,CW,CY,CV,EA,ER,EN,ED,EC,EE,EQ,EG,EH,EI,EL,EK,EM,EF,EP,ES,ET,EW,EY,EV,QA,QR,QN,QD,QC,QE,QQ,QG,QH,QI,QL,QK,QM,QF,QP,QS,QT,QW,QY,QV,GA,GR,GN,GD,GC,GE,GQ,GG,GH,GI,GL,GK,GM,GF,GP,GS,GT,GW,GY,GV,HA,HR,HN,HD,HC,HE,HQ,HG,HH,HI,HL,HK,HM,HF,HP,HS,HT,HW,HY,HV,IA,IR,IN,ID,IC,IE,IQ,IG,IH,II,IL,IK,IM,IF,IP,IS,IT,IW,IY,IV,LA,LR,LN,LD,LC,LE,LQ,LG,LH,LI,LL,LK,LM,LF,LP,LS,LT,LW,LY,LV,KA,KR,KN,KD,KC,KE,KQ,KG,KH,KI,KL,KK,KM,KF,KP,KS,KT,KW,KY,KV,MA,MR,MN,MD,MC,ME,MQ,MG,MH,MI,ML,MK,MM,MF,MP,MS,MT,MW,MY,MV,FA,FR,FN,FD,FC,FE,FQ,FG,FH,FI,FL,FK,FM,FF,FP,FS,FT,FW,FY,FV,PA,PR,PN,PD,PC,PE,PQ,PG,PH,PI,PL,PK,PM,PF,PP,PS,PT,PW,PY,PV,SA,SR,SN,SD,SC,SE,SQ,SG,SH,SI,SL,SK,SM,SF,SP,SS,ST,SW,SY,SV,TA,TR,TN,TD,TC,TE,TQ,TG,TH,TI,TL,TK,TM,TF,TP,TS,TT,TW,TY,TV,WA,WR,WN,WD,WC,WE,WQ,WG,WH,WI,WL,WK,WM,WF,WP,WS,WT,WW,WY,WW,YA,YR,YN,YD,YC,YE,YQ,YG,YH,YI,YL,YK,YM,YF,YP,YS,YT,YW,YY,YV,VA,
VR,VN,VD,VC,VE,VQ,VG,VH,VI,VL,VK,VM, VF,VP,VS,VT,VW,VY,VV
这样的二肽包括两种氨基酸均为L构型、D构型或构型的混合物的种类。
三肽,即三个键合的氨基酸残基,也是有用的实施方案。三肽包括那些其中A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y通过标准肽键键合到以上列举的任何二肽的氨基或羧基终端上。序列-X1-Pro-X2-(其中X1为任意氨基酸,X2为氢、任意氨基酸残基或脯氨酸的羧酸酯)被5-乙基-5-苯基巴比妥酸羧基肽酶切割,以产生带有游离羧基的X1,X1反过来又自催化切割酰胺化键。X2通常是X2羧基的苄基酯。其它实施方案包括四肽如那些由上述列举的任何二个相同或不同的二肽(例如AA和AA连接起来,或例如AA和GI连接起来)通过氨基终端或羧基终端互相连接起来的四肽。一种、二种或更多四肽通过四肽的氨基或羧基终端可以键合到通式1或通式2表示的化合物上。
有某些实施方案中,通式1或通式2表示的化合物包含一种或多种氨基酸或具有结构(A)、(B)或(C)的肽:
(A)R32-NH-{[C(R29)(R30)]b-C(O)-N(R31)}f-[C(R29)(R30)]a-C(O)-O-类固醇,
(B)R33-O-{C(O)-[C(R29)(R30)]d-N(R31)}g-C(O)-[C(R29)(R30)]c-N(R31)-O-类固醇,或
(C)R33-O-{C(O)-[C(R29)(R30)]d-N(R31)}e-C(O)-[C(R29)(R30)]c-N(R31)-C(O)O-类固醇,
其中(A)、(B)或(C)可独立地选择且它们键合到R1到R4的1、2、3或更多个上,其中R29-R31中的每一个都独立地选择;R29独立地为-H或C1-20的有机部分(例如C1-6烷基,例如-CH3或-C2H5);R30独立地为氨基酸的侧链,包括上述天然存在的氨基酸的侧链,例如-H、-CH3、-CH2C6H5;R31为-H或保护基;R32和R33独立地包括-H、保护基、酯或酰胺,其中的每一个原子或基团可独立地选择;a、b、c和d独立地是1、2、3、4或5,通常为1;e、f和g各自独立地为0到1000的整数,通常各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8;a、b、c和d各自独立地为1或2;e、f和g独立地为0、1、2、3、4或5。
如果氨基酸或残基具有2个或更多胺基,如赖氨酸或精氨酸或鸟氨酸残基,那么R29通常为-H而R30可包含[C(R34)2]n2N(RPR)-,其中n2为0、1、2、3、4、5或6,RPR为-H或保护基并且每个R34独立地为-H、C1-20选择性取代的烷基、C6-20选择性取代的芳基、C7-20选择性取代的烷芳基、C7-20选择性取代的芳烷基、C1-20选择性取代的烷氧基、C6-20选择性取代的芳氧基或羟基。这样的化合物含有许多类固醇部分。
例如当赖氨酸或鸟氨酸的ε-或δ-和α-氨基被类固醇部分所取代时,人们相信酰胺化物能够释放活性药物分子,在不同的药物动力学条件下预期每个分子都会出现,因此又进一步维持了药物的释放。
盐:本发明实施方案包括盐和本发明化合物(通式1表示的化合物)的复合体,包括药用的或相对无毒的盐。某些本发明化合物具有一个或多个部分,这些部分在水溶液中至少会带部分正电荷或负电荷,通常溶液pH值约4-10,溶液能够参与盐、复合体、具有部分盐和部分复合体特性的组合物或其它非共价相互作用的形成,所有这些都称为“盐”。盐通常是生物相容性的或药物可接受的或无毒的,特别是对于哺乳动物细胞。生物毒性的盐也可用于本发明化合物的合成中间体。当期望得到水溶性组合物时,经常使用一价盐。
通常金属盐是通过金属氢氧化物与本发明的化合物反应制备的。通过这种方法选择性制备的金属盐的例子为含有Li+、Na+和K+的盐。不溶的金属盐的制备可以通过往更可溶的金属盐溶液中加入合适的金属化合物使不溶性的金属盐从更可溶盐的溶液中沉淀出来。本发明的盐可以通过把某些有机酸和无机酸加入到本发明化合物的酸性或碱性中心如在本发明的嘧啶碱类似物的碱性中心而形成,有机酸如有机羧酸,无机酸如烷基磺酸或氢卤酸。金属盐包括含有Na+、Li+、K+、Ca++或Mg++的盐。其它金属盐可能包含铝、钡、锶、镉、铋、砷或锌离子。
本发明化合物的盐可以包括适合的阳离子和酸阴离子的组合,如碱金属和碱土金属离子或铵和季铵离子与磷酸或磷膦酸基团的酸阴离子部分的组合,其存在于本发明聚合物或单体中。
盐通过标准方法生产,包括在含有选定的酸的水、水-醇或水-有机溶液中溶解游离碱,然后选择性蒸发该溶液。在含有酸的有机溶液中游离碱参加反应,在这种情况下盐通过可以直接分离或通过浓缩溶液获得。
合适的胺盐包括具有足够碱度以形成稳定盐的胺,通常为低毒的胺,包括三烷基胺(三丙胺、三乙胺、三甲胺)、普鲁卡因、二苯基胺、N-苄基-β-苯乙胺、ephenamine、N,N’-二苄基乙二胺、N-乙基哌啶、苄胺和二环己基胺。
盐包括有机磺酸或有机羧酸盐,例如通过将酸添加到碱性中心制备,碱性中心通常为胺。磺酸的例子包括C6-16芳基磺酸、C6-16杂芳基磺酸和C1-16烷基磺酸如苯磺酸、α-萘磺酸、β-萘磺酸、(S)-樟脑磺酸、甲磺酸(CH3SO3H)、乙磺酸(C2H5SO3H)、正丙基磺酸、异丙基磺酸、正丁基磺酸、仲丁基磺酸、异丁基磺酸、叔丁基磺酸、戊基磺酸和己基磺酸。有机羧酸的例子包括C1-16烷基、C6-16芳基羧酸和C4-16杂芳基羧酸如乙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、草酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、烟酸和2-苯氧基苯甲酸。
本发明盐包括由无机酸制备的盐,无机酸例如HF、HCl、HBr、HI、H2SO4、H3PO4、Na2CO3、K2CO3、CaCO3、MgCO3和NaClO3。选择性地与一种阳离子如Ca++、Mg++、Li+、Na+或K+一起存在的合适的阴离子包括砷酸盐、亚砷酸盐、甲酸盐、山梨酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、高碘酸盐、重铬酸盐、乙二醇脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate)、胆酸盐、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛磺石胆酸盐、四硼酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、亚硫酸盐、氨基磺酸盐、次硫酸盐、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、硫氰酸盐、硅酸盐、偏硅酸盐、CN-、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、苦味酸盐、亚硫酸氢盐、六氟磷酸盐、次氯酸盐、hypochlorate、硼酸盐、偏硼酸盐、钨酸盐和尿酸盐。
盐还包括本发明化合物与一种或多种氨基酸形成的盐。尽管通常氨基酸上带有酸性或碱性基团的侧链,例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸或谷氨酸,或中性基团的侧链如氨基乙酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或高氨酸,但许多氨基酸都可使用,特别是天然发现的蛋白质成分氨基酸。
本发明组合物包括非离子化以及两性离子形式的化合物,以及带有化学计量的水的水合物。
立体异构体:本发明的化合物(通式1表示的化合物)包括在任何或所有不对称原子的富集的或拆分的光学异构体,这从所述内容中可以显而易见地看出。外消旋和非对映的混合物以及单独的光学异构体可以分离或合成,以致于基本与其对映体或非对映异构体分离,并且这些都在本发明的范围内。在本发明化合物中可以找到手性中心,如R1、R2、R3和R4。
下述的一种或多种方法用于制备对映富集的或纯异构体。这些方法大致以优选顺序列举,即人们通常应该由手性前体进行立体有择合成,然后色谱分离,然后自发结晶。
立体有择合成作为例子描述。当合适的手性起始材料易得且选择反应步骤不会导致在手性位置发生不希望的外消旋化时可以方便地使用这种类型的方法。立体有择合成的一个优点是不会产生不希望的对映异构体,对映异构体是必须从终产物中除去的,因此就降低了总合成收率。一般来讲熟悉本领域的技术人员能够理解应该使用什么样的起始材料和反应条件以通过立体有择合成方法获得所期望的对映富集的或纯的异构体。
如果通过常规实验合适的立体有择合成不能通过经验设计或确定,熟悉本领域的技术人员就会采用其它方法。一种具有通用性的方法是在手性色谱树脂上进行色谱分离。这种树脂装在柱子里,通常叫做Pirkle柱,在市场上可以买到。这种柱含有手性固定相。外消旋物置于溶液中并装载到柱子上,然后通过HPLC分离。例如请参见,色谱学会会议论文集(Proceedings Chromatographic Society)-国际手性分离研讨会,Sept.3-4,1987。可以筛选用于最优分离技术的手性柱的例子包括Diacel Chriacel OD、Regis Pirkle共价D-苯基甘氨酸、RegisPirkle Type 1A、Astec Cyclobond II、Astec Cyclobond III、Serva ChiralD-DL=Daltosil 100、Bakerbond DNBLeu、Sumipas OA-1000、Merk纤维素三乙酸酯柱、Astec Cyclobond 1-Beta,或Regis Pirkle共价D-萘基丙氨酸。所有这些柱对每种外消旋混合物并不是都有效。但是,熟悉本领域的技术人员应该理解需要一定量的常规筛选以确定最有效的固定相。当使用这些柱时,建议使用本发明化合物的实施方案,其中的电荷没有中和,例如酸性官能团如羧基并没有酯化或酰胺化。
另一种方法需要把混合物中的对映异体体转化成含有手性助剂的非对映体,然后通过通常的柱色谱分离结合物。这是一种非常合适的方法,特别是当实施方案中包含游离羟基、氨基或羟基时,这些基团会形成盐或共价键合到手性助剂上。手性纯的氨基酸、有机酸或有机磺酸都值得使用手性助剂,这些在本领域是公知的。可以形成含有这种助剂的盐或这些盐共价(不可逆)键合到官能团上。例如,纯D或L氨基酸可用于把本发明实施方案的羧基酰胺化,然后通过色谱法分离。
酶分离是另一种具有潜在价值的方法。在这种方法中,人们在外消旋混合物中制备对映异构体的共价衍生物,通常是低级烷基酯(例如羧基),然后衍生物进行酶切割,通常使用水解方法。这种方法要想成功,必须选择一种能够进行立体有择切割的酶,因此通常需要按常规方法筛选若干种酶。如果要切割的是酯,那么人们选择酯酶、磷酸酯酶和脂酶,并且确定它们对于衍生物的活性。典型的酯酶来自于肝、胰脏或其它动物器官并包括猪肝酯酶。
如果对映异构体混合物从溶液中分离而来或作为集聚体即对映纯晶体的混合物溶化,那么晶体可以进行机械分离,因此产生对映富集的配制物。但是这种方法对于大规模的制备不太实用并且对于真正的外消旋化合物其价值也有限。
不对称合成是另一种用于获得对映体富集的技术。例如,一种手性保护基与要进行保护的基团进行反应,并允许反应混合物达到平衡。如果反应是对映有择的,那么产物就会产生富集的对映异构体。
还可以进一步找到分离对映异构体混合物的方案,作为例子但不限于,《对映异构体、外消旋体和拆分》(Enantiomers,Racemates,andresolutions),Jean Jacques,Andre Collet和Samuel H.Wilen(KriegerPublishing Company,Malabar,FL,1991,ISBN 0-89464-618-4):Part 2,对映异构体混合物的拆分(Resolution of Enantiomer Mixture),217-435页;更具体地,第4章,直接结晶分离(Resolution by DirectCrystallization),217-251页,第5章,非对映异构体的形成和分离(Formation and Separation of Diastereomers),251-369页,第6章,引发结晶的非对称转化(Crystallization-Induced AsymmetricTransformations),369-378页,和第7章,实验分离方式和技术(Experimental Aspects and Arts of Resolutions),378-435页;更具体地,5.1.4部分,醇的分离、醇转化为成盐衍生物(Resolution of Alcohols,Transformations of Alcohols into Salt-Forming Derivatives),263-266页,5.2.3部分,醇、硫醇和酚的共价衍生物(Covalent Derivatives ofAlcohols,Thiols,and Phenols),332-335页,5.1.1部分,酸的分离(Resolution of Acids),257-259页,5.1.2部分,碱的分离(Resolution ofBases),259-260页,5.1.3部分,氨基酸的分离(Resolution of AminoAcids),261-263页,5.2.1部分,酸的共价衍生物(Covalent Derivatives ofAcids),329页,5.2.2部分,胺的共价衍生物(Covalent derivatives ofAmines),330-331页,5.2.4部分,醛、酮和亚砜的共价衍生物(CovalentDerivatives of Aldehydes,Ketones,and Sulfoxides),335-339页,and 5.2.7部分,共价非对映异构体的色谱行为(Chromatographic Behavior ofCovalent Diastereomers),348-354页。
如果上下文没有其它指明或暗示,本发明组合物或制剂中的液体组分如赋形剂的百分数的表达是指组分的体积百分数(v/v)。因此,20%的丙二醇是指本发明组合物或制剂中存在20%v/v的丙二醇。在本发明组合物中所指明的赋形剂的量不受其形式例如NF或USP级溶剂或赋形剂的影响。因此,如果其它的限制条件如水含量不过量,一种含有约30%聚乙二醇300 NF的本发明组合物也可由USP级对应物代替。
此处使用的“先天免疫”是指一种或多种通常与患者的非特异性免疫保护机理相关的组分。这些组分包括交替补充的途径,例如因子B、因子D和备解素;NK细胞、噬菌细胞(单核细胞、巨噬细胞)、中性白细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、纤维细胞;抗菌化学品,例如防卫素;自然障碍-皮肤、粘膜上皮细胞;以用某些白介素、趋化因子和细胞因子。先天免疫在抵抗细胞内寄生虫感染如白血细胞感染、肝感染及其它感染如淋巴节感染方面起作用。通过通式l表示的化合物或此处所述的方法增强先天免疫就能够增强吞噬溶酶体的融合或运动,而某些病原体如细胞内细菌如分枝细菌或李斯特菌属会抑制吞噬溶酶体的融合或运动。
正如此处所使用的,所指的CD分子、特异免疫细胞子集、免疫反应等等,一般都使用应用于人体内发现的分子、细胞等的术语。在其它物种中这些分子、细胞等的类似物或对应物可能会有不同的术语,但也包括在本发明范围内。在科学文献中可以找到关于各种CD分子和免疫细胞子集的术语和功能的描述。所指的病人的Th0、Th1或Th2细胞以及Th1或Th2免疫是指鼠类Th0、Th1或Th2细胞或反应的人类对应物。例如请参见,A.K.Abbas等编著的《细胞和分子免疫学》(Cellular and Molecular Immunology),W.B.Saunders Company,thirdedition,1997,ISBN 0-7216-4024-9,4-469页,和I.Kimber和M.K.Selgrade编著的《免疫副毒理学的T淋巴细胞亚群》(T LymphocyteSubpopulation in Immunotoxicology),John Wiley & Sons Ltd.,1998,ISBN 0-471-97194-4,1-53页。
“免疫抑制分子”是指一些这样的分子如环孢子菌素、环己酰胺、丝裂霉素C、阿霉素、紫杉醇和两性霉素B。这些分子倾向于对免疫系统具有毒性并且直接或间接产生免疫抑制如使分裂细胞中毒,或者它们能够下调免疫。
“类固醇受体”是指一种基因产物,通常是蛋白质单或二聚体,能够键合到配体上,配体如天然类固醇或它的一种类似物如通式1所表示的化合物。类固醇受体包括孤立类固醇受体。孤立类固醇受体是蛋白质,其天然配体或生物功能至少还有部分不清楚。作为此处所使用的,类固醇受体包括同型二聚体如SXR和(CARβ)2,和异型二聚体如PXR-CARβ或RXR-CARβ。类固醇受体也包括同种型如用于PXR受体的PXR.1和PXR.2,和类固醇的同族体如称作MB67的CARβ的同族体。同种型通常通过不同的接合方法用于来自一种基因的核RNA,而同族体通常是一种类固醇受体基因的清楚的复制,其中基因复制的编码与参考类固醇受体基因产物相比仅有较少的差别。这种差别最通常可以在二聚体以外的区域以及类固醇受体结构的类固醇键合区找到。通常同种型和同族体与参考基因或类固醇受体键合同样或类似的配体。类固醇受体可以来源于人或动物,如从细胞中、组织中或来自任何灵长类动物、啮齿类动物(包括鼠类)、鸟类、绵羊、牛、马、犬或猫科物种的任何物种或任何本文别处提到的或本文引用的任何参考中的任何物种群(如种或属的)的任何物种的cDNA表达库中获得。
在把包括一种类固醇受体和一种通式1所表示的化合物结合起来的条件下,“发明复合体”或“复合体”是指一种包含一种类固醇受体和一种通式所表示的化合物以及选择性含有其它分子的复合体。这种其它的分子包括(i)DNA识别序列(下文用“DNARS”表示),即类固醇受体特异识别和键合的序列和(ii)能够键合到类固醇受体-通式1化合物复合体上的转录因子。此处所使用的这些复合体能够在体外或体内细胞或不含细胞的系统中出现。例如复合体包括类固醇受体异型二聚体-通式1化合物的结合、类固醇受体同型二聚体-通式1化合物的结合、类固醇受体单体-通式1化合物的结合、类固醇受体异型二聚体-通式1化合物-DNA(或DNARS)的结合、类固醇受体同型二聚体-通式1化合物-DNA(或DNARS)的结合、类固醇受体异型二聚体-通式1化合物-转录因子的结合、类固醇受体同型二聚体-通式1化合物-转录因子的结合、类固醇受体异型二聚体-通式1化合物-DNA(或DNARS)-转录因子的结合和类固醇受体同型二聚体-通式1化合物-DNA(或DNARS)-转录因子的结合。
“激动剂”或“拮抗剂”分别为一种加强或减弱受体活性的化合物或组合物,这样可能导致受调节基因转录因子的增加或减弱。受体(和转录因子)可以通过加强或减弱转录而调节其靶向基因的转录。
一般方法:已经有关于确定各种组合物中的水含量或溶剂含量的方法,例如卡尔费休法(Karl Fischer)(KF)和干燥失重法(LOD)。LOD测定样品中的所有挥发份,而KF通常用于测定总水分。当水为唯一存在的挥发份时,对于一给定的组合物LOD值与KF值相等或稍低。KF测定化合物的水合物中的水,而LOD测定水以及其它可能存在的挥发份。本发明组合物和制剂可以方便地使用KF滴定法(例如使用一台METROHM 684 KF库仑计或等价物)按照公开的方法(美国药典(U.S.Pharmacopoeia),vol.23,1995,chapter<921>,U.S.PharmacopeialConvention,Inc.,Rockville,MD)和生产商的库仑计说明书分析水含量。分析中所使用的物质量约50-100mg,使用一台5位分析天平(Sartorius,RC210D型,或合适的等价物)进行测定。本发明组合物和制剂中所指明的水量为通过KF分析所测得的量。
粉末X射线衍射(XRD)方法用于表征各种晶体化合物(例如请参见,美国药典(U.S.Pharmacooeia),vol.23,1995,<941>,p.1843-1845,U.S.Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville,MD;Stout等,X射线结构测定(X-Ray Structure Determination);A Practical Guide,MacMillanCo.,New York,N.Y.,1986)。从晶体化合物得到的衍射图案或其衍射部分通常可对给定的晶体形式进行鉴定,尽管从连续的几批晶体得到的重复衍射图案中不经常出现弱的或极弱的衍射峰。而且,XRD带的相对强度,特别是低x-射线入射角值(低θ),可能由于例如晶相、粒径或其它测定条件的差别而出现的最佳方向效应而有所变化。XRD光谱中的峰通常是由给定的θ值+/-约0.1-0.2来定义的。从1、2、3、4、5或更主要强度XRD峰获得的XRD信息选择性地与一种或多种其它鉴定数据(熔点、DSC、IR)结合通常很适合用于从其它包含有同样组合物的晶体形式中表征或描述一种晶体物质如BrEA半水合物。
其它用于鉴定或描述晶体物质如BrEA半水合物的技术包括熔点(MP)、差式扫描量热法(DSC)和红外吸收光谱(IR)数据。DSC测定当晶体结构改变或晶体熔解时晶体吸热或放热的热转化温度。MP数据和DSC热转化温度在连续分析1或2℃的范围内通常具有可重现性。IR测定与存在的与基团如羟基相关的特殊化学键相关的红外光的吸收,这些基团对应于特定光的波长产生振动。
本发明实施方案:本发明提供BrEA半水合物,它通常不含有其它形式的BrEA如无定形BrEA或无水BrEA。此处所使用的BrEA半水合物或晶体BrEA半水合物是指在一个确定的三维空间图案或晶格中几乎所有的组分分子具有有序排列的固体BrEA和水。晶体BrEA半水合物可以包含一种或多种晶相如板晶、棒条、盘状或针状。基本不含有其它形式BrEA的BrEA半水合物是指干燥或基本干燥(其中液体占总重量的不足约10重量%)的固体制剂,其中制剂中存在的超过约55重量%的BrEA为BrEA半水合物。这种组合物通常含有至少约60重量%,或至少约70重量%,或至少约80重量%,通常至少约90重量%或至少约95重量%,或至少约98重量%的BrEA半水合物,其余存在的为其它形式的BrEA如无定形或无水BrEA。固体BrEA半水合物典型含有至少约90重量%,通常含有至少97重量%或98重量%的化合物,以及少于约10重量%,通常少于约3重量%或2重量%的副产物,副产物可能包括BrEA的16β异构体或一种或多种BrEA合成中的副产物。通常在一种固体或液体介质中存在的固体BrEA的量不包括可检测量的其它形式的BrEA(使用标准分析方法如FTIR、DSC或XRD),因此半水合物就占所存在的BrEA总量的约99-100重量%。
其它本发明的实施方案包括含有BrEA半水合物实质量的组合物,其中BrEA半水合物存在于含有一种或多种其它形式的BrEA如无定形BrEA或无水BrEA,以及选择性含有一种或多种附加组分如任何本文所述的赋形剂的组合物中。此处所使用的这些组合物中的“实质量”的BrEA半水合物包含至少占所存在的BrEA总量的约15-20重量%或至少约20重量%的BrEA半水合物,典型为至少约25重量%,更典型为至少约30重量%,经常为至少约35重量%,通常为至少约45重量%。这些组合物通常为固体如制剂或单位剂量,但是它们也包括含有固体BrEA的悬浮液、沉淀物、凝胶和胶体。这种悬浮液或沉淀物可以从例如从一种含有水的溶液中沉淀BrEA半水合物或通过往液体赋形剂中加入固体BrEA而得到。很明显,含有实质量BrEA的组合物可能实质上不含有上述其它形式的固体BrEA。
通过以下一种或多种表征BrEA半水合物的方法可以方便地鉴定BrEA半水合物:(1)其熔点或分解点或熔程(选择性表达为+/-2℃),(2)一种或多种BrEA半水合物的DSC转化温度或范围(任何一种可以选择性表达为+/-2℃),(3)一种或多种BrEA半水合物的特征IR吸收带,(4)使用Cu-Kα辐射获得的BrEA半水合物的XRD光谱(例如基本上按照美国药典(U.S.Pharmacopoeia),vol.23,1995,<941>,p.1843-1845中描述的方法得到)的1、2、3、4、5、6或更多最高强度的XRD峰(任何一种或多种可选择性表达为+/-0.1°θ或+/-0.2°θ),(5)存在少于约3重量%或少于约2重量%的其它化合物,(6)约2.5重量%的干燥BrEA半水合物的含水量(例如2.3-2.7重量%),其中干燥的BrEA半水合物是指通过过滤、选择性地使用一种无水溶剂如己烷洗涤一次、再次过滤,然后在约60℃下真空干燥直至约60℃下24小时内没有进一步的重量损失(例如,其中的含水量基本上是用美国药典(U.S.Pharmacopoeia),vol.23,1995,p.1801-1802或1840-1843方法<731>或<921>中描述的卡尔费休法或其它方法测定的)所得到的干燥化合物,(7)通过对BrEA半水合物进行单晶X射线晶体照相所得到的晶胞常数和定向阵(例如基本上是按照WO99/04774的实施例13中所述的方法得到的),(8)通过偏振光显微术进行约100×放大至约150×放大所观察到的结果对晶体形状进行描述,或(9)BrEA半水合物平均晶体尺寸和形状描述。
因此例如,BrEA半水合物可能通过一种或多种其IR吸收带表征,例如1741cm-1和1750cm-1处的羰基峰,以及其熔点或分解点或熔程和/或θ值(X射线衍射)为17.8、23.8、24.2、26.9-27.2、28.6、30.1和32.2处的1、2、3、4、5、6或更多XRD峰(通常是最强的峰)。
BrEA半水合物适合制备包含一种适用于人用药物或兽用用途的赋形剂的组合物。这种组合物用来制备制剂和单位剂量。单位剂量典型包括片剂、胶囊、锭剂或无菌溶液,包括用于非肠道给药的无菌溶液。固体单位剂量形式通常含有约3-1000mg BrEA半水合物,典型在每单位剂量中含有约20-400mg,例如约25mg、约50mg、约100mg、约150mg或约250mg。
本发明提供一种制备BrEA半水合物的方法,包括接触水、16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17酮和一种C1-C6醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇)和水。通常存在唯一一种C1-C6醇例如乙醇,它是无水的或可以含有最高约2重量%的水。在某些实施方案中,该方法使用的溶液含有约5-25重量%的水、约30-45重量%的乙醇和约30-45重量%的BrEA制品。典型的BrEA制品为固体制品,含有至少约80重量%通常至少约90重量%或至少约95重量%的BrEA。该溶液可以包含约18-22重量%的水、约37-43重量%的乙醇和约37-43重量%的BrEA制品。在进行沉淀或结晶方法时,溶液典型在约-20-约45℃的温度下,通常在约0-约20℃温度下。溶液保持在这种温度范围下30分钟-约12小时且在结晶过程中选择性地使用慢速至中速搅拌溶液。
一个相关的实施方案包含一种制备BrEA半水合物的方法,包括从含有至少约15-25重量%的水、约35-45重量%的BrEA制品和至少约35-45重量%的一种或多种与水混溶的溶剂通常为C1-6醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇)的溶液中沉淀BrEA。BrEA制品可以选择性地含有一种或多种BrEA合成中的副产物。典型的BrEA半水合物制品或批料包含少于约5重量%,通常少于约3重量%或约2重量%的副产物,如BrEA合成中的副产物。该方法的特征包括含有有机溶液的接触水,有机溶液含有BrEA和一种有机溶剂如C1-C6醇(例如乙醇)或丙酮。往该溶液中加入水会导致BrEA半水合物的沉淀。含有BrEA半水合物晶体或沉淀的溶液是本发明的实施方案,用于制备以后通常在环境温度下干燥和储存的固体BrEA。
从含水溶液中沉淀BrEA半水合物可以通过已知的方法完成,如降低溶液温度、使用饱和的或接近饱和的BrEA溶液、真空浓缩饱和的或接近饱和的BrEA溶液(通常在相对低的温度下进行,通常为约15-25℃)、往饱和的或接近饱和的BrEA溶液中加入BrEA半水合物晶种(例如约10-100mg/l-10L溶液)、加热饱和的或接近饱和的BrEA溶液(约25-35℃几分钟,然后降低温度或有效冷却溶液)以及选择性地往溶液中加入BrEA半水合物晶种或往饱和的或接近饱和的BrES乙醇-水溶液中加入液体如加入水或乙醇,这会导致溶液过饱和。BrEA也可以从其它溶剂或溶剂体系中沉淀,包括丙酮和丙酮-乙醇。这些溶剂通常都可与水混溶。也可以使用BrEA的两相沉淀以回收固体BrEA半水合物,例如先沉淀并回收固体,然后或者将母液冷却或引晶或者将母液放置例如在环境温度下约一、二或更多天以得到二次获得结晶。而且,BrEA半水合物也可以选择性地重结晶以进一步增加终固体的纯度,基本上按照此处所述的方法。已经描述了结晶有机化合物的方法,
例如A.S.Myerson,工业结晶手册(Handbook of IndustrialCrystallization),1993,Butterworth-Heinemann,Stoneham,MA,p 1-101。
其它相关的实施方案包括通过将含有BrEA和一种有机溶剂的溶液与水接触的方法获得的产物。典型的溶液如上所述,例如一种含有约3-5体积%的水和至少约40体积%的一种或多种与水混溶的溶剂的溶液,溶剂通常为极性溶剂如C1-6醇或酮(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇,通常为乙醇或丙酮)。这种过程可以通过一种或多种上文所述的技术完成,例如冷却饱和的或接近饱和的BrEA的水-乙醇溶液或选择性用BrEA半水合物引晶冷却的溶液。一个与此相关的实施方案含有溶液或固体,溶液或固体中含有湿的BrEA半水合物晶体或湿的过滤的或离心的BrEA半水合物滤饼,滤饼可在结晶后得到。这些实施方案的例子包括往BrEA-醇溶液中加入水,例如往约6体积的BrEA-乙醇溶液中缓慢加入约0.5-1.5体积或约0.8-1.2体积的水以得到BrEA半水合物。这些实施方案的其它例子包括往BrEA-酮溶剂溶液中加入水,例如往约10体积BrEA-丙酮中缓慢加入约0.5-1.5体积或约0.8-1.2体积的水以得到BrEA半水合物。
另一个相关的实施方案是把BrEA半水合物研磨到平均粒子尺寸约0.01-200μm,或约0.1-10μm或约0.5-5μm。因此磨碎的BrEA半水合物的平均粒子尺寸或直径可能相对较小例如约0.03-2.0μm或约0.1-1.0μm,或有时更大例如约0.5-5.0μm或约1-5.0μm。磨碎的BrEA半水合物适合于制备固体制剂和用于人类的或兽用的非肠道制剂。磨碎的物质促进BrEA半水合物在溶剂或赋形剂中的溶解并促进其与固体或固体赋形剂的混合。
尽管也可能使用纯BrEA半水合物给患者施用,但是其通常是以固体制剂形式存在或用于制备液体制剂。制剂通常用于制备单位剂量,例如片剂、胶囊或锭剂,用于口服、口腔或舌下给药,它们通常含有约10-1000mg或典型含有约25-400mg BrEA半水合物。作为选择,实施方案包括一种用于非肠道(例如皮下、皮下、静脉内、肌肉、腹膜内)给药的通过以下方法产生的产品:将BrEA半水合物与一种液体赋形剂接触、并选择性地对溶液消毒、并选择性地把溶液分配到小瓶或安瓿中,其可以是单剂量使用或多剂量使用、并选择性地把制剂在低温(约0-12℃或约2-10℃)下储存,其中液体赋形剂是例如PEG100、PEG200、PEG300、PEG400、丙二醇、苯甲酸苄酯、苄醇或乙醇的一种、两种、三种或多种。这种用于非肠道给药的产品含有典型为约10-170mg/mL,通常为约20-110mg/mL或约30-100mg/mL的BrEA、选择性一种或多种盐、缓冲液或抑菌剂或防腐剂(例如NaCl、BHA、BHT或EDTA)。
其它实施方案包括一种通过以下方法产生的产品:将BrEA半水合物与一种适用于人药用途或兽用的赋形剂接触,其中BrEA半水合物基本不含其它形式的BrEA。该产品对制备含有半水合物的制剂或单位剂量形式是有用的。
从BrEA半水合物制得的制剂或含有BrEA半水合物的制剂通常储存的条件为限制与制剂接触的水量,例如在盛有制剂的密封容器中的硅胶。已经描述了容器的水渗透特性,例如容器-渗透(Containers-Permeation),Chapter,USP 23,1995,U.S.Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville,MD,p.1787。
实施方案包括当进行一种方法的步骤或操作时过渡产生的本发明组合物。例如,当一种含有少于约3%水的通式1表示的化合物BrEA与一种赋形剂如一种PEG、一种醇、丙二醇或苯甲酸苄酯接触时,该组合物在加入一种组分与另一种组分之前为非均相混合物。当组分接触时,混合物的均匀性增加并且组分相互之间所占的比例达到一理想值。因此,含有少于约3%水的本发明组合物可以含有约0.0001-99%的通式1表示的化合物如BrEA和一种或多种赋形剂。当制备本发明组合物或制剂时必然产生这些过渡的组合物或制剂,并且它们也包括在受专利保护的本发明实施方案中。
一般来讲,存在于本发明组合物和制剂中的通式1表示的化合物在非水赋形剂中完全溶解。但是,在某些实施方案例如过渡组合物和某些制剂中,通式1表示的化合物是部分溶解的,而其余部分以固体的形式存在,这些组合物或制剂可能为悬浮液或胶体。
适用于非肠道给人或动物给药通式1化合物的本发明组合物和制剂通常包含两种、三种或更多赋形剂。用于说明的实施方案包括(1)丙二醇、PEG200、PEG300、乙醇和苯甲酸苄酯中的任意两种、三种或四种,以及(2)丙二醇、PEG100、PEG200、PEG300、PEG400和苯甲酸苄酯中的任意两种、三种或四种。
本发明组合物和制剂一般含有约0.01-10%的BrEA通常约1-5%以及约0.01-3%的水,典型为约0.05-3%,通常为约0.1-1%。本发明制剂通常以适用于每天一次或两次或每2-3天一次非肠道给药的单位剂量或多剂量形式提供。单位剂量含有约3-1000mg/单位剂量的BrEA,典型为约5-500mg,通常为约10-200mg。对于处理逆转录酶病毒例如人体内的HIV,每单位剂量在约1-6mL,通常约2-4mL体积中通常含有约10-250mgBrEA,通常约100-200mg。
本发明实施方案包括通过组合、混合或其它把BrEA与一种、二种或更多赋形剂接触的过程制备的产品。这种产品通过把组分进行接触的常规方法获得。这种产品也可选择性地包含有一种稀释剂、一种崩解剂和一种粘合剂,或本文中描述的或本文中引用的其它赋形剂。
在存在显著量水的情况下,人们发现BrEA在溴原子处发生差向异构,这导致产生16α-和16β-BrEA异构体的混合物。本发明含有BrEA或BrEA半水合物的组合物和制剂通常含有少于约3%的水,典型少于约0.3%,通常少于约0.1%。人们发现这些组合物和制剂当在环境温度下(约5-40℃)储存在密闭容器中时,相对含有更多水的对照组合物和制剂具有良好的稳定性。这种液体还有一种特征即化合物沉淀的意外减少,看起来是由水引起的。
本发明实施方案包括含有少于约3%水、通式1化合物和一种通常认为不适合于人用但对于制备本发明用于兽用的制剂有用的化合物的组合物。兽用制剂是用于把本发明组合物给下列动物给药的目的的组合物:灵长类动物、猫、狗、马、母牛、兔和其它患者,且可以含有兽医技术可接受的赋形剂,并与通式1化合物如BrEA有相容性。这些兽用组合物通常不适用于人类,因为它们包含的赋形剂不适用于人类,例如乙醇之外的醇类如甲醇、丙醇或丁醇。这些赋形剂典型存在的量相对较低,例如约1-30%,通常约1-5%。
本发明实施方案包括组合物和制剂,例如单位剂量形式和无菌溶液,其含有(1)约1-100mg/mL通式1化合物、约57.5%丙二醇、约25%PEG300、约1 2.5%乙醇及约5%苯甲酸苄酯;(2)约1-60mg/mL通式1化合物、约70%丙二醇、约25%PEG300及约5%苯甲酸苄酯;(3)约1-60mg/mL通式1化合物、约25%PEG300、约35%丙二醇、约35%甘露醇及约5%苯甲酸苄酯;(4)约1-60mg/mL通式1化合物、约57.5%丙二醇、含有约25%PEG300和PEG200的混合物(例如PEG300:PEG200约为1∶10-约10∶1)、约12.5%乙醇及约5%苯甲酸苄酯;(5)约1-60mg/mL通式1化合物、约75%丙二醇、含有约25%PEG300和PEG200的混合物(例如PEG300∶PEG200约为1∶10-约10∶1)及约5%苯甲酸苄酯;(6)约1-60mg/mL通式1化合物、约25%PEG300和PEG200(例如PEG300∶PEG200约为1∶10-约10∶1)、约35%丙二醇、约35%甘露醇及约5%苯甲酸苄酯;(7)任何一种(1)-(6)的制剂,其中通式1化合物为约40-55mg/mL;(8)任何一种(1)-(6)的制剂,其中通式1化合物为约30-100mg/mL;(9)任何一种(1)-(8)的制剂,其中存在1、2、3或4种通式1化合物;(10)任何一种(1)-(8)的制剂,其中存在1种或2种通式1化合物;(11)任何一种(1)-(8)的制剂,其中存在1种通式1化合物;(12)任何一种(1)-(11)的制剂,其中通式1化合物在R1-R6、R10、R15、R17或R18中的任意1、2或3个可独立地选择下列物质:酯、硫酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、氨基酸或1种或2种可独立地选择肽的通式1化合物;(13)任何一种(1)-(12)的制剂,其中通式1化合物包含或者为BrEA或BrEA半水合物;(14)任何一种(1)-(13)的制剂,其中通式1化合物包含或者为BrEA的酯、硫酸酯或磷酸酯。
其它实施方案包括通过把本发明组合物或制剂例如单位剂量形式、上述(1)-(14)中任何一个实施方案、或用于制备制剂的组合物在约10-40℃下储存至少3天,例如在环境温度下储存约1-24个月。在此期间内本发明制剂通常储存在密封的或感应密封的容器中。本发明组合物通常储存在密闭的容器中。本说明书和权利要求揭示了用于这些实施方案的示例性的合适的制剂和单位剂量形式。
其它实施方案包括化合物、组合物和制剂,其中R1-R6、R10、R15、R17和R18的一种或多种包含氨基酸或肽,例如R1、R2或R4包含氨基酸或肽,R3为卤素且R5和R6均为-CH3。在R1-R6的一个或多个位置上的肽可以包含一种细胞表面结合肽如全蛋白或纤连蛋白或逆连蛋白(retronectin)如KQAGDV的序列。
在通式1化合物中,每个R4都可独立地选择。在某些实施方案中,一个R4为卤素,另一个为另一个部分。在其它实施方案中,两个R4都是可独立选择的部分而不是卤素,例如一个C1-C20的有机部分。
R1-R6、R10、R15、R17和R18包括部分例如酯、硫酯、碳酸酯、氨基酸、肽和/或氨基甲酸酯,通常在生理状态下它们是化学和/或酶促可以水解的。这样的部分是独立选择的。通常这些部分会在类固醇核的R1-R6位置上产生-OH、-SH或-NH2。通式1化合物的实施方案包括下列方案:(1)R1、R2和R4中的一个为可水解的部分(例如酯、硫酯、碳酸酯、氨基酸、肽或氨基甲酸酯),R1、R2和R4的另外两个为-H,R3不为氢,R5和R6均为-CH3;(2)R1、R2和R4的两个为可水解的部分(例如独立选择的酯、硫酯、碳酸酯、氨基酸、肽和/或氨基甲酸酯),R1、R2和R4的另外一个为-H,R3不为氢,R5和R6均为-CH3;(3)R1、R2和R4为可水解的部分,R3不为氢,R5和R6均为-CH3。在这些实施方案中,R3基团通常为β-构型而R1、R2和R4-R6通常为α-构型。
在其它实施方案中,R1-R6、R10、R15、R17和R18的一个或多个,通常一个包含一种氨基酸或肽,而其余基团从此处列举的部分中独立地选取。在这些实施方案中,肽通常为二聚体(二肽)或三聚体(三肽)。例如R1、R2和R4的一个包含一种氨基酸,R1、R2和R4的其余基团独立地包括-OH、=O、酯、碳酸酯或氨基甲酸酯,而R3为卤素、羟基或酯,R5和R6独立地为-H、-(CH2)n-CH3、-(CH2)n-CH2OH或-(CH2)n-CH2F、-(CH2)2-4-O-(CH2)2-4-CH3,其中n为0、1、2、3、4、5、6、7或8,经常为0、1或2,通常为0。通常这些酯、碳酸酯或氨基甲酸酯在生理状态下是可以水解的。
可以水解的部分通常含有酰基、酯、醚、硫醚、酰胺、氨基酸、肽、碳酸酯和/或氨基甲酸酯。一般来讲,可水解部分的结构并不重要并可以变化。在某些实施方案中,这些部分含有总共约4-约10个碳原子。在其它实施方案中的这些可水解的部分含有有机部分,如上所述的用于酯的有机部分,它们含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子以及1、2、3、4、5或6个杂原子例如氧、氮或硫。这些可水解的部分可以不包括在血浆、血液、细胞内细胞质或肠内带电的基团,或者包括在一种或多种条件下带有1、2、3或更多正电、负电或正电和负电的基团。根据基团的不同及其所处的条件,电荷可以为分数。这些可水解的部分在其氢原子和/或碳原子处可以包含1、2、3、4或更多取代基,例如-OH、受保护的羟基、-SH、受保护的硫醇、羧基、受保护的羧基、胺、受保护的胺、-O-、-S-、-CO-、-CS-、烷氧基、烷硫基、链烯氧基、芳基、-OP(O)(O)-O-、-OS(O)(O)-O-和/或杂环。这些取代基是独立选择的。
通式1所表示的含有一个可水解部分的化合物可以包含一个或多个独立选择的-O-CHR24C(O)OR25、-S-CHR24C(O)OR25、-NH-CHR24C(O)OR25、-O-CHR24C(S)OR25、-S-CHR24C(S)OR25、-NH-CHR24C(S)OR25、-O-CHR24OC(O)R25、-S-CHR24OC(O)R25、-NH-CHR24OC(O)R25、-O-CHR24C(O)N(R25)2、-S-CHR24C(O)N(R25)2、-NH-CHR24C(O)N(R25)2、-O-CHR24OR25、-S-CHR24OR25、-NH-CHR24OR25、-O-CHR24C(R25)2CH2OX、-S-CHR24C(R25)2CH2OX、-NH-CHR24C(R25)2CH2OX、-O-CHR24C(R25)2OX、-S-CHR24C(R25)2OX或-NH-CHR24C(R25)2OX,一个或多个R1-R6、R10、R15、R17和R18包含的基团。这些可水解的部分当中,R24独立地是-H、-CH2-C6H5、-CH2-CH2-C6H5、C1-8烷基、C2-8链烯基、芳基或杂环,其中每个烷基、链烯基、芳基和杂环部分又独立地选择性被1、2、或3个,通常为1个-O-、-S-、-NH-、卤素、芳基、-OX-、-SX-、-NHX-、酮(=O)或-CN部分取代,或C1-8烷基选择性地被3、4、5、或6个卤素取代,且X为-H或保护基。R24的例子有-H、-CH3、-C2H5、-CH2-C1-5选择性取代的烷基、-CH2-CH2-C1-4选择性取代的烷基和-CH2-CH2-O-C1-4选择性取代的烷基。R25独立地为-H、-CH2-C6H5、-CH2-CH2-C6H5、C1-12烷基、C2-12链烯基、芳基、杂环、-CH2-杂环或-CH2-芳基,其中每个烷基、链烯基、芳基、杂环、-CH2-杂环或-CH2-芳基部分独立地选择性被1或2个,通常为1个-O-、-S-、-NH-、卤素、芳基、-OX-、-SX-、-NHX-、酮(=O)、-C(O)OX或-CN部分取代,或C1-12烷基、C2-12链烯基或芳基选择性地被3、4、5或6个卤素取代,其中X为-H或保护基,或芳基、杂环、-CH2-杂环或-CH2-芳基部分选择性独立地被1、2或3个C1-4烷基部分取代,或芳基部分或杂环,通常在环碳处带有1、2或3个C1-4烷氧基部分。R25的例子有-H、-CH3、-C2H5、-C3H7、-C4H9、-C6H13、-C6H5、-C6H4OH、-C6H4OCH3、-C6H4F、-CH2-C1-5选择性取代的烷基、-CH2-CH2-C1-4选择性取代的烷基和-CH2-CH2-O-C1-4选择性取代的烷基。
在至少保留一个化合物的情况下,通式1化合物的实施方案包括或不包括在通式1范围内的化合物的所有子集。例如,通常包括在例如本发明非水溶液制剂和本发明的间歇式剂量方案和免疫调节方法中的通式1化合物的一个子集是通式1化合物,其中R2为羟基或一个可以水解为羟基的任意构型的基团,R5和R6是α-构型的甲基。任意从通式1化合物中排除的子集化合物包括已经在一项或多项在先技术参考文献或出版物中公开的一种或多种化合物,例如一个或多个在本文中引用的参考文献中的一个或多个化合物,特别是那些由于新颖性、明显性和/或创造性的原因可能使得所有权利要求或实施方案不能获得专利权的化合物。
通式1化合物的种和属的说明性实施方案按以下所述内容命名。
第1组:说明性实施方案包括按照在下表A和B中给定的化合物结构标记命名。表B中命名的每个化合物具有下述通式B,
其中R5和R6均为-CH3,在1-2-、4-5或5-6-位置没有双键,一个R4为卤素,R7、R8和R9均为-CH2-,R1、R2、R3和R4为表A中指定的取代基。这些按照表A和B命名的化合物称为“第1组”化合物。
表B中命名的化合物是通过R1、R2、R3和R4指定的数字,按照如下化合物命名惯例进行命名的。R1.R2.R3.R4依据表A所述的编号的化学取代基。表A中的每个数字为R1、R2、R3和R4指定了一个不同的结构。当R1、R2、R3或R4为二价部分时如=O,在对应位置上不存在氢。因此,命名为1.2.1.1的第1组化合物是通式B的结构,其带有键合到3-和7-位(分别为可变基团R1和R2)碳上的β-羟基、键合到碳16(可变基团R3)的α-溴和碳17(可变基团R4)处的双键氧(=O),即1.2.1.1具在以下结构。
表A
R11 -OH2 =O3 -SH4 =S5 -O-CH36 -O-S(O)(O)-O-Na+7 -O-S(O)(O)-OC2H58 -CH39 -H10 -OC(O)C(CH3)3 | R21 -H2 -OH3 =O4 -CH35 -OCH36 -OC2H57 -OCH2CH2CH38 -OCH2CH2CH2CH39 -CI10 -Br |
R31 -Br2 -CI3 -I4 -F5 -H6 -OH7 =O8 -O-C(O)-CH39 -O-C(O)-CH2CH310 -O-C(O)-CH2CH2CH3 | R41 =O2 -OH3 -H4 -F5 -CI6 -Br7 -I8 -O-C(O)-CH39 -O-C(O)-CH2CH310 -O-C(O)-CH2CH2CH3 |
表B1.1.1.1,1.1.1.2,1.1.1.3,1.1.1.4,1.1.1.5,1.1.1.6,1.1.1.7,1.1.1.8,1.1.1.9,1.1.1.10,1.1.2.1,1.1.2.2,1.1.2.3,1.1.2.4,1.1.2.5,1.1.2.6,1.1.2.7,1.1.2.8,1.1.2.9,1.1.2.10,1.13.1,1.1.3.2,1.13.3,1.1.3.4,1.1.3.5,1.1.3.6,1.1.3.7,1.1.3.8,1.1.3.9,1.1.3.10,1.1.4.1,1.1.4.2,1.1.43,1.1.4.4,1.1.4.5,1.1.4.6,1.1.4.7,1.1.4.8,1.1.4.9,1.1.4.10,1.1.5.1,1.1.5.2,1.1.5.3,1.1.5.4,1.1.5.5,1.1.5.6,1.1.5.7,1.1.5.8,1.1.5.9,1.1.5.10,1.1.6.1,1.1.6.2,1.1.63,1.1.6.4,1.1.6.5,1.1.6.6,1.1.6.7,1.1.6.8,1.1.6.9,1.1.6.10,1.1.7.1,1.1.7.2,1.1.7.3,1.1.7.4,1.1.7.5,1.1.7.6,1.1.7.7,1.1.7.8,1.1.7.9,1.1.7.10,1.1.8.1,1.1.8.2,1.1.8.3,1.1.8.4,1.1.8.5,1.1.8.6,1.1.8 7,1.1.8.8,1.1.8.9,1.1.8.10,1.1.9.1,1.1.9.2,1.1.9.3,1.1.9.4,1.1.9.5,1.1.9.6,1.1.9.7,1.1.9.8,1.1.9.9,1.1.9.10,1.1.10.1,1.1.10.2,1.1.10.3,1.1.10.4,1.1.10.5,1.1.10.6,1.1.10.7,1.1.10.8,1.1.10.9,1.1.10.10,1.2.1.1,1.2.1.2,1.2.13,1.2.1.4,1.2.1.5,1.2.1.6,1.2.1.7,1.2.1.8,1.2.1.9,1.2.1.10,1.2.2.1,1.2.2.2,1.2.2.3,1.2.2.4,1.2.2.5,1.2.2.6,1.2.2.7,1.2.2.8,1.2.2.9,1.2.2.10,1.2.3.1,1.2.3.2,1.2.3.3,1.2.3.4,1.2.3.5,1.2.3.6,1.2.3.7,1.2.3.8,1.2.3.9,1.2.3.10,1.2.4.1,1.2.4.2,1.2.4.3,1.2.4.4,1.2.4.5,1.2.4.6,1.2.4.7,1.2.4.8,1.2.4.9,1.2.4.10,1.2.5.1,1.2.5.2,1.2.5.3,1.2.5.4,1.2.5.5,1.2.5.6,1.2.5.7,1.2.5.8,1.2.5.9,1.2.5.10,1.2.6.1,1.2.6.2,1.2.6.3,1.2.6.4,1.2.6.5,1.2.6.6,1.2.6.7,1.2.6.8,1.2.6.9,1.2.6.10,1.2.7.1,1.2.7.2,1.2.7.3,1.2.7.4,1.2.7.5,1.2.7.6,1.2.7.7,1.2.7.8,1.2.7.9,1.2.7.10,1.2.8.1,1.2.8.2,1.2.8.3,1.2.8.4,1.2.8.5,1.2.8.6,1.2.8.7,1.2.8.8,1.2.8.9,1.2.8.10,1.2.9.1,1.2.9.2,1.2.9.3,1.2.9.4,1.2.9.5,1.2.9.6,1.2.9.7,1.2.9.8,1.2.9.9,1.2.9.10,1.2.10.1,1.2.10.2,1.2.10.3,1.2.10.4,1.2.10.5,1.2.10.6,1.2.10.7,1.2.10.8,1.2.10.9,1.2.10.10,1.3.1.1,1.3.1.2,1.3.1.3,1.3.1.4,1.3.1.5,1.3.1.6,1.3.1.7,1.3.1.8,1.3.1.9,1.3.1.10,1.3.2.1,1.3.2.2,1.3.2.3,1.3.2.4,1.3.2.5,1.3.2.6,1.3.2.7,1.3.2.8,1.3.2.9,1.3.2.10,1.3.3.1,1.3.3.2,1.3.3.3,1.3.3.4,1.3.3.5,1.3.3.6,1.3.3.7,1.3.3.8,1.3.3.9,1.3.3.10,1.3.4.1,1.3.4.2,1.3.4.3,1.3.4.4,1.3.4.5,1.3.4.6,1.3.4.7,1.3.4.8,1.3.4.9,1.3.4.10,1.3.5.1,1.3.5.2,1.3.5.3,1.3.5.4,1.3.5.5,1.3.5.6,1.3.5.7,1.3.5.8,1.3.5.9,1.3.5.10,1.3.6.1,1.3.6.2,1.3.6.3.1.3.6.4,1.3.6.5,1.3.6.6,1.3.6.7,1.3.6.8,1.3.6.9,1.3.6.10,1.3.7.1,1.3.7.2,1.3.7.3,1.3.7.4,1.3.7.5,1.3.7.6,1.3.7.7,1.3.7.8,1.3.7.9,1.3.7.10,1.3.8.1,1.3.8.2,1.3.8.3,1.3.8.4,1.3.8.5,1.3.8.6,1.3.8.7,1.3.8.8,1.3.8.9,1.3.8.10,1.3.9.1,1.3.9.2,1.3.9.3,1.3.9.4,1.3.9.5,1.3.9.6,1.3.9.7,1.3.9.8,1.3.9.9,1.3.9.1.0,1.3.10.1,1.3.10.2,1.3.1.0.3,1.3.10.4,1.3.10.5,1.3.10.6,1.3.10.7,1.3.10.8,1.3.10.9,1.3.10.10,1.4.1.1,1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4,1.4.1.5,1.4.1.6,1.4.1.7,1.4.1.8,1.4.1.9,1.4.1.10,1.4.2.1,1.4.2.2,1.4.2.3,1.4.2.4,1.4.2.5,1.4.2.6,1.4.2.7,1.4.2.8,1.4.2.9,1.4.2.10,1.4.3.1,1.4.3.2,1.4.3.3,1.4.3.4,1.4.3.5,1.4.3.6,1.4.3.7 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9.7,10.5.9.8,10.5.9.9,10.5.9.10,10.5.10.1,10.5.10.2,10.5.10.3,10.5.10.4,10.5.10.5,10.5.10.6,10.5.10.7,10.5.10.8,10.5.10.9,10.5.10.10,10.6.1.1,10.6.1.2,10.6.1.3,10.6.1.4,10.6.1.5,10.6.1.6,10.6.1.7,10.6.1.8,10.6.1.9,10.6.1.10,10.6.2.1,10.6.2.2,10.6.2.3,10.6.2.4,10.6.2.5,10.6.2.6,10.6.2.7,10.6.2.8,10.6.2.9,10.6.2.10,10.6.3.1,10.6.3.2,10.6.3.3,10.6.3.4,10.6.3.5,10.6.3.6,10.6.3.7,10.6.3.8,10.6.3.9,10.6.3.10,10.6.4.1,10.6.4.2,10.6.4.3,10.6.4.4,10.6.4.5,10.6.4.6,10.6.4.7,10.6.4.8.10.6.4.9,10.6.4.10,10.6.5.1,10.6.5.2,10.6.5.3,10.6.5.4,10.6.5.5,10.6.5.6,10.6.5.7,10.6.5.8,10.6.5.9,10.6.5.10,10.6.6.1,10.6.6.2,10.6.6.3,10.6.6.4,10.6.6.5,10.6.6.6,10.6.6.7,10.6.6.8,10.6.6.9,10.6.6.10,10.6.7.1,10.6.7.2,10.6.7.3,10.6.7.4,10.6.7.5,10.6.7.6,10.6.7.7,10.6.7.8,10.6.7.9,10.6.7.10,10.6.8.1,10.6.8.2,10.6.8.3,10.6.8.4,10.6.8.5,10.6.8.6,10.6.8.7,10.6.8.8,10.6.8.9,10.6.8.10,10.6.9.1,10.6.9.2,10.6.9.3,10.6.9.4,10.6.9.5,10.6.9.6,10.6.9.7,10.6.9.8,10.6.9.9,10.6.9.10,10.6.10.1,10.6.10.2,10.6.10.3,10.6.10.4,10.6.10.5,10.6.10.6,10.6.10.7,10.6.10.8,10.6.10.9,10.6.10.10,10.7.1.1,10.7.1.2,10.7.1.3,10.7.1.4,10.7.1.5,10.7.1.6,10.7.1.7,10.7.1.8,10.7.1.9,10.7.1.10,10.7.2.1,10.7.2.2,10.7.2.3,10.7.2.4,10.7.2.5,10.7.2.6,10.7.2.7,10.7.2.8,10.7.2.9,10.7.2.10,10.7.3.1,10.7.3.2,10.7.3.3,10.7.3.4,10.7.3.5,10.7.3.6,10.7.3.7,10.7.3.8,10.7.3.9,10.7.3.10,10.7.4.1,10.7.4.2,10.7.4.3,10.7.4.4,10.74.5,10.7.4.6,10.7.4.7,10.7.4.8,10.7.4.9,10.7.4.10,10.7.5.1,10.7.5.2,10.7.5.3,10.7.5.4,10.7.5.5,10.7.5.6,10.7.5.7,10.7.5.8,10.7.5.9,10.7.5.10,10.7.6.1,10.7.6.2,10.7.6.3,10.7.6.4,10.7.6.5,10.7.6.6,10.7.6.710.7.6.8,10.7.6.9,10.7.6.10,10.7.7.1,10.7.7.2,10.7.7.3,10.7.7.4,10.7.7.5,10.7.7.6,10.7.7.710.7.7.8,10.7.7.9,10.7.7.10,10.7.8.1,10.7.8.2,10.7.8.3,10.7.8.4,10.7.8.5,10.7.8.6,10.7.8.7,10.7.8.8,10.7.8.9,10.7.8.10,10.7.9.1,10.7.9.2,10.7.9.3,10.7.9.4,10.7.9.5,10.7.9.6,10.7.9.7,10.7.9.8,10.7.9.9,10.7.9.10,10.7.10.1,10.7.10.2,10.7.10.3,10.7.10.4,10.7.10.5,10.7.10.6,10.7.10.7,10.7.10.8,10.7.10.9,10.7.10.10,10.8.1.1,10.8.1.2,10.8.1.3,10.8.1.4,10.8.1.5,10.8.1.6,10.8.1.7,10.8.1.8,10.8.1.9,10.8.1.10,10.8.2.1,10.8.2.2,10.8.2.3,10.8.2.4,10.8.2.5,10.8.2.6,10.8.2.7,10.8.2.8,10.8.2.9,10.8.2.10,10.8.3.1,10.8.3.2,10.8.3.3,10.8.3.4,10.8.3.5,10.8.3.6,10.8.3.7,10.8.3.8,10.8.3.9,10.8.3.10,10.8.4.1,10.8.4.2,10.8.4.3,10.8.4.4,10.8.4.5,10.8.4.6,10.8.4.7,10.8.4.8,10.8.4.9,10.8.4.10,10.8.5.1,10.8.5.2,10.8.5.3,10.8.5.4,10.8.5.5,10.8.5.6,10.8.5.7,10.8.5.8,10.8.5.9,10.8.5.10,10.8.6.1,10.8.6.2,10.8.6.3,10.8.6.4,10.8.6.5,10.8.6.6,10.8.6.7,10.8.6.8,10.8.6.9,10.8.6.10,10.8.7.1,10.8.7.2,10.8.7.3,10.8.7.4,10.8.7.5,10.8.7.6,10.8.7.7,10.8.7.8,10.8.7.9,10.8.7.10,10.8.8.1,10.8.8.2,10.8.8.3,10.8.8.4,10.8.8.5,10.8.8.6,10.8.8.7,10.8.8.8,10.8.8.9,10.8.8.10,10.8.9.1,10.8.9.2,10.8.9.3,10.8.9.4,10.8.9.5,10.8.9.6,10.8.9.7,10.8.9.8,10.8.9.9,10.8.9.10,10.8.10.1,10.8.10.2,10.8.10.3,10.8.10.4,10.8.10.5,10.8.10.6,10.8.10.7,10.8.10.8,10.8.10.9,10.8.10.10,10.9.1.1,10.9.1.2,10.9.1.3,10.9.1.4,10.9.1.5,10.9.1.6,10.9.1.7,10.9.1.8,10.9.1.9,10.9.1.10,10.9.2.1,10.9.2.2,10.9.2.3,10.9.2.4,10.9.2.5,10.9.2.6,10.9.2.7,10.9.2.8,10.9.2.9,10.9.2.10,10.9.3.1,10.9.3.2,10.9.3.3,10.9.3.4,10.9.3.5,10.9.3.6,10.9.3.7,10.9.3.8,10.9.3.9,10.9.3.10,10.9.4.1,10.9.4.2,10.9.4.3,10.9.4.4,10.9.4.5,10.9.4.6,10.9.4.7,10.9.4.8,10.9.4.9,10.9.4.10,10.9.5.1,10.9.5.2,10.9.5.3,10.9.5.4,10.9.5.5,10.9.5.6,10.9.5.7,10.9.5.8,10.9.5.9,10.9.5.10,10.9.6.1,10.9.6.2,10.9.6.3,10.9.6.4,10.9.6.5,10.9.6.6,10.9.6.7,10.9.6.8,10.9.6.9,10.9.6.10,10.9.7.1,10.9.7.2,10.9.7.3,10.9.7.4,10.9.7.5,10.9.7.6,10.9.7.7,10.9.7.8,10.9.7.9,10.9.7.10,10.9.8.1,10.9.8.2,10.9.8.3,10.9.8.4,10.9.8.5,10.9.8.6,10.9.8.7,10.9.8.8,10.9.8.9,10.9.8.10,10.9.9.1,10.9.9.2,10.9.9.3,10.9.9.4,10.9.9.5,10.9.9.6,10.9.9.7,10.9.9.8,10.9.9.9,10.9.9.10,10.9.10.1,10.9.10.2,10.9.10.3,10.9.10.4,10.9.10.5,10.9.10.6,10.9.10.7,10.9.10.8,10.9.10.9,10.9.10.10,10.10.1.1,10.10.1.2,10.10.1.3,10.10.1.4,10.10.1.5,10.10.1.6,10.10.1.7,10.10.1.8,10.10.1.9,10.10.1.10,10.10.2.1,10.10.2.2,10.10.2.3,10.10.2.4,10.10.2.5,10.10.2.6,10.10.2.7,10.10.2.8,10.10.2.9,10.10.2.10,10.10.3.1,10.10.3.2,10.10.3.3,10.10.3.4,10.10.3.5,10.10.3.6,10.10.3.7,10.10.3.8,10.10.3.9,10.10.3.10,10.10.4.1,10.10.4.2,10.10.4.3,10.10.4.4,10.10.4.5,10.10.4.6,10.10.4.7,10.10.4.8,10.10.4.9,10.10.4.10,10.10.5.1,10.10.5.2,10.10.5.3,10.10.5.4,10.10.5.5,10.10.5.6,10.10.5.7,10.10.5.8,10.10.5.9,10.10.5.10,10.10.6.1,10.10.6.2,10.10.6.3,10.10.6.4,10.10.6.5,10.10.6.6,10.10.6.7,10.10.6.8,10.10.6.9,10.10.6.10,10.10.7.1,10.10.7.2,10.10.7.3,10.10.7.4,10.10.7.5,10.10.7.6,10.10.7.7,10.10.7.8,10.10.7.9,10.10.7.10,10.10.8.1,10.10.8.2,10.10.8.3,10.10.8.4,10.10.8.5,10.10.8.6,10.10.8.7,10.10.8.8,10.10.8.9,10.10.8.10,10.10.9.1,10.10.9.2,10.10.9.3,10.10.9.4,10.10.9.5,10.10.9.6,10.10.9.7,10.10.9.8,10.10.9.9,10.10.9.10,10.10.10.1,10.10.10.2,10.10.103,10.10.10.4,10.10.10.5,10.10.10.6,10.10.10.7,10.10.10.8,10.10.10.9,10.10.10.10
其它说明性的通式B化合物组包括以下描述的化合物。如果没有另外指定,以下化合物组的所有氢原子和R基团与通式B的第1组化合物的定义相同。
第2组:该组包括具有表A定义的R1、R2、R3和R4取代基的表B中命名的化合物,其中R1、R2、R3和R4取代基键合到与第1组化合物所述除在5-6位置存在一个双键外相同的类固醇核上。因此,第2组化合物1.3.1.1具有结构:
第3组:该组包括具有表A定义的R1、R2、R3和R4取代基的表B中命名的化合物,其中R1、R2、R3和R4取代基键合到与第1组化合物所述除在1-2和5-6位置存在双键外相同的类固醇核上。因此,第3组化合物2.2.5.1具有结构:
第4组:该组包括具有表A定义的R1、R2、R3和R4取代基的表B中命名的化合物,其中R1、R2、R3和R4取代基键合到与第1组化合物所述除在1-2位置存在一个双键外相同的类固醇核上。因此,第4组化合物5.2.7.8具有结构:
第5组:该组包括具有表A定义的R1、R2、R3和R4取代基的表B中命名的化合物,其中R1、R2、R3和R4取代基键合到与第1组化合物所述除在4-5位置存在一个双键外相同的类固醇核上。因此,命名为3.5.2.9的第5组化合物具有结构:
第6组:该组包括具有表A定义的R1、R2、R3和R4取代基的表B中命名的化合物,其中R1、R2、R3和R4取代基键合到与第1组化合物所述除在1-2和4-5位置存在双键外相同的类固醇核上。因此,命名为10.2.7.8的第6组化合物具有结构:
第7-1至7-6组:这些组包括上述的6个化合物,不同之外在于R5为氢而不是甲基。因此,第7-1组具有与上述第1组相同的类固醇,即不存在双键,但R5为-H。第7-2组包括与上述第2组相同的类固醇核,即在5-6位置存在一个双键,但R5为-H。第7-3至7-6组化合物具有相同的类固醇核。因此,命名为1.2.1.9的第7-1至7-6组化合物具有以下结构:
第7-5组化合物1.2.1.9和
第7-6组化合物1.2.1.9。
第8-1至8-6组:这些组中包括在第1-6组中命名的每个化合物,不同之处在于通式B的R5为-CH2OH而不是甲基。第8-1至8-6组化合物具有与第1-6组化合物按相同方式命名的结构,不同之处在于R5为-CH2OH而不是甲基。这些组与第7-1至7-6组化合物的命名方式相同。因此,命名为1.2.1.9的第8-1和第8-2组化合物具有以下结构:
第8-1组化合物1.2.1.9和
第9-1至9-6组:这些组包括在第1-6组中命名的每个化合物,不同之处在于通式B的R6为氢而不是甲基。第9-1至9-6组化合物具有与第7-1至7-6组化合物按相同方式命名的结构,不同之处在于R6为氢而不是甲基。因此,命名为1.2.1.9的第9-1组和第9-2组化合物具有以下结构:
第9-2组化合物1.2.1.9。
第10-1至10-6组:这些组包括在第1-6组中命名的每个化合物,不同之处在于通式1的R6为-CH2OH而不是甲基。第10-1至10-6组化合物具有与第7-1至7-6组化合物按相同方式命名的结构,不同之处在于R6为-CH2OH而不是甲基。因此,命名为1.2.1.9的第10-1组和第10-2组化合物具有以下结构:
第11-1至11-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下取代基代替:
1 -O-C(O)-CH2CH2CH2CH3(-O-C(O)-CH2CH2CH2CH3代替-OH,-OH是表A中R1取代基1)
2 -O-C(O)-CH2CH2CH2CH2GH2CH3
3 -O-C(O)-CH2CH2OCH2CH3
4 -O-C(O)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH3
5 -O-C(O)-CH2CH2CH2CH2OCH2CH3
6 -O-C(O)-CH2CH2OCH2CH2CH2CH3
7 -O-C6H4Cl
8 -O-C6H3F2
9 -O-C6H2-O(CH2)2-O-CH2CH3
10 -O-C6H4-C(O)O(CH2)0-9CH3
第11-1至11-6组化合物具有与第7-1至7-6组化合物按相同方式命名的结构,不同之处在于表A中的取代基1-10由上述列举的R1取代基1-10代替。因此命名为1.2.1.9的第11-1和11-2组化合物具有以下结构:
命名为1.2.1.9的第11-7-1和11-7-2组化合物具有以下结构:
第11-7-1组化合物1.2.1.9和
第11-7-2组化合物1.2.1.9。
命名为1.2.1.9的第11-8-1和11-8-2组化合物具有以下结构:
第11-8-2组化合物1.2.1.9。
第12-1至1 2-1 0-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-P(O)(O)-CH2CH(CH3)CH3(-O-P(O)(O)-OCH2CH(CH3)CH3代替-OH,-OH为表A中R1取代基1)
2 -O-P(O)(O)-OCH2CH2CH2CH2CH3
3 -O-P(O)(O)-OCH2CH2CH2CH2CH2CH3
4 -O-P(O)(O)-OCH2CH2CH(CH2CH2)CH3
5 -O-CH2CH2CH2CH2CH2CH3
6 -O-C2H5
7 -O-CH2CH2CH3
8 -O-CH2CH2CH2CH3
9 -O-CH(CH3)CHCH3
10 -O-C(CH3)3
第13-1至13-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-(CH2)4CH3(-O-(CH2)4CH3代替-OH,-OH为表A中的R1取代基1)
2 -O-C(O)-NH2
3 -O-C(O)-NHCH3
4 -O-C(O)-NHC2H5
5 -O-C(O)-NHCH2CH2CH3
6 -O-C(O)-NHCH2CH2OCH2CH3
7 -O-C(O)-CH3
8 -O-C(O)-C2H5
9 -O-C(O)-CH2CH2CH3
10 -O-C(O)-CH2CH2CH2CH3
第14-1至14-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-CH2C6H5
2 -O-CH2C6H5
3 -O-CH2C6H4OCH3
4 -O-CH2C6H4OCH3
5 -O-CH2C6H4F
6 -O-CH2C6H4F
7 -O-CH2C6H3(OCH3)2
8 -O-CH2C6H3(OCH3)2
9 -O-CH2C6H4OCH2CH3
10 -O-CH2C6H4OCH2CH3
第15-1至15-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-CH2CH2NH2(-O-C(O)-CH2CH2NH2代替-OH,-OH为表A中R1取代基1)
2 -O-C(O)-CH2CH2CH2NH2
3 -O-C(O)-CH2OH
4 -O-C(O)-CH2CH2OH
5 -O-C(O)-CH2CH2CH2OH
6 -O-C(O)-CH2SH
7 -O-C(O)-CH2CH2SH
8 -O-C(O)-CH2CH2CH2SH
9 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C2H5
10 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C2H5
第16-1至16-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-A4-NH2,其中A4-NH2为由-NH2取代的4碳烷基(-O-C(O)-A4-NH2代替-OH,-OH为表A中R1取代基1)
2 -O-C(O)-A6-NH2,其中A6-NH2为由-NH2取代的6碳烷基
3 -O-C(O)-A8-NH2,其中A8-NH2为由-NH2取代的8碳烷基
4 -O-C(O)-A4-OH,其中A4-OH为由-OH或-O-取代的4碳烷基
5 -O-C(O)-A6-OH,其中A6-OH为由-OH或-O-取代的6碳烷基
6 -O-C(O)-A8-OH,其中A8-OH为由-OH或-O-取代的8碳烷基
7 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C3H7
8 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C3H7
9 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C4H9
10 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C4H9
第17-1至17-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R1取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C6H13
2 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C6H13
3 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C8H17
4 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C8H17
5 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C5H10OH
6 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C5H10OH
7 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C3H6OH
8 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C3H6OH
9 -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C7H14OH
10 -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C7H14OH
第18-1至18-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R4取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)CH2NH2
2 -O-C(O)C(CH3)H-NH2
3 -O-C(O)C(CH2C6H5)H-NH2
4 -O-C(O)-O-NHC(CH3)H-CO2H
5 -O-C(O)-O-NHCH2-CO2H
6 -O-C(O)-O-NH(CH2C6H5)H-CO2H
7 -O-C(O)-CF3
8 -O-C(O)-CH2CF3
9 -O-C(O)-(CH2)3CF3
10 -O-C(O)-(CH2)5CH3
第19-1至19-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R4取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-O-CH3
2 -O-C(O)-O-CH2CH3
3 -O-C(O)-O-C3H7
4 -O-C(O)-O-C4H9
5 -O-C(O)-O-C6H13
6 -O-C(O)-O-C6H5
7 -O-C(O)-O-C6H4OH
8 -O-C(O)-O-C6H4OCH3
9 -O-C(O)-O-C6H4OCH2CH3
10 -O-C(O)-O-C6H4F
第20-1至20-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R4取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-S-CH3
2 -O-C(O)-S-CH2CH3
3 -O-C(O)-S-C3H7
4 -O-C(O)-S-C4H9
5 -O-C(O)-S-C6H13
6 -O-C(O)-S-C6H5
7 -O-C(O)-S-C6H4OH
8 -O-C(O)-S-C6H4OCH3
9 -O-C(O)-S-C6H4OCH2CH3
10 -O-C(O)-S-C6H4F
第21-1至21-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R4取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(S)-O-CH3
2 -O-C(S)-O-CH2CH3
3 -SH
4 =S
5 -O-C(S)-O-C6H13
6 -O-C(O)-O-CH2C6H5
7 -O-C(O)-O-CH2C6H4OH
8 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH3
9 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH2CH3
10 -O-C(O)-O-CH2C6H4F
第22-1至22-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R2取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(S)-O-CH3
2 -O-C(S)-O-CH2CH3
3 -O-C(S)-O-C3H7
4 -O-C(S)-O-C4H9
5 -O-C(S)-O-C6H13
6 -O-C(O)-O-CH2C6H5
7 -O-C(O)-O-CH2C6H4OH
8 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH3
9 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH2CH3
10 -O-C(O)-O-CH2C6H4F
第23-1至23-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R3取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(S)-O-CH3
2 -O-C(S)-O-CH2CH3
3 -O-C(S)-O-C3H7
4 -O-C(S)-O-C4H9
5 -O-C(S)-O-C6H13
6 -O-C(O)-O-CH2C6H5
7 -O-C(O)-O-CH2C6H4OH
8 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH3
9 -O-C(O)-O-CH2C6H4OCH2CH3
10 -O-C(O)-O-CH2C6H4F
第24-1至24-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R2取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-O-C6H5
2 -O-C(O)-O-C6H4OCH3
3 -SH
4 =S
5 -O-CHR24-C(O)-OR25
6 -O-CHR24-C(O)-R25
7 -O-CHR24-C(O)-N(R25)2
8 -O-CHR24-C(O)-NHR25
9 -O-CHR24-C(O)-NH2
10 -O-CHR24-C(O)-OC6H5
第25-1至25-10-6组:这些组包括在第1至10-6组中命名的每个化合物,其中表A中列举的R3取代基1-10由以下基团代替:
1 -O-C(O)-O-C6H5
2 -O-C(O)-O-C6H4OCH3
3 -SH
4 =S
5 -O-CHR24-C(O)-OR25
6 -O-CHR24-C(O)-R25
7 -O-CHR24-C(O)-N(R25)2
8 -O-CHR24-C(O)-NHR25
9 -O-CHR24-C(O)-NH2
10 -O-CHR24-C(O)-OC6H5
第26-1至26-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中通式B的R7为-O-而不是-CH2-。因此,命名为1.2.5.9的第26-1第26-2组化合物具有以下结构:
命名为1.2.5.9的第26-8-1和26-8-2组化合物具有以下结构:
命名为1.2.5.9的第26-11-1和第26-11-2组化合物具有以下结构:
第26-11-1组化合物1.2.5.9和
第27-1至27-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中通式B的R8为-O-而不是-CH2-。因此,命名为1.2.5.9的第27-1第27-2组化合物具有以下结构:
第27-1组化合物1.2.5.9和
命名为1.2.5.9的第27-8-1和27-8-2组化合物具有以下结构:
第27-8-2组化合物1.2.5.9。
命名为1.2.5.9的第27-11-1和第27-11-2组化合物具有以下结构:
第27-11-1组化合物1.2.5.9和
第28-1至28-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中通式B的R9为-O-而不是-CH2-,并且在1-2位置上没有双键存在。因此例如不存在第28-3、28-4、28-6、28-8-3、28-8-4或28-8-6组,因为这些化合物中存在1-2双键且2-位的环氧带电。因此,命名为1.2.5.9的第28-1、第28-2和第28-5组化合物具有以下结构:
第28-5组化合物1.2.5.9。
命名为1.2.5.9的第28-8-1第28-8-2组化合物具有以下结构:
第28-8-1组化合物1.2.5.9和
命名为1.2.5.9的第28-11-1和第28-11-2组化合物具有以下结构:
第29-1至29-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R7为-NH-而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第30-1至30-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R8为-NH-而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第31-1至31-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R9为-NH-而不是-CH2-,并且在1-2位置不存在双键。因此例如不存在第31-3、31-4、31-6、31-8-3、31-8-4或31-8-6组化合物。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第32-1至32-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R7、R8、R9中的两个独立地为-NH-、-O-或-S-,而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第33-1至33-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R7、R8、R9中的两个独立地为-NH-、-O-或-S-,而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第34-1至34-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R7为-S-,而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第35-1至35-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R8为-S-,而不是-CH2-。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第36-1至36-25-10-6组:这些组包括在第1至25-10-6组中命名的每个化合物,其中R9为-S-,而不是-CH2-,并且在1-2位置不存在双键。因此例如不存在第36-3、36-4、36-6、36-8-3、36-8-4或36-8-6组。这些化合物按第26-1第26-25-10-6组化合物所述的方法命名。
第37-1至37-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中R1不是二价的,例如不为=O,并且它为α-构型,而不是如通式B中所示的β-构型。
第38-1至38-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中R2不是二价的,例如不为=O,并且它为α-构型,而不是如通式B中所示的β-构型。
第39-1至39-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中R3不是二价的,例如不为=O,并且它为β-构型,而不是如通式B中所示的α-构型。
第40-1至40-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中R4不是二价的,例如不为=O,并且它为α-构型,而不是如通式B中所示的β-构型。
第41-1至41-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中R2和R4不是二价的,例如不为=O,并且它们同为α-构型,而不是如通式B中所示的β-构型。
第42-1至42-25-10-6组:这些组包括上述在第1至36-25-10-6所有组中命名的每个化合物,其中当5-位为氢时,其为β-构型,而不是如通式B中所示的α-构型。
第1至42-25-10-6组化合物中命名的任何化合物或一般化合物都适用于本文所述的方法。
在某些实施方案中,R1-R6、R10、R15、R17和R18中的一个或多个独立地具有这些结构和/或独立地包括所命名的化合物,-H、-OH、=O、-SH、=S、-NH2、-CN、-N3、卤素、=CH2、=NOH、=NOC(O)CH3、-C(O)-CH3、-C(O)-(CH2)1-4-CH3-CCH、-CCCH3、-CH=CH2,-CH=CH2CH3,-O-C(O)-(CH2)m-(CF2)n-CH3,-O-C(O)-(CH2)m-(CF2)n-CF3,-O-C(O)-(CH2)m-(CF2)n-CH2F,-O-C(O)-O-(CH2)m-(CF2)n-CH3,-O-C(O)-O-(CH2)m-(CF2)n-CF3,-O-C(O)-O-(CH2)m-(CF2)n-CH2F,-O-C(O)-NH-(CH2)m-(CF2)n-CH3,-O-C(O)-NH-(CH2)m-(CF2)n-CF3,-O-
C(O)NH-(CH2)m-(CF2)n-CH2F(其中m为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10,n为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10,通常n为0),
-CH(CH3)-(CH2)2-C(O)NH-CH2COOH,-CH(CH3)-(CH2)2-C(O)NH-CH2SO3H,-OSi(CH3)2C(CH3)3,-C(OH)=CHCH3,=CH(CH2)0-15CH3,-(CH2)0-14CH2F,-(CH2)0-14CH2Cl,-(CH2)0-14CH2Br,-(CH2)0-14CH2l,-(CH2)2-10-O-(CH2)0-4CH3,-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3,-(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3,-O-(CH2)0-14CH2F,-O-(CH2)0-14CH2Cl,-O-(CH2)0-14CH2Br,-O-(CH2)0-14CH2l,-O-(CH2)2-10-O-(CH2)0-4CH3,-O-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3,-O-(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3,-O-C(O)-(CH2)0-14CH2F,-O-C(O)-(CH2)0-14CH2Cl,-O-C(O)-(CH2)0-14CH2Br,-O-C(O)-(CH2)0-14CH2l,-O-C(O)-(CH2)2-10-O-(CH2)0-4CH3,-O-C(O)-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3,-O-C(O)-(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3,-O-C(S)-(CH2)0-14CH2F,-O-C(S)-(CH2)0-14CH2Cl,-O-C(S)-(CH2)0-14CH2Br,-O-C(S)-(CH2)0-14CH2l,-O-C(S)-(CH2)2-10-O-(CH2)0-4CH3,-O-C(S)-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3,-O-C(S)-(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3,-(CH2)0-16NH2,-(CH2)0-15CH3,-(CH2)0-15CN,-(CH2)0-15CH=CH2,-(CH2)0-15NHCH(O),-(CH2)0-16NH-(CH2)0-15CH3,-(CH2)0-15CCH,-(CH2)0-15OC(O)CH3,-(CH2)0-15OCH(OH)CH3,-(CH2)0-15C(O)OCH3,-(CH2)0-15C(O)OCH2CH3,-(CH2)0-15C(O)(CH2)0-15CH3,-(CH2)0-15C(O)(CH2)0-15CH2OH,-O(CH2)1-16NH2,-O(CH2)1-15CH3,-O(CH2)1-15CN,-O(CH2)1-15CH=CH2,-O(CH2)1-15NHCH(O),-O(CH2)1-16NH-(CH2)1-15CH3,-O(CH2)1-15CCH,-O(CH2)1-15OC(O)CH3,-O(CH2)1-15OCH(OH)CH3,-O(CH2)1-15C(O)OCH3,-O(CH2)1-15C(O)OCH2CH3,-O(CH2)1-15C(O)(CH2)0-15CH3,-O(CH2)1-15C(O)(CH2)0-15CH2OH,-OC(O)(CH2)1-16NH2,-OC(O)(CH2)1-15CH3,-C(O)O(CH2)1-15CN,-C(O)O(CH2)1-15CH=CH2,-OC(O)(CH2)1-15NHCH(O),-OC(O)(CH2)1-16NH-(CH2)1-15CH3,-OC(O)(CH2)1-15CCH,-OC(O)(CH2)1-15OC(O)CH3,-OC(O)(CH2)1-15OCH(OH)CH3,-OC(O)(CH2)1-15C(O)OCH3,-OC(O)(CH2)1-15C(O)OCH2CH3-OC(O)(CH2)1-15C(O)(CH2)0-15CH3,-OC(O)(CH2)1-15C(O)(CH2)0-15CH2OH,
磷酸烯醇丙酮酸,D-葡萄糖胺,葡糖胆酸,葡萄糖醛酸,泛酸,丙酮酸,葡萄糖,果糖,甘露糖,蔗糖,乳糖,海藻糖,鼠李糖,半乳糖,核糖,2’-脱氧核糖,3’-脱氧核糖,甘油,3-磷酸甘油酸酯,一种PEG(PEG20,PEG100,PEG200,PEG10000),一种聚氧化烯聚合物,甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,脯氨酸,4-羟基脯氨酸或一种寡核苷酸或包含约4-约21个单体的类似物。
当取代基为寡核苷酸或聚合物时,通常这些物质中只有一种键合到通式1表示的化合物。通常情况是当R1-R2和R4-R6包含一种或多种这种取代基(或本文所述的其它取代基)时,取代基以β-构型存在,而R3通常包含一个β-构型的取代。在某些实施方案中,R2处于α-构型。
在某些实施方案中,R1-R6、R10、R15、R17和R18中的一个或多个独立地包含一种核苷、一种核苷酸、一种寡核酸或任一这些物质的一种类似物。通常这种部分通过端羟基、硫醇、酰基部分或胺在5’、3’或2’位键合到类固醇核上,条件是当那些位置上存在羟基、硫醇、酰基或胺时。对于寡核苷酸和寡核苷酸类似物,与类固醇的键合有时是通过在内部2’-位上的一个糖羟基。
磷酸二酯的类似物的键合包括硫代磷酸酯键合和本文所引用的参考文献中所述的其它键合。寡核苷酸偶合基团是指任何适合在相邻核苷酸间或其类似物间产生一种磷酸二酯键合或磷酸二酯类似物键合的部分。合适的寡核苷酸偶合基团包括-OH、H-膦酸酯、烷基氨基膦酸酯或氨基磷酸酯如β-氰乙基-氨基磷酸酯、N,N-二异丙基氨基-β-氰乙氧基磷化氢和其它在引用的参考文献中所述的寡核苷酸偶合基团。合适的嘌呤和嘧啶碱包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及其它在引用的参考文献中所述的嘌呤和嘧啶。合适的核苷、核苷酸、寡核苷酸以及其类似物已经有描述,例如请参见,美国专利USP4725677,4973679,4997927,4415732,4458066,5047524,4959463,5212295,5386023,5489677,5594121,5614622,5624621;和公开号为WO 92/07864,WO 96/29337,WO 97/14706,WO 97/14709,WO97/31009,WO 98/04585和WO 98/04575的PCT公开文本,所有的这些在本文中引作参考。通式1化合物例如在第1至第42-25-10-6组中命名的任何化合物,适合与寡核苷酸键合,以调节寡核苷酸的亲油性或把寡核苷酸运输或渗透到细胞中。一旦结合之物进入细胞,这种键合在生物学上易于促进类固醇从寡核苷酸上释放。
表2列举了R1-R6、R10、R15、R17和R18的一个或多个可以包含的这些和其它示例性部分。Pr指保护基。这些部分通常键合到R1、R2和R4位置的一个或多个上,通常键合到这些位置的一个或两个上。对于具有不只一种给定变量的结构例如A3或A5结构中的X,每一个都可独立地选择。
表2
通常用于储存本发明组合物和制剂的容器会限制进入所储存物质的水量。通常制剂包装在密封的或感应密封容器中。容器通常是感应密封的。容器的水渗透特性已经有描述,例如《容器-渗透》
(Containers--Permeation),chapter.USP 23<671>,United StatesPharmacopeial Convention,Inc.,12601 Twinbrook Parkway,Rockville,MD 20852,pp.:1787以及下列等等(1995)。
使用通式A所表示的化合物治疗某些疾病例如感染如疟疾、HCV或隐孢子虫属已经有所描述。通式A具有以下结构
其中Q1为-C(R1)2-或-C(O)-;Q2为-C(R1)2-、-C(R1)(Y)-、-C(Y)-或-CH2-CH2-;Q3为-H或-C(R1)3-;Q4为-C(R1)2-、-C(O)-、羟基乙烯基亚甲基(-CH(CH=CHOH)-)或甲基亚甲基(-CH(CH3)-);Q5为-C(R1)2-或-C(O)-;
X和Y独立地为-OH、-H、低级烷基(例如C1-6烷基)、-O-C(O)-R5、-C(O)-O-R5、卤素(即-F、-Cl、-Br或-I)或=O;每个R1独立地为-H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基;R2为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-OR3、酯(例如-O-C(O)-R4或-C(O)-O-R4)、硫酯(例如-O-C(S)-R4或-C(S)-O-R4)、硫缩醛(例如-S-C(O)-R4或-C(O)-S-R4)、硫酸酯(例如-O-S(O)(O)-O-R4)、磺酸酯(例如-O-S(O)-O-R4)或氨基甲酸酯(例如-0-C(O)-NH-R4或-NH-C(O)-O-R4)或R2与键合到同一碳原子上的R1一起为=O;R3为-S(O)(O)-OM、-S(O)(O)-OCH2-CH(O-C(O)-R6)-CH2-O-C(O)-R6、-P(O)(O)-OCH2-CH(O-C(O)-R7)-CH2-O-C(O)-R7、结构(B)所示的葡萄糖苷酸,
或R3为C1-18烷基、C2-18链烯基、C2-18炔基、C1-18酯或C1-18硫酯,其中任意上述C1-18或C2-18部分在一个或多个氢原子处被一个或多个独立选择的-ORPR(包括-OH)、-NHRPR(包括-NH2)或-SRPR(包括-SH)基团所取代,或R3为C1-18脂肪酸、C2-20炔基、(J)n-苯基-C1-15-烷基、(J)n-苯基-C2-5-链烯基;R4为-H、保护基、选择性取代的C1-18烷基、选择性取代的C1-18链烯基、选择性取代的C1-18炔基、选择性取代的芳基、选择性取代的芳基-C1-6烷基、选择性取代的芳基-C2-6链烯基、选择性取代的芳基-C2-6炔基、选择性取代的杂环-C1-6烷基、选择性取代的C2-6链烯基-杂环、选择性取代的C2-6炔基-杂环或选择性取代的杂环,其中上述任何部分在1、2、3、4、5或更多个碳原子或氢原子处被一个或多个独立选自-O-、-S-、-NRPR-(包括-NH-)、-NH-C(O)-、-ORPR(包括-OH)、-NHRPR(包括-NH2)、-SRPR(包括-SH)、=O、=S、=N-OH、-CN、-NO2、-F、-Cl、-Br或-I的基团或原子所取代;每个R5独立地为直链或支链的C1-14烷基;每个R6独立地为直链或支链的C1-14烷基;每个R7独立地为直链或支链的C1-14烷基或结构(B)所示的葡萄糖苷酸基团;每个RPR独立地为-H或独立选择保护基;n为0、1、2或3;
每个J独立地为-F、-Cl、-Br、-I、C1-4烷基、C1-4链烯基、C1-4烷氧基、羧基、硝基、硫酸基、磺酰基、C1-6羧酸酯或C1-6硫酸酯;M为氢、钠、-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-R6)-CH2-O-C(O)-R6、-P(O)(O)-OCH2-CH(O-C(O)-R7)-CH2-O-C(O)-R7、或结构(A)所示的葡萄糖苷酸基因;通式1中的点划线表示一个选择性的双键,条件是在4-5和5-6位置上没有双键以及当存在一个双键时,0或1个R1基团在1-、2-、4-、5-、6-或17-位上键合到碳原子上,使得这些碳原子为四价;以及盐、立体异构体、位置异构体、代谢物、类似物或前体。
通式A所示的化合物,特别是当11-位的两个R1不是羟基、烷氧基或可水解为羟基的部分时,一般适用于本文公开的方法和组合物,例如它们用于增强患者的Th1免疫反应。给药方法和剂量基本按本文所述。
间歇式给药方法:人们可以间歇地把通式1表示的化合物如BrEA或BrEA酯对患者用药,而不会引起通常与不连续剂量有关的不希望的问题。这些不希望的问题包括病原体(病毒如HIV或寄生虫如疟原虫寄生虫)对治疗药剂产生抗药性或病人或患者没能坚持服药的失败治疗。间歇式给药程序包括按以下方式口服、局部或非肠道给药通式1表示的化合物:(1)给药约3-约20天,(2)约4-约20天不服用通式1化合物,(3)给药约4-约40天,和(4)选择性重复给药程序1、2、3、4、5、6、10、15、20、30或更多次。通常给药步骤(1)和(3)保持约3-15天,通常约3-5天。一般来讲,上述给药程序步骤(1)-(3)至少重复一次,通常至少2、3、4、5或6次。对于倾向于保持很长时间的感染,例如HIV、HCV或其它慢性病毒或寄生虫感染,间歇式给药程序通常保持相对长的时期,例如至少约6个月或约5年。
在间歇式给药程序中,通式1化合物可以通过任意途径给药,例如肌肉(i.m.或I.M.)、皮下(s.c或S.C.)、静脉内(i-v.或I.V.)、真皮内、其它非肠道途径,气雾剂使用量为约0.1-约10mg/kg/天,通常为0.2-4mg/kg/天。作为选择,人们也可以把通式1化合物按口服约4-40mg/kg/天的量给药,通常约6-20mg/kg/天。在某些实施方案中,间歇式给药方法不包括通常用于把避孕类固醇给例如人类女性用药的给药程序,例如每天服用21天,然后不给药7天。一般来说,本文所述的含有通式1化合物的非水溶液制剂是通过i.v.、i.m.、s.c.或其它非肠道途径给药的。每天的剂量可以是单一剂量给药特别是对于非肠道用药的剂量,或把剂量分成2、3、或4个次级剂量,通常为2个,特别是对于口服用药的剂量。
示例性的实施方案为(a)给药通式1化合物例如BrEA或BrEA的酯或碳酸酯,隔日一次20天,然后(b)不给药1、2、3、4、5、6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天,然后(c)给药通式1化合物每天至少一次,例如隔日给药通式1化合物20天,以及(d)选择性重复(a)、(b)或(c)1、2、3、4、5或6次或更多次。这些实施方案的一个子方案为(a)给药通式1化合物例如BrEA或BrEA的酯或碳酸酯,隔日一次20天,然后(b)不给药约10-40天,然后(c)给药通式1化合物每天至少一次,例如隔日给药通式1化合物20天,以及(d)选择性重复(a)、(b)或(c)1、2、3、4、5或6次或更多次。在任何实施方案中,人们可以以每天2或3个次级剂量给药通式1化合物。
其它实施方案为(a)给药通式1化合物例如BrEA或BrEA的酯或碳酸酯,一天一次约8-12天,然后(b)不给药1、2、3、4、5、6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天,然后(c)给药通式1化合物每天至少一次,例如隔日给药通式1化合物8-12天,以及(d)选择性重复(a)、(b)或(c)1、2、3、4、5或6次或更多次。该实施方案的一个子方案为(a)给药通式1化合物例如BrEA或BrEA的酯或碳酸酯,一天一次约10天,然后(b)不给药约10-40天,然后(c)给药通式1化合物每天至少一次,例如每天一次给药通式1化合物约10天,以及(d)任意重复(a)、(b)或(c)1、2、3、4、5或6次或更多次。在任何实施方案中,人们可以以每天2或3个次级剂量给药通式1化合物。
本发明间歇式给药方法的一个方面是监控患者对于给药的反应。例如,当对一个患有病毒感染(如HCV、HIV、SIV、SHIV)的患者给药时,人们可以监测患者或病原体的反应,例如一种或多种症状的改善或血清中受感染的粒子或病毒RNA的变化。一旦观察到反应,就可以再继续给药1、2或3天,然后停止给药至少一天(至少24小时),通常至少2或3天。一旦患者的反应出现减轻的信号(例如病毒血清RNA开始增加),可以重新开始一个给药疗程。患者对通式1化合物的反应的一个方面是患者可能会在较短的时间内通常是约5-10天,显示可测量的反应,这就使得可以例如通过监控周围白血细胞(“PBMC”)中的病毒滴定度或通过测定血液中的病毒的核酸水平直接跟踪患者的反应。人们可以在间歇式给药期间或给药后监测一种或多种免疫细胞子集,如NK、LAK、树突细胞或调节ADCC免疫反应的细胞,以监控患者的反应并确定何时显示必须进行进一步的给药通式1化合物。按照本文所述这些细胞子集是受到监控的,例如通过流式细胞测量术。
对于本文所述的任何治疗或方法,患者所表现的长期的有益效果或持续的免疫反应可能是由于单一给药通式1化合物或几次每日给药通式1化合物或间歇式给药通式1化合物所引起的。单一给药是指在24小时内给患者给药通式1化合物1、2、3或更多剂量并且至少在约45天至2个月如3、4、5、6或更多个月内不再对患者给药任何通式1化合物。在完成一短期疗程(例如每日给药2、3、4、5或6天)后,长期的有益效果或免疫反应可能还会持续,患者不再接受任何通式1化合物,或在某些情况下不接受任何其它的医治引起患者病理状况的主要原因的医疗治疗。这种有益效果可以持续超过约5-30天。
在某些情况下,在用通式1化合物对患者进行一短期疗程后,治疗引起的有益效果在超过3个月(4或5或更多月)内可以观察到。因此,给药通式1化合物提供了一种有效保护患者免受感染发展,或免受不需要的免疫反应(例如发炎)引起的不利后果,或免受免疫抑制(例如由感染、化学疗法所引起)的方法,而在最初的给药程序后至少3个月不再服用该化合物,最初的给药程序可以是间歇式或连续给药例如超过1天-约4个月(1-15天、约1个月、约2个月等)。
合成方法:用于制备通式1化合物的试剂和反应条件已经有描述,例如请参见以上的引用内容、美国专利USP 5874598、5874597、5874594、5840900;PCT申请WO 9901579。把多种有机部分键连到多种活性基团上的通用化学合成方法已经有描述。例如在G.T.Hermanson的《生物连接技术》(Bioconjugate Techniques),AcademicPress,1996中,在3-136页描述了官能目标如氨基酸、肽和碳水化合物,在137-166页描述了官能目标中活性基团的化学性质,活性基团如胺、硫醇、羧基、羟基、醛、酮和活性氢原子(例如连接到给电子部分如杂芳环上的-H)。该参考文献还在169-416页和605-638页描述了对制备衍生物如零长度交联剂、同双官能交联剂、异双官能交联剂、标记、探针和聚合物。该文献还在639-671页描述了改性寡核苷酸的合成方法。
一方面,氨基酸或肽通过氨基使用一种偶联试剂如光气(Cl-CO-Cl)或Cl-CS-Cl以及适合受保护的并在需要时可以保护的氨基酸或肽和类固醇连接到类固醇上。这种连接在氨基酸或肽与类固醇核之间产生了插入部分-CO-O-或-CS-O-。
示例性合成方案:举例但不限于以下方法,用于制备一种或多种本文所公开的化合物。例如在以下文献中,可以发现起始物质和方案的简明变化,在本文中引作参考:A.P.Davis等,四面体通讯(Tetrahedron Lett.),33:5111-5112,1992;I.Takashi等,化学药物通报(Chem.Pharm.Bull.),34:1929-1933,1986;I.Weisz等,Arch.Pharm.,319:952-953,1986;T.Watabe等,药物化学学报(J.Med.Chem.),13:311-312,1970;M.Davis等,化学会志C(J.Chem.Soc.C.),(11):1045-1052,1967;R.C.Cambie等,化学会志(J.Chem Soc.)Perkin Trans.,1,(20):2250-2257,1977;L.Minale等,J.Chem Soc.,Perkin Trans.1,(20):2380-2384,1974;C.K.Lai等, 类固醇(Steroids),42:707-711,1983;S.Irie等,合成(Synthesis),(9):1135-1138,1996;E.J.Corey,美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),118:8765-8766,1996;M.E.Annunziato等,生物连接化学(Bioconjugate Chem.),4:212-218,1993;N.J.Cussans等,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,(8):1650-1653,1980;D.H.R.Barton等,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,(9):393-394,1978;H.Loibner等,Helv.Chim.Acta,59:2100-2113,1976;T.R.Kasturi等,Proc.Indian Acad.Sci.,[Ser.]:Chem.Sci.,90:281-290,1981;T.Back,有机化学学报(J.Org.Chem.),46:1442-1446,1981;A.Canovas等,Helv.Chim.Acta,63:486-487,1980;R.J.Chorvat等,J.Org.Chem.,43:966-972,1978;M.Gumulka等,加拿大化学学报(Can.J.Chem.),63:766-772,1985;H.Suginome等,J.Org.Chem.,55:2170-2176,1990;C.R.Engel等,加拿大杂环(Can.Heterocycles),28:905-922,1989;H.Sugimone等,Bull.Chem.Soc.Jpn.,62:193-197,1989;V.S.Salvi等,Can.Steroids,48:47-53,1986;C.R.Engel等,Can.Steroids,47:381-399,1986;H.Suginome等,Chem.Lett.,(5):783-786,1987;T.Iwadare等,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,(11):705-706,1985;H.Nagano等,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,(10):656-657,1985;V.S.Salvi等,Steroids,27:717:725,1976;C.H.Engel等,Steroids,25:781-790,1975;M.Gobbini等,Steroids,61:572-582,1996;A.G.Gonzalez等,四面体(Tetrahedron),46:1923-1930,1990;S.C.Bobzin等,J.Org.Chem.,54:3902-3907,1989;B.Solaja等,Croat.Chem.Acta,59:1-17,1986;Y.Kashman等,Tetrahedron,27:3437-3445,1971;K.Yoshida等,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo),15:1966-1978,1967;P.B.So11man等,化学通讯(Chem.Commun.),(11):552-554,1967;H.Suginome等,J.Org.Chem.,55:2170-2176,1990;H.Suginome等,Journal Chem.Lett.,(5):783-786,1987;G.A.Tolstikov等,Zh.Org.Khim.,22:121-132,1986;T.Terasawa等,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,(4):990-1003,1979;Z.Zhuang等,有机化学(Yougi Huaxue),(4):281-285,1986;W.T.Smith等,Trans.Ky.Acad.Sci.,45:76-77,1984;A.K.Batta等,Steroids,64:780-784,1999;B.Ruan等,Steroids,65:29-39,2000;L.Garrido等,Steroids,65:85-88,2000;P.Ramesh等,Steroids,64:785-789,1999;M.Numazawa等,Steroids,64:187-196,1999;P.N.Rao等,Steroids,64:205-212,1999;M.Numazawa等,Steroids,64:320-327,1999;美国专利3281431、3301872、3325535、3325536、3952018、4602008、5571795、5627270、5681964、5744453;国际申请WO 9408588、WO 9508558、WO 9508559、WO 9638466、WO 9809450;英国专利GB 1168227、GB 813529、GB802618;法国专利824529;日本专利JP 45010134;欧洲专利申请EP232788、EP430078;和德国专利DE 19631189。
方案1:对于方案1中所示的结构,R5-R9与通式1化合物的定义一致。因此,当R5和R6均为β-构型的-CH3时,R7、R8和R9均为-CH2-,9-位和14-位的H为α-构型,3-位的醋酸酯为β-构型,8-位的H为β-构型,方案1中的化合物1为DHEA乙酸酯。本文公开的该方案以及其它方案中3、7、16、17或其它位置的乙酸酯基可独立地为其它本文所述的酯部分,例如C2-50酯包括-C(O)-(CH2)0-4-(CF2)0-4-CF3包括-C(O)-CF3,-C(O)-C2-29选择性取代的烷基,-C(O)-CH2-C2-28选择性取代的链烯基,-C(O)-CH2-C2-28选择性取代的炔基,-C(O)-(CH2)0-6选择性取代的苯基,或-C(O)-(CH2)0-6选择性取代的杂环或本文描述的或引用的参考文献中的其它有机部分。
本文所描述的这些有机部分的典型取代基包括1、2、3或更多个独立选择的-O-、=O、选择性保护的羟基、-S-、选择性保护的硫醇、-NH-、选择性保护的-NH2、选择性保护的-C(O)OH、-C(O)-NH-、-C(O)-NH2、-NH-C(O)-H、-NH-C(O)-C0-4H1-9、-NH-C(O)-O-C0-4H1-9、-CN、-NO2、-N3或卤素。按照需要保护活性基团,例如=O在LiCR反应中通常要保护,LiCR反应用于在以下的方案1中产生化合物
1。
方案1
缩写:
LDA=二异丙基酰胺锂;MCPBA=间氯过苯甲酸;TMSCl=三甲基氯硅烷;DMAP=4-甲基氨基吡啶;Dibromantin=1,3-二溴-4,4-二甲基乙内酰脲;
R=CRA;RA=-H或如本文所述的C1-C50有机部分,例如-H、-C1-20选择性取代的烷基、-C1-20选择性取代的链烯基、-C1-20选择性取代的炔基、-(CH2)0-6选择性取代的苯基或-(CH2)0-6选择性取代的杂环。
方案2:使用方案1的最后两步由方案1中所示的结构
A化合物制备通式
2的化合物:(1)Dibromantin,(2)LiBr,(3)Li-C-R,其中R为CRA,RA为-H或C1-12选择性取代的烷基。当R7、R8和R9均为-CH2-时,9-位和14-位的H为α-构型,8-位的H为β-构型,方案1的第一个化合物是DHEA乙酸酯。RA烷基部分的典型取代包括1、2或更多个独立选择的-O-、选择性保护的=O、选择性保护的羟基、-S-、选择性保护的硫醇、-NH-、选择性保护的-NH2、选择性保护的-C(O)OH、-C(O)-NH-、-C(O)-NH2、-NH-C(O)-H、-NH-C(O)-C0-4H1-9、-NH-C(O)-O-C0-4H1-9、-CN、-NO2、-N3或卤素。
方案2
方案3:如方案1在C-7处进行烯丙位溴化作用。R和RA为方案1和2中所定义的。
方案3
方案4:在C-16处存在溴的情况下,锂试剂(当R为-CH时,为炔化锂)加成到17-位的>C=O上导致形成环氧化物或发生频那醇重排。作为选择,不具有结构
3的化合物可以在温和的酸催化下脱水,再通过用Br2、H2O处理链烯而形成通式
4的化合物。R和RA的定义同方案1和2。
方案4
方案5:硼氢化钠在C-7处产生差向异构体混合物,混合物可以通过标准方法如HPLC、TLC或柱色谱进行分离。为得到纯7α-OH化合物,烯丙位溴化作用后如方案1和3所述进行水解。
方案5
方案6
方案6:如方案1、2、3或4中那样通过使用炔化锂处理乙酸酯制备通式
6的化合物。R和RA的定义同方案1和2。
方案7:使用如方案1和4中所述的试剂从3-乙酸酯制备通式
7的化合物。R和RA的定义同方案1和2。
方案8:由通式
A的化合物,通过硼氢化钠在C-17处还原,然后进行乙酰化制备通式
8的化合物。
方案9:使用如方案1和3中所述的反应制备起始物质。
方案9
方案10:在C-3处进行还原和乙酰化,在C-17处进行水解和氧化使得通式10a和10b的化合物如方案1-9中在C-3、C-16和C-17处所示发生官能作用。7-氧代乙酸酯可以由通式A化合物3-乙酸酯代替,使用如方案1-9所示的反应,7-氧代乙酸酯同样也能够在C-3、C-16和C-17处发生官能作用。
用LDA处理10a,然后对烯醇进行烷基化,使得引入侧链如R10,R10可以为例如C1-C20烷基(甲基、乙基)、C1-C20链烯基(CH2=CH-(CH2)0-6-)、苄基、-(CH2)1-4-O-(CH2)0-4-CH3。
方案10
方案1-9显示在所示位置引入羟基官能团。把羟基转化成其它的官能团的方法本质上与在例如本文引用的参考文献中所述的方法一致。例如,通式
1-
10c化合物的酯如-O-C(O)-RB,其中RB是一个C1-50有机部分,由类固醇的醇制备而来,可以通过使用合适的酸酐或酰氯(RB-C(O)-Cl)处理类固醇的醇以形成任何所需要的酯。醚如-O-RB,由醇制备而来,通过形成碱金属的醇盐(Na+或K+),然后用一级或二级碘化物(RB-I)处理而得。硫代碳酸酯RB-C(S)-O-,通过用Lawesson试剂处理RB-C(O)-O-制得。
硫酸酯NaO-S(O)(O)-O-、RB-O-S(O)(O)-O-,例如CH3(CH2)0-18-S(O)(O)-O-,通过用氯磺酸处理醇,然后用NaOH处理制得,或者由替代方案使用KMnO4氧化亚硫酸酯制得。如果期望得到烷基(如甲基)酯,可以使用烷基氯-磺酸酯(甲基氯-磺酸酯)。亚硫酸酯HO-S(O)-O-和铵盐NH4O-S(O)-O或RBO-S(O)-O-酯(如CH3O-S(O)-O-)通过标准方法制备。铵盐是通过用氨和二氧化硫处理醇制得的。当在一种合适的碱如三乙胺存在下,用烷基氯亚硫酸酯(如甲基氯亚硫酸酯)、链烯基氯亚硫酸酯或炔基氯亚硫酸酯处理醇时,会得到酯例如烷基酯、链烯基酯和炔基酯(如甲基酯)。在Na2CO3存在下,用二乙基氯磷酸酯处理醇制得磷酸酯RBO-P(ORPR)(O)-O-。作为选择,如果在三苯基膦(PPh3)和二乙基氮二羧酸酯存在下,用磷酸二酯处理醇,会转化形成相应的三酯(Mitsunobu反应)。
硫代磷酸酯RBO-P(SRPR)(O)-O-是通过用如磷酸酯所述使用二乙基氯磷酸酯的一硫类似物处理醇而制得的。碳酸酯RBO-C(O)-O-由相应的类固醇的醇使用氯甲酸酯(RBC(O)-Cl)例如C1-20烷基、链烯基或炔基氯甲酸酯(如CH3(CH2)0-5-C(O)-Cl)而制备的。氨基甲酸酯RB-NH-C(O)-O-通过在三氟乙酸的存在下,用异氰酸酯(RBN=C=O)或NaOCN处理类固醇的醇制得。氨基酸酯ZNX-CHY-C(O)-O通过将类固醇的醇与N-保护的氨基酸的酰氯偶合制得。
氧化连接到类固醇核上的羟基用于得到酮及相关的官能性。例如,可以使用多种氧化试剂如AcOH中的CrO3或氯铬酸吡啶盐、二铬酸吡啶盐或草酰氯与三乙胺(Swern氧化)将醇转化为酮。硫酮(=S)是通过用Lawesson试剂[2,4-二(4-甲氧苯基)-1,3,2,4-二硫二phosphetane-2,4-二亚硫酸酯;可以从Aldrich购得]处理酮制得的。硫缩醛-C(SRB)(SRB)-为在酸催化条件下(例如HCl),用RB-SH硫醇处理酮(-C(O)-)制备的。膦酸酯RO-P(ORPR)(O)-,是在KF存在下,通过将磷酸二酯加成到酮上产生羟基膦酸酯而制备的。人们可以任意使用脱水和加氢方法去掉羟基。
取代羟基以产生多种官能性。例如硫醇-SH,通过使用PBr3将醇转化成溴化物,用硫脲然后用NaOH处理溴化物得到硫醇。硫醚RB-S-通过用NaOH以及所需的卤化物如烷基卤化物处理硫醇制得。作为选择,醇的衍生物如对甲苯磺酸酯或甲磺酸酯可以由硫醇阴离子RB-S-替代以产生硫醚。硫酯R-C(O)-S-通过用硫羰酸的钠盐处理醇的甲苯磺酸酯(或甲磺酸酯)制备。
取代羟基可以用于在碳原子处产生连接到类固醇上的酯RBO-C(O)-和酰胺-NHRB-C(O)-。对于酰胺或胺,RB为-H、保护基或C1-50有机部分。这些物质通过使用NaCN取代由类固醇溴化物转化而来。氰化物基团可以水解为酰胺或酸。将酸酯化或在合适的羧基活化试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)存在下,酸与O-保护的氨基酸发生标准肽偶合反应以形成类固醇-C(O)NH-CHY-C(O)-OR,其中Y是氨基酸的侧链或C1-C10有机部分,R为保护基(或当脱保护后为氢)。
连接到类固醇碳原子上的胺和胺的衍生物如RB-NH-、RB-C(O)-NH-、RB-O-C(O)-NH-或RBOC(O)-CHRB-NH-,通常由标准方法制备。例如,胺(NH2-类固醇)通常由酰胺(NH2-C(O)-类固醇)通过Hoffmann重排(Br2,NaOH)或由类固醇的酰氯通过Curtius重排(NaN3)制备。随后可以通过烷基化作用引入RB取代基。在标准Mitsunobu条件(PPh3,DEAD)下,可以使用类固醇的醇作为起始物质,使用N-(叔丁氧羰基)-对甲苯磺酰胺,以产生N-Boc磺酰胺。人们可以选择性去除任一个保护基。用三氟乙酸处理产物产生磺酰胺(RB-S(O)(O)-NH-类固醇)。作为选择,用萘基钠(sodium naphthalenide)脱保护得到N-Boc化合物。使用酰氯(RB-C(O)-Cl),胺(NH2-类固醇)可以转化为酰胺(RBNH-C(O)-类固醇)。用氯甲酸乙酯处理得到N-氨基甲酸酯(RBOC(O)-NH-类固醇)。胺(NH2-类固醇)也可能使用α-溴酯(RB-C(O)-CHY-NH2)进行烷基化以产生氨基酸取代的类固醇(RB-O-C(O)-CHY-NH-类固醇)。
当反应如取代反应产生产物混合物时,所需要的中间体在进行下一步反应前,可以选择性地同其它产物分离或至少从其它产物中部分富集(例如富集至少约10倍,通常至少约50-100倍)。在类固醇碳原子处发生的取代反应通常在3-位以最大效率继续进行,3-位是相对立体不受阻碍的,而C-17位相对在某种程度上不如C-3位容易接近。C-3、C-7、C-17和C-16位的相对反应性使得人们可以利用它们的反应性以控制按顺序在同一个类固醇分子上引入不同的官能团。在反应性更强的位置C-3或C-17上的基团如羟基也可以按顺序保护或脱保护以允许在其它位置上如C-7或C-16引入官能团。
连接到化合物上的聚合物如PEG基本上如上所述。例如,PEG200或PEG300通过使用一种PEG醇盐(PEG-ONa)取代类固醇溴化物,通过醚键(PEG-O-类固醇)在3、7、16、17或其它位置上连接到类固醇上。作为选择,可以用类固醇烷氧化物处理PEG-Br。聚乙二醇酯如在美国专利USP 5681964中所述的那些也可以通过使用一种合适的通式1化合物以及本文所述的方法制备。使用已知方法,可以将单糖或多糖和寡糖连接到类固醇羟基上,例如请参见USP 5627270。
包含一个或多个环杂原子的通式1类固醇的类似物按照以下方法合成。
方案11:含有两个或三个环杂原子的通式1化合物按该方案方法制备。在该方案中,X为-CH2-、-NH-、-O-或-S-;R40为-H或-Br;R41为具有约12个或更少碳原子的有机部分,典型为C1-C8选择性取代的烷基(如甲基、羟甲基、乙基、丙基)或C2-C8选择性取代的具有一个双键的链烯基(如乙烯基),该链烯基带有1、2、3或更多个独立地选择的取代基(如-OH、-COOH、-O-)以及其它任何含有一个通常受保护的官能团的取代基。从
19制备化合物
20通过在酸中(H+)使用一种二元醇如HOC(CH3)2C(CH3)2OH完成(B.H.Lipshutz等,Synth.Commun.12:267,1982)。大体积保护基的使用有利于在5-6位而不是4-5位产生双键。
方案11
方案12A-12D:结构
12化合物按下述方案制备。大多数反应基本上按参考文献所描述的方法进行。例如请参见W.D.Langley,有机合成(Org.Syn.),1,122,1932(化合物
30);R.Ratcliffe等,J.Org.Chem.35:4000,1970(化合物
32);A.I.Meyers等,J.Org.Chem.39:2787,1974(化合物
33,
41;J.L Isidor等,J.Org.Chem.38:544,1973(化合物35);G.Wittig等,Chem.Ber.87:1318,1954(化合物
36;P.M.Pojer等,Tet.Lett.3067,1976(化合物
38);A.Maercker,Org.React.14:270,1965(化合物
37);E.J.Corey等,Tet.Lett.3269,1975(化合物37);R.S.Tipson,J.Org.Chem.9:235,1944(化合物
39);G.W.Kabalka,J.Org.Chem.51:2386,1986;B.B.Carson等,Org.Synth.1:179,1941(化合物
43);H.J.Bestman等,Justus Liebigs Ann.Chem.693:132,1966(化合物
39);M.Miyano等,J.Org.Chem.37:268,1972(化合物
51);W.H.Glaze等,J.Org.Chem.33:1987,1968(化合物
52)。
方案12A
X为NH、S和CH2的结构
12化合物分别按下述方案12B、12C和12D制备。
方案12B
方案12C
方案12D
方案13:该方案及下述反应用于制备具有结构
13的化合物,以及相关的用于在通式1化合物的R7和R8处引入氧、碳、氮或硫的化合物。制备化合物
63的反应物3-氯-2-甲基丙烯(reg.No.563-47-3)可以购得(例如从Aldrich,Fluka)。
方案13
以下所示为制备化合物
59及其类似物的方案,其中CH2、S或NH-CH2代替了氧。适合将化合物106转化为107的反应条件已经有描述(T.Hamada等,杂环(Heterocycles),12:647,1979;T.Hamada等,J.Am.Chem.Soc.108:140,1986)。
β-甲氧乙氧甲基氯化物(MEM-Cl)
如下所述,把具有以下结构的化合物中的甲基酮部分(-C(O)-CH3)(R-C(O)-CH3)转化成其它官能团。使用例如Br2或I2的碱液切割甲基酮以产生一个羧基部分,
然后基本如文献所述(S.J.Chakrabarty,《有机化学中的氧化》(Oxidations in Organic Chemistry),Part C,W.Trahnnousy,editor,Academic Press,NY,1987,chapter 5;L.J.Smith等,Org.Synth.III 302,1953)用酸处理,产生R-C(O)-OH。用LiAlH4将羧酸还原为醇。用例如Br2水将羧酸转化为溴化物的过程基本如文献所述(J.S.Meck等,Org.Synth.V,126,1973;A.Mckillop等,J.Org.Chem.34:1172,1969)。
用N-溴丁二酰亚胺对结构
11的化合物进行溴化得到在7-位有溴的类固醇及其类似物。
将
11A化合物脱保护以产生醛化合物
12。如方案11所示,溴原子最终处于7-位。通过将类固醇与碱(如KOH水溶液)反应可以把溴转化为羟基,反过来再使用已知方法保护羟基,已知方法如使用C6H5-CH2-Br和碱(KOH)。基本使用描述的方法对醇进行保护和脱保护,例如请参见W.H.Hartung等,Org.React.7:263,1953;E.J.Rerst等,J.Org.Chem.29:3725,1968;A.M.Felix等,J.Org.Chem.43:4194,1978;D.A.Evans等,J.Am.Chem.Soc.101:6789,1979;国际申请WO 98/02450。使用类似的反应在其它位置将溴转化为羟基。其它取代基如方案1-10所述连接到类固醇上。
还有其它适合在7-位引入官能团的替代方案。例如,在5-6位置具有一个双键,且7-位未取代的通式1化合物可以选择性地保护,例如用乙酸酯保护羟基,以及通过文献所述方法(USP 2170124)使用铬酸氧化在7-位上引入酮。使用温和的条件如Al(O-iPr)3将7-位的羰基还原为羟基,以避免还原5-6位的双键。使用强还原条件如LiBH4在THF中会把7-羰基转化为羟基,并且还原5-6双键以及分子中存在的其它双键。
使用H2和Pd可以在16-17位对双键进行选择加氢,而不会还原5-6位的双键。一般来讲,酮(=O)可以使用二元醇进行保护,例如在进行随后的氧化或还原反应之前,在对甲苯磺酸和苯中酮与乙二醇发生反应。
本文所述的多种可以构成通式1化合物的基团如键连到类固醇核上的羟基或酮或取代的烷基、取代的杂环、氨基酸和肽可以含有一个或多个活泼部分如羟基、羧基、氨基或硫醇。很明显,在本技术中,用于制备通式1化合物的中间体也可以得到保护。非环以及环保护基以及相应的切割反应在《有机化学中的保护基》(Protective Groups inOrganic Chemistry),Theodora W.Greene(John Wiley & Sons,Inc.,NewYork,1991,ISBN 0-471-62301-6)(下文称“Greene”)中有描述,这里不再详细说明。在本发明的范围内,这些保护基可以从本发明分子上除去而不会不可逆地改变共价键结构或分子残余部分的氧化/还原态。例如,键连到-O-或-NH-基团上的保护-RPR可以除去以分别形成-OH或-NH2,而不会影响分子中的其它共价键。有时如果需要,可以一次除去不止一个保护基,或者它们可以按顺序除去。在本发明的含有一个以上保护基的化合物中,保护基可以相同或不同。
尽管可以理解受保护的中间体也在本发明的范围之内,但保护基仍然可以通过已知的方法除去。保护基的去除可以是费力的或者简单的,这取决于所涉及的转化的经济因素和性质。一般来讲,在合成通式1化合物时,人们可以使用带有环外的胺或羧基的保护基。对于大多数治疗应用,胺基应该脱保护。通常使用保护基以在反应如烷基化或酰化中保护敏感基团以免发生共价改变。通常保护基通过例如水解、消除或氨解除去。因此,从官能性方面作简单的考虑就足以在本发明化合物的给定位置选择一个可逆的或不可逆的保护基。合适的保护基及其选择标准在T.W.Greene和P.G.Wuts编著的《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis),第二版,Wiley Press,10-142、143-174、175-223、224-276、277-308、309-405和406-454页有描述。
确定一个基团是否需要保护可通过常规方式进行,如Kocienski,Philip J.的《保护基》(Protecting Groups)(Gerog Thieme Verlag Stuttgart,New York 1994)(下文称“Kocienski”),1.1部分,第2页;以及Greene第1章,1-9页中所述。特别是当按摩尔比例,90%的保护基通过脱保护反应除去,而低于50%,典型25%,更典型为10%的脱保护的本发明产物分子其共价键结构或氧化/还原态有所变化而非由去除保护基所引起时,该基团就是一个保护基。当一个分子中存在同种类型的多个保护基时,当所有该类型的保护基都除去时可以确定摩尔比例。当一个分子中存在多个不同类型的保护基时,每种类型的保护基单独处理(并且摩尔比例可以确定)或与其它保护基一起处理,这取决于一种类型保护基的脱保护条件是否也适用于其它类型。在本发明的一个实施方案中,当按常规技术所确定的摩尔比例,90%的保护基通过常规脱保护反应除去,而低于50%,典型25%,更典型为10%的脱保护的本发明产物分子其共价键结构或氧化/还原态发生不可逆变化而非由去除保护基所引起时,该基团就是一个保护基。不可逆变化需要一定的化学条件(不包括那些由水解、酸/碱中和或常规的分离或提纯的条件)以恢复本发明的脱保护的分子的共价键结构或氧化/还原态。
保护基与一般概念及其特殊使用方法在Kocienski,Philip J.的“Protecting Groups”(Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York,1994)中有详细描述,本文将其全部引作参考。具体内容是第1章,保护基:概述,1-20页,第2章,羟基保护基,21-94页,第3章,二醇保护基,95-117页,第4章,羧基保护基,118-154页,第5章,羰基保护基,155-184页,第6章,氨基保护基,185-243页,第7章,结尾,244-252页,和附录,253-260页,这些内容都结合了各自的特异性。更具体地,部分2.3甲硅烷基醚,2.4烷基醚,2.5烷氧基烷基醚(缩醛),2.6综述(羟基和硫醇保护基),3.2缩醛,3.3亚甲硅烷基衍生物,3.41,1,3,3-四异丙基二亚甲硅氧烷基衍生物,3.5综述(二醇保护基),4.2酯,4.3 2,6,7-三氧二环[2.2.2]辛烷[OBO]及其它原酸酯,4.4噁唑啉,4.5综述(羧基保护基),5.2O,O-缩醛,5.3 S,S-缩醛,5.4O,S-缩醛,5.5综述(羰基保护基),6.2N-酰基衍生物,6.3N-磺酰基衍生物,6.4N-亚磺酰基衍生物,6.5N-烷基衍生物,6.6N-甲硅烷基衍生物,6.7亚胺衍生物,以及6.8综述(氨基保护基),这些每一部分在其讨论的对必要的官能团保护和脱保护的内容有其特异性。另外,在该书内封面和翻面页中的表格“主要保护基索引”、第14页的缩写以及第15页的“试剂和溶剂”本文都将其完全引作参考。
在第14-118页描述了典型的羟基保护基,其包括醚(甲基);取代的甲醚(甲氧基甲基、甲基硫甲基、叔丁基硫甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基、苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈创木酚甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、四氢吡喃基、3-溴四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基、4-甲氧基四氢硫代吡喃基、4-甲氧基四氢硫代吡喃基S,S-二氧撑、1-[(2-氯-4-甲基)苯基1-4-甲氧基哌啶-4-基、1,4-二氧杂环己烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-亚甲基苯并呋喃-2-基);取代的乙醚(1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基);取代的苄基醚(对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-和4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基-N-氧撑、二苯基甲基、对,对’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰甲氧基)苯基二苯基甲基、4,4’,4”-三(4,5-二氯苯二甲酰亚氨基)甲基、4,4’,4”-三(乙酰丙酰氧基苯基)甲基、4,4’,4”-三(苯酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基-甲基)二(4,4’-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫戊环-2-基、苯并异噻唑基、S,S-二氧撑);甲硅烷基醚(三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基);酯(甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基-甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、对聚苯基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫)戊酸酯、六甲基丙酮酸酯、金刚烷二甲酸酯、丁烯酸酯、4-甲氧基丁烯酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(酮酸酯);碳酸酯(甲基、9-芴基甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、2-(三苯基磷鎓基)乙基、异丁基、乙烯基、烯丙基、对硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基、甲基二硫代碳酸酯);带有辅助切割的组群(2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基碳酸酯、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯);杂酯(2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基-丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、丁二酸单酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯(惕各酸酯)、邻(甲氧基羰基)苯甲酸酯、对聚苯甲酸酯、α-萘酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’-四甲基二氨基磷酸酯、N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫代膦酸酯、2,4-二硝基-苯基氨基甲酸酯);以及磺酸酯(硫酸酯、甲磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯、甲苯磺酸酯(Tos)))。
更典型的羟基保护基包括取代的甲基醚、取代的苄基醚、甲硅烷基醚,和酯包括磺酸酯,更典型的,三烷基甲硅烷基醚、甲苯磺酸酯和乙酸酯。
典型的1,2-和1,3-二醇保护基在Greene的第118-142页有描述,其包括环缩醛和缩酮(亚甲基、乙叉基、1-叔丁基乙叉基、1-苯基乙叉基、(4-甲氧基苯基)乙叉基、2,2,2-三氯乙叉基、丙酮化合物(异丙叉基)、环戊叉基、环己叉基、环庚叉基、苄叉基、对甲氧基苄叉基、2,4-二甲氧基苄叉基、3,4-二甲氧基苄叉基、2-硝基苄叉基);环原酸酯(甲氧基亚甲基、乙氧基亚甲基、二甲氧基亚甲基、1-甲氧基乙叉基、1-乙氧基乙叉基、1,2-二甲氧基乙叉基、α-甲氧基苄叉基、1-(N,N-二甲基氨基)乙叉基衍生物、α-(N,N-二甲基氨基)苄叉基衍生物、2-氧代环戊叉基);以及甲硅烷基衍生物(二叔丁基亚甲硅烷基、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二亚甲硅烷氧基)衍生物、四叔丁氧基二甲硅烷氧基-1,3-二叉基衍生物、环碳酸酯、环硼酸酯、乙基硼酸酯、苯基硼酸酯)。
更典型的1,2-和1,3-二醇保护基包括环氧化物和丙酮化合物。
典型的氨基保护基在Greene的第315-385页有描述,其包括氨基甲酸酯(甲基和乙基、9-芴基甲基、9-(2-硫代)芴基甲基、9-(2,7-二溴)芴基甲基、2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢硫代呫吨基)]甲基、4-甲氧基苯酰基);取代的乙基(2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-苯酰乙基、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基、1,1-二甲基-2-卤代乙基、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基、1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基、2-(N,N-二环己基酰氨基)乙基、叔丁基、1-金刚烷基、乙烯基、烯丙基、1-异丙基烯丙基、肉桂基、4-硝基肉桂基、8-喹啉基、N-羟基哌啶基、烷基二硫、苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、对溴苄基、对氯苄基、2,4-二氯苄基、4-甲基亚硫酰苄基、9-蒽基甲基、二苯基甲基);带有辅助切割的基团(2-甲基硫乙基、2-甲基磺酰基乙基、2-(对甲苯磺酰基)乙基、[2-(1,3-二亚硫酰)]甲基、4-甲基苯硫基、2,4-二甲基苯硫基、2-磷鎓基乙基、2-三苯基磷鎓基异丙基、1,1-二甲基-2-氰基乙基、间-氯-对-酰氧基苄基、对-(二羟基氧硼基)苄基、5-苯并异噁唑基甲基、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基);能够光切割的基团(间-硝基苯基、3,5-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基、苯基(邻硝基苯基)甲基);脲型衍生物(吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基、N’-苯基氨基硫羰基);各种氨基甲酸酯(叔戊基、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基、环丁基、环己基、环戊基、环丙基甲基、对癸氧基苄基、二异丙基甲基、2,2-二甲氧基羰基乙烯基、邻(N,N-二甲基-酰胺)苄基、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基酰胺)丙基、1,1-二甲基丙炔基、二(2-吡啶基)甲基、2-呋喃基甲基、2-碘乙基、异冰片基、异丁基、异烟碱基、对-(对’-甲氧基苯偶氮基)苄基、1-甲基环丁基、1-甲基环己基、1-甲基-1-环丙基甲基、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基、1-甲基-1-(对-苯偶氮基苯基)乙基、1-甲基-1-苯基乙基、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基、苯基、对-(苯偶氮基)苄基、2,4,6-三叔丁基苯基、4-(三乙基铵)苄基、2,4,6-三甲基苄基);酰胺(N-甲酰、N-乙酰、N-氯乙酰、N-三氯乙酰、N-三氟乙酰、N-苯乙酰、N-3-苯基丙酰、N-甲基吡啶基、N-3-吡啶基羧酰胺、N-苯甲酰苯丙氨酰衍生物、N-苯甲酰、N-对苯基苯甲酰);带有辅助切割基团的酰胺(N-邻硝基苯乙酰、N-邻硝基苯氧基乙酰、N-乙酰乙酰基、(N’-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰、N-3-(对羟基苯基)丙酰、N-3-(邻硝基苯基)丙酰、N-2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰、N-2-甲基-2-(对苯偶氮基苯氧基)丙酰、N-4-氯丁酰、N-3-甲基-3-硝基丁酰、N-硝基肉桂酰、N-乙酰基蛋氨酸衍生物、N-邻硝基苯甲酰、N-邻(苯酰氧基甲基)苯甲酰、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮);环状亚胺衍生物(N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫代丁二酰、N-2,3-二苯基马来酰基、N-2,5-二甲基吡咯基、N-1,1,4,4-四甲基-二甲硅烷基氮杂环戊烷加成产物、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮基);N-烷基和N-芳基胺(N-甲基、N-烯丙基、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基、N-3-乙酰氧基丙基、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)、季铵盐、N-苄基、N-二(4-甲氧基苯基)甲基、N-5-二苯并环庚基、N-三苯基甲基、N-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基、N-9-苯基芴基、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲基、N-二茂铁基甲基、N-2-吡啶甲基胺N’-氧化物);亚胺衍生物(N-1,1-二甲基硫代亚甲基、N-苄叉基、N-对甲氧基苄叉基、N-二苯基亚甲基、N-[(2-吡啶基)基]亚甲基、N-(N’,N’-二甲基氨基)亚甲基、N,N’-异丙叉基、N-对硝基苄叉基、N-邻羟苄叉基、N-5-氯邻羟苄叉基、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基、N-环己叉基);烯胺衍生物(N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己基));N-金属衍生物(N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬或钨)]羰基、N-铜或N-锌螯合物);N-N衍生物(N-硝基、N-亚硝基、N-氧化物);N-P衍生物(N-二苯基氧膦基、N-二甲基硫代氧膦基、N-二苯基硫代氧膦基、N-二烷基磷酰基、N-二苄基磷酰基、N-二苯基磷酰基);N-Si衍生物;N-S衍生物;N-亚磺酰衍生物(N-苯硫基、N-邻硝基苯硫基、N-2,4-二硝基苯硫基、N-五氯苯硫基、N-2-硝基-4-甲氧基苯硫基、N-三苯基甲基亚磺酰、N-3-硝基吡啶硫基);和N-磺酰衍生物(N-对甲苯磺酰、N-苯磺酰、N-2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰、N-2,4,6-三甲氧基苯磺酰、N-2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰、N-五甲基苯磺酰、N-2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰、N-4-甲氧基苯磺酰、N-2,4,6-三甲基苯磺酰、N-2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰、N-2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢呋喃-6-磺酰、N-甲磺酰、N-β-三甲基甲硅烷基乙磺酰、N-9-蒽磺酰、N-4-(4’,8’-二甲氧基萘甲基)苯磺酰、N-苄基磺酰、N-三氟甲基磺酰、N-苯甲酰甲基磺酰)。
更典型的氨基保护基包括氨基甲酸酯和酰胺,更典型的包括N-乙酰基基团。
能够进行生物切割的基团典型包括前药。在《前药的设计》(Designof Prodrugs),Hans Bundgaard(Elsivier,N.Y.,1985,ISBN 0-444-80675-X)(Bundgaard)中描述了大量的这种基团,此处不作详细介绍。特别是在Bundgaard的第1-92页描述了前药及其对于大量官能团的生物切割反应。在Bundgaardr的第3-10页详细描述了具有羧基和羟基的前药,第10-27页描述了酰胺、亚胺和其它NH-酸性化合物,第27-43页为胺,第62-70页为环状前药。这些部分任意键连到类固醇的R1-R6、R10、R15、R17和R18中的一个、二个或更多个上。
代谢物:本文描述的这些化合物在体内的代谢物也在本发明的范围之内,在此程度上,本发明的这些产物比现有技术新颖且不显著。例如这些产物可能是由于酶促或化学过程,进入体内的通式1化合物发生氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等等而产生的。因此,本发明通过包括将本发明的一种化合物与患者例如人、啮齿类动物或灵长类动物接触,在足够产生其代谢产物的期间所产生的新颖的且不显著的化合物。这样的产物通常是通过以下过程来鉴定的:制备一种带有放射性标记(例如14C、3H、131I、32P、35S或99Tc)的本发明化合物,然后非肠道对动物如大鼠、小鼠、豚鼠、灵长类或人给药一可检测的剂量(例如大于约0.5mg/kg),经过足够长的代谢时间(通常约30秒至30小时),然后从尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物。这些产物的分离很容易,因为它们都作了标记(其它的产物通过使用能够与在代谢产物中存活的抗原决定簇结合的抗体进行分离)。代谢产物的结构通过常规方法确定,例如通过MS、HPLC或NMR分析。对于熟悉本领域的技术人员来说,代谢产物的分析通常与常规药物的新陈代谢研究采用同样的方法。只要这些转化产物在体内不能再发现,那么它们在用于本发明化合物的治疗剂量的诊断分析中就是有用的,即使它们本身并不具有治疗活性。
用于制备制剂的配方和组合物:尽管也可能单独给药活性组分,但通常都是以它们的药物制剂形式给药。本发明可用于兽和人的制剂包含至少一种活性组分如通式1化合物和一种或多种可接受的赋形剂,以及其它治疗组分。
本发明的另一个方面涉及一种包含一种或多种药用赋形剂或载体的组合物。一种或多种通式1化合物(也就是所说的“活性组分”)通过任何适用于要接受治疗的疾病的途径给药。适用于非水溶液液体制剂和其它通式1化合物的制剂的给药途径包括口服、直肠、鼻用、局部(包括口腔和舌下)、阴道和非肠道(包括皮下、肌肉、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)。非水溶液液体制剂通常是通过一种非肠道途径给药的。在其它实施方案中,如本发明的间歇式给药方法,通式1化合物可以一种非溶液液体制剂,一种干燥的固体制剂其可以是口服、局部、非肠道制剂,或一种可以非肠道、口服或局部使用的水溶液液体制剂的形式存在。可以理解优选的途径例如可以随患者的病理状况或体重或患者对用通式1化合物进行的治疗或其它合适的治疗所作出的的反应而变化。
制剂包括适用于上述给药途径的那些。制剂可以方便地以单位剂量形式存在,并可以通过在制药领域已知的任何技术制备。通常可以在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1985,17版,和Nema等,PDA J.Pharm.Sci.Tech.1997,51:166-171中找到有关技术、赋形剂和制剂的内容。制备本发明制剂的方法包括把活性组分与赋形剂结合的步骤。通常制剂的制备方法为:将活性组分与液体赋形剂或固体赋形剂细粉或两种赋形剂均匀地、紧密地结合,然后如果合适,使产品成形。
本发明适合口服给药的制剂制备成分散的单元,如每单元含有预定量活性组分的胶囊、扁囊剂和片剂;如粉剂或粒剂;如在水中或非水液体中的溶液或悬浮液;或如水包油乳液或油包水乳液。活性组分也可以块剂、干药糖剂或糊剂的形式提供。
通过挤压或模压制造选择性带有一种或多种辅助组分的片剂。在一台合适的机器里,通过挤压以自由流动形式如粉末或颗粒,并选择性与一种粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的活性组分,来制造压缩的片剂。在一台合适的机器里,通过模压湿润的粉末状活性组分与一种惰性稀释剂的混合物制造模压片剂。片剂可以选择性包衣或打标记,并选择性配制以提供缓释或控释的活性组分。
对于眼睛或其它外部组织如嘴和皮肤感染,制剂通常是以含有活性组分的局部软膏剂或乳膏的形式施用,活性组分的量例如0.075-20重量%(包括范围为0.1-20重量%,增量为0.1重量%的活性组分,如0.6重量%、0.7重量%等)通常为0.2-15重量%,最通常为0.5-10重量%。当为软膏剂形式时,活性组分可以与石蜡或与水混溶的软膏基料一起施用。作为选择,活性组分也可以与水包油乳膏基料配制成乳膏剂。
如果需要,乳膏基料的水相可以包含例如至少30重量%的多羟基醇,即具有两或两个以上羟基的醇如丙二醇、1,3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG400)及其混合物。局部制剂可以按需要包含一种增强活性组分的吸收或透过皮肤或其它染病部位的化合物。皮肤透过增强剂的例子包括二甲亚砜和有关的类似物。
本发明乳液的油相可以以已知的方式由已知的赋形剂组成。尽管油相可以仅仅包含一种乳化剂(另有利泄剂),但按照需要,它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油的一种或两种组成的混合物。可以一起包含有亲水的乳化剂与亲油的乳化剂,后者起稳定剂的作用。某些实施方案同时含有油和脂肪。乳化剂与稳定剂一起或不加稳定剂组成所谓的乳化蜡,蜡与油和脂肪一起组成所谓的乳化软膏基料,该基料形成乳膏制剂的油状分散相。
适用于本发明制剂的利泄剂和乳化稳定剂包括Tween60TM、Span80TM、十六醇十八醇混合物、苄醇、十四烷醇、一硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。
选择用于制剂的合适的油或脂肪的依据是达到所需要的美容特性。乳膏剂通常是非油性的、非着色的和可洗去的产品,其具有合适的稠度以防止从管或其它容器中漏出。可以使用直链的或支链的一或二元烷基酯如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷醇酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、十四酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或称为Crodamol CAP的支链酯的混合物。这些物质的单独使用或混合使用取决于所需要的特性。作为选择,可以使用高熔点脂类如白软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。
适于对眼睛进行局部给药的制剂还包括滴眼剂,其中活性组分溶解或悬浮在一种合适的赋形剂中,特别是一种用于在pH值接近中性如约6-8时带有一个或多个电荷的活性组分的含水溶剂。在这种制剂中活性组分的含量典型为约0.5-20重量%,典型为约1-10重量%,通常为约2-5重量%。
适用于嘴中局部给药的制剂包括在调味基料通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中含有活性组分的锭剂;在惰性基料如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中含有活性组分的软锭剂;以及在一种合适的液体赋形剂中含有活性组分的漱口药。
直肠给药的制剂可以带有合适的基料的栓剂的形式提供,基料中含有例如可可油或水杨酸酯。
适于肺内给药或鼻内给药的制剂其颗粒尺寸范围例如为0.01-500微米(包括平均颗粒尺寸范围为0.01-500微米,增量为0.1微米或其它数值如0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、20、25、30、35、50、75、100等微米的颗粒),颗粒通过经由鼻腔快速吸入或经由口腔吸入以到达肺泡囊。合适的微粉化的制剂包括活性组分的水或油溶液或悬浮液。适用于气雾剂、干粉或片剂给药的制剂可以根据常规方法制造,并且可以与其它治疗试剂如此前用于治疗或预防病毒或其它如本文所述的感染的化合物一起提供。这种制剂可以通过例如口服、非肠道(i.v.、i.m.、s.c.)、局部或口腔途径给药。
适用于阴道给药的制剂可以阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式提供,除活性组分外,其还含有在本领域中已知适用的赋形剂。
适于非肠道给药的制剂包括水溶液或非水溶液无菌注射溶液,其可以含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预期的受体血液等渗的溶质;以及可以含有悬浮剂和增稠剂的水溶液或非水溶液无菌悬浮液。
制剂以单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶提供,并且可以储存在冰干(冻干)条件下,在使用前仅仅需要加入无菌液体赋形剂如注射用水。可以由无菌、颗粒以及前述的片剂制备临时使用的注射用溶液或悬浮液。如本文所述,单位剂量制剂是指含有每日剂量或一日多次剂量或其适当部分的活性组分的制剂。
应当理解除了以上具体叙述的组分,考虑到所讨论的制剂类型,本发明制剂可以包括其它在本领域常用的试剂或赋形剂,例如那些适用于口服给药的制剂可以含有调味剂。
本发明还提供含有至少一种上述活性组分以及一种兽用赋形剂的兽用组合物。兽用赋形剂是适用于给药该组合物目的的物质,其可以是固体、液体或气体物质,另外在兽用领域中其是惰性的或可接受的,并且与活性组分相容。这些兽用组合物可通过口服、非肠道或任何其它所需途径给药。
本发明制剂包括含有活性组分控释药物制剂(“控释制剂”),其中活性组分的释放是受到控制和调节的,这样就允许减少给药的频率或提高给定活性组分的药物动力学或毒性分布。
有效剂量的活性组分至少取决于所治疗病症的本质、毒性、化合物是用于预防(较低剂量)还是抵御现存的感染或疾病、给药的方式以及药物制剂,并且由临床医生通过常规剂量放大研究确定。人们认为有效剂量可以从约0.05-约30mg/kg体重/天。例如,对于局部给药,一个体重大约70kg的成年人每天选择的剂量范围从约1mg-约500mg,通常约5mg-约40mg,并且根据给药部位可以采用单剂量或多剂量形式。
实施方案包括含有脂质体或脂类复合体的制剂,脂类复合体中含有通式1化合物如BrEA或其酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基酸或肽。这种制剂按照已知方法制备,如美国专利USP 4427649、5043165、5714163、5744158、5783211、5795589、5795987、5798348、5811118、5820848、583401 6和5882678。脂质体选择性含有另外一种治疗试剂,如两性霉素B、顺铂、阿霉素、蛋白酶抑制剂、核苷或核苷酸类似物如本文所提到的那些。含有脂质体的制剂可以通过任何一种标准方法对患者给药,如口服、气雾剂或非肠道(如s.c.、i.v.或i.m.)。
治疗应用:通式1化合物或由这些化合物通过水解或体内的新陈代谢所产生的生物活性物质具有大量临床和非临床用途。该化合物通常用于增强Th1免疫反应或减少Th2免疫反应。本文所使用的Th1或Th2免疫反应是指通常在哺乳动物中但不是在鼠类动物系统中所观察到的反应,术语Th1和Th2是从鼠类动物中来的。因此,在人类中,Th1细胞优先显示趋化因子受体CXCR3和CCR5,而Th2细胞优先表达CCR4分子以及更少量的CCR3分子。
本发明的方面包括含有至少一种通式1的化合物以及药学可接受载体的组合物,通式1化合物的含量能有效增加所期望的免疫细胞子集如CD4+T细胞、NK(自然杀伤淋巴细胞)细胞或树突细胞的相对比例或调节免疫细胞子集一种或多种功能。典型的免疫调节以调节增强Th1免疫反应或减弱Th2免疫反应的基因的表达为主要内容。通式1化合物的作用包括CD分子的表达或改变细胞子集如CD4+或CD8+的比例或其在患者血液或组织中的相对数量。CD分子参与多种免疫细胞子集的作用,并且可以用作体内免疫功能的指示器。在某些方面,通式1化合物激活通常改变(增加或减少)细胞的表达或改变细胞的数量的免疫细胞,数量发生改变的细胞表达CD4、CD6、CD8、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD43、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69、CD71、CD90或HLA-DR分子的组合。通常表达这些分子如CD25、CD16或CD69的细胞的数目是增加的。通常观察到的这种增加是表达这些分子的一种或多种的循环白细胞比例的增加。在某些情况下,可以发觉每细胞这种分子的数目是改变的。
在对患者给用通式1化合物后,粘连分子CD2、CD5、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD31、CD44、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD54、CD58、CD103或CD104的一种或多种的表达也可发觉发生了改变。通常表达这些分子如CD5或CD56的细胞的数目是增加的。免疫反应的多个方面中粘连分子的功能有如连接到第一类MHC分子上、在细胞间转换信号或连接到在与内皮或其它类型细胞相关联的细胞外基质中的分子上。对患者给用通式1化合物还会影响某些免疫细胞子集如NK细胞(如CD8-、CD56+或CD8+、CD56+)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的数目。通常可以观察到循环NK或LAK细胞数目的增加,这体现在表达CD16、CD38、CD56、CD57或CD94的一个或多个细胞数目的增加。还可观察到循环树突细胞前体数目的增加,其显示为表达CD11c、CD80、CD83、CD106或CD123的一个或多个的细胞数目的增加。尽管人们能够观察到表达这些分子的一个或多个的循环白血细胞比例的增加,在某些情况下,可以发现每细胞这些分子的数目发生改变。细胞数目和每细胞CD分子的密度都能够进行可测调节。免疫细胞子集的调节通常是在间歇式给药通式1化合物时发生的。
在给患者施用通式1化合物后,可以发觉一个或多个归巢受体如CD62L的表达也受到了影响。通常表达这些分子如CD62L的细胞数目是增加的。
其它由于在患者体内存在通式1化合物而受到调节的CD分子包括细胞因子分子如CD115、CDW116、CD117、CD118、CDW119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CDW127、CDW128或CDW130。通常每细胞受体分子的数目可以调节。例如用于调节Th1免疫反应(如IL-2、γIFN)的细胞因子的受体通常在调节Th1免疫反应的细胞内或细胞上增加。调节这些分子可以通过调节在受影响细胞或其它细胞,通常为免疫细胞,内的细胞因子合成,而直接或间接与细胞内表达细胞因子受体的受体配合。免疫细胞可以与受体合成受到调节的细胞配合。
用通式1化合物治疗患者会引起某些免疫细胞子集的对照或基础水平以上或以下至少25-50%的变化(如至少30%或至少40%以上或以下)。例如,通常在对患者给药单剂量的通式1化合物7天后,被激活的CD8+细胞如CD8+、CD69+、CD25+T细胞、CD8+、CD69+、CD25-T细胞或CD8+、CD69-、CD25+T细胞的总数目会增加超过约30%。个别患者被激活的CD8+细胞或被激活的CD8+细胞的子集的总数目的增加可能会超过50%、60%或100%。通常被激活的CD8+细胞或被激活的CD8+细胞的子集的总数目的增加范围为约30-40%,但个别患者相对于基础水平,其每单位血液体积内被激活的CD8+细胞的数目的增加会超过100%。
给药通式1化合物能够影响其它免疫细胞子集。例如,在患者服用通式1化合物期间或给药后,循环CD4+、CD69+、CD25-(Th1辅助细胞)和CD8+、CD16+、CD38+LAK细胞或CD8-、CD16+、CD38+LAK细胞的浓度通常会增加。而CD8-、CD16+、CD38+和CD8+、CD16+、CD38+(ADCC效应细胞)和低侧向散布Lin-、DR+、CD123+(树突细胞前体)或低侧向散布Lin-、DR+、CD11c+(树突细胞或前体)可能显示出适度或明显的增加。
在受到免疫抑制,例如由感染(如病毒(HIV、HCV)、细菌感染或寄生虫感染)或化疗(例如抗病毒化疗、癌症化疗或放射化疗)引起免疫抑制的患者中给用通式1化合物,Th1或Th2反应的平衡会发生可喜的转变,患者可以抵御免疫抑制作用。当Th1反应未达最理想或不足时,用通式1化合物治疗患者可使Th1反应增强或Th2反应减弱。相反,当Th2未达最理想或不足时,用通式1化合物治疗患者可使Th2反应增强或Th1反应减弱。因此,通式1化合物可用于改变患者的免疫反应的性质以在受到免疫抑制时达到更加平衡的免疫反应。作为选择,通式1化合物可以有选择性地抑制不适当的或不想要的免疫反应。看起来,增强的Th1反应至少部分是由以下因素的一个或几个引起的:(i)生物制约减少,例如高水平的IL-4或IL-10通过预先存在的最初Th1效应细胞影响Th1功能;(ii)Th0细胞与Th1细胞的分化增强或被Th1细胞调节的反应增强;(iii)辅助细胞功能增强,例如抗原通过树突前体细胞或巨噬细胞显示;(iv)Th1前体或祖细胞的增殖或分化增强;(v)树突细胞或其前体中的IL-12表达增强,这导致由Th0前体的Th1细胞分化增强;(vi)与Th1功能如IL-2、γ干扰素(γIFN)或淋巴毒素相关联的因子的表达或活性增强。
本发明方法的一个方面是在给患者施用通式1化合物如BrEA后,改变IL-4或IL-10的表达。并同时观察到细胞外的IL-4或IL-10水平迅速减少到ELISA不可检测的水平。细胞内IL-10水平减少到接近或低于流式细胞测量术的检出限。因此对患者施用通式1化合物就提供了一种抑制白介素任一者或两者的方法。这种抑制可能与例如Th1反应受到抑制(如由病毒、细菌或寄生虫感染(HIV、HCV等)或化疗引起)或未达最理想时的患者,其相对于Th2或Th0反应增强的Th1免疫反应相关联。在许多患者中,服用通式1化合物以前,其IL-4或IL-10,通常是IL-10的水平很低或不可检测。在这些患者中,服用通式1化合物会导致可以检测的白介素(通常是IL-4)水平的快速下降。
在某些实施方案中,对患有病原体感染如病毒、细菌或寄生虫感染的患者给药通式1化合物。可以认为通式1化合物适用的感染范围很广(例如请参见J.B.Peter编著的《传染病实验室试验的使用和说明》(Use and Interpretation of Laboratory Tests in Infectious Disease),第5版,Specia1ty Laboratories,Santa Monica,CA 90404,1998,第1-271页),这是因为该化合物通常能够增强Th1免疫反应和/或减弱Th2免疫反应。治疗这些感染所遇到的困难如进行性弓形虫脑炎、疟疾、肺结核、利什曼病和血吸虫病看来通常都与不需要的Th2免疫反应有关。通常不需要的Th2免疫反应与细胞因子或白介素如IL-4和IL-10的一种或多种的表达增强有关,或由其引起。给药通式1化合物或本文公开的其它化合物,一般都会减弱与Th2有关的一种或多种细胞因子或白介素的表达。同时,该化合物也增强与Th1免疫反应有关的一种或多种细胞因子或白介素的表达。由于具有调节Th1和Th2免疫反应的能力,这些化合物对许多临床疾病如感染、免疫抑制或癌症很有用,这些疾病都需要增强Th1免疫反应。例如,对播散性或扩散性结核,就需要减弱Th2免疫反应以使患者疾病的发展减慢或更有效地清除受感染的细胞。
本发明的一个方面是提供一些实施方案,其中对患者给药通式1化合物和谷胱甘肽还原酶抑制剂如谷胱甘肽磺基肟[CH3-(CH2)3-S(=O)(=NH)-(CH2)2-CHNH2-C(O)OH]以治疗感染如寄生虫感染如疟疾、弓形虫、隐孢子虫属或治疗癌症或恶性肿瘤。减少还原谷胱甘肽的供给可以增强巨噬细胞的噬菌作用,这可能是由增强了受感染细胞或正在复制的恶性细胞中的氧化性破坏引起的。另一方面,使用谷胱甘肽还原酶抑制剂可以使得免疫系统对受感染的或恶性细胞的识别增强。例如相对于单独使用通式1化合物,通式1化合物如BrEA和谷胱甘肽磺基肟一起使用以加强从受感染细胞中清除环形期疟疾或增强免疫系统对恶性细胞的识别。其中施用这些实施方案的感染和恶性肿瘤如本文所述。
本发明的另一个方面是使用一种通式1化合物和一种类黄酮如naragin类黄酮以增强通式1化合物的生物利用率。在这些实施方案中,把有效量的类黄酮施用给已经接受通式1化合物的患者。通常给患者的施用量为1-10mg类黄酮/kg体重,类黄酮如甲基补骨酯甲素A、香蜂草苷(异樱花素-7-芸香苷或新枸桔苷)、黄马诺苷(异阔叶合欢查尔酮-7-葡萄糖苷)、黄烷酮吖嗪、黄烷酮二乙酰基腙、黄烷酮腙、水飞蓟素、水飞蓟亭、异水飞蓟素或silandrin。类黄酮化合物通常与通式1化合物一起施用给患者或在通式1化合物施用给患者之前几个小时如约1、2或3个小时后施用给患者。
脂质体制剂可以用以加强通式1化合物输送到某些细胞类型如肿瘤细胞(例如请参见USP 5714163)或网状内皮系统(RES)细胞。RES包括巨噬细胞、单核吞噬细胞、脾脏窦状隙、淋巴结和骨髓的衬细胞以及造血组织的成纤维状的网状细胞。RES细胞一般是吞噬细胞,并且是使用脂质体或其它组合物或制剂在体内或体外定位输送通式1化合物的目标。因此,人们可以把通式1化合物输送到由网状组织发展成的瘤(网状内皮瘤)。脂质体也可以选择性地含有一种来自传染物如疟疾寄生虫的肽。该肽可以促进产生第二级MHC和B细胞反应。
疫苗佐剂:本文所公开的化合物也可以用作免疫原的疫苗佐剂或免疫原组合物的组分以制备能够特异与通式1化合物、其保留免疫学识别的抗原决定簇(抗体结合的位置)的代谢产物或用于接种抵抗如传染物或恶性细胞的标准抗原相结合的抗原。因此免疫原组合物用作制备与通式1化合物结合的抗体的中间体,用于如诊断、质量控制等方法,或用于分析该化合物或其新型代谢产物。另外,该化合物对提高抗体抵抗其它非免疫原的多肽方面也是有用的,因为该化合物可以用作刺激免疫反应不完全抗原部位。
所关心的水解产物包括上述水解受保护的酸性和碱性基团的产物。在某些实施方案中,含有免疫原多肽如白蛋白、匙孔血蓝蛋白以及下述其它多肽的酸性或碱性酰胺通常用作免疫原。上述代谢产物可能保留有相当程度与本发明化合物的免疫交叉反应性。因此,本发明的抗体能够结合到未加保护的本发明化合物上而不结合到受保护的化合物上;另一方面,代谢产物能够结合到受保护的化合物上和/或代谢产物不结合到本发明受保护的化合物上,或能够特异结合于任何一种或三种物质上。合乎需要的是抗体基本上不会与天然存在的物质发生交叉反应。显著的交叉反应性是指在特定分析的特定分析条件下,足以干扰分析的反应性。
本发明免疫原包括本发明表现为与免疫原物质相关联的所需要的抗原决定簇的化合物。在本发明的范围内,这种关联是指共价键合以形成一种免疫原结合物(合适时)或非共价键合物质的混合物或上述的组合。免疫原物质包括佐剂如弗罗因德佐剂、免疫原蛋白质以及免疫原多糖,免疫原蛋白质如病毒、细菌、酵母、植物和动物多肽特别是匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。具有所需要的抗原决定簇结构的化合物通常是通过使用一种多官能团(通常为双官能团)交联剂共价结合到一种免疫多肽或多糖上。制备半抗原免疫原的方法本身是常规方法。考虑到可用作交联的前体或水解产物上的官能团以及产生与免疫原物质相对的特异于所述的抗原决定部位的抗体的可能性,在此以前任何用于把半抗原结合到免疫多肽等上的方法都很合适用在这里。
通常多肽结合在本发明化合物上的部位与要识别的抗原决定簇相距较远。
结合物以常规方式制备。例如,交联剂N-羟基丁二酰亚胺、丁二酸酐或C2-8烷基-N=C=N-C2-8烷基用于制备本发明的结合物。该结合物包含一种本发明化合物,它通过一个键或一个具有1-100个典型为1-25个更典型为1-10碳原子的连接基团结合到免疫原物质上。该结合物通常色谱法等与起始物质及副产物分离,然后经无菌过滤后储存于小瓶中。已经描述了制备半抗原-载体免疫原的合成方法,例如请参见G.T.Hermanson的《生物结合技术》(Bioconjugate Techniques),AcademicPress,1996,第419-493页。
本发明的化合物是通过例如下述任何一种基团交联的:羟基、羧基、碳原子或胺基。多肽的酰胺包括在这类化合物中,其中多肽用作上述保护基。
动物通常对于免疫原结合物或衍生物以及以常规技术制备的抗血清或单克隆抗体具有免疫。
在通式1化合物用作增强患者对于抗原例如蛋白质、肽或病毒或细胞制品的免疫反应的实施方案中,通式1化合物大约与抗原同时施用给患者,如在抗原施用给患者的约7天之内。在某些实施方案中,通式1化合物在抗原施用给患者之前的1、2、3或4天施用。在其它的实施方案中,通式1化合物与抗原在同一天施用给患者。在另外的实施方案中,通式1化合物在抗原施用给患者之后1、2或3天施用给患者。通式1化合物可以使用本文所述的或引用的参考文献中的任何一种制剂或给药方法施用给患者。本发明的方面包括含有一种通式1化合物、一种或多种赋形剂以及一种抗原或抗原制品如破裂的细胞或病毒或如减毒的病毒或DNA疫苗的组合物或制剂。
相关的实施方案包括一种方法,它包括把有效量的通式1化合物和一种特异抗原施用给患者(如哺乳动物如人或灵长类动物)或输送到患者的组织。这些方法能够增强于抗原的免疫反应。增强的免疫反应包括对于例如蛋白质、肽、多糖、微生物、肿瘤细胞提取物或致命放射状肿瘤或病原体细胞(如来自黑素瘤、肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、良性前列腺增生、病毒或细菌,或本文描述的其它肿瘤或病原体的抗原或细胞)的抗原的粘膜免疫反应。这些实施方案的方面包括当抗原或免疫原经鼻内或口服施用给患者时,能够增强患者的免疫反应。在这些方面,通式1化合物大约与抗原同时施用或在抗原施用的约3-72小时内施用已经描述了使用免疫调节试剂以增强对疫苗的免疫反应,
例如请参见USP 5518725。
通式1化合物的其它用途包括把化合物施用给患病的患者。这种处理可以治疗或改善疾病的源头和/或与病理状况相关联的症状,病理状况如病原体(病毒、细菌、真菌)感染、恶性肿瘤、不需要的免疫反应。不需要的免疫反应即引起病理和/或症状的免疫反应,如自免疫疾病或过敏症或疾病例如增殖不足疾病如正常的或受损的组织生长或伤口愈合或烧伤愈合,或免疫抑制疾病如特征为没有所需要的反应和/或所需要的反应不足的疾病。
许多癌症或恶性肿瘤与有害的Th2免疫反应或缺乏Th1反应相关联。Th1免疫反应不足可能使得恶性细胞能够避开免疫监视。这些疾病包括非小细胞肺癌、支气管癌、肾细胞癌或肿瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、胰腺癌或胃腺癌、与人类乳头瘤病毒属有关的子宫颈上皮内瘤形成、颈癌、肝脏肿瘤以及皮肤T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿、塞泽里综合症)。
在某些这种实施方案中,患者的过度增殖疾病或恶性疾病可能与一种或多种病原体有关。例如肝脏细胞癌与HCV或HBV有关、卡波济氏肉瘤与HIV-1或HIV-2有关、T细胞白血病与HTLV1有关、伯基特氏淋巴瘤与埃巴病毒有关、或乳头瘤或癌与乳头瘤病毒(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45)有关或胃腺癌或胃MALT淋巴瘤与幽门螺杆菌感染有关。在其它实施方案中,通式1化合物施用给患有看来似乎与病原体如咽喉、食道、胃、肠、结肠、卵巢、肺、乳房或中枢神经系统出现的黑素瘤或癌症或癌症前期无关的过度增殖的患者。
在一个示例性实施方案中,用含有2-20重量%BrEA的局部乳膏制剂处理患有黑素瘤或黑素瘤前体病变的病人。乳膏施用到主痣(发育不良的痣或普通获得的痣)、主皮肤黑素瘤、附属皮肤黑素瘤以及痣或黑素瘤周围的皮肤上。如果适合,在施用乳膏之前,待处理的部位用肥皂洗净或用醇(乙醇或异丙醇)擦洗。根据待处理部位的大小,每天一次或两次施用约0.1-0.4g/待处理区域或病变的乳膏约10-20天。在病人恢复正常活动之前,约15-30分钟内不要动施药部位的乳膏。对某些病变,观察到多数病人痣和黑素瘤的发展减慢并出现明显的衰退。初步治疗之后,用与初步治疗相同的剂量每隔一天施用制剂至少1-4个月。对于这些病人,按照病人的医生的建议以及病人的许可可以有选择地开始或继续治疗前体病变或黑素瘤的标准疗法,如二甲基三氮烯基咪唑羧酰胺或亚硝基脲(如BCNU、CCNU)。在肿瘤或前体病变通过外科切除且切除部位已完全愈合的情况下,病人有选择地在该部位以及邻近的周围区域每隔一天继续施用制剂至少1-4个月。在某些实施方案中,继续每天施用通式1化合物的口服组合物或制剂,如对于本身是新化合物的通式1化合物。例如对于恶性黑素瘤,有选择地系统施用BrEA,使用一种下述实施例中的制剂隔日给药1-5mg/天约1周-约4个月。
Th1免疫反应不足通常与病毒感染有关。病毒感染可能由DNA或RNA病毒如疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、腺病毒、逆转录酶病毒、外衣病毒、α-病毒、虫媒病毒、黄热病病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒和/或瘟病毒引起。已经描述了病毒的例子。例如请参见,B.N.Fields等,基础病毒学(Fundamental Virology),第3版,1996,Lippencott-RavenPublishers,第2章第23-57页,包括第26-27页的表4,28-29页的表5,第17章第523-539页,第26-27章第763-916页,第32章第1043-1108页,以及第35章第1199-1233页。本文所用的逆转录酶病毒包括人类和动物病毒,例如HIV-1、HIV-2、LAV、人类T细胞白血病病毒I(“HTLVI”)、HTLVII、HTLVIII、SIV、SHIV、FIV、FeLV。其它可以造成病毒感染的病毒,包括其基因组、分化体、隔离群、株系等等,包括人丙型肝炎病毒(“HCV”)、鸭乙型肝炎病毒(“HBV”)、人甲型肝炎病毒(“HAV”)、鸭肝炎病毒、土拨鼠肝炎病毒、人(“HPV”,例如HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45)或动物乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒I型(“HSV-1”)、单纯疱疹病毒II型(“HSV-2”)、人疱疹病毒VI型(“HHV-6”)、人疱疹病毒VIII型(“HHV-8”)、登革热病毒(I-IV型)、西方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒和牛病毒性腹泻病毒。
其它涉及免疫失调或Th2免疫反应过度的疾病包括自体免疫疾病如SLE(系统性红斑狼疮)、骨质疏松症、多发性硬化、重症肌无力、格氏病、与螨虫相关的溃疡性皮炎、风湿性关节炎和骨关节炎。Th2免疫反应过度也与有害的症状或病理例如疲劳、疼痛、发热或或感染发率病增加有关,其与老化、过敏和发炎疾病如囊性纤维化病人的过敏性支气管肺曲霉病、过敏性哮喘、过敏性呼吸道疾病、过敏性鼻炎、特应性皮炎、呼吸道反响过强的上皮下纤维化、慢性窦炎、慢性过敏性鼻炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、纤维变性肺泡炎(肺纤维化)相关。
其它在临床上与Th2免疫反应过度症状有关或具有Th2免疫反应过度症状如疲劳、病痛、发热或感染发病率增加的迹象为精神分裂症、急性脊髓炎、肉状瘤病、烧伤、外伤(如骨折、出血、外科)和异种移植的免疫反应。所有这些疾病的至少部分病理的常见的基础免疫组件使得单一试剂就能有效用于治疗疾病或医治与Th1反应不足或Th2反应过度有关的症状。在所有存在Th1反应不足或Th2反应过度的疾病中,按照本文所述方法,施用有效量的通式1化合物就可以改善这些与疾病相关的一种或多种症状。因此,人们可以使用本文所述的制剂或给药途径间歇式给药通式1化合物。
在某些应用中,通式1化合物可以直接或间接干扰一种病原体如病毒或寄生虫(疟疾)的复制、生长或细胞间的传递。直接影响感染物或恶性细胞可以改善患者的临床状况。抑制寄生虫或受感染细胞用于进行正常复制或新陈代谢的一种或多种酶如葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶可以干扰细胞复制,其中葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶能够影响NADPH的细胞生殖(例如请参见Raineri等,生物化学(Biochemistry),1970 9:2233-2243)。这种影响能够使通式1化合物具有抑菌效果。细胞酶表达或活性的调节也能够干扰病原体如HIV或疟疾寄生虫的复制或生长或干扰肿瘤细胞的复制或生长,如抑制血管生成。增强Th1免疫反应一般也会改善临床效果。
在其它应用中,实施方案是包括将通式1化合物与细胞接触,并使得通式1化合物与类固醇激素受体形成复合体或调节生物活性的方法。类固醇激素受体可以是表现出与通式1化合物中度或高度键合亲合性的孤独核激素受体。在某些实施方案中,类固醇受体是已知的类固醇受体。通式1化合物与受体相互作用产生的生物效应能够导致对病原体或其细胞的复制或生长进行干扰。例如,可以改变HIV感染细胞的HIV转录的表达。受体-通式1化合物的复合体可以直接干扰依靠LTR的HIV基因转录,这使得病毒复制减慢。
本发明实施方案包括含有部分纯化或纯化的包含通式1化合物和类固醇受体的复合体的组合物。这种类固醇受体可以是孤独类固醇核受体或特征化的类固醇受体,其中任一种类型与通式1化合物都具有中度或高度的键合亲合力如低于约0.5-10×10-6M,通常低于约1×10-7M,或更高的亲合力作用,低于约0.01-10×-9M。通式1化合物也可以增强免疫反应,这使得免疫反应和变化的细胞内条件同时存在以改善本文所述的一种或多种病理状况。
通式1化合物也可以用于鉴定调节生物反应的受体,如参与影响加强的Th1细胞因子合成的受体。本发明实施方案包括一种方法,“方法1”,它允许在多种生物系统中,测定类固醇受体上的受测化合物的一种或多种作用。一般来讲,受测化合物为通式1化合物。这种系统包括含有本质上或诱导表达所述的类固醇受体的DNA构造的细胞,如SXR、CARβ、RXR、PXR、PPARα或其混合物或二聚体,如SXR/RXR。在其它生物系统中,类固醇受体可以受到一种可调节启动子的转录控制。另外,表达其它基因如类固醇诱导基因如类固醇诱导细胞色素P450。对于这种方法,类固醇受体源通常与一种监控受体的方法例如通过测定受受体调节的基因的转录结合。构成类固醇受体和选择性监控方法的细胞有时是指本文所称的“生物系统”。类固醇受体源包括通常能够表达所述的类固醇受体和从这种细胞取得的提取物的细胞细胞系和细胞群。其它符合本方法目的的有用的生物系统源是来自实验动物表达受体的组织。
方法1的一个方面允许人们使用一种方法,测定在类固醇受体上通式1化合物的一种或多种作用,其包括(a)提供一种生物系统如细胞提取物、细胞或组织,该生物系统含有具有许多类固醇受体的细胞,所述类固醇受体包括含有类固醇受体如SXR、CAR-β、RXR、PPARα、PXR或包含其一种或多种的二聚体的单体、同型二聚体或异型二聚体;(b)通过将细胞与类固醇受体(如SXR、CAR-β、RXR、PPARα或PXR)激动剂或拮抗剂接触,以激活或抑制这些含有类固醇受体的单体、同型二聚体或异型二聚体;(c)将几乎所有的类固醇受体激动剂或拮抗剂从细胞中去除;(d)当处于不含激动剂或拮抗剂的活性状态时,测定这些含有类固醇受体的单体、同型二聚体或异型二聚体的活性;(e)将细胞与受测化合物接触;(f)当单体、同型二聚体或异型二聚体仍然不含激动剂或拮抗剂时,测定受测化合物对这些含有一种或多种类固醇受体的单体、同型二聚体或异型二聚体的至少一种作用;和(g)可选择地将受测化合物归类为类固醇受体的激动剂或拮抗剂或具有很少或不具有可测作用的中性化合物。
方法1可以测定的作用包括测定或测量对表达受到类固醇受体影响的基因的作用。该基因可以是与病理状况如感染物、免疫紊乱或过度增殖相关的基因。
因此,如果一种先前并没有认为是蛋白质生物合成调节子的化学物质能够转录调节对一种与维持或医治病理状况的一种或多种症状有关的蛋白质进行编码的基因,可以确定方法1的另一个方面,“方法1A”。该方法包括(a)将包含真核细胞的试样与通式1化合物接触,其中真核细胞包含许多类固醇受体蛋白质和以5’以3’顺序的DNA结构,该DNA结构包含(i)编码所述的蛋白质基因的可调节的转录调节序列,(ii)编码所述蛋白质的基因的一个启动子,和(iii)表达能够产生可测信号、偶合到启动子上、并受启动子控制的多肽的报道基因,在一定条件下,如果该化学物质能够起到编码所述的蛋白质基因的转录调节子的作用,会使报道基因表达的多肽产生可测量的或可检测的信号;(b)定量测定所产生信号的数量;和(c)将测定的信号量与所产生的信号量进行选择性地比较以确定引起由多肽产生的信号中的可检测的变化的化学物质,并确定该化学物质是否特异转录调节与病理状况的一种或多种症状的维持或医治有关的基因的表达,所产生的信号量是在不存在任何正在测试的化学物质或刚刚将试样与其它化学物质接触的条件下检测的。
在实施方法1A时,人们通常可以将包含预定数目的相同的或基本相同的真核细胞的试样与预定浓度的通式1化合物接触。真核细胞含有使用常规分子生物学方法和流程制备的DNA结构。一般来讲,该DNA结构按5’到3’顺序包含(i)参与调节与病理的维持或医治有关的基因的表达的转录调节序列;(ii)该基因的启动子,和(iii)表达能够产生可检测信号、偶合到启动子上、并受启动子控制的多肽的报道基因。该结构保持在一定的条件下,如果通式1化合物能够起到编码所述的蛋白质的基因的转录调节子的作用,它会使得由报道基因表达的多肽产生可测量的或可检测的信号。一旦经过足够的时间以产生可检测的反应或信号,人们就能够确定所产生的信号量。通常反应或信号是定量测量的,但定性测量对于快速筛选的目的也是有用的。
对于方法1A,人们也可以选择性地将可检测的信号与产生的信号的量进行比较,所产生的信号为(i)在不存在通式1化合物的情况下检测的信号或(ii)当将试样与其它化学物质接触时,将通式1化合物确定为能够在多肽产生的可检测的信号中引起变化的化学物质。然后,人们通常能够确定是否通式1化合物特异转录调节与病理状况的一种或多种症状的维持或医治有关的基因的表达。
方法1和1A的其它方面包括一种筛选方法,其包括分别将许多相同的、基本相同的或不同的试样,每个试样都含有预定数目的细胞中的每一个与预定浓度的要测试的每种不同的通式1化合物接触,例如,其中该许多试样中包含多于约1×103或多于约1×104的试样或多于0.5-5×105个试样。在其它方面中,人们可以通过定量聚合酶链反应确定RNA的数量。在1或1A的任一项中,可以使用任何本文所述的或命名的通式1化合物。
本发明的方面包括另一种方法,“方法2”,其主要内容是鉴定一种基因,它的表达由传染病治疗试剂的一种候选结合配偶体调节。通常该结合配偶体为类固醇受体,如含有SXR、CAR-β、PXR、PPARα或RXR或其同系物或同等型的单体、同型二聚体或异型二聚体。类固醇受体通常表现为一个复合体,该复合体包含例如通式1化合物和可调型基因的DNARS,其被所述类固醇受体或含有类固醇受体的复合体识别并特异性结合。这些复合体也可包含一种转录因子,该转录因子键合到所述类固醇受体上或邻接或接近DNARS的核酸序列上。可能存在的示例性转录因子包括ARA54、ARA55、ARA70、SRC-1、NF-κB、NFAT、AP1、Ets、p300、CBP、p300/CBP、p300/CBP关联因子、SWI/SNF和SWI/SNF、CBP、SF-1、RIP140、GRIP1和Vpr的人类同系物中的一种或多种。一般而言,人们在活体内或活体外提供第一和第二组细胞,并把第一组细胞与传染病治疗试剂接触,但不将活体内或活体外的第二组细胞与传染病治疗试剂接触。通过常规流程从细胞中恢复RNA或产生来源于RNA的cDNA。从第一组和第二组细胞中分析RNA或来源于RNA的cDNA,就可以确定它们之间的差别,人们可以利用这种差别确定一种基因,该基因的表达由传染病治疗试剂的候选结合配偶体或任何与该基因有关的DNARS调节。
方法2的一个方面是确定通式1化合物调节、或参与与病理状况的一种或多种症状的维持或医治有关的基因的调节或转录的能力。一般而言,人们希望通式1化合物会使该基因的转录增加。病理状况通常与一种传染物如病毒、寄生虫或细菌有关,但也可能包括免疫疾病如自体性免疫疾病或免疫不足。病理状况也可以是对感染缺乏免疫反应中,或对过度增殖疾病或恶性肿瘤缺乏免疫反应。可以应用该方法的其它病理状况是发炎疾病。
在某些方面,方法2使用的通式1化合物会做上标记。这种化合物是通过常规方法,使用标准标记如放射标记、荧光标记或本文所述以及引用的参考文献中的其它标记制备的。
方法2的一个实施方案涉及通过扣除杂交法分析RNA、或来源于RNA的cDNA。在该实施方案中,使从第一组和第二组细胞得到的RNA或cDNA进行杂交,并去除所得到的双链结构。这使得可以恢复编码基因的核酸,该基因的转录由通常为类固醇受体的候选结合配偶体调节。人们可以使用常规方法从由该方法恢复的核酸中扩增并获得核酸和蛋白质序列信息。由通式1化合物转录诱导或抑制的核酸序列为候选结合配偶体。
转录诱导的基因在由通式1化合物处理的第一组细胞中会得到富集,而耗尽或不存在任何受抑制的基因。在这些实施方案中,在去除双链结构后恢复的RNA通常通过标准RT-PCR或PCR流程进行扩增。这些流程通常使用几组特异的随机引物对,然后通过凝胶电泳分析扩增的核酸。被通式1化合物诱导的核酸表现为带,通常为双链DNA,它不存在于对照或第二组细胞中。第一组细胞中被通式1化合物的结合配偶体转录抑制的核酸会耗尽或不存在该核酸。一旦这种基因的候选物得到确认,它们可以被克隆或表达,并且与该基因有关的DNARS形成含有一个候选结合配偶体和一个选择性标记的通式1化合物的复合体的能力会通过常规方法,使用例如固定在柱子上的DNARS、或含有一种选择性标记的DNARS和一种候选结合配偶体的复合体的共沉淀使用抗结合配偶体抗体进行分析,常规方法如平衡透析、亲和层析。核酸序列分析通常用于鉴定与可调型基因的编码区相邻的区域以鉴定与该基因有关的任何DNARS。可能通过结合到含有一种候选结合配偶体如类固醇受体以及选择性一种通式1化合物的复合体的DNARS上对DNARS进行确认。通过DNA足迹法或其它检测结合作用的方法完成对DNARS的定位和确认。DNARS、受体或通式1化合物可以在方法2的这些变体中进行标记。
一般来讲,第二组细胞可以与第一组细胞相同或基本相同。在细胞基本相同的实施方案(方法1和2)中,第一组或第二组细胞可以通过存在或不存在DNA结构互相进行区分,该DNA结构表达(i)一种类固醇受体和/或(ii)一种容易检测的蛋白质如β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、磷酸酯酶、或氯霉素乙酰转移酶,该蛋白质的转录调节通常是由类固醇受体进行调节的。在这些实施方案中,第一组和第二组细胞的差别用来简化对通式1化合物和类固醇受体结合配偶体的生物效应的分析。如果它们没有表现出已知的或明显的形态或基因差别,这两组细胞就认为是“相同的”。
通常第二组细胞起对照作用,并且因此它们在获得RNA或cDNA之前,不与任何通式1化合物接触。但是,对于某些实施方案,人们可以把第二组细胞与已知的类固醇受体结合配偶体的激动剂或拮抗剂接触。这使得可以将通式1化合物的效价与激动剂或拮抗剂的效价进行比较。
在其它实施方案中,人们可以通过提供第三组细胞对方法2进行修改,当第二组细胞用类固醇受体激动剂或拮抗剂进行处理时,第三组细胞可选择性用作未处理的对照。在这些实施方案中,人们通常会将通式1化合物的效应与基因或DNA结构表达的激动剂或拮抗剂进行比较。DNA结构含有启动子或其它受到由与结合配偶体协调一致的通式1化合物引起的转录调节,通常是转录增加的调节序列。
包括复合体可以含有的孤独类固醇受体、其同系物、同等型和辅因子(如辅阻遏物、转录因子、基因启动子区域或序列)的典型的哺乳动物和其它类固醇受体为类固醇生成因子-1(SF-1)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子(COUP-TFI)及其哺乳动物同系物、类维生素A和甲状腺激素受体(SMRT)的沉默介质及其哺乳动物同系物、NF-E3、COUP-TFII及其哺乳同系物、睾丸孤独受体TR2、甲状腺激素α1(TRα1)、类维生素A的X受体α、TRα1/RXRα 异型二聚体、直接复制-4甲状腺激素反应素(DR4-TRE)、雌激素受体(ER)、雌激素受体相关α(ERRα)、雌激素受体相关β(ERRβ)、类固醇异生素受体(SXR)、肝细胞核因子4(HNF-4)、肝细胞核因子3(HNF-3)、肝X受体(LXRs)、LXRα、雌激素受体α(ERα)、构成型雄烷受体-β(CAR-β)、RXR/CAR-β异型二聚体、短异型二聚体配偶体(SHP)、SHR/ERα异型二聚体、雌激素受体β、SHP/ERβ异型二聚体、睾丸孤独受体TR4、TR2/TR4异型二聚体、孕甾烷X受体(PXR)和同等型、细胞色素P-450单氧酶3A4基因启动子区域和同等型、HNF-4/细胞色素P-450单氧酶3A4基因启动子区域和同等型复合体、HIV-1长末端重复序列(LTR)、HIV-2 LTR、TR2/HIV-1 LTR复合体、TR4/HIV-1 LTR复合体、TR4/HIV-1 LTR复合体、TRα1/TR4/HIV-1LTR复合体、TR2同等型(TR2-5、TR7、TR9、TR11)、DAX-1、DAX-1/类固醇生成急性调节蛋白质基因启动子区域、ReVErb、ReVErbAα、ReVErbβ、乳腺癌中扩增的类固醇受体辅激活物(AIB 1)、p300/CREB结合蛋白质-相互作用蛋白质(p/CIP)、甲状腺激素受体(TR、T3R)、甲状腺激素反应素(T3REs)、构成型雄烷受体(CAR)、非洲爪蟾属xSRC-3和哺乳动物(人类)同系物、TAK1/TAK1、过氧化物酶体增殖激活的受体α(PPARα)复合体、PPARα/RXRα复合体、TAK-1/RIP-140复合体、视黄酸受体(RAR)、RARβ、TR4/RXRE复合体、SF-1/类固醇羟化酶基因启动子区域、SF-1/催产素基因启动子区域、SF-1/ACTH受体基因启动子区域、大鼠耳-2和哺乳动物同系物、人类TR3孤独受体(TR3)、RLD-1、OR-1、雄激素受体、糖(肾上腺)皮质激素受体、雌激素受体、孕酮受体、盐皮质激素受体、OR1、OR1/RXRα复合体、TIF-1、CBP/P300复合体、TRIP1/SUG-1复合体、RIP-140、SRC1α/P160复合体和TIF-2/GRIP-1复合体、RAR/N-CoR/RIP13复合体、RAR/SMRT/TRAC-2复合体和DNARS 5’AGGTCANAGGTCA3’或5’TGCACGTCA3’。当例如这些复合体进行无细胞分析时,它们的一种可以包括在本发明方法内。通过把表达这些蛋白质,如含有稳定DNA结构或用于瞬时感染分析的结构哺乳动物或酵母细胞的蛋白质的一种或多种的DNA结构插入细胞内,能够促进在细胞内形成这些复合体。在活体内或体外使用通式1化合物作为激动剂、拮抗剂或作为参考标准进行分析或诱导生物反应的方法基本如下述文献所述:例如请参见USP 5080139、5696133、5932431、5932555、5935968、5945279、5945404、5945410、5945412、5945448、5952319、5952371、5955632、5958710、5958892、5962443;国际专利申请WO 96/19458、WO 99/41257、WO 99/45930。这些包含通式1化合物并用于实施这些方法的复合体或分析系统都属于本发明的方面。
通式1化合物通常与一种或多种生物配体相互作用从而导致生物反应。为有助于为通式1化合物确认候选结合配偶体,人们可以使用连接到载体通常为固体载体上的放射标记的通式1化合物作为恢复候选结合配偶体的方法。通式1化合物可以通过例如类固醇核的3-、7-、16-或17-位连接到载体上。此种用途的连接剂是已知的并且包括同双官能团试剂和异双官能团试剂,它们中的一些可以买到。人们使用的连接剂通常包含约2-20个连接的原子。这些连接的原子通常大部分为碳,并带有置换一个或多个碳原子的一个、二个或三个氧、硫或氮原子。人们能够利用从合适的细胞或组织获得的cDNA表达库作为候选结合配偶体源。细胞或组织要可以从哺乳动物或脊椎动物寄主如人、鼠、鸟、灵长类或其它来源如昆虫(果蝇)、其它的无脊椎动物(酵母、细菌、支原体种、原质团种、四膜虫种、C.elegans)或其它本文或所引用的参考文献中所述的有机体组群或物种获得。合适的组织包括皮肤、肝组织或细胞(包括肝细胞和肝巨噬细胞)、纤维细胞、单核细胞、树突细胞、肾细胞和组织、脑或其它中枢神经系统细胞或组织(包括神经元、星形胶质细胞和神经胶质细胞)、周围神经系统组织、肺、肠、胎盘、乳房、卵巢、睾丸、肌肉(包括心脏或肌原肌细胞组织或细胞)、白血细胞(包括T细胞、B细胞、骨髓细胞和组织)、淋巴组织或流质和软骨细胞。
人们从非人类源分离得到的候选结合配偶体通常含有对通式1化合物具有相似结合特性的人类同系物。因此非人类候选结合配偶体可以有利于人类同系物的恢复,例如通过制备抗血清或从包含人类同系物的溶液中沉淀人类同系物或通过将非人类候选结合配偶体序列与已知的人类基因序列进行比较。一旦获得候选结合配偶体源,它就可以与标记的通式1化合物(例如通常用14C或3H标记)以及包含该标记的通式1化合物和候选结合配偶体的复合体接触,并且该候选结合配偶体通过例如亲和层析或抗体沉淀法进行恢复。复合体的恢复提供了至少部分纯化的候选结合配偶体源,即候选结合配偶体得到富集,例如与起始候选结合配偶体源材料中候选结合配偶体的丰度相比,其至少富集了10倍或至少富集了100倍或至少富集了500倍。
本发明的方面包括一种包含部分纯化的(相对于天然源如细胞或细胞溶解产物,纯化了至少约2-10倍)复合体或包含通式1化合物和类固醇受体的纯化的(相对于天然源如细胞或细胞溶解产物,纯化了至少约20-5000倍)复合体(其中部分纯化或纯化的复合体被选择性地分离)、血清类固醇结合蛋白质(例如人类血清白蛋白、α1-酸糖蛋白、性激素结合球蛋白、睾酮结合球蛋白、皮质类固醇结合球蛋白、雄激素结合蛋白质(大鼠))或另一种结合配偶体如转录因子或DNARS。这些组合物的一个方面包括通过将部分纯化或纯化的组合物与一种或多种细胞、一种或多种组织、血浆或血液接触的过程所生成的产物。
其它方面包括一种测定通式1化合物的生物活性的方法,其包括(a)将通式1化合物与一个细胞或细胞群接触;(b)测定以下一项或多项:(i)结合配偶体与通式1化合物的复合体,(ii)细胞或细胞群的增殖,(iii)细胞或细胞群的分化,(iv)蛋白质激酶C的活性,(v)蛋白质激酶C底物磷酸化的水平,(vi)一个或多个靶基因的转录,(vii)类固醇如糖皮质激素的细胞反应的抑制,(viii)抑制类固醇如糖皮质激素、性类固醇诱导的转录或(ix)抑制HIV LTR促进的转录;和(c)可选择地将步骤(b)中得到的结果与一种合适的对照物进行比较。该实施方案的方面包括(i)该方法,其中结合配偶体是一种类固醇受体、一种转录因子或DNARS,(ii)该方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对于与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫相关的复制或细胞病理效应的调节活性,(iii)该方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对于与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫相关的调节活性或所测定的生物活性是细胞或包含NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、树突细胞、滑膜细胞、小神经胶质细胞、纤维细胞、转化细胞(新生细胞)、病毒感染细胞、细菌感染细胞或寄生虫感染细胞细胞群的新陈代谢(通过3H-胸苷吸收或其它本文或参考文献中所述的分析方法进行分析),和(iv)该方法,其中靶基因是病毒基因、细菌基因、寄生虫基因、与癌症有关的基因如其中的病毒基因为DNA或RNA聚合酶基因、逆转录基因、包膜基因、蛋白酶基因或与病毒核酸复制有关的基因或病毒结构基因。
一个实施方案,是一种方法,其包括将含有一种类固醇受体和一种通式1化合物的复合体与反式激活蛋白接触,因此形成一种包含类固醇受体蛋白质、通式1化合物和反式激活蛋白的复合体,其中该反式激活蛋白存在于(1)细胞或组织提取物(例如细胞核、含有细胞核的溶解产物或不含细胞或组织的细胞核的溶解产物),(2)部分纯化或纯化的细胞或组织提取物,(3)组织培养的细胞或(4)患者细胞中,其中(1)-(4)的任一项可选择性包含一种靶基因(天然基因或通过标准基因工程技术引入的基因),其表达的水平在复合体形成后可选择性地进行分析。在某些实施方案中,该反式激活蛋白是部分纯化的或纯化的,并且存在于细胞或组织提取物或部分纯化的或纯化的细胞或组织提取物中。反式激活蛋白可以是TIF-1、CBP/P300、TRIP1/SUG-1、RIP-140、SRC1α/P160、或TIF-2/GRIP-1。在任意这些实施方案中,与合适的对照物(例如在同样的条件下的对照物,但不含对应于通式1化合物的添加化合物,或其中另一种化合物(例如已知连接到类固醇受体上的类固醇)用作基准或参考标准测量变化的靶基因表达)相比,含有类固醇受体蛋白质、通式1化合物和反式激活蛋白的复合体可以增加或减少靶基因的转录。在这些方法中,靶基因可以为病原体基因(病毒、细菌、寄生虫、真菌、酵母)或与病理状况(自体免疫、发炎、过度增殖)有关的基因。
通式1化合物很适合用于所述的某些方法,这些方法使用类固醇调节细胞或组织中的生物活性。例如,通式1化合物可以用来有选择性地与特异类固醇受体或类固醇孤独受体、或它们的与患者的病理状况有关的亚型相互作用,内容基本如USP 5668175所述。在这些应用中,通式1化合物可以用作受体的配体,对与病理状况(类固醇激素响应的疾病状态)相关的基因产物的异常表达进行调节。这种基因通常是由类固醇激素进行调节的。在其它应用中,人们可以使用通式1化合物对连接到类固醇受体或类固醇孤独受体上的配体以及一个或多个如AP-1和/或带有DNA序列的转录因子(或辅因子)进行筛选,内容基本如USP 5643720所述。同样地,通式1化合物可以基本按USP 5597693、5639598、5780220、5863733和5869337所述来应用。在某些这类实施方案中,通式1化合物被标记以利使用。合适的标记在本领域是已知的并且包括放射标记(如3H、14C、32P、35S、131I、99Tc以及其它卤素同位素)、荧光标记(如荧光素、试卤灵、得克萨斯红、若丹明、BODIPY、芳基磺酸菁)、化学发光部分(如吖啶酸酯)、金属螯合剂、生物素、抗生物素蛋白(avadin)、肽标记物(如组氨酸六聚物、被单克隆或多克隆抗体识别的肽)、共价交联部分。人们可以按照已知的方法制备这些标记化合物。
适合测定多种化合物的生物效应如激活免疫系统细胞(如NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞、滑膜细胞、小神经胶质细胞、纤维细胞)的方法已经有描述,例如Jakob等,免疫学学报(J.Immunol.),1998,161:3042-3049,Pierson等,血液(Blood),1996,87:180-189,Cash等,临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.),1994,98:313-318,Monick等,J.Immunol.,1999,162:3005-3012,Rosen等,传染免疫学(Infect.Immun.),1999,67:1180-1186,Grunfeld等,J.Lipid Res.,1999,40:245-252,Singh等,免疫细胞生物学(Immunol.Cell Biol.),1998,76:513-519,Chesney等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 1997,94:6307-6312,Verhasselt等,J.Immunol.1999 162:2569-2574,Avice等,J.Immunol 1999 162:2748-2753,Cella等,实验药学学报(J.Exp Med.),1999 189:821-829,Rutalt等,FreeRadical Biol.Med.1999 26:232-238,Akbari等,J.Exp.Med.1999 189:169-178,Hryhorenko等,免疫药理学(Immunopharmacology)1998 40:231-240,Fernvik等,Inflamm.Res.1999 48:28-35,Copper等,J.Infect.Dis.1999 179:738-742,Betsuyaku等,J.Clin.Invest.1999 103:825-832,Brown等,Toxicol.Sci.1998 46:308-316,Sibelius等,Infect.Immunol.1999 67:1125-1130。在这些方法中使用通式1化合物是本发明的方面,并且它们允许例如测定通式1化合物对基因的生物效应,该基因的表达受到通式1化合物和类固醇受体的调节。
实施方案包括任意上述的方法,例如方法1,其中细胞或生物系统包含NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞、滑膜细胞、小神经胶质细胞、神经胶质细胞、纤维细胞或肝细胞,它们选择性地含有表达一个或两个克隆的类固醇受体的DNA结构。该方法可选择性地分析相对于对照物,通式1化合物对细胞的效应。对照物包括使用已知的类固醇受体的激动剂或拮抗剂或将与通式1化合物接触的细胞与没有与通式1化合物接触的对照物细胞(通常与处理的细胞为同一细胞类型)进行比较。通过已知的分析方法测定相对于对照物的反应如激活类固醇受体。
在某些情况下,通式1化合物会调节(增加或减少)细胞中的一个或多个基因的转录。在其它情况下,通式1化合物会增强患者的以下细胞的一种或多种的溶酶体运动:NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞、滑膜细胞、小神经胶质细胞或纤维细胞。这些效应通常是直接或间接通过类固醇受体调节的,类固醇受体调节基因转录,如使得分析中使用的细胞如PKCα、PKCβ、PKCγ或PKCζ中的蛋白质激酶C(PKC)的活性增加。
其它相关的实施方案是一种组合物,其包含部分纯化的或纯化的由通式1化合物和类固醇受体组成的复合体、血清类固醇结合蛋白质(例如人类血清结合白蛋白、α1-酸糖蛋白、性激素结合球蛋白、睾酮结合球蛋白、皮质类固醇结合球蛋白、雄激素结合蛋白(大鼠))或另一种结合配偶体如转录因子或DNARS。这些组合物的一个方面包括一种由将部分纯化的或纯化的组合物与一个或多个细胞、一个或多个组织、血浆或血液接触所产生的产物。
另一个实施方案包括一种测定通式1化合物的生物活性的方法,其包括(a)将通式1化合物与一个细胞或细胞群接触;(b)测定以下一项或多项:(i)结合配偶体与通式1化合物的复合体,(ii)细胞或细胞群的增殖,(iii)细胞或细胞群的分化,(iv)蛋白质激酶C的活性,(v)蛋白质激酶C底物磷酸化的水平,(vi)一个或多个靶基因的转录,(vii)类固醇如糖皮质激素的细胞反应的抑制,(viii)抑制类固醇如糖皮质激素、性类固醇诱导的转录或(ix)抑制HIV LTR推进的转录;和(c)可选择地将步骤(b)中得到的结果与一种合适的对照物进行比较。该实施方案的方面包括(i)该方法,其中结合配偶体是一种类固醇受体、一种转录因子或DNARS,(ii)该方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对于与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫相关的复制或细胞病理效应的调节活性,(iii)该方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对于与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫相关的调节活性或所测定的生物活性是细胞或包含NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、树突细胞、滑膜细胞、小神经胶质细胞、纤维细胞、转化细胞(新生细胞)、病毒感染细胞、细菌感染细胞或寄生虫感染细胞细胞群的新陈代谢(通过3H-胸苷吸收或其它本文或参考文献中所述的分析方法进行分析),和(iv)该方法,其中靶基因是病毒基因、细菌基因、寄生虫基因、与癌症有关的基因如其中的病毒基因为DNA或RNA聚合酶基因、逆转录基因、包膜基因、蛋白酶基因或与病毒核酸复制有关的基因或病毒结构基因。
另一个实施方案是一种方法,其包括将含有一种类固醇受体和一种通式1化合物的复合体与反式激活蛋白接触,因此形成一种包含类固醇受体蛋白质、通式1化合物和反式激活蛋白的复合体,其中该反式激活蛋白存在于(1)细胞或组织提取物(例如细胞核、含有细胞核的溶解产物或不含细胞或组织的细胞核的溶解产物),(2)部分纯化或纯化的细胞或组织提取物,(3)组织培养的细胞或(4)患者细胞中,其中(1)-(4)的任一项可选择性地包含一种靶基因(天然基因或通过标准基因工程技术引入的基因),其表达的水平在复合体形成后可选择性地进行分析。在某些实施方案中,该反式激活蛋白是部分纯化的或纯化的,并且存在于细胞或组织提取物或部分纯化的或纯化的细胞或组织提取物中。反式激活蛋白可以是TIF-1、CBP/P300、TRIP1/SUG-1、RIP-140、SRC1α/P160、或TIF-2/GRIP-1。在任意这些实施方案中,与合适的对照物(例如在同样的条件下的对照物,但不含对应于通式1化合物的任何添加化合物,或其中另一种化合物(例如已知连接到类固醇受体上的类固醇)用作基准或参考标准测量变化的靶基因表达)相比,含有类固醇受体蛋白质、通式1化合物和反式激活蛋白的复合体可以增加或减少靶基因的转录。在这些方法中,靶基因可以为病原体基因(病毒、细菌、寄生虫、真菌、酵母)或与病理状况(自体免疫、发炎、过度增殖)有关的基因。
当实施本文所述的这些方法时,人们通常希望所观察到的生物效应包括含有两种或多种组分的复合体的形成。这些组分可以包含一种或多种转录因子或转录的辅调节物或辅阻遏物及其同系物和同等型。这些因子和含有这些因子的复合体包括类固醇受体辅激活物-1族(SRC-1、SRC-1/血清反应因子)的成员、NF-KB、NFAT、p300、CBP、p300/CBP、p300/CBP相关因子、SWI/SNF和人类及其它同系物、BRG-1、OCT-1/OAF、APl、Ets、雄激素受体相关蛋白54(ARA54)、雄激素受体相关蛋白55(ARA55)、雄激素受体相关蛋白70(ARA70)、RAC3/ACTR、CREB结合蛋白(CPB)、SRC-1α、受体作用蛋白140(RIP-140)、转录因子激活蛋白1、激活功能2、糖皮质激素受体作用蛋白1(GRIP-1)、受体作用蛋白160(RIP-160)、半乳糖4D损害的抑制因子(SUG-1)、转录中间因子1(TIF-1)、转录中间因子2(TIF-2)、SMRT、N-CoR、N-CoA-1、p/CIP、类固醇生成因子1(SF-1)、p65(RelA)和由人类免疫缺乏病毒和及其同等型和同系物编码的Vpr。这些因子的一种或多种可以存在于含有通式1化合物和类固醇受体的复合体中,如SXR、PPARα、CAR-β、RXR和/或PXR。
在一个相关的实施方案中,通式1化合物用来对体外的哺乳动物细胞施加抑制细胞效应。这类细胞通常是淋巴细胞或转化T细胞系,淋巴细胞如从血液或富含淋巴细胞的器官(如脾脏、淋巴组织或淋巴结)获得的T细胞群。通过这种活性可以估计通式1化合物调节免疫学作用的能力,如增强Th1免疫反应或抑制与Th2有关的一种或多种细胞因子的表达。因此,本发明的方法包括(a)将通式1化合物与体外淋巴细胞接触,(b)测定该化合物施加的抑制细胞程度以确认一种抑制细胞化合物和(c)可选择地将抑制细胞化合物给免疫受抑制的患者用药,以确定该化合物对一种或多种本文所述的患者免疫反应的作用,如增强Th1细胞因子或细胞反应或减弱与Th2相关的细胞因子的表达。通常这些方法是通过使用一定范围的通式1化合物浓度和合适的对照物进行的,对照物如已知的抑制细胞试剂或含有溶剂但不含通式1化合物的空白。通过标准方法测量对细胞增殖的抑制。测量该化合物的抑制细胞作用的方法包括测量在受到处理的和未受处理的培养物中活细胞数目或使用例如将3H-胸苷引入受处理的和未受处理的培养物中测量DNA合成。通常细胞生长介质中通式1化合物的浓度范围为约0.1μm-约100μm,对固定数目的细胞(如约0.4×105-约5×105)使用4-6个不同的化合物浓度。将通式1化合物留在组织培养中与细胞接触足够长的时间以观察抑制细胞作用,如约16小时至约6天,典型为约24-72小时。在这些实施方案中,人们可以可选择地鉴别类固醇受体的生物活性的调节,如激活PPARα,它可能与化合物引起的抑制细胞作用有关。
在某些应用中,通式1化合物看来能够改善与感染或疾病有关的一种或多种症状。例如,治疗患有如由逆转录病毒感染、癌症化疗或其它原因引起的免疫抑制的患者,通常会显示一种或多种相关的症状如体重损失、发热、贫血、疲劳得到改善,或减轻与二次感染如HSV-1、HSV-2、乳头瘤、人类细胞巨化病毒(“CMV”)、肺孢子虫属(如卡氏肺孢子虫)或念珠菌属(白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌)感染有关的感染症状。通式1化合物也可用于自体骨髓移植或干细胞移植中免疫系统的恢复。在某些实施方案中,通式1化合物以按本文所述的非水溶液液体制剂形式给药或按本文所述的任意间歇式给药方案使用固体或液体制剂给用通式1化合物。在患有逆转录病毒感染的患者具有包括一种或多种症状的的情况下,对患者给药约0.1-约10mg/kg/天(通常为约0.4-约5kg/kg/天)通式1化合物,在1-4周内通常会使得一种或多种症状发生明显的改善。症状有:相对低的CD4数(例如约10-200,通常约20-100)、一种或多种另外的病原体感染(HSV-1、HSV-2、HHV-6、HHV-8、CMV、HCV、一种HPV、卡氏肺孢子虫或念珠菌感染)以及一种或多种贫血、疲劳、卡波济氏肉瘤、发热或非自主体重损失(至少约5%体重)。在其它实施方案中,通式1化合物施用给患有看起来与病毒感染有关的疾病的患者,病毒感染如与CMV有关的肺炎或视网膜炎、与埃巴病毒有关的鼻咽癌或口腔毛状白斑、与细小病毒19有关的溶血性贫血中的与风疹病毒或再生障碍危象有关的进行性全脑炎或糖尿病。
在一个典型的实施方案中,感染有HCV的病人服用一种含有约20mg/mL BrEA的水溶液等渗α-环糊精或β-环糊精制剂。该制剂经静脉内给药每天单一剂量或每天两次次剂量。病人以1-10mg/kg/天的剂量服用4-10天,然后不给药5-30天,然后再次服用环糊精制剂4-10天。重复该给药方法一次、二次或多次。在治疗中,对HCV进行临床标记,如血液或血浆中的病毒核酸、血液或血浆中的肝酶(如AST/SGOT、ALT/SGPT、碱性磷酸酶)的水平。对于这些病人,可以有选择地开始一种标准抗HCV治疗如干扰素和/或病毒唑,或继续按照病人的医生的建议或病人告知的同意。在某些这种实施方案中,连续每天给药通式1化合物作为一种口服或非肠道组合物或制剂的组分,如对于本身是一种新的通式1化合物。BrEA也可以选择性地系统给药,使用例如实施例1中的制剂,1-5mg/kg/隔日给药约1-4个月,或以一种口服制剂的形式5-40mg/kg/隔日给药1-4个月。
在任何公开的实施方案中,人们可以选择性地将另外一种治疗药品与通式1化合物的给药结合,即在给药通式1化合物之前、之中或之后,对患者用药。例如,对于患有病毒或寄生虫感染的患者或在给药通式1化合物的过程中,也可以给药其它的治疗药品给患者,如核苷类似物用于病毒感染或氯喹用于疟疾。这些附加的治疗通常包括对于患者病理状况的标准治疗方法,但其也可以包括实验性或其它处理。例如,人们可以辅助给药维生素(多种维生素、单一维生素)、抗氧剂或其它试剂(维生素E、别嘌呤醇)、营养补剂(液体蛋白或碳水化合物制品)或作为病人药物状况的保证或病人的医生建议的其它治疗方法。在任何本文所述的实施方案中,任何这些附加的治疗可以与任何通式1化合物如BrEA、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯或氨基酸或其与肽的结合物的给药结合。
这些附加的治疗对有经验的技术人员是显而易见的。这些治疗根据要治疗的疾病、组分的交叉反应性以及这种结合的药学特性进行选择。例如,当治疗人类或其它患者的逆转录病毒感染时,通式1化合物与一种或多种逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、抗生素或镇痛剂结合。合适的通式1化合物包括那些如本文的化合物第1组至42-25-20-6组以及其它地方所述的化合物。典型的逆转录酶抑制剂为AZT、3TC、D4T、ddI、ddC、阿得弗韦地匹(adefovir dipivoxil)、9-[2-(R)-[[二[[(异丙氧羰基)氧基)甲氧基]-膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤、(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤和阿得弗韦。典型的蛋白酶抑制剂为印地那韦、那非那韦、利托那韦、印地那韦(crixivan)和斯扩那韦(sequanavir)。也可以使用融合抑制剂,如HIV融合抑制剂。当治疗呼吸系统或其它系统的病毒感染如丙型肝炎病毒(“HCV”)或流感病毒感染(如流感A或B)时,本发明的组合物选择性与抗病毒素(如γ-干扰素、金刚胺、甲金胺、病毒唑或USP 5763483公开的化合物(特别是权利要求1和2中描述的化合物)和5866601公开的化合物)、粘液溶解药、祛痰药、支气管扩张药、抗生素、退热药或镇痛药结合使用。
在某些实施方案中,将通式1化合物施用于患有寄生虫或细菌感染的患者,以减慢感染的发展,干扰感染物的复制或发展或改善一种或多种相关的症状,如体重损失、贫血或二次感染。寄生虫有疟疾寄生虫、昏睡病寄生虫和与胃肠感染有关的寄生虫。寄生虫和细菌包括以下生物体的种、群、属、株或隔离种群:胃肠寄生虫、微孢子目、等孢子球虫属、小球隐孢子虫属、分枝杆菌(鸟分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎分枝杆菌、渗透分枝杆菌)、支原体属(发酵支原体、渗透支原体、肺炎支原体)、锥虫属(布氏锥虫、冈比亚锥虫、克氏锥虫、伊氏锥虫)、利什曼虫属(杜氏利什曼虫、硕大利什曼虫、巴西利什曼虫)、疟原虫属(恶性疟原虫、诺氏疟原虫、间日疟原虫、伯格氏疟原虫)、埃利希体属(犬埃利希体、E.chaffeensis、嗜噬胞埃利希体、马埃利希体、腺热埃利希体)、微小巴贝虫、嗜血杆菌属(睡眠嗜血菌、流感嗜血杆菌)、布鲁菌属(羊布鲁菌、流产布鲁菌)、巴尔通体属(B.henselae)、鲍特菌属(支气管败血性鲍特菌、百日咳鲍特菌)、埃希杆菌属(大肠杆菌)、沙门菌属(鼠伤寒沙门菌)、志贺菌属(韦氏志贺菌)、假单孢菌属(铜绿色假单孢菌)、奈瑟菌属(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌)、链球菌属、葡萄球菌属(金黄色葡萄球菌)、立克次体属(立氏立克次体)、耶尔森菌属(小肠结肠炎耶尔森菌)、嗜肺军团菌和利斯特菌属(单核细胞增多性利斯特菌)。
例行实验可以将本文所述的本发明的一种或多种间歇式按剂量给药方案或一种或多种非水溶液液体制剂应用于本文所述的任何用途或应用。对于本身为新型化合物的通式1化合物,该化合物可以按照本发明的间歇式按剂量给药方案施用给患者,按剂量给药方案如连续每日单一剂量或每天二次或多次按剂量给药。另外,任何通式1化合物如本身为新型化合物的一种或多种通式1化合物,都可以存在于本文所述的任何固体或液体制剂中。例行实验可以将这些制剂和按剂量给药方案应用于本文所述的任何用途或应用。
编号的实施方案 本发明的几个方面以及相关主题包括以下编号的实施方案。
在某些方面,本发明涉及含有通式1化合物的非水溶液液体制剂。典型的实施方案如下所述。
1.一种组合物,其含有一种或多种通式1或通式2化合物,以及一种或多种非水液体赋形剂,其中该组合物的含水量低于约3体积%。
2.实施方案1所述的组合物,其中一种或多种通式1化合物具有以下结构,
或
其中,R7和R9分别为-CHR10、-CH2-、-CH=、-O-、-S-或-NH-,其中R10为-OH、-SH、C1-10选择性取代的烷基、C1-10选择性取代的烷氧基、C1-10选择性取代的链烯基或C1-10选择性取代的炔基;而R8为-CH2-、-O-、-S-或-NH-,其中在5(如果存在)、8、9和14位的氢原子分别为α.α.α.α(即5α、8α、9α、14α)、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.ββ、α.β.α.β、β.α.αβ、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.ββ、β.α.β.β、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α。
3.实施方案2所述的组合物,其中一种或多种通式1化合物具有以下结构,
其中在5(如果存在)、8、9和14位的氢原子分别为α.α.α.α、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.β.β、α.β.α.β、β.α.α.β、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.β.β、β.α.β.β、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α。
4.实施方案1、2或3所述的组合物,其中存在一种、二种、三种或四种通式1化合物。
5.实施方案1、2、3或4所述的组合物,其中含水量低于约0.3体积%。
6.实施方案1、2、3、4或5所述的组合物,其中一种或多种非水液体赋形剂是一种醇、一种聚乙二醇、丙二醇或苯甲酸苄酯的一种、二种或多种。
7.实施方案1-6(实施方案1、2、3、4、5或6)的任一项所述的组合物,其中通式1化合物为1 6α-16α-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7α-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7α,17β-三羟基-5-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮、3β,7α-二羟基表雄(甾)酮、3 β,7β-二羟基表雄(甾)酮、3 β-羟基-7-氧代-表雄(甾)酮。
8.实施方案7所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
9.实施方案1-8任一项所述的组合物,其中该组合物含有二种、三种、四种或五种非水液体赋形剂。
10.实施方案9所述的组合物,其中该组合物含有三种或更多种非水液体赋形剂。
11.实施方案1-10任一项所述的组合物,其中通式1化合物占该组合物的0.0001-99重量/体积%。
12.实施方案1-11任一项所述的组合物,其中该组合物构成一单元药剂。
13.实施方案12所述的组合物,其中该单元药剂含有大约0.5-100mg/mL的通式1化合物。
14.实施方案10所述的组合物,其中该组合物含有约1.0-60mg/mL的通式1化合物。
15.实施方案14所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮或16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
16.实施方案1所述的组合物,其中一种或多种非水液体赋形剂包括一种聚乙二醇、丙二醇和苯甲酸苄酯。
17.实施方案16所述的组合物,其中该组合物的含水量低于约0.3体积%。
18.实施方案17所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮或16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
19.实施方案18所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
20.实施方案16所述的组合物,其还含有一种醇。
21.实施方案20所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮或16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
22.实施方案1所述的组合物,其中一种或多种非水液体赋形剂包括苯甲酸苄酯、聚乙二醇、一种醇以及任意一种另外的非水液体赋形剂。
23.实施方案22所述的组合物,其中该组合物的含水量低于约0.3体积%。
24.实施方案22或23所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮或16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
25.实施方案24所述的组合物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
26.实施方案22、23、24或25所述的组合物,其中聚乙二醇为聚乙二醇300和/或聚乙二醇200。
27.实施方案26所述的组合物,其中所述醇为聚乙二醇300。
28.实施方案22或23所述的组合物,其含有约2.5-25体积%的乙醇、约1-10体积%苯甲酸苄酯、约10-35体积%聚乙二醇300、约40-65体积%丙二醇以及约2-60mg/mL16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
28A.28A.实施方案22、23、24、25或26所述的组合物,其含有约0.1-10体积%苯甲酸苄酯、约0.1-10体积%苄醇、约1-95体积%聚乙二醇200、约1-95体积%丙二醇以及约2-60mg/mL16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。实施方案28A的组合物可以含有约2体积%苯甲酸苄酯、约2体积%苄醇、约40体积%聚乙二醇200、约5 1体积%丙二醇(qs)以及约50mg/mL16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
29.实施方案28所述的组合物,其含有约12.5体积%乙醇、约5体积%苯甲酸苄酯、约25体积%聚乙二醇300、约57.5体积%丙二醇以及约50mg/mL16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
30.实施方案1-29任一项所述的组合物,其还含有一种局部麻醉剂。
31.实施方案30所述的组合物,其中该局部麻醉剂为普鲁卡因、苯佐卡因或利多卡因。
32.实施方案1-31任一项所述的组合物,其中该组合物包括溶剂化物、悬浮液、胶体、凝胶或任何上述的组合。
33.一种由以下过程产生的产物:将含有一种或多种通式1化合物和第一非水液体赋形剂的组合物与第二非水液体赋形剂接触,其中该产物含有少于约3%水,以及其盐、类似物、构型异构体和互变异构体。
34.实施方案33所述的产物,其中该产物含有少于约0.3%的水。
3 5.实施方案33或34所述的产物,其中第一非水液体赋形剂为一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)或丙二醇。
36.实施方案33、34或35所述的产物,其中第二非水液体赋形剂为一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)或丙二醇。
38.一种通过以下过程产生的产物:将含有一种或多种通式1化合物以及两种非水液体赋形剂的组合物与第三非水赋形剂接触,其中该产物含有少于约3%的水,以及其盐、类似物、构型异构体和互变异构体。
39.实施方案38所述的产物,其中该产物含有少于约0.3%的水。
40.实施方案38或39的产物,其中的两种非水液体赋形剂选自一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)、丙二醇、苯甲酸苄酯和一种醇(如乙醇)。
41.实施方案38、39或40所述的产物,其中第三非水液体赋形剂为一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)、丙二醇、苯甲酸苄酯或一种醇(如乙醇)。
42.一种通过以下过程产生的产物:将含有一种或多种通式1化合物以及三种非水液体赋形剂的组合物与第四非水液体赋形剂接触,其中该产物含有少于约3%的水,以及其盐、类似物、构型异构体和互变异构体。
43.实施方案42所述的产物,其中该产物含有少于约0.3%的水。
44.实施方案42或43的产物,其中的三种非水液体赋形剂选自一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)、丙二醇、苯甲酸苄酯和一种醇(如乙醇)。
45.实施方案42、43或44所述的产物,其中第四非水液体赋形剂为一种聚乙二醇(如PEG300或PEG200)、丙二醇、苯甲酸苄酯和一种醇(如乙醇)。
46.实施方案33-45中任何一项所述的产物,其中产物储存在低温(约4℃-约8℃)或环境温度下约30分钟至约2年。
47.实施方案33-46任一项所述的产物,其中一种或多种通式1化合物包括1、2、3或4种通式1化合物。
48.实施方案33-46任一项所述的产物,其中一种或多种通式1化合物包括一种通式1化合物。
49.实施方案33-48任一项所述的产物,其中一种或多种通式1化合物选自16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮和16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
50.实施方案49所述的产物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
51.实施方案49产物,其含有约2.5-25体积%乙醇、约1-10体积%苯甲酸苄酯、约10-35体积%聚乙二醇300、约40-65体积%丙二醇以及约2-60mg/mL 16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
52.实施方案51所述的产物,其含有约12.5体积%乙醇、约5体积%苯甲酸苄酯、约25体积%聚乙二醇300、约57.5体积%丙二醇以及约50mg/mL 16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
53.实施方案33-52任一项所述的产物,其还含有一种局部麻醉剂。
54.实施方案52的组合物,其中的局部麻醉剂为普鲁卡因、苯佐卡因或利多卡因。
55.一种通过以下过程产生的产物:将含有一种通式1化合物与一种非水液体赋形剂接触,其中该产物含有少于约3体积%的水,以及其盐、类似物、构型异构体和互变异构体。
56.实施方案55所述的产物,其中该产物含有少于约0.3体积%的水。
57.实施方案53所述的产物,其中该产物储存在低温(约4℃-约8℃)或环境温度下约1小时至约2年。
58.实施方案53所述的产物,其中第一非水液体赋形剂为一种聚乙二醇、一种醇、丙二醇或苯甲酸苄酯。
59.实施方案33-58任一项所述的产物,其中通式1化合物占该产物的约0.01%-约99%重量/体积比。
60.实施方案33-59任一项所述的产物,其中该产物为单元药剂。
61.实施方案60所述的单元药剂包含一种溶液,其含有约0.5-70mg/mL一种或多种通式1化合物。
62.实施方案55-61任一项所述的产物,其中一种或多种通式1化合物选自16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮和16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
63.实施方案62所述的产物,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
64.实施方案33-61任一项所述的产物,其中一种或多种通式1化合物选自在第1组至第21-10-6组命名的系列化合物的一种或多种化合物。
65.一种方法,其包括将实施方案1-64任一项所述的组合物或产物施用给患有病原体感染或恶性肿瘤或免疫抑制或失调疾病的患者,如受抑制的Th1免疫反应或不需要的Th2免疫反应。
66.实施方案65所述的方法,其中病原体感染为DNA病毒感染或RNA病毒感染。
67.实施方案66所述的方法,其中RNA病毒感染为逆转录病毒感染或肝炎病毒感染。
68.实施方案67所述的方法,其中逆转录病毒感染或肝炎病毒感染为HIV、FIV、SIV、SHIV或丙型肝炎病毒感染。
69.实施方案65所述的方法,其中病原体感染为细胞内寄生虫感染。
70.实施方案69所述的方法,其中细胞内寄生虫感染为疟疾感染。
71.实施方案65所述的方法,其中通式1化合物具有以下结构,
其中R7、R8和R9中的一个、两个或三个为-CH2-或-CH=,并且5(如果存在)、8、9、14位的氢原子构型分别为α.α.α.α、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.β.β、α.β.α.β、β.α.α.β、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.β.β、β.α.β.β、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α 。
72.实施方案71所述的方法,其中通式1化合物具有以下结构,
73.实施方案72所述的方法,其中R1、R2和R4分别为-OH、一种C2-C20酯或C1-C20烷氧基,R3为-H,R7、R8和R9的两个或三个为-CH2-。
74.实施方案72或73所述的方法,其中通式1化合物具有以下结构,
75.实施方案71-74任一项所述的方法,其中5(如果存在)、8、9和14位的氢原子构型分别为α.α.β.α或β.α.β.α。
在其它的实施方案中,通式1化合物包括新型化合物,其中的一些在以下的编号的实施方案中描述。
1A.通式1化合物具有以下结构,
其中,R7、R8和R9任意选择,且R7、R8和R9的一个、两个或三个不是-CH2-或-CH=,并且5(如果存在)、8、9和14位的氢原子构型分别为α.α.α.α、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.β.β、α.β.α.β、β.α.α.β、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.β.β、β.α.ββ、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α。
2A.实施方案1A所述的化合物,其中R8为-CH2-、-O-、-S-或-NH-。
3A.实施方案1A或2A所述的化合物,其中R7为-CH2-CHR10-、-O-CHR10-或-O-C(O)-。
4A.实施方案1A、2A或3A所述的化合物,其中不存在R8或R9。
5A.实施方案1A或2A所述的化合物,其中R7和R9分别为-CHR10-、-CH2-、-CH=、-O-、-S-或-NH-,其中R10为-OH、-SH、C1-30有机部分、C1-30酯、C1-10选择性取代的烷基、C1-10选择性取代的烷氧基、C1-10选择性取代的链烯基或C1-10选择性取代的炔基。
6A.实施方案1 A、2A、3A、4A或5A所述的化合物,其中通式1化合物具有以下结构,
其中5(如果存在)、8、9和14位的氢原子分别为α.α.α.α、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.β.β、α.β.α.β、β.α.α.β、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.β.β、β.α.β.β、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α。
7A.实施方案6A所述的化合物,其中R4为-OH、=O、-SH、C1- 30酯或C1-30烷氧基,其中酯或烷氧基部分被一个、二个或多个独立地选择的取代基任意取代,取代基任意选自-F、-Cl、-Br、-I、-O-、=O、-S-、-NH-、-ORPR、-SRPR或-NHRPR。
8A.实施方案6A或7A所述的化合物,其中R1为-OH、=O、-SH、一种C1-30酯或C1-30烷氧基,其中酯或烷氧基部分被一个、二个或多个独立地选择的取代基任意取代,取代基任意选自-F、-Cl、-Br、-I、-O-、=O、-S-、-NH-、-ORPR、-SRPR或-NHRPR。
9A.实施方案1A、2A或3A所述的化合物,其中通式1化合物具有以下结构,
其中5(如果存在)、8、9和14位的氢原子分别为α.α.α.α、α.α.α.β、α.α.β.α、α.β.α.α、β.α.α.α、α.α.β.β、α.β.α.β、β.α.α.β、β.α.β.α、β.β.α.α、α.β.β.α、α.β.β.β、β.α.ββ、β.β.α.β、β.β.β.α或β.β.β.β,典型为α.α.β.α或β.α.β.α。
1OA.实施方案9A所述的化合物,其中R4为-OH、=O、-SH、C1-30酯或C1-30烷氧基,其中酯或烷氧基部分被一个、二个或多个独立地选择的取代基任意取代,取代基任意选自-F、-Cl、-Br、-I、-O-、=O、-S-、-NH-、-ORPR、-SRPR或-NHRPR。
11A.实施方案9A或10A所述的组合物,其中R1为-OH、=O、-SH、一种C1-30酯或C1-30烷氧基,其中酯或烷氧基部分被一个、二个或多个独立地选择的取代基任意取代,取代基任意选自-F、-Cl、-Br、-I、-O-、=O、-S-、-NH-、-ORPR、-SRPR或-NHRPR。
12A.一种含有实施方案1A-11A任一项所述的化合物以及一种适合于人类药用或兽用的赋形剂的组合物,赋形剂如本文所述或引用的参考文献中描述的赋形剂。
13A.一种通过以下过程产生的产物:将实施方案1A-11A任一项所述的化合物与适合于人类药用或兽用的赋形剂接触,赋形剂如本文所述或引用的参考文献中描述的赋形剂。
14A.实施方案1A-13A任一项所述的化合物、组合物或产物用于制备一种药物的用途,该药物用于预防或治疗或改善一种或多种与感染、免疫抑制疾病、恶性肿瘤、癌变前疾病的症状,或用于调节哺乳动物的免疫反应,如增强Th1反应或减弱Th2反应,如本文或引用的参考文献中所述的感染、恶性肿瘤或免疫失调。
15A.实施方案14A所述的用途,其中感染为病毒感染(如HIV、HCV、疱疹病毒、外衣病毒、人类乳头瘤病毒感染或本文所述或引用的参考文献中的其它病毒)、细菌感染(如疏螺旋体属、军团菌属或本文所述或引用的参考文献中的其它细菌)、真菌或酵母感染(如念珠菌属、曲霉菌属或本文所述或引用的参考文献中的其它酵母)或寄生虫感染(如疟疾寄生虫、胃肠线虫、蠕虫、利什曼原虫属、隐孢子虫属、鼠弓形虫、卡氏肺囊虫、血吸虫、粪类圆线虫或本文所述或引用的参考文献中的其它寄生虫)。
16A.实施方案1A-15A所述的化合物、组合物、产物或用途,其中通式1化合物是第1至第42-25-10-6组中命名的任何一种化合物,或通式1化合物为第1至第42-25-10-6组的任何化合物中所述种类的一种。
在其它方面,本发明提供适用于治疗本文所述的疾病的按剂量给药方法。以下实施方案描述某些这种方法。
1B.一种方法,其包括将一种或多种通式1化合物(或一种含有通式1化合物的组合物)间歇式向患者给药,或将通式1化合物(或一种含有通式1化合物的组合物)输送给患者的组织,如本文所述的或命名的任何通式1化合物,包括上述实施方案1-64以及1A-11A中所述的化合物。
2B.实施方案1B所述的方法,其中患者患有感染、过度增殖紊乱、过度增殖疾病、免疫抑制疾病、不需要的免疫反应,或其中患者最近经受或不久将经受外伤、外科手术或医疗治疗,其中医疗治疗不是实施方案1B的方法。
3B.实施方案2B所述的方法,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意结合有关。
4B.实施方案3B所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病得到改善,或不需要的免疫反应(如Th2反应)减少,或其中患者Th1免疫反应得到增强。
5B.实施方案3B所述的方法,其中患者的先天免疫、特异性免疫或二者得到了增强。
6B.实施方案5B所述的方法,其中患者的先天免疫得到增强。
7B.实施方案6B所述的方法,其中患者的特异性免疫得到增强,如其中患者的Th2免疫反应减少或其中患者的Th1免疫反应增强。
8B.实施方案2B所述的方法,其中一种或多种通式1化合物按照下述按剂量给药方案施用给患者,该按剂量给药方案包括以下步骤,
(a)一天至少一次对患者给药通式1化合物至少2天;
(b)不对患者给药通式1化合物至少1天;
(c)一天至少一次对患者给药通式1化合物至少2天;和
(d)选择性地重复步骤(a)、(b)和(c)至少一次或重复步骤(a)、(b)和(c)的变体至少一次。
9B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(c)与步骤(a)包括相同的按剂量给药方案。
10B.实施方案9B所述的方法,其中该按剂量给药方案的步骤(a)包括给药一种或多种通式1化合物每天一次、每天两次、每天三次或每天四次。
11B.实施方案10B所述的方法,其中该按剂量给药方案的步骤(a)包括给药一种或多种通式1化合物每天一次或每天两次。
12B.实施方案10B所述的方法,其中步骤(a)包括给药一种或多种通式1化合物约3-约24天。
13B.实施方案12B所述的方法,其中步骤(a)包括给药一种或多种通式1化合物约4-约12天。
14B.实施方案13B所述的方法,其中步骤(a)包括给药一种或多种通式1化合物约4-约8天。
15B.实施方案14B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约3-约120天。
16B.实施方案15B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约4-约60天。
17B.实施方案16B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约5-约30天。
18B.实施方案16B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约8-约60天。
19B.实施方案15B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)至少重复约4次。
20B.实施方案15B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)重复约5-约25次。
21B.实施方案15B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约2个月。
22B.实施方案15B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约12个月。
23B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约3-约120天。
24B.实施方案23B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约4-约60天。
25B.实施方案24B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约5-约30天。
26B.实施方案23B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药一种或多种通式1化合物约8-约60天。
27B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)至少一次。
28B.实施方案27B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)约3-约25次。
29B.实施方案1B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约2个月。
30B.实施方案29B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约12个月。
31B.实施方案8B-30B任一项所述的方法,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意结合有关。
32B.实施方案31B所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病得到改善,或不需要的免疫反应减少。
33B.实施方案32B所述的方法,其中患者的先天免疫、特异性免疫或二者得到增强。
34B.实施方案33B所述的方法,其中患者的先天免疫得到增强。
35B.实施方案34B所述的方法,其中患者的特异性免疫得到增强。
36B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(c)的按剂量给药方案比步骤(a)短。
37B.实施方案36B所述的方法,其中步骤(a)包括给药通式1化合物7-约24天。
38B.实施方案37B所述的方法,其中步骤(c)包括给药通式1化合物4-约12天。
39B.实施方案38B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约3-约120天。
40B.实施方案39B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约4-约60天。
41B.实施方案40B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约5-约30天。
42B.实施方案36B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)至少一次。
43B.实施方案42B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)约3-约25次。
44B.实施方案36B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约2个月。
45B.实施方案44B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约12个月。
46B.实施方案36B-45B任一项所述的方法,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意组合有关。
47B.实施方案46B所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病得到改善或不需要的免疫反应减少。
48B.实施方案47B所述的方法,其中患者的先天免疫、特异性免疫或二者得到增强。
49B.实施方案48B所述的方法,其中患者的先天免疫得到增强。
50B.实施方案49B所述的方法,其中患者的特异性免疫得到增强。
51B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(c)包括比步骤(a)更长的按剂量给药期。
52B.实施方案51B所述的方法,其中步骤(a)包括给药通式1化合物7-约24天。
53B.实施方案52B所述的方法,其中步骤(c)包括给药通式1化合物4-约12天。
54B.实施方案53B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约3-约120天。
55B.实施方案54B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约4-约60天。
56B.实施方案55B所述的方法,其中步骤(b)包括不给药通式1化合物约5-约30天。
57B.实施方案51B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)至少一次。
58B.实施方案57B所述的方法,其中步骤(d)包括重复步骤(a)、(b)和(c)约3-约25次。
59B.实施方案51B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约2个月。
60B.实施方案59B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)以及重复步骤(a)、(b)和(c)经历的时间至少约12个月。
61B.实施方案51B-60B任一项所述的方法,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意结合有关。
62B.实施方案61B所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病得到改善,或不需要的免疫反应减少。
63B.实施方案62B所述的方法,其中患者的先天免疫、特异性免疫或二者得到增强,或其中患者的Th1免疫反应增强,或患者的Th2免疫反应减弱。
64B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)的变体包括实施第一按剂量给药方案步骤(a)、(b)和(c)一次、二次或三次,然后实施一次或多次第二按剂量给药方案步骤(a’)、(b’)和(c’),其中第二按剂量给药方案的步骤(a’)、(b’)和(c’)的一次或多次比第一按剂量给药方案对应的步骤时间长。
65B.实施方案8B所述的方法,其中步骤(a)、(b)和(c)的变体包括实施第一按剂量给药方案步骤(a)、(b)和(c)一次、二次或三次,然后实施一次或多次第二按剂量给药方案步骤(a’)、(b’)和(c’),其中第二按剂量给药方案的步骤(a’)、(b’)和(c’)的一次或多次比第一按剂量给药方案对应的步骤时间短。
66B.实施方案1B-67B任一项所述的方法,其中一种或多种通式1化合物以气雾剂的形式经口服、肌肉、静脉内、皮下、局部、阴道、直肠、颅骨内、鞘内、真皮内给药或口腔给药。
67B.实施方案66B所述的方法,其中一种或多种通式1化合物主要为存在于固体制剂中的固体形式,或一种或多种通式1化合物主要为存在于液体制剂中的溶剂化物、胶体或悬浮液形式,或一种或多种通式1化合物存在于凝胶、乳膏剂或糊剂中。
68B.实施方案2B-67B任一项所述的方法,其中患者的病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、或免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意结合为(a)DNA病毒感染或RNA病毒感染(HSV、CMV、HBV、HCV、HIV、SHIV、SIV);(b)支原体感染、利斯特菌属感染或分枝杆菌感染;(c)细胞外细菌感染;(d)真菌感染;(e)酵母感染(含珠菌属,隐珠菌属);(d)原生动物(疟疾、利什曼原虫属、隐孢子虫属、弓形体病、肺囊虫);(e)多细胞寄生虫;(f)自体免疫疾病(SLE、RA、糖尿病);(g)癌症(实体癌选自例如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤;弥漫性癌症选自淋巴癌、白血病、结肠癌、肉瘤);(h)癌前期;(i)化疗(阿霉素、顺氯氨铂、丝裂霉素C);(j)放疗;(k)免疫抑制治疗;(1)抗感染药剂治疗;(m)外伤(外科手术或其它);(n)一度、二度和三度烧伤;(o)免疫抑制分子;(p)胃肠炎(过敏性肠炎、克罗恩氏病、慢性腹泄);或(q)(a)到(p)的任意组合。
69B.实施方案68B所述的方法,其中RNA病毒感染为逆转录感染或肝炎病毒感染。
70B.实施方案68B或69B所述的方法,其中一种或多种通式1化合物为一种通式1化合物。
71B.实施方案70B所述的方法,其中一种或多种通式1化合物在组合物中,该组合物包含有,(a)一种或多种非水液体赋形剂,其中该组合物含有少于约3体积%的水;(b)一种包含药学可接受的赋形剂的固体;或(c)一种或多种液体赋形剂,其中该组合物含有多于约3体积%的水。
72B.实施方案68B或71B所述的方法,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮或16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮。
73B.实施方案72B所述的方法,其中通式1化合物为16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
74B.实施方案1B-73B所述的方法,其中通式1化合物不包括一种或多种任意通式1化合物。
75B.一种用于治疗患者的非自主性体重损失、口部损伤、皮肤损伤、机会性感染、腹泄或疲劳的方法,其包括对患者(例如由病毒感染、胃肠感染、化疗、厌食引起的非自主性体重损失)间歇式给药一种或多种通式1化合物。
76B.实施方案75B所述的方法,其中患者患有免疫抑制疾病。
77B.实施方案76B所述的方法,其中患者为人。
78B.实施方案77B所述的方法,其中患者为1天至18岁的人(如1个月至6岁)。
79B.实施方案75B-78B任一项所述的方法,其中与不具有患者的病理状况的典型的可比对照主体相比,患者的特异性免疫保持受损状态。
80B.实施方案79B所述的方法,其中在一个或多个按剂量给药疗程期间(如按剂量给药1周至约2周或更长),患者的CD4细胞数目不会显著增加。
81B.实施方案80B所述的方法,其中患者的CD4细胞数目为约20-约100CD4+细胞/mm3或约20-约75CD4+细胞/mm3。
82B.实施方案1B-81B任一项所述的方法,其中患者患有病原体感染或恶性肿瘤,并且病原体或恶性肿瘤在经过一段时间后不会对通式1化合物产生抗药性,该时间段通常与在用非通式1化合物进行治疗的患者中,至少约50%产生可测抗药性相关。
83B.实施方案82B所述的方法,其中病原体感染为HIV、SIV、SHIV或HCV感染。
84B.实施方案82B或83B所述的方法,其中通式1化合物为以下化合物的一种或多种:16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷、16α-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯、16α-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β,17β-二羟基-5α-雄烯、16β-溴-3β,7β,17β-三羟基-5α-雄烷、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β-羟基-5α-雄烯-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烷-17-酮、16β-溴-3β,7β-二羟基-5α-雄烯-17-酮或其一种生理上可接受的酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、氨基酸结合物或其肽结合物。
85B.实施方案84B所述的方法,其中通式1化合物为16α-溴-3 β-羟基-5α-雄烷-17-酮或一种生理上可接受的酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、氨基酸结合物或其肽结合物。
86B.实施方案1B-85B任一项所述的方法,其中通式1化合物为第1至第42-25-10-6组中命名的所有化合物中的一种,或通式1化合物为第1至第42-25-10-6组的任意化合物的所述种类中的一种。
在其它实施方案中,本发明提供一种调节患者的免疫细胞或免疫反应的方法。以下编号的实施方案描述某些这种方法。
1C.一种调节患者的先天免疫或增强患者的Th1免疫反应或减少患者的Th2免疫反应的方法,其包括对患者给药通式1化合物,包括本文所述或公开的所有通式1化合物,包括在上述实施方案1-64和1A-11A中所述的化合物。
2C.实施方案1C的方法,其中患者的先天免疫得到了增强。
3C.实施方案1C或2C所述的方法,其中患者患有先天免疫抑制疾病、受抑制的Th1免疫反应或不需要的Th2免疫反应。
4C.实施方案3C所述的方法,其中先天免疫抑制、受抑制的Th1免疫反应或不需要的Th2反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在或上述的任意结合有关。
5C.实施方案1C-3C任一项所述的方法,其中患者的Th1免疫反应得到了增强。
6C.实施方案1C所述的方法,其中患者的Th2免疫反应减少了。
7C.实施方案6C所述的方法,其中患者所患的疾病包括不需要的免疫反应(如自体免疫疾病、SLE、糖尿病)。
9C.实施方案6C或7C所述的方法,其中患者为脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物或人。
10C.实施方案9C所述的方法,其中脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物或人的特异性免疫调节为(i)在体内或体外对病毒感染或恶性肿瘤细胞的增强的CTL或Th1反应,(ii)通过树突细胞或树突细胞前体增强抗原表达或生物活性,或(iii)增强对受病毒感染的或恶性肿瘤细胞的杀伤力。
11C.实施方案10C所述的方法,其中脊椎动物为人,病毒感染为HIV感染,CTL或Th1反应包括对于一种或多种HIV的gag蛋白或HIV的gp120增强的反应。
12C.实施方案1C、4C、10C或11C所述的方法,其中患者的Th1细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)、NK细胞、外围血液淋巴细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞或纤维细胞是被激活的,该激活由相对于未处理的对照物,主体增强的3H-胸苷吸收,或在循环中的细胞型数量的增加或从一个组织或分隔部分(如皮肤)到另一个组织或分隔部分(例如血液、淋巴结、脾脏或胸腺)的细胞类型的明显的运动而度量。
13C.实施方案1C、4C、10C、11C或12C所述的方法,其中通式1化合物调节患者的NK细胞一种或多种基因的转录,噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞或纤维细胞被激活(例如通过提高的蛋白激酶C的活性或通过类固醇受体或孤核激素受体的生物活性的调节而测量)。
14C.实施方案 lC所述的方法,其中通式1化合物增强患者的NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞或纤维细胞的一种或多种中的溶酶体运动。
15C.实施方案1C所述的方法,其中通式1化合物增强患者的NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、树突细胞或纤维细胞(如PKCα、PKCβ、PKCγ和PKCζ)的一种或多种中的蛋白激酶C的活性。
16C.一种含有部分纯化或纯化的复合体的组合物,该复合体含有一种通式1化合物和一种类固醇受体、一种血清类固醇结合蛋白(例如人类血清白蛋白、α1-酸糖蛋白、性激素结合球蛋白、睾酮结合球蛋白、皮质类固醇结合球蛋白、雄性激素结合蛋白(大鼠))或一种结合配偶体(如复合试剂、脂质体、抗体)。
17C.一种通过以下过程产生的产物:将实施方案16C中部分纯化或纯化的组合物与一种或多种无菌容器、一种或多种注射器、一种或多种药学可接受的赋形剂(如上述设计说明书中定义的赋形剂,包括糖、乳糖、蔗糖、填充剂、润滑剂、粘合剂、或本文引用的参考文献中命名的任何赋形剂)、一种或多种细胞、一种或多种组织、血浆或血液接触。
18C.实施方案1C-17C所述的方法,其中患者患有感染、过度增殖紊乱、过度增殖疾病、免疫抑制疾病、不需要的免疫反应,或其中患者最近经历了或近期内将要经历创伤、外科手术或医药治疗,其中医药治疗不是实施方案1C所述的方法。
19C.实施方案18C所述的方法,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫、多细胞寄生虫、自体免疫疾病、癌症、癌前期、化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、创伤、烧伤、免疫抑制分子的存在、胃肠炎或上述的任意结合有关。
20C.实施方案19C所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病得到改善或不需要的免疫反应减少。
21C.实施方案19C所述的方法,其中患者的免疫抑制疾病与病毒感染有关。
22C.实施方案21C所述的方法,其中病毒感染包括DNA病毒或RNA病毒感染。
23C.实施方案22C所述的方法,其中RNA病毒感染包括逆转录感染或肝炎病毒感染。
24C.实施方案18C-23C所述的方法,其中患者患有慢性腹泄、非自主性体重损失(通常至少约5%或以上)、恶病质(通常至少大约5%或以上)、肌肉萎缩、一种或多种口部损伤(通常至少约1cm2)、一种或多种生殖器损伤(通常至少约1cm2)、皮肤损伤(通常至少约1cm2)或与AIDS有关的机会性感染的一种或多种。
25C.一种方法(例如测定通式1化合物的生物活性或调节细胞或不含细胞的转录系统中的转录),其包括:(a)将通式1化合物与一个细胞或一个细胞群在体外或体内接触;(b)测定以下一项或多项:(i)结合配偶体与通式1化合物的复合体,(ii)细胞或细胞群的增殖,(iii)细胞或细胞群的分化,(iv)蛋白质激酶C的活性,(v)蛋白质激酶C底物磷酸化的水平,(vi)一个或多个靶基因的转录,(vii)类固醇如糖皮质激素的细胞反应的抑制或增强,(viii)类固醇(诱导的转录的抑制)如糖皮质激素、性类固醇,(ix)逆转录病毒(如HIV、SIV、FIV或SHIV)LTR促进的转录的抑制,或(x)在体内血液循环中免疫细胞群数量的调节(如哺乳动物,例如灵长类或人类体内的循环的外周血淋巴细胞);和(c)任意选择地将步骤(b)中得到的结果与一种合适的对照进行比较。
26C.实施方案25C所述的方法,其中结合配偶体为类固醇受体、转录因子或类固醇激素总科的孤独受体。
27C.实施方案25C所述的方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫有关的复制或细胞病理效应进行调节的活性。
28C.实施方案25C所述的方法,其中所测定的生物活性是通式1化合物对与逆转录病毒、肝炎病毒或原生寄生虫有关的复制和细胞病理效应进行调节的活性,或所测定的生物活性是一个细胞或包含NK细胞、噬菌细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、纤维细胞、转化细胞、感染病毒的细胞、感染细菌的细胞或感染寄生虫的细胞的细胞群的新陈代谢(通过3H胸苷吸收进行分析)。
29C.实施方案25C所述的方法,其中靶基因是病毒基因、细菌基因、寄生虫基因、与癌症有关的基因。
30C.实施方案29C所述的方法,其中病毒基因为聚合酶基因、逆转录基因、包膜基因、蛋白酶基因或与病毒核酸复制有关的基因或病毒结构基因。
31C.实施方案30C所述的方法,其中聚合酶基因编码DNA聚合酶或编码RNA聚合酶。
32C.实施方案30C所述的方法,其中逆转录基因编码人类、灵长类、鸟类或猫科动物逆转录病毒的逆转录酶。
33C.一种方法,其包括将通式1化合物施用给患有逆转录病毒感染且CD4数为550或更少的人或灵长类动物。
34C.实施方案33C所述的方法,其中人的CD4数目为约20-约100或约20-约80。
35C.实施方案33C所述的方法,其中人的CD4数目为约30-约150。
36C.实施方案33C所述的方法,其中人的CD4数目为约500或更少,约450或更少,约400或更少,约350或更少,约300或更少,约250或更少,约200或更少,约150或更少,约100或更少,约50或更少,或约25或更少或者约20或更少。
37C.实施方案33C-36C所述的方法,其中通式1化合物存在于含有一种或多种非水液体赋形剂以及少于约3体积%水的组合物中,或存在于本说明书或任何上述编号的实施方案中所公开的任何制剂中。
38C.实施方案33C-37C所述的方法,其中通式1化合物按照本说明书中或任何上述编号的实施方案中所公开的一种间歇式按剂量给药方案给药。
39C.实施方案30C-45C所述的方法,其中人同时感染了丙型肝为病毒、乙型肝炎病毒、HSV-1、HSV-2、疟疾寄生虫、肺囊虫寄生虫或隐孢子虫寄生虫。
40C.实施方案46C所述的方法,其中人的HCV水平降低。
41C.一种方法,其包括将通式1化合物施用给患者或组织培养中的神经系统细胞,因此通式1化合物结合到与神经系统有关的细胞受体上,并且(1)引发神经系统或组织培养的细胞的生物反应和/或(2)引发传递到远的部位或细胞的神经元反应,其中该方法可任意用于筛选通式1化合物的生物活性,治疗患者的病理疾病(如病原体感染如病毒(HIV)、恶性肿瘤或神经系统紊乱如与AIDS有关的痴呆、老年性痴呆、帕金森氏病、多发性硬化),或测定通式1化合物对患者或神经系统或组织培养中的细胞的生物有效度或新陈代谢,其中新陈代谢可以任意通过将一种通式1化合物的生物效应与对照化合物比较进行测定,对照化合物可以与通式1化合物不同。
42C.实施方案41C所述的方法,其中与神经系统细胞有关的受体是神经传递系受体(如γ-氨基丁酸受体如A型、NMDA受体)和/或类固醇受体(如雄性激素受体、雌性激素受体)。
43C.实施方案41C或42C所述的方法,其中神经系统细胞是神经元、星形胶质细胞和/或神经胶质细胞。
44C.实施方案41C、42C或43C所述的方法,其中神经系统细胞或组织培养细胞的生物反应为基因转录(如神经传递素、血管升压素、热激蛋白)增加或减少、蛋白质(如血管升压素)分泌增加或减少、氧化应力损害减少、氧化氮释放增强和/或神经突增长加强。
45C.实施方案1C-44C任一项所述的方法,其中通式1化合物是选自通式1化合物的任意一种或多种或第1组至第21-10-6组命名的化合物中的一种或多种。
46C.一种方法,其用于(a)通过患者的免疫细胞调节至少一种免疫细胞抗原的表达,其中免疫细胞抗原选自CD3、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD25、CD38、CD56、CD62L、CD69、CD45RA、CD45RO、CD123、HLA-DR、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNFα、IGF1和γIFN,或(b)激活患者的CD8+T细胞或CD8-T细胞,其中激活包括至少暂时增强T细胞对CD25或CD69的表达,或(c)增加患者CD16+细胞(如CD8+、CD16+、CD38+或细胞CD8-、CD16+、CD38+)内被CD8+或CD8-淋巴因子激活的杀伤(淋巴)细胞的比例,或(d)增加以下细胞的比例:(i)CD8-、CD16+天然杀伤细胞,(ii)CD8+、CD16+天然杀伤细胞或(iii)调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8-、CD16+细胞,或(iv)调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8+、CD16+细胞,或(e)增加患者的循环白血细胞(如Lin-、HLA-DR+、CD123+或Lin-、HLA-DR+、CD11c+细胞)中的树突细胞前体的比例,或(f)增加患者的循环的白血细胞中CD45RA+T细胞或CD45+、RO+T细胞的比例,或(g)改变(增加或减少)患者的循环的白血细胞中CD62L+T细胞的比例或相对数目,或(h)增加患者的循环的CD8+或CD4+T细胞中表达CD62L的CD8+或CD4+T细胞的比例,或(i)减少患者的循环的CD8+或CD4+T细胞中表达CD62L的CD8+或CD4+T细胞的比例,或(j)增加患者的循环的白血细胞中HLA-DR+、CD8+、CD38+细胞的比例,或(k)减少由患者的白血细胞所表达的或存在于患者的白血细胞或患者的血浆中的(或患者的白细胞在体外受刺激后所表达的)IL-4或IL-10的水平,或(1)至少暂时增加存在于患者的白血细胞或患者的血浆中的树突细胞前体或树突细胞的数目,或(m)增强CD4+T细胞表达IL-2、IL-12或γIFN的能力,该方法包括将通式1化合物和药学可接受的赋形剂施用给患者。
47C.实施方案46C所述的方法,其中通式1化合物具有以下结构,
其中,R1为-OH或可以在生理条件下水解转化为-OH的基团(如C1-30酯),两者都可以处于α-或β-构型;R2为处于α-或β-构型的氢或者当5、6位置为双键时无R2;R3为-H或-Br,两者都可以处于α-或β-构型;R4为-OH或可以在生理条件下水解转化为-OH的基团(如C1-30酯),两者都可以处于α-或β-构型,或R4为=O并且在同一个碳原子上不存在键合的氢原子;R4A为R4、-C(O)-CH3或-C(O)-(CH2)1-6-CH3;R5为-H或-OH或可以在生理条件下水解转化为-OH的基团(如C1-30酯),任一者都可以处于α-或β-构型,或R5为=O并且在同一个碳原子上不存在键合的氢原子;在5-6位的点划线为一个任意的双键,或其中通式1化合物具有本文命名或描述的任何通式1化合物中所示的结构,包括上述实施方案1-64和1A-11A所述的化合物。
48C.实施方案46C或47C所述的方法,其中每天将通式1化合物施用给患者,时间从一天至约15天,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多天。
49C.实施方案48C所述的方法,其中在对患者给药通式1化合物至少约4-7天的最后,如至少4、5、6、7或更多天,可检测到免疫细胞抗原的表达受到了调节。
50C.实施方案48C或49C所述的方法,其中在对患者给药通式1化合物至少约8-90天的最后,例如至少约8、10、12、15、20、25、28、30、35、40、42、45、49、50、55、56、60、63、65、70、75、77、80、84、85、90、91、95、98、100或更多天,可检测到免疫细胞抗原的表达。
51C.实施方案46C-51C任一项所述的方法,其中患者患有免疫抑制疾病、病原体感染或与Th1免疫反应不足或Th2免疫反应过度有关的疾病。
52C.实施方案51C所述的方法,其中病原体感染为病毒感染、细菌感染、酵母感染、真菌感染或类病毒感染,如其中病原体感染为病毒感染如DNA病毒感染或RNA病毒感染(如嗜肝DNA病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、黄病毒、披膜病毒、弹状病毒、微小RNA病毒、布尼亚病毒、呼肠孤病毒、正粘病毒或副粘病毒,如HIV1、HIV2、SIV、SHIV或本文所述或引用的参考文献中所述的其它病毒所引起的感染)。
53C.实施方案52C所述的方法,其中患者患有与病原体感染有关或由病原体感染引起的免疫抑制疾病。
54C.实施方案46C-53C任一项所述的方法,其中患者为哺乳动物、人、灵长类动物或啮齿类动物。
55C.实施方案46C-54C任一项所述的方法,其中通过非肠道(例如通过静脉内、皮下、肌肉或髓内注射)、局部、口服、舌下或口腔对患者给药约0.05mg/kg/天至约20mg/kg/天,例如约0.1mg/kg/天、约0.2mg/kg/天、约0.5mg/kg/天、约1.0mg/kg/天、约1.5mg/kg/天、约2mg/kg/天、约2.5mg/kg/天、约3.0mg/kg/天、约4mg/kg/天或约6mg/kg/天,即约0.1-10mg/kg/天,典型约0.2-7mg/kg/天。
56C.实施方案55C所述的方法,其中患者同时服用一种或多种第二治疗药剂以治疗病原体感染,如病毒感染如HIV-1感染、HIV-2感染、HAV感染、HBV感染、HCV感染、埃巴病毒感染、HSV-1感染、HSV-2感染、人类疱疹病毒6感染、人类疱疹病毒7感染、人类疱疹病毒8感染,细菌或寄生虫感染如疟疾感染、利什曼病、隐孢子虫病、弓形体病、支原体感染、毛滴虫感染、衣原体感染、肺囊虫感染、沙门氏菌感染、利斯特菌感染、大肠杆菌感染、耶尔森菌感染、弧菌感染、假单胞杆菌感染、分枝杆菌感染、嗜血杆菌感染、奈瑟球菌感染、葡萄球菌感染或链球菌感染。
57C.实施方案56C所述的方法,其中一种或多种第二治疗药剂为蛋白酶抑制剂、逆转录抑制剂、病毒、细菌或寄生虫的DNA或RNA聚合酶抑制剂、抗菌抗生素或抗真菌药剂,如AZT、ddI、ddC、D4T、3TC、病毒(如HIV)融合抑制剂、羟基脲、那非那韦、沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、氯喹、氯喹类似物、两性霉素B、氟康唑、克霉唑、异烟肼、氨苯砜、利福平、环丝氨酸、红霉素、四环素、抗生素、万古霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、氟喹酮(flurorquinolone)(如卷须霉素、氟哌酸)、头孢霉素抗生素、β-内酰胺抗生素或氨基糖苷类抗生素(如链霉素、卡那霉素、妥布拉霉素)。
58C.实施方案46C-57C所述的方法,其中患者为人、灵长类动物、犬科动物、猫科动物或啮齿类动物。
59C.一种组合物,其含有有效量的免疫细胞子集调节通式1化合物以及药学可接受的载体。
60C.实施方案59C所述的组合物,其中免疫细胞子集为(1)CD8+T细胞,(2)CD4+T细胞,(3)CD8+淋巴因子激活的杀伤细胞,(4)CD8-淋巴因子激活的杀伤细胞,(5)CD8-、CD16+天然杀伤细胞,(6)CD8+、CD16+天然杀伤细胞,(7)调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8-、CD16+细胞,(8)调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8+、CD16+细胞,(9)树突细胞或树突细胞前体,(10)CD45RA+T细胞,(11)CD45RO+T细胞,(12)CD45RA+、CD45RO+T细胞,(13)CD8+、CD62LT细胞,(14)CD4+、CD62L+T细胞或(15)HLA-DR+、CD8+、CD38+T细胞。
61C.一种检测与对患者给药通式1化合物有关的生物反应的方法,其包括(1)从患者获得样品,(2)将通式1化合物施用给患者以得到受处理的患者,(3)从受到处理的患者取得第二样品,(4)在获得样品的24小时内,分析该样品以得到检测生物反应的对照信息,(5)在获得第二样品的24小时内,分析第二样品是否存在生物反应以获得实验信息,和(6)任意将对照信息与实验信息进行比较以检测生物反应的存在、不存在、相对强度或绝对强度。
62C.实施方案61C所述的方法,其中通式1化合物还含有药学可接受的载体。
63C.实施方案61C或62C所述的方法,其中与对患者给药通式1化合物有关的生物反应为调节细胞表面抗原的表达、免疫细胞子集中细胞的绝对数量或相对数量增加、免疫细胞子集中细胞的绝对数量或相对数量减少或免疫细胞子集中细胞的绝对数量或相对数量没有变化。
64C.实施方案63C所述的方法,其中免疫细胞子集为CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+淋巴因子激活的杀伤细胞、CD8-和CD16+天然杀伤细胞、循环树突细胞前体、循环树突细胞、组织树突细胞前体、组织树突细胞、CD8+淋巴激活的杀伤细胞、CD8-淋巴因子激活的杀伤细胞、CD8-和CD16+天然杀伤细胞、CD8+和CD16+天然杀伤细胞、调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8-、CD16+细胞、调节依赖抗体的(细胞介导)细胞毒性的CD8+、CD16+细胞、CD45RA+T细胞、CD45RA+、CD45RO+T细胞、CD45RO+T细胞、CD8+、CD62L T细胞、CD4+、CD62L+T细胞或HLA-DR+、CD8+、CD38+T细胞、单核细胞或巨噬细胞。
65C.实施方案64C所述的方法,其中生物反应至少暂时调节免疫细胞抗原或免疫辅助细胞抗原(如在内皮细胞表面的粘着分子或在T细胞或B细胞表面的细胞因子受体)。
66C.实施方案65C所述的方法,其中免疫细胞抗原为蛋白质、糖蛋白或通常或仅仅由淋巴样细胞(淋巴细胞或白血细胞或其前体,如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、LAK细胞、NK细胞、树突细胞)表达的细胞表面抗原。
67C.实施方案65C所述的方法,其中免疫细胞抗原为CD分子、白介素或细胞因子,任意选自CD16、CD25、CD38、CD62L、CD69、CD45RA、CD45RO、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNFα、IGF1和γIFN。
68C.实施方案61C-67C任一项所述的方法,其中患者为人、灵长类动物、犬科动物、猫科动物或啮齿类动物。
69C.一种改变患者体内Th1-Th2平衡的方法,其包括将有效量的通式1化合物施用给患者,由此能够检测到患者的IL-4或IL-10的表达或分泌受到了调节。
70C.实施方案30C所述的方法,其中患者的IL-4或IL-10的表达或分泌减少并且可以检测到患者体内对感染或免疫抑制疾病产生的Th1免疫反应的Th1-Th2平衡增强。
71C.实施方案1C-70C任一项所述的方法,其中通式1化合物为第1至第42-25-10-6组命名的任何化合物,或通式1化合物为第1至第42-25-10-6组的任何化合物中所述的任何种类。
读罢这些实施方案,那么对这些实施方案、权利要求以及本公开的其余的部分变化或修改对于熟悉本领域的技术人员来讲都是显而易见的。这种变化和修改都在本发明的范围和精神之内。本文所有引用的文献以其全文引入作为参考。本文所引用的所有文献在此专门引入作为参考。
实施例 以下的实施例进一步说明本发明,而不以任何方式限制本发明。
实施例1.BrEA制剂如下在25%聚乙二醇300、12.5%无水乙醇、5%苯甲酸苄酯和57.5%丙二醇中制备两批非水溶液BrEA制剂,其中BrEA的浓度为50mg/mL。BrEA从Procyte公司获得。其余的赋形剂如下所示。
供应商
赋形剂 规格 批号 终产品浓度
丙二醇 USP 阿尔科化学公司(Arco Chemical) 57.5体积%
HOC-61220-01104
聚乙二醇 NF 联合碳化公司(Union Carbide) 25体积%
300 695752
无水乙醇 USP 麦克尔米科蒸馏(McCormick Distilling) 12.5体积%
97K10
苯甲酸苄酯USP 光谱制药(Spectrum Pharmaceuticals) 5体积%
MG025
该制剂的制备是通过将BrEA悬浮在聚乙二醇300中,并且按顺序加入丙二醇、苯甲酸苄酯和无水乙醇以形成溶液,另外加入丙二醇将溶液稀释到最终需要的体积。过程如下所述。
将计量好的聚乙二醇300加入到混合容器中,然后一边搅拌,一边把计量的BrEA加入容器中,至少搅拌5分钟形成均匀的乳状液体,将丙二醇加入容器,至少搅拌5分钟以形成均匀的悬浮液。将计量的苯甲酸苄酯加入容器,搅拌大约5分钟以形成半透明悬浮液。将无水乙醇加入容器,搅拌大约5分钟以形成清澈的无色溶液。然后加入丙二醇以获得最终需要的制剂,并且搅拌约5分钟。将该药物溶液转移到分装装置中,在每小瓶中加入1.2mL。在氮气压力下,将溶液连续通过两个0.2μm聚偏氟乙烯过滤器过滤至2cc琥珀色玻璃小瓶中。小瓶用涂有聚四氟乙烯的丁基橡胶塞盖住小瓶,卷边密封。产品小瓶中使用的材料如下所示。
材料
来源
产品代码
描 述
小瓶 Wheaton 2702-B51BA 管状小瓶,2mL/13mm,玻璃,
类型1琥珀色
塞子 Omniflex V9239 13mm,涂有聚四氟乙烯的丁基橡胶塞
FM257/2
密封 West 4107 翻转密封,13mm淡灰色桥接
产品规格经以下一种或多种分析检测。
检测 | 规格 | 方法 |
物理检测 | 清澈无色溶液,带有淡淡的醇的气味 | |
体积回收率 | NLT*1.0mL | USP23<1> |
比重 | TBD | USP23<841> |
活性组分分析 | 标示的90-110% | HPLC |
无菌 | 无菌 | USP23<71> |
内毒素 | <0.1 EU/mg | USP23<85> |
颗粒物质 | ≥10μm NMT**6000/cnt≥25μm NMT 600/cnt | USP23<788> |
*NLT—不小于
**NMT—不大于
批次分析
检测 | 规格 | 第1批 | 第2批 |
物理检测 | 清澈无色溶液,带有淡淡的醇的气味 | 正 | 正 |
体积回收率 | NLT 1.0mL | 1.15mL | -- |
比重 | TBD | 1.0411 | -- |
活性组分分析 | 标示的90-110% | 103.10% | 104.25% |
无菌 | 无菌 | 无菌 | -- |
内毒素 | <0.1 EU/mg | 0.024EU/mg | -- |
颗粒物质 | ≥10μm NMT 6000/cnt≥25μm NMT 600/cnt | 2615 | -- |
实施例2.BrEA药物物质和BrEA制剂的稳定性 使用BrEA以及来自实施例1的制剂进行6个月期的加速稳定性研究。在1、2、3、4、5和6个月时间点时取样,并与实施例1所列的规格进行比较。用第1批和第2批的BrEA制剂进行实时稳定性(25℃,60%相对湿度)研究,取样时间点为3、6、9、12、1 8、24和36月。在40℃和75%相对湿度下储存3个月后,BrEA效力的分析结果至少为标签值的95%。从稳定性测试得到的结果表明升高第1批和第2批制剂的温度和湿度时,BrEA至少可以稳定3个月。
实施例3.灵长类动物间歇式按剂量给药方案 用实施例1所述的BrEA制剂治疗感染有SHIV229逆转录病毒的猪尾短尾猿猴。SHIV229是包含HIV和SIV序列的重组逆转录病毒,J.Thompson等,摘要#75,第16届非人类灵长类模型的爱滋病年会,1998年10月7-10日,亚特兰大,佐治亚州,M.Agy等,摘要#67,第16届非人类灵长类模型的爱滋病年会,1998年10月7-10日,亚特兰大,佐治亚州。在猴子身上建立进行性感染,在感染后约180-210天时未受处理的受到感染的动物会出现严重的末期疾病症状。四只猪尾短尾猿猴(每组2只)接受皮下注射制剂1或2mg/kg体重连续10天(方案1)。在第8周,4只猴子中的3只再次治疗,对2只未受治疗的猴子隔日用5mg/kg制剂治疗20天(方案2)。在第19周,所有接受治疗的猴子都开始用每天一次3mg/kgBrEA制剂的第3疗程连续处置10天,每次隔4周重复所有3个疗程(方案3)。
感染有1-100个TCID50单位的动物通过静脉内或直肠内给药。在按剂量给药开始之前,第一组动物的病毒滴定度范围为106-108。所有的动物都显示血浆病毒SHIV RNA的初期上升。2-3周后,滴定度开始下降,并且4只动物中的3只经过初步治疗后4-5周时,其平均病毒滴定度在基线以下,为0.76log,显示对治疗作出了反应。到第8周时,所有的动物的滴定度都返回到基线值。血糖浓度下降显著,碱性磷酸酶水平上升,而SGOT/GGT值向正常值的最高端发展。没有观察到所监测参数的其他明显变化。在第一方案结束时,所有猴子的CD4水平仍然低于100细胞/mm3。
第二处置方案(方案2)的5只猴子中的3只对BrEA治疗的反应比以更低的剂量处置所观察到的反应水平程度深、持续时间长。在有反应的猴子中,低于基线平均下降1.47log。经过第一方案后没有反应的猴子当在第二方案中给药BrEA制剂时出现反应。两只没有出现反应,一只来自受治疗组,一只来自无经验处理组。第三处置(方案3)正在进行,动物正受到监测。
该研究中的猴子抢救自一次传染性研究,并且受研究的第一组的4只猴子(方案1)由于与疾病有关的原因情况已经开始恶化,人们认为它们在实验开始后只能活几周。一只猴子在第356天死于对获得血液分析样品期间使用的麻醉剂的毒性反应。在应用这些药物时,其余的猴子受到多个轮次的治疗,看起来处于较好的临床健康状态。从感染开始,它们存活了超过380天。通过间歇式按剂量给药BrEA制剂进行治疗。三只对照猴子感染了1-10,000个SHIV229TCID50单位,并且没有接受治疗。这些猴子被作为非治疗支持存活研究。感染有SHIV229的猪尾短尾猿猴的平均死亡时间为193天。受到治疗的猴子保持良好的临床健康状态超过350天,并且其CD4水平低于20细胞/mm3,且除了一只猴子出现轻度贫血外没有机会性感染或与疾病有关的症状。
这些结果显示感染有具有极强的致病性的SHIV逆转录病毒的灵长类动物表现出完全出乎意料的疗效反应。结果表明该治疗方案中的大部分患者不仅相对于未处理的对照动物存活期延长,而且与逆转录感染有关的临床症状也大大地得到改善,尽管事实上其CD4数目仍然很低,即初期低于约100CD4细胞/mm3,在治疗方案的后期低于约20CD4细胞/mm3。到此为止,这些结果即(1)大部分具有低CD4水平(低于约150细胞/mm3,特别低于约75细胞/mm3)的患者具有良好的临床健康状态,和(2)尽管间歇式按剂量给药期延长,临床上没有对治疗的病毒抗药性信号,在灵长类、人类或其它动物身上都没有出现。SHIV229模型在猪尾短尾猿身上致病力极强。在这些模型身上几个星期出现的现象在感染有HIV的人类身上通常需要几年。人们没有料到治疗这些感染有病毒的猴子并且使用通常使用的抗逆转录病毒药剂如AZT、3TC或蛋白酶抑制剂治疗,会显著影响疾病发展的过程。这些动物的临床状况继续改善,如每只动物的体重增加约8-15%。这些结果说明使用间歇式按剂量给药方案进行治疗非常有效,尽管患者的特异性免疫仍然有明显的损害,如低CD4数目所表明的结果。使用免疫刺激剂如IL-2可以增加CD4数目,或根据治疗方案、给药的持续时间或患者的最初医学状况,在某些患者身上例如人它们可能会自然增加。这里显示的抗病毒效果看起来至少部分是通过增强患者的免疫反应起作用的,如通过噬菌细胞(NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞)增强免疫反应,和/或增强任何其余的特异性免疫反应,即使有的话,患者能够集合这些特异性免疫反应。
实施例4.人类治疗方案 使用含BrEA或其它通式1化合物的非水溶液制剂进行剂量增加的临床实验,这些制剂按照实施例1制备。病人为无处理经验或有处理经验,每个剂量水平检测3-10个病人。最初的剂量经非肠道如s.c.或i.m.给药25mgBrEA或其他通式1化合物。该剂量一天一次给药或一天两次给药1-12天,然后不给药至少7天(如7-90天)。随后一天一次按剂量给药1-12天,然后不给药至少7天(如7-90天)。受测的其它剂量水平为20mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg和300mg,每个剂量作为单一剂量一天一次给药,或以细分剂量一天分两次、三次或更多次给药。使用与剂量增加实验相同的给药方案进行有效性剂量实验,或有效性剂量实验可以选择隔日给药一次或两次3-17天,然后不给药7-90天,然后重复隔日给药一次或两次3-17天。使用从剂量增加实验获得的最佳剂量如约10-200mg/天通式1化合物,无限期重复该方案(如至少约3-18个月)。
实施例5.动物药理学研究 使用BrEA的口服以及皮下制剂进行非临床研究。大鼠口服给药溶于不同赋形剂中的14C BrEA以确定该药物在血液和不同器官中的水平。这些初步的药物动力学研究结果表明通过口服给药,BrEA的吸收率为约0.1-15%,经粪便排泄至少约80%。
实施例1的非水溶液BrEA制剂以单一皮下剂量施用给大鼠。在给药的24小时内,超过90%的药物离开注射位置,并且在给药后8-12小时时,血浆中的浓度达到最大,约注射剂量的1.2%。该药物在血浆中的循环半衰期为约12小时。该药物在任何主要的器官内都不会聚集到一显著量,并且主要通过尿排泄。
使用实施例1的制剂将BrEA经皮下施用给大鼠。在给药的24小时内,大约90%的药物离开注射位置,并且在注射后1个小时时,血浆中浓度达到最大,约为注射剂量的0.2%。从血浆中排出是两相的,其半衰期分别为约12和72小时。在任何主要器官内,BrEA都不会积累到显著量,并且主要通过粪便排泄。也在猕猴身上进行实施例1制剂的研究以确定血浆药物动力学。
血浆中14C BrEA的药物动力学分析在两只雌性猕猴身上进行。使用剂量1mg/kg的示踪化合物(16α-溴-3β-羟基-5α-[4-14C]-雄烷-17-酮[50mCi/mmole])在肩胛骨区域以体积1mL/kg皮下注射。BrEA在25%聚乙二醇300、12.5%无水乙醇、5%苯甲酸苄酯以及适量的丙二醇中制成制剂。每只动物注射40μCi。在0、0.5、1、2、4、8和24小时时取血液样品以测定14C的行为。在8小时内血浆中的放射性上升至接近峰浓度并且直到24小时研究结束大约保持在相同的水平。
在新西兰白兔身上进行14C BrEA的药物动力学分析。20μCi 14C标记的16α-溴-3β-羟基-5α-[4-14C]-雄烷-17-酮[50mCi/mmole]加上1mg/kg未标记的BrEA施用给三只新西兰白兔的每一只,在肩胛骨区域皮下注射体积为1mL/kg。该药物在25%聚乙二醇300、12.5%无水乙醇、5%苯甲酸苄酯和适量的丙二醇中制成制剂。在0.5、1、2、4、8、12、24小时时对所有三只动物取血液样品,并且在48小时时对两只动物取样。给药后24小时和48小时,分别杀死一只和两只动物,并且收集以下的器官/组织:脑、心脏、肾、肝、肺、骨胳肌、脾以及注射部位的肌肉和皮肤。除了这些器官和组织外,尿和粪便以及笼子冲洗物也收集起来。在以上列举的任何器官中,BrEA都没有积累到显著量。在所有器官中,观察到肝脏中具有最大量的药物,在24小时和48小时,分别含有大约注射剂量的0.8%和0.12%(平均0.13%)。
器官中的药物浓度(兔)
器官或组织 动物201/24小时 动物301/48小时 动物302/48小时 | |||
脑 | 0.005 | 0.002 | 0 |
心脏 | 0.008 | 0.003 | 0.002 |
肾 | 0.155 | 0.055 | 0.050 |
肝 | 0.76 | 0.145 | 0.125 |
肺 | 0.029 | 0.019 | 0.011 |
脾 | 0.002 | 0 | 0 |
骨胳肌(样品质量以克计) | 0.002(3.8g) | 0(6g) | 0(5g) |
皮肤(样品质量以克计) | 0.008(8g) | 0.002(6g) | 0.004(9g) |
通过用全血中的浓度乘以动物的假定的血液体积200mL计算给药剂量在全部血液中的平均浓度。大约在8小时,血液中药物的量达到极值,并且在48小时仍然存在明显的小量药物。在全血中BrEA的量始终比血浆中低,表明药物没有被血红细胞吸收到明显量。
通过口服给药不同制剂进行体内实验以测定BrEA的生物利用度。BrEA是(1)溶于大豆油、维生素E油、维生素E与Cremophore的混合物中或(2)BrEA微粉化并与或不与表面活性剂结合。这些制剂将在下文描述。这些制剂通过口服给药给大鼠,并测定血液、肝、脾、肾和淋巴结中的BrEA的浓度。在使用微粉化BrEA进行的研究中,估计大脑的药物吸收情况。当BrEA溶于维生素E和大豆油以及维生素E与Cremophore的混合物中时,收集24小时的尿和粪便。此项研究得到的数据表明BrEA进入淋巴中,但从其它器官中迅速排出。给药24小时后回收在粪便中的14C放射性的量为78-83%。以下对每个实验作简要说明,结果列于表6中。
添加有14C标记的BrEA的BrEA(5mg在1.0mL大豆油或维生素E油中)经胃内给药给大鼠。用50μL乙醇促进BrEA在维生素E或大豆油中的溶解。给药后在1.5、3、5.5和24小时对动物进行化验(3个/时间点),并测定血液、肝、脾、肾、淋巴结以及24小时的粪便和尿中的14C的放射性。根据14C的放射性得到结果表明一些BrEA进入了淋巴系统。在血液、肝和淋巴结中,溶于大豆油的吸收量比维生素E油大。
添加有14C标记的BrEA的BrEA(5mg在1.0mL或维生素E与Cremophore混合物中)经胃内给药给大鼠。添加60μL乙醇促进BrEA在维生素E-Cremophore混合物中的溶解。给药后在2、3、5.5和24小时时对动物进行化验(4个/时间点),并测定血液、肝、脾、肾、淋巴结以及24小时的粪便和尿中的14C的放射性。结果表明小部分的药物被淋巴系统吸收。从血浆、肝和淋巴结中的数值可以断定,与大豆油或维生素E溶剂相比,该药物的吸收更慢,且其在组织中的存在时间更长。
三只雄大鼠一组,口服给药含有10或32mg以表面活性剂Synperonic PE/F127(2.5重量%)微粉化的BrEA及的1.0mL 0.9%NaCl。给药后在1.5、5和24小时检测大鼠。分析血液、肝、脾、肾、淋巴结和脑中的14C放射性。与BrEA在维生素E油和大豆油中的实验相比,在血液中BrEA的浓度更高,1.5小时为0.3%,并且10和32mg剂量在5小时后分别增加到0.8%和0.9%。另外,在1.5小时测定的淋巴结中的数值类似,且对于10和32mg剂量来说,该浓度在5小时和24小时分别保持在5.3%和5.2%,3.7%和3.1%(请参见表6).
在重复剂量实验中,大鼠胃内每6-16小时给药含有2mg以表面活性剂Synperonic PE/F127(2.5重量%)微粉化的BrEA的1.0mL0.9%NaCl。在第一次给药后40、72、84、90和96小时杀死大鼠(每时间点3只)。化验血液、肝、脾、肾和淋巴结中14C的放射性。注意到在本次实验中,血液、肝、肾和淋巴结中的水平比前述的实验高。
三只雄大鼠一组,经口服给药含有2、4或10mg微粉化BrEA并不含表面活性剂的1.0mL 0.9%NaCl。给药后1.5、5和24小时时杀死大鼠并分析血液、肝、脾、肾、淋巴结和脑中的14C的放射性。在所观察的组织中,不含表面活性剂的微粉化BrEA的浓度比加有表面活性剂的BrEA低。
实施例6.在体外对寄生虫的抑制 对于体外抗疟疾测试,使用微量滴定板。按照WHO标准方法(WHO,1990)制备药物的浓度为pMol/孔。受测化合物在无菌的RPMI-1640中溶于15%DMSO。使用对氯喹敏感(如WS/97)和抗氯喹(如MN/97)的疟原虫分离物。
如下所述进行裂殖体抑制分析。在微量滴定板上预先加入定量的各种浓度的受测化合物。50μL被寄生的RPMI-1640中的红细胞悬浮液(0.2mL红细胞+0.3mL血清+4-5mLRPMI-1640)分配到含有各种浓度受测化合物的微量滴定孔中。对每个浓度读数三次。
如下所述进行结合3H-次黄嘌呤分析。该测试按照Desjardins等在1979年的程序进行。在37℃下培养30小时后,将来自裂殖体抑制实验中的带有另外三个孔的微量滴定板加入3H-次黄嘌呤过夜。在带有微孔过滤装置的微孔玻璃过滤器上将细胞悬浮液冲洗两次。通过Beckman LS6000 β-闪烁计数器对该滤膜盘计数。通过绘制DPM相对药物浓度的曲线测量药物的活性。
抗氯喹敏感的T996/86恶性疟原虫化合物的体外活性
浓度(μM) | DHEA* | BrEA* | 雄烯甲酸甲酯* | 雄烷甲酸甲酯* |
30 | 65.6 | 98 | 60 | 61.5 |
15 | 44 | 60.1 | 45.7 | 47.4 |
7.5 | 38.3 | 50 | 40.9 | 45.3 |
3.25 | 37.2 | 43.7 | 46 | 41.4 |
1.875 | 23.2 | 40.9 | 41 | 43.4 |
0.938 | 37.2 | 31.8 | 43.3 | 47.1 |
IC50 | 19.0μM | 7.5μM | 19.5μM | 17.5μM |
*--%抑制
氯喹浓度(nM) | %抑制氯喹 |
200 | 95.9 |
100 | 94.6 |
50 | 97.3 |
25 | 94.5 |
12.5 | 86.8 |
6.25 | 27.2 |
IC50 | 9.0nM |
16α-氯表雄(甾)酮和16α-溴脱氢表雄(甾)酮抗氯喹敏感的T996.86和抗氯喹的K1恶性疟疾原虫的体外活性如下所示。
T996.86
KI
16-α-氯表雄(甾)酮 IC50 -9.25pg/mL ~9.25μg/mL
DHEA-Br IC50 -25.0pg/mL ~25.0μg/mL
其它通式1化合物,例如第1组至第25-6组的任何化合物以同样的方式使用以抑制疟原虫寄生虫。
实施例7.抑制berghei疟原虫的4天体内实验方案。4天抑制测试已经被广泛应用,并且它可以在1周的时间内进行。该测试包括在实验(D0)的第1天对感染了寄生虫的红细胞进行接种,然后注射受测化合物,化合物也可以在方案的第2、3和4天给药。在第5天,取血涂片并且或者通过计算寄生虫血症或者通过计算预定标度(即1-5)的寄生虫数目评价抗疟原虫的活性。Peters(Ann.Trop.Med.Parasitol.64:25-40,1970)描述了4天测试的基本程序。
该方案简要如下所述。每个受测组使用5只雌性TO小鼠。使用肝素化的注射器通过心脏穿刺术从具有30+%寄生虫血症的供体小鼠身上收集P.berghei HP15 ANKA寄生虫。用稀释剂(50%HIFCS+50%无菌PBS)将血液稀释到最终浓度为1%寄生虫血症或每0.2mL感染悬浮液中1×107个受感染的红细胞。每只小鼠通过静脉内接种,这种方式比通过腹膜内给药0.2mL感染悬浮液会产生更均匀的感染率。以剂量为100mg/kg在(16.7%DMSO+83.3%celacol)中制备受测化合物。接种寄生虫2小时后,经腹膜内给予该甾化合物制剂从D0开始,每天一次给药化合物,并持续连续的3天。在给药化合物的最后一天从尾巴血液制备血涂片,并将血液与100%甲醇混合,并用10%吉姆萨染液染色。在0-5的标度,评定寄生虫血症,其中5是对照样的值。
将1%寄生虫血症1×107红细胞/mL的接种体,以每只小鼠(雌性TO小鼠)0.2mL的量通过静脉内注射输送。在第1天接种后2小时开始给药,并持续3天。当评价寄生虫血症时,在第5天取自所有20只小鼠的血涂片分析结果如下所示。
化合物 | 治疗 | 寄生虫血症记数(0-5) |
BrEA雄烯甲酸DHEA氯喹对照 | 100mg/kg×4天i.p.*100mg/kg×4天i.p.*100mg/kg×4天i.p.*3mg/kg×4天i.p.*N/A | 12115 |
i.p.*=腹膜内注射
在一个类似的方案中,用含有1×107红细胞/ml的溶液通过I.V.注射对小鼠进行接种。两小时后通过I.V.给药。一天一次给药BrEA或其它通式1化合物(0.2mL I.V.或S.C.)共4天。研究之后剪切尾部获得血样。感染有P.berghei的小鼠用于获得受感染的细胞。在小鼠的心脏血液中获得寄生虫,每只未受感染的小鼠用带有14%寄生虫血症的0.2mL血液经I.V.进行感染。两小时后,将第一剂量的BrEA(100mg/kg I.V.或S.C.)输送给受感染的动物。BrEA制剂为45%羟丙基-β-环糊精和0.9%盐水溶液中含有15mg/ml BrEA的的无菌溶液。动物受感染后在第1、2、3和4天时,BrEA(100mg/kg I.V.或S.C.)输送给受感染的动物。经I.V.给药BrEA的组中第30天时没有出现死亡,而所有的对照动物到第10天时全部死亡。通过S.C.给药BrEA的动物到第11天全部死亡。
实施例8.大鼠体外和体内研究 在体外方案中,寄生虫(恶性疟原虫、对氯喹敏感的株系WT和抗氯喹的株系Dd2)的水平调整为1%而使用介质将血细胞比容(hermocrit)调整到7%。用一个96孔板,每个孔中加入50μL寄生虫和100μL与介质混合的药物,将相同的程序进行三次。将板置于一个含有生理气体混合物的小室中,并在37℃培育。在24、48和72小时时改变介质/药物混合物。在第5天时对每个孔制作载玻片,用吉姆萨染液染色,每块载玻片计数500个红血细胞。将三份取平均,数据记录为百分抑制率。
在体内方案中,对体重80-85g的Lewis大鼠进行标准的寄生虫(berghei疟原虫)IP注射。2小时后,每只大鼠静脉内注射下表中所述的一种治疗药品,然后放回它们的住处,供给标准实验食物并允许它们随意进食和水。再次称重,然后在接种后的第5、11和28天时用26规格的针取血。测量血细胞比容(hermocrit),然后制作每只大鼠的血涂片。然后用吉姆萨染液将血涂片染色并测定寄生虫血症(定义为带有寄生虫的红细胞百分比)的水平。再次把动物放回住处,并每天观察两次以取得进行性疾病或相反的药物反应的证据,进行性疾病定义为倦怠,相反的药物反应定义为在总共28天内损失起始体重20%。如果注意到进行性疾病或相反的药物反应,使该动物无痛死亡。
BrEA制剂为在45%羟内基-β-环糊精和0.9%盐水中含有15mg/mlBrEA的无菌溶液。
第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 |
0.9%盐水对照 | 氯喹对照,40mg/kg | 低剂量BrEA,30mg/kg | 高剂量BrEA,60mg/kg |
在第0、1、2和3天时进行静脉内注射,结果如下所示。结果表明用含有BrEA的制剂进行的体内治疗将寄生虫血症减少到与氯喹(“Clq”)对照所观察到的相当的结果。结果简述如下。
第4天 RBC寄生虫血症
盐水对照 16%
氯喹对照 10%
低剂量BrEA 9%
高剂量BrEA 7%
第11天 %RBC寄生虫血症
盐水对照 36%
氯喹对照 16%
低剂量BrEA 12%
高剂量BrEA 11%
实施例9.人类临床研究-寄生虫感染 受感染病人出现的对药物治疗的反应按照世界卫生组织的标准(WHO,1973)分级。通过寄生虫以及发热消除时间来评价对药物的反应。寄生虫消除以三个指标表达:(i)寄生虫的数目减少治疗前(基线)值的50%(PC50)的时间;(ii)寄生虫数目减少基线值的90%(PC90)的时间;以及(iii)寄生虫数目下降到显微检测水平以下的时间(寄生虫消除时间PCT)(N.J.White和S.Krishna,Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.83:767-777,1989;White等,J.Infect.Dis.165:599-600,1992;White等,J.Infect.Dis.166:1195-1196,1992)。发热消除时间定义为从施用药物开始到口腔或直肠的温度下降至或低于37.2℃并保持至少48小时的时间。
在治疗之前以及在治疗后第4、6、8、12、18、20、24、30和36小时或治疗后每隔4或6小时从病人身上获得静脉血液直到周围寄生虫血症完全消失。无菌收集血液并输送到含有2mL酸性柠檬酸葡萄糖酯(ACD)的10mL注射器中用于体外培养。在温育以前,将血浆与红血细胞分离并把红血细胞洗涤两次。通过改进的标准体外培养技术(W.Trager和J.B.Jensen,科学[Science]193:673-675,1976;A.M.Oduola等,J.Protozool.39:605-608,1992)培养寄生虫。在收集后10分钟内将样品分散到无菌离心管中并旋转。将上浮的血浆储存起来,而用培养介质(洗涤介质,RPMI-1640介质,含有25mM HEPES缓冲剂和25mmol/LNaOH)洗涤压积的细胞两次。通过真空抽吸技术将血沉棕黄层去掉。对每个血液样品用完全洗涤介质[CMP(补充了10%人血浆的洗涤介质)]进行1∶10的稀释。每个样品取1mm转移到24孔微培养板的2个孔中。在预混的含5%CO2、5%O2和90%N2气体氛围和37℃下培育培养物。培养介质每天改变一次,在开始培养后第24和48小时时准备薄的血涂片用于显微镜检查。如果受寄生虫感染的红血细胞的比例超过2%,则用未受寄生虫感染的洗过的A型Rh阳性红血细胞稀释培养物样品。
显微检查 在体内研究过程中,分别用无水甲醇(100%)和加热来固定薄的和厚的血涂片,并用10%Giemsa染色20min。通过在清晰的接合区数2000个红血细胞并确定被寄生虫感染的比例对薄的血涂片中的寄生虫血症进行定量。在厚血涂片中,通过计数对抗白细胞的寄生虫对寄生虫血症进行定量。如果在检查了厚血涂片上200个显微区域后没有发现寄生虫,则该涂片为阴性。在体外研究过程中,通过Li等人对Jiang方法的改进方法(J.B.Jiang等,柳叶刀(Lancet)2(8293):285-288,1982;K.Silamut和N.J.White,Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.87:436-443,1993;X.L.Li等,Chi.J.Parasitol.Dis.12:296,1994),将预处理的薄的和厚的血涂片按环形期分级。在对每个时间点获得的血液进行培育后的24和48小时,在清晰的接合区域内大约计数5000个红细胞,并按成熟程度分级为微环、小环、大环、着色的营养体和裂殖体。功能性存活能力按在体外培养24-48小时后能够成熟为着色的营养体或裂殖体的无性环的形式的比例进行估计(W.M.Watkins等,Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.87:75-78,1993)。
计算参数 病人表现出急性的、有症状的、严重的、非大脑纯粹恶性疟原虫疟疾。他们不耐口部液体、体温高于39℃、每微升血液中含有超过5000个寄生虫、具有无性繁殖的寄生虫血症并在抗疟疾药物的尿检中呈现阴性。每4小时对病人经静脉内施用悬浮于无菌的45%β-环糊精的盐水中、浓度为25mg/mL的BrEA。该方案连续进行4天。在前72小时内每6小时对寄生虫血症进行定量和临床检测,然后每天对参数进行评价直到第7天(168小时)以及其后第l4天。
血涂片用吉姆萨染液染色,并在厚涂片中通过计数2000个对抗白细胞的寄生虫对厚涂片的寄生虫血症进行定量,在薄的血涂片中通过获得受感染的红细胞的比例对寄生虫血症进行定量。按照WHO标准对药物治疗的反应分级。使用寄生虫和发热消除时间对药物反应进行评估。寄生虫消除以三个指标表达:寄生虫数目减少到治疗前值(基线值)50%的时间(PC50原文误为60);减少到基线值90%的时间(PC90);减少至低于显微检测水平(寄生虫消除时间)的PCT。
发热消除时间定义为从施用药物开始到口腔或直肠的温度下降至低于37.2℃并保持至少48小时的时间。在第l4天时寄生虫消除速率为100%。因此临床反应包括两个病人表现出的对寄生虫血症的影响,以及一种或多种感染症状的改善。
疟疾病人静脉内给药BrEA试验
病人A | 病人B | |
发热消除时间寄生虫消除时间50%消除的时间90%消除的时间100%消除的时间 | 12小时18小时24小时48小时 | 18小时24小时48小时64小时 |
实施例10.体外细胞研究 使用完整细胞,检测了在正常人RBC内BrEA对戊糖-磷酸酯支路(PPS)的作用。由于葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶(“G6PD”)是PPS的限制酶,因此人们认为在完整细胞内检测PPS通量比在细胞溶解产物中检测G6PD活性更能反映G6PD的活性。通常在细胞溶解产物中检测到的G6PD的活性比在完整的、静止的、未受刺激的RBC中的PPS通量大约高1100倍(细胞溶解产物中的G6PD活性:165;PPS通量0.142微摩尔/小时/mLRBC)。在完整细胞内的PPS通量和G6PD活性取决于许多因素(NADPH、NAD和ATP浓度,以及细胞内的pH值),如果检测在细胞溶解产物内进行则这些因素保持恒定,而在完整细胞内则可以变化。细胞中G6PD的活性水平显著高于正常的基本要求,并且对总G6PD活性的抑制可能对细胞内的PPS通量没有或只有很小的后果。例如,具有地中海G6PD突变体的RBC相对于正常个体约有1-3%的残留活性,对基本PPS通量没有损害,但当通过PPS的通量受到亚甲基蓝添加剂的刺激时,显示对通量有损害。使用各种量的BrEA进行了一系列的实验,并在未受刺激的基本RBC和受亚甲基蓝(MB)刺激的RBC中检测PPS通量。
下述的数据显示了在未受刺激的和受MB刺激的正常RBC中的PPS通量(微摩尔/小时/mlRBC)。不同浓度的BrEA(最终为0.3、3.5和7微摩尔)补充到悬浮于RPMI的洗过的RBC悬浮液中,在10%血细胞比容时pH为7.4,因此无需另外的培育和另外的洗涤就可以立即检测出PPS通量。在BrEA浓度为7μM时观察到对受MB刺激的PPS通量的微量抑制。
PPS通量 | |
对照样,未受刺激的RBCDMSO对照样,未受刺激的RBCDMSO对照样,受MB刺激的RBC0.3μM BrEA,未受刺激0.3μM BrEA,MB刺激3.5μM BrEA,未受刺激3.5μM BrEA,MB刺激7μM BrEA,未受刺激7μM BrEA,MB刺激 | 2302705090250500027049502954660 |
下述数据显示了三次实验的平均值,其中在正常的RBC内检测基本的、未受刺激的和受MB刺激的PPS通量(微摩尔/小时/ml RBC)。在这些实验中,不同浓度的BrEA(最终为~0.8、8和80微摩尔)补充到悬浮于RPMI的洗过的RBC悬浮液中,在10%血细胞比容(hermocrit)时pH为7.4。在37℃培育90分钟后,检测含BrEA和不含有BrEA的PPS通量。结果显示了MB刺激的PPS通量的剂量依赖性抑制作用。在8微摩尔时的抑制为10%(p=0.006相对于对照+DMSO),在80微摩尔时的抑制为25%(p=0.002相对于对照+DMSO)。
PPS通量 | |
对照样,未受刺激的RBC对照样,受MB刺激的RBCDMSO对照样,未受刺激的RBCDMSO对照样,受MB刺激的RBC0.8μM BrEA,未受刺激0.8μM BrEA,MB刺激8μM BrEA,未受刺激8μM BrEA,MB刺激80μM BrEA,未受刺激80μM BrEA,MB刺激 | 43054104804890410493045044304503660 |
实施例11.抑制寄生虫生长 以下显示了Epi(16α-溴-表雄(甾)酮)对寄生虫(恶性疟原虫)生长的影响。EPI在浓度为1μM时具有活性。
治疗后寄牛虫血症
时间为0 | 24小时 | 48小时 | 72小时 | |
对照样+DMSOEpi 1μMEpi 10μMEpi 100μMEpi 500μM | 5%5%5%5%5% | 5.40%5.70%5.60%00 | 3.10%5.50%0.90%00 | 5.20%1.60%000 |
对照样+DMSOEpi 50nMEpi 1μMEpi 2.5μMEpi 5μMEpi 10μMEpi 50μM | 2%2%2%2%2%2%2% | 8.80%9.90%5.80%7.30%5.40%4.20%0 | 11%9.20%6.10%5.80%6%3%0 | 8%8.30%2.10%3.20%1.80%00 |
通过标准方法测定寄生虫血症(显微检查至少500个细胞,用Diff-QuickTM(Baxter)染色)。在标准条件下在RPMI-1640中培育寄生虫,RPMI-1640中补充Hepes/葡萄糖(10mM),谷氨酸盐(0.3g/1)和10%人血浆。血细胞比容为1%。
实施例12.对噬菌作用的刺激 使用人类粘着单核细胞测定BrEA影响受疟原虫感染的RBC的噬菌作用的能力。寄生虫血症水平约为8-10%,按如下所述从血液的血沉棕黄层中获得人单核细胞。从新鲜收集的不含血小板的血沉棕黄层获得周围血液单核细胞,血沉棕黄层得自两种性别的健康成年人供体血液样品。用微温的补充有10mM葡萄糖的PBS(PBS-G)将分离出的细胞洗涤一次,并再次将细胞以5×106细胞/mL的浓度悬浮在补充有23mM NaHCO3和25mM Hepes,pH7.4(RMBH)的冰冷的RPMI-1640中。以4∶1的比例把DynabeadsM450总B和总T(Dynal)在4℃下20分钟加入到细胞中。按制造商所指定的方法去除B型淋巴细胞和T型淋巴细胞。剩余的单核细胞在RMBH洗涤2次,并再次以1×106浓度悬浮在AIMV细胞培养介质中(Gibro)。收集单核细胞层,在37℃下用PBS-G洗涤,并再次以1×106细胞/mL的浓度悬浮在AIMV细胞培养介质中。通过CD14表达进行估算纯化的细胞中单核细胞的比例超过90%。
受调理的寄生虫化的RBC(PE)的噬菌作用按下述进行测定。通过与10PE/单核细胞混合引发新鲜血清调理的PE的噬菌作用。将悬浮液进行简单的离心(室温下150×g5秒)以改善PE与单核细胞的接触。为避免在离心后以及在整个培养时期内单核细胞的附着,细胞保持以5×106细胞/mL的浓度悬浮在AIMV介质中,该介质在37℃下置于加湿的培育箱(95%空气,5%CO2)中的直径为6cm的聚四氟乙烯底盘(Heraeus)中。通过显微检查术进行估算至少有90%的单核细胞吞噬PE。对照细胞保持在相同的条件下但没有噬菌作用。通过前述的生物体发光方法(E.Schwarzer等,Br.J.Haematol.1994
88:740-745)对噬菌作用进行定量估算。
如下所述进行红细胞处理和寄生虫培养。从新鲜血液(Rh+)中分离红细胞(RBC)。洗涤过的RBC用裂殖体/营养体阶段的寄生虫(Palo Alto染色,不含支原体)进行感染。用珀可(Percoll)-甘露醇方法分离阶段特异性的寄生虫。简单来讲,在Percoll-甘露醇梯度(寄生虫血症>95%SPE)上分离的正常的裂殖体阶段寄生虫化的RBC(SPE)与悬浮于生长介质(含有25mmol/L Hepes,20mmol/L葡萄糖,2mmol/L谷氨酰胺,24mmol/L NaHCO3,32mg/L庆大霉素和10%AB或A型人类血清,pH7.30的RPMI-1640介质)中的RBC混合以在选定的血细胞比容值开始同步培养。将接种体寄生虫血症调整至正常SPE的20%以分离环形寄生虫化的RBC(RPE),调整至正常SPE的5%以分离营养体阶段寄生虫化的RBC(TPE)。接种后14-18小时,寄生虫处于第一周期的环形期;在34-33小时,寄生虫为第一周期的营养体阶段;接种后40-44小时寄生虫处于第一周期的裂殖体阶段。RPE、TPE和SPE在珀可(Percoll)-甘露醇梯度上分离。寄生虫血症通常为8-10%的RPE以及>95%的TPE。非寄生虫化和寄生虫化的RBC用电子计数。为估算总寄生虫血症以及对RPE、TPE和SPE的相对贡献,在指定时间下由培养物制备载玻片,用Diff-QuickTM寄生虫染色剂染色,并在显微下检测大约400-1000个细胞。
使用各种浓度的通式1化合物如BrEA检测其对寄生虫化的RBC的影响,如0.5μM、1μM、10μM、25μM和50μM。营养体寄生虫化的RBC、裂殖体寄生虫化的RBC或环形期寄生虫化的RBC按所述方法进行检测。
实施例13.人疟疾的临床试验 建立包括15-20个病人的临床试验方案。对于第I阶段、I/II阶段或第II阶段试验,病人轻度感染有一种或多种寄生虫,并且他们出现轻度症状(低于RBC寄生虫血症的约8-10%)。治疗以前,病人任选被HIV、HCV、TB以及隐孢子虫感染。对于一种或多种共感染的病人给予标准共感染治疗。病人在医院里治疗一周。二个或多个剂量组如25、50或100mg/天非肠道给药BrEA,如通过肌肉、皮下或静脉内注射,时间为病人接受给药的当周的3、4或5天。给药连续进行或以间歇式程序进行,如在隔日分2、3或4次给予一个剂量的药。
含有BrEA的制剂如本文所述,如实施例1所述的制剂或含有100mg/mLBrEA、~30体积%PEG300、30体积%的丙二醇、30体积%的苯甲酸苄酯以及2体积%苄醇的制剂。在第5-7天,如果观察到寄生虫血症的减少低于50%,则给予病人标准疟疾治疗(甲氟喹)。在治疗周内以及治疗之后的1、2、3或更多周内,定期采集血样以估算寄生虫血症、药代动力学、血浆细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-10、IGF1、γIFN、GM-CSF)和细胞内细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-10、IGF1、γIFN、GM-CSF)。在起始给药后约2-12周后,使用与起始剂量方案相同或类似的方案,选择性再次对病人进行治疗。
对感染有简单的疟疾的半免疫病人进行示例性的肌肉给药BrEA的开放式标记研究。该制剂包含100mg/mLBrEA、~30体积%PEG300、30体积%的丙二醇、30体积%的苯甲酸苄酯以及2体积%苄醇。在该研究的前7天病人呆在医院里作为住院病人。在连续5天内病人每天接受肌肉给药50mg或100mgBrEA。在前7天直到研究的第14天,每天的评估可以包括寄生虫血症评估(每天两次)、化学、血液学和药物水平(药物动力学评估)。如果在研究7天后,寄生虫血症从检测值下降,并且病人在临床上是稳定的,随后可以作为住院病人每天跟踪病人的寄生虫血症(每天两次)直到再过7天。如果在研究过程的任何时间,病人出现临床上不稳定,则不再继续研究而对其进行标准疟疾治疗。由于BrEA抑制葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶,所以不应对缺乏该酶的病人进行实验。其它可能排除病人参加实验的考虑包括诊断有以下任何病症的病人:严重贫血(血细胞比容<21%或血色素<7g/dL);有肾脏或肝脏衰竭史和/或实验证实的呼吸困难,证据是呼吸困难或呼吸速率≥30次/分钟;血压过低(收缩压<90mmHg);心动过速(心率>130下/分钟)怀孕或哺乳期妇女;明显的活性伴同疾病(需要特殊治疗的急性药物诊断);周围血涂片的寄生虫血症>10%的病人。
可以从每个病人身上采集血样用于将来的临床评价如确定活化标示物或免疫学分析(如对细胞内或细胞外白介素IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12、γIFN和TNFα的分析)。
实施例14.脂质体制剂 按如下所述制备适用于非肠道给药的脂质体。400mg磷酯酰胆碱与80mgBrEA溶解于氯仿和甲醇(体积比2∶1)中,通过减压下旋转蒸发将溶液干燥。通过加入8.0mL 0.9%重量体积比的NaCl溶液并搅拌溶液将所得的膜再水化。脂质体的尺寸用选择性方式测量,如通过光子相关光谱(Malvern Zetasizer 3000或同等物)。例如通过超声波降解法将平均尺寸减少至400nm以下,或使用合适的过滤器进行过滤使脂质体的尺寸理想化。用类似的程序制备含有浓度为15-100mg/mL通式1化合物脂质体制剂。制剂用于将该化合物口服或非肠道给药(I.M.、S.C.,I.V.)。
实施例15.环糊精制剂 按如下所述制备含有BrEA的环糊精制剂。45g羟丙基-β-环糊精加入1L无菌生理盐水中,将混合物搅拌约4-24小时直到得到清澈的溶液。加入非微粉化的BrEA至浓度为20mg/mL,并将混合物搅拌直到得到清澈的溶液。使用0.2μm孔尺寸的过滤器通过过滤对溶液进行除菌,并将溶液分配至无菌容器中。用类似的程序制备含有约15-100mg/mL通式1化合物的环糊精制剂。该制剂用于经口服、非肠道(I.M.、S.C.,I.V.)或口腔内或舌下途径给药该化合物。
实施例16.栓剂制剂 按如下所述制备含有通式1化合物如BrEA的栓剂制剂。计量足量的非微粉化的BrEA以获得所需要数目的单元,每个单元含有500mgBrEA。BrEA与一种栓剂基料如从食用植物油中获得的游离脂肪酸混合,以提供所需要的特性,如游离脂肪酸含量约0.1重量%、皂化值约242、碘值约3、水含量约0.1重量%,以及封闭毛细管熔点约35℃。
实施例17.人类HCV的临床试验 对一个感染有HIV和HCV的女性病人连续3天I.V.给药BrEA,使用的制剂是在45%(重量/体积)的羟丙基-β-环糊精的盐水中含有20mg/mLBrEA。在3天治疗期内,每4小时将4mL制剂(80mg BrEA)施用给病人。在按剂量给药之前,病人的HCV水平经PCR测量为6.5Log10,在按剂量给药的第一天HCV水平为6.2Log10,给药的第三天HCV水平为5.5Log10,施用完最后的剂量三天后HCV水平为4.9Log10。经PCR测量HIV RNA水平为5.2Log10(给药前),5.8Log10(第一天),5.9Log10(第三天)和5.4Log10(第六天)。NK细胞计数(细胞/mm3)在给药前、第0天和第3天分别为28、41和38。
实施例18.制剂含有100mg/mLBrEA、~30体积%PEG300、30体积%的丙二醇、30体积%的苯甲酸苄酯以及2体积%苄醇的制剂是通过下述方法制备的:将BrEA悬浮在聚乙二醇300中,并按顺序加入丙二醇和苯甲酸苄酯以形成溶液,额外加入丙二醇将终溶液稀释到所需要的体积。具体程序如下。
将计量的聚乙二醇300加入到混合用容器中。然后一边搅拌,一边加入计量的BrEA到容器中,至少混合5分钟以形成均匀的乳状液,将丙二醇加入容器中并至少混合5分钟以形成均一的悬浮液。将计量的苯甲酸苄酯加入容器,并混合大约5分钟以形成半透明的悬浮液。然后再加入丙二醇以获得所需要的最终制剂,并混合大约5分钟。将该药物溶液输送到体积分配装置中,每个小瓶分装1.2mL。在氮气压力下,将溶液通过两个0.2μm聚四氟乙烯无菌过滤器过滤至2cc琥珀色玻璃小瓶中。小瓶盖上涂有聚四氟乙烯的丁基橡胶塞并卷边密封。
实施例19.机会性感染的临床方案 一个将100mg BrEA经肌肉施用给感染HIV并存在机会性感染(OIs)危险的晚期病人进行双盲法、随机性的、安慰剂控制的研究。血清反应呈阳性、CD4细胞计数≤100细胞/mm3、HIV RNA浓度为1×106拷贝/mL、Karnofsky数目至少为60的HIV-1病人被确认为该方案的潜在参与者。在监测评估前,所有临床方案的病人都必须理解并签订书面通知的同意表格。
使用实施例16制剂中的BrEA。连续3-5天施用药物或赋形药物,然后观察约35-90天,例如观察37天。一个示例性的治疗方案包括治疗5天,然后观察37天,该过程在超过42周内总计重复7次。监控OIs的发生率以及OIs消退或受到控制的时间,并与安慰剂控制组进行比较。可以在完成用于后续治疗的研究后,在2或3个月内每月对病人进行监测。监测到OIs的发生或与AIDS有关的疾病,如肺结核(TB)、念珠菌病、肺囊虫病(PCP)、腹泄、或卡波济氏肉瘤可以被视为方案的终点。如果一个病人被诊断出一种或多种该方案指定的机会性感染,就开始对OI进行方案治疗,如Fluconazole用于念珠菌病或用于PCP、三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲基异噁唑或氨苯砜。使用其它通式1化合物进行类似的方案。
实施例20.人类HIV临床方案 感染有HIV的病人使用制剂经i.m.给药25-200mgBrEA,该制剂含有100mg/mLBrEA、~30体积%PEG300、30体积%的丙二醇、30体积%的苯甲酸苄酯以及2体积%苄醇。病人每天给药一次连续5天,然后在约28天或更长时间内进行无BrEA的治疗。然后对病人进行连续5天给药BrEA的一个或多个疗程,然后至少约28天不给药。最多进行5轮5天治疗,然后28天不给药的方案。然后对从病人获得的血液或血浆样品使用流动血细胞计数法以及其它已知的分析方法进行免疫反应分析。在从每个病人获得样品的24小时内分析免疫细胞子集或其它测量的标示物。本质上按照标准方法使用可买到的试剂制备并使用加标记的抗体,如与荧光染料(FITC、藻红蛋白、别藻蓝蛋白或PerCP)结合的抗CD抗原抗体,例如请参见PharMingen,1998研究产品目录,第732-774页的技术方案,第182-295页的人类细胞表面分子以及在第2-173页的小鼠、大鼠和仓鼠的细胞表面分子和第344-489页的细胞因子和化学因子试剂。
该临床方案为使用3个BrEA剂量水平经肌肉施用给感染有HIV的病人的I/II阶段、开放式标记、随机化的研究,病人缺少治疗历史。分为三个治疗组,每组包含2个部分(部分A和B)。病人在整个研究的A和B部分接受相同剂量的BrEA。如果病人出现抗病毒反应(HIVRNA滴定度至少在监测值和基线值的平均值以下0.5log)或得益(任何在低于平均监测值和基线值的HIV RNA滴定度的减少)于在研究的A和B部分所接受的治疗,病人可以按照开始治疗时所接受的剂量继续接受5天的使用实施例2的BrEA制剂进行的治疗。该治疗疗程可以重复最多达6次。
在整个研究过程中监测所有病人的HIV RNA(Chiron QuantiplexTM支链DNA分析)水平、T细胞子集[CD4/CD8]、前病毒的HIVDNA(PBMC)、白介素[IL-2、4、6、8、10和12](血清)、γIFN(血清)、类胰岛素生长因子[IGF-1](血清)和肿瘤坏死因子[TNF](血清)。可以在病人样品的子集中进行PBMC定量共培养(细胞)。也可以对另外的激活标示物进行分析。设计化学分析、血液学操作盘和尿分析。另外,共感染有乙型肝炎和/或丙型肝炎、疟疾或肺结核的病人可以定期进行监测其病毒滴定度或微生物培养物。在部分A第一次给药和部分B最后一次给药后,从病人的子集中采集系列血样和尿样以确定药物动力学。
治疗可以包括不止一次肌肉注射。肌肉注射可以在不同的部位进行(即左或右上臂或大腿或臀部),并且可以单一给药100mg或分二次或多次每次小于100mg(如50mg)给药200mg BrEA。
该研究分两个部分,第1和第2部分。每个部分均包括两个部分,部分A和部分B。参加此项研究的前12个病人分配到第1部分所述的计划。其余的24名病人分配到该研究的第2部分。每部分的计划如下所述。
部分A包括单一肌肉注射BrEA制剂。病人按受注射的日期为研究的第1天。从第1天开始,采集参加药物动力学小组的病人的系列血样和尿样。该研究的部分B在研究的第8天(第1部分)或研究的第15天(第2部分)开始。
第1部分的部分B包括以与研究的A部分相同的剂量连续5天每天肌肉注射实施例1的制剂。病人按受第一次给药的时间大约为研究的第8-12天。5天的治疗疗程过后,进行大约28天的观察期(或从第一次给药时的第8天大约经32天至第40天第二治疗疗程开始)。在观察期期间,要求病人每周返回诊所进行各项测试。大约从研究的第12-17天开始,采集参加药物动力学小组的病人的系列血样和尿样。
第2部分的B部分包含以与研究的A部分相同的剂量连续5天每天肌肉注射实施例2的制剂。病人按受第一次给药的时间大约为研究的第15天。5天的治疗疗程过后,进行大约45天的观察期(或从第一次给药时的第15天开始大约经49天至第64天第二治疗疗程开始)。在观察期期间,要求病人每周返回诊所进行各项测试。大约从研究的第19天开始,采集参加药物动力学小组的病人的系列血样和尿样。
按如下所述进行随机化剂量增加研究。当每组12个病人中的4位完成了5天的部分B的每日给药并且没有出现严重的与药物相关的不利现象时,经主办人和研究者协商后他们就参与下一个更高剂量水平的研究。
前4个参与的病人分配到50mg剂量组。如果没有出现严重的与药物有关的不利现象,后8个患者将以1∶1的比例随机接受或者50mg或100mg剂量水平。如果接受100mg病人没有出现严重的与药物有关的不利现象,然后下面24个病人将以1∶2∶3的方式随机接受50、100、或200mg的剂量水平。
如果一个剂量组12个病人中的4位出现严重的与药物有关的不利现象(III或IV级),则另加两个病人接受同样的剂量水平。另外,对于参与下一个剂量水平组的病人,如果已经报名,则暂时停止实验,直至安全性得到评估。如果另外两个病人中的1人也出现严重的与药物有关的不利现象,该剂量水平的给药将会中止。一经主办人与研究者协商,将会有另外的病人参与在剂量限制组与下一个低剂量组之间的剂量水平实验,以确定最大可耐药剂量(MTD)。额外的病人参与一个特殊剂量水平会通过修正方案确定。
结果表明单一剂量50mg或100mg给药BrEA会增加激活的CD8+和CD4+细胞(如CD8+、CD69+、CD25-细胞)的数量,这些细胞是在病人的血液中循环的。此外,在循环中的树突前体细胞、NK细胞、LAK细胞以及调节ADCC(被CD8+、CD16-免疫细胞子集调节的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性)功能的细胞数量也增加了。通常在连续5天给药时观察到进一步的增加。
某些结果简述如下。疗程1、2和3是指每天注射BrEA(每次注射50mg或100mgBrEA)的连续5天治疗方案。在如下的图表中,HE2000是指含有100mg/mLBrEA、~30体积%PEG300、30体积%丙二醇、30体积%苯甲酸苄酯以及2体积%苄醇的制剂。下述的数据为在基线(开始给药的那一天)以及病人按受至少一次给药BrEA后各个时间从病人的血样中获得。结果显示免疫细胞群以及与Th1免疫反应有关的细胞因子表达分布显著增加。这些方案的病人开始时CD4的数量至少为200细胞/mm3,HIV RNA血浆负载量为5,000-1×106RNA拷贝/mL。给药一个疗程的BrEA(连续5天,i.m.注射)后,所有的病人都表现出免疫细胞水平的增加,这些免疫细胞包括激活的CD8T细胞(如CD8+、CD69+、CD25+)、LAK细胞(如CD8+、CD16+、CD38+)、NK细胞(如CD8-、CD 16+)、ADCC细胞(如CD8-、CD16+)以及树突细胞(Lin-、HLA-DR+、CD11c+或Lin-、HL-ADR+、CD123+)。平均CD4IL-10产量从66%的中值下降到细胞的4%,而CD4γIFN从8%的中值上升到63%,引起在细胞因子的产量从Th2向Th1转变。
在下述图表中,基线数据以“BL”或“pre”表示。
BrEA治疗后免疫显型的增加
显型 基线a 疗程1 疗程2 疗程3
CD8+CD69+CD25- 18 54 56 75
n= (13) (13) (9) (4)
bp= <0.001 <0.001 0.04
CD8+CD16+CD38+ 8 27 28 25
n= (10) (10) (4) (4)
p= <0.001 0.047 0.02
CD8-CD16+ 53 253 28S 249
n= (12) (12) (4) (2)
p= <0.001 0.02 0.04
Lin-HLA-DR+ 3.2 17.7 11.4c 14.7c
CD11c+/CD123+
n= (10) (10) (5) (4)
p= <0.001 0.02 0.04
IL2+CD4d 3.14e 29.25 31.42 13.59
n= 13 13 3 4
p= <0.001 0.09 0.04
IL10+CD4d 66 20.9 8.9 15.3
n= 13 13 5 3
p= 0.005 0.005 0.03
Th1反应d 17 66 64 53
n= (13) (13) (5) (5)
p= 0.001 0.033 0.025
a细胞/μL的中值
bt测试的成对值
c对于在基线按受第2和第3个疗程的病人不可用的测试,第2疗程开始的基线值为6.4
dCD4的百分比
e从第8天开始的基线值(前述的第一次5天治疗)
激活的T细胞平均值按疗程与基线对比
LAK反应的平均值按疗程与基线反应的对比
NK、ADCC应答的平均值按疗程与基线对比
按疗程的树突细胞应答的平均值
HE2000使HIV中的IL10+CD4细胞正常化
HE2000增加Th1细胞百分比
Th1(主要为IFNg+)应答与基线的对比
实施例21.治疗HIV感染症状 两个感染有HIV并患有慢性腹泄的病人按如下所述给药BrEA。皮下输送BrEA制剂(40mg/mL BrEA在25体积%PEG300、12.5体积%乙醇、5体积%苯甲酸苄酯、~57.5体积%丙二醇)。病人每天接受在1.5mL中的60mgBrEA 10天。在给药期间,腹泄停止。10天的给药期结束后,腹泄复发。其它口服接受BrEA的病人其腹泄也减轻了。
实施例22.皮下制剂 基本按本文所述制备BrEA制剂。该制剂含有50mg/mL BrEA、40体积%PEG200、2体积%苄醇、2体积%苯甲酸苄酯以及~66体积%丙二醇(qs)。该制剂特别适用于皮下给药该化合物。
实施例23.制备BrEA半水合物—方法1通过溴化表雄(甾)酮制备粗BrEA,然后从甲醇中结晶。通过将25g粗BrEA溶解于75mL回流的乙醇中并进行适度搅拌制备半水合物。在保持溶液搅拌、回流时向BrEA溶液中慢慢加入12.5mL水。保持搅拌溶液,然后将溶液慢慢冷却至约20-25℃,并保持温度约20-25℃约15分钟以得到BrEA半水合物晶体的悬浮液。过滤回收晶体,在约20-25℃时用25mL水∶乙醇(体积比5∶1)溶液洗涤,然后在50-60℃下真空干燥约13小时直到产物的重量恒定。晶体主要为棒状和针状,带有少量的其它形状如片状。
该程序得到22.5gBrEA半水合物(产率90%),通过KF分析其水含量为2.6重量%,HPLC面积法分析其纯度为100%,其FTIR光谱中羰基峰在1741cm-1和1750cm-1。FTIR扫描无水BrEA显示唯一羰基峰在1749cm-1。DSC扫描显示三次吸热。一次具有较宽的浅峰,在约109-110℃开始,在约150℃结束。该宽DSC峰与随样品温度的增加半水合物晶体的失水一致。第二次吸热约在83-100℃,其与从样品中失去的少量残留乙醇一致。DSC扫描无水BrEA不出现半水合物中所观察到的该宽吸热峰也与半水合物的失水一致。在100-150℃范围以上,半水合物的DSC扫描中约在163-164℃(该温度为无水BrEA的熔点)时,出现第三吸热尖峰。通过USP方法<197>得到FTIR,其中BrEA半水合物样品在KBr中制备。DSC温度记录图通过以10℃/分钟的加热速率,从25℃-250℃进行扫描获得。
实施例24.制备BrEA半水合物—方法2 通过将10g粗BrEA解在40mL回流的丙酮中并适度搅拌制备半水合物。保持溶液回流及搅拌时,向溶液中慢慢加入4.0mL水。保持搅拌溶液,然后将溶液冷却至约20-25℃,并保持约20-25℃约15分钟以获得BrEA半水合物晶体的悬浮液。通过过滤回收晶体,在约20-25℃用6.0mL水∶丙酮(体积比10.1)溶液洗涤,然后在50-60℃真空干燥过夜(约13-15小时)直到产物的重量恒定。该方法获得7.0gBrEA半水合物(产率70%),KF分析其水含量为2.6重量%,FTIR光谱中羰基峰在1741cm-1和1750cm-1。
实施例25.BrEA半水合物颗粒尺寸的分析 基本上按本文所述制备BrEA半水合物,并使用一台颗粒尺寸仪(Malvern仪器)确定尺寸。所使用的分析模型为用于多分散样品和体积分布类型的模型。分析显示晶体的直径尺寸范围为约0.5μm-约880μm。约90%的颗粒具有约20μm-约220μm直径,并且大部分晶体的直径为约30-200μm。平均颗粒直径为约93μm。晶体的比表面积为约0.25m2/g。
在没有指明的程度上,那些本领域内的普通技术人员理解本文所述的各种特殊实施方案、化合物或组合物的任何一种可以进一步修改以包括其它的合适的特征,如本文以及本文引用的参考文献中所公开的任何其它的特殊实施方案。
Claims (41)
1.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物。
2.权利要求1的16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物,其具有以下一种或多种特征:(1)通过差式扫描量热法分析测量,在100℃+/-2℃时开始出现吸热,(2)傅立叶转换红外吸收光谱测量在1741cm-1和1750cm-1处出现两个羰基吸收带,(3)卡尔-费休法滴定测量水含量2.4重量%-2.6重量%,和(4)在θ值为17.8°+/-0.2°,23.8°+/-0.2°,24.2°+/-0.2°,(26.9°-27.2°)+/-0.2°,28.6°+/-0.2°,30.1°+/-0.2°和32.2°+/-0.2°θ处的1、2、3、4、5、6或7的粉末X射线衍射峰,其中粉末X射线衍射峰用Cu-Kα辐射测定。
3.权利要求1的16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物,其具有0.01-200微米的平均颗粒大小。
4.一种组合物,其含有16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物和一种或多种适用于人类药用或兽用的赋形剂。
5.权利要求4的组合物,其中存在少于3重量%的16β-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮。
6.权利要求4或5的组合物,其为单位剂量制剂形式,包含3mg-1000mg的16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物。
7.权利要求6的组合物,其中所述单位剂量制剂为片剂、胶囊、锭剂、软膏、乳膏、悬浮液、凝胶或胶体。
8.权利要求4的组合物,其中所述组合物为口服或非肠道给药的制剂。
9.权利要求4的组合物,其中所述组合物为阴道、直肠、口腔或舌下用药制剂。
10.一种制备16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物的方法,包括将水与含有16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮和C1-C6醇的溶液接触。
11.权利要求10的方法,其中C1-C6醇为乙醇。
12.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于治疗患有或易患有免疫抑制疾病或不需要的免疫反应的患者,所述免疫抑制疾病或不需要的免疫反应其任意一种或二种与(1)一种病原体感染,其选自病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫感染以及多细胞寄生虫感染,(2)一种自体免疫疾病,(3)癌或癌前期,(4)化疗、放疗、免疫抑制治疗、抗感染药剂治疗、免疫抑制分子的存在、过敏或炎症,(5)前述(1-4)的任意结合,(6)创伤、烧伤、骨质疏松症或骨折或者(7)老化有关。
13.权利要求12的应用,其中所述免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与化疗、放疗或免疫抑制治疗有关。
14.权利要求12的应用,其中所述化疗、放疗或免疫抑制治疗是阿霉素治疗、顺氯氨铂治疗、丝裂霉素C治疗、两性霉素B治疗、γ-放疗、用于病毒感染或癌症的核苷类似物治疗、环孢菌素治疗或皮质类固醇治疗。
15.权利要求12的应用,其中免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫感染以及多细胞寄生虫感染有关。
16.权利要求15的应用,其中的病毒感染、细胞内细菌感染、细胞外细菌感染、真菌感染、酵母感染、细胞外寄生虫感染、细胞内寄生虫感染、原生寄生虫感染以及多细胞寄生虫感染是由选自逆转录酶病毒、披膜病毒、黄病毒、嗜肝DNA病毒属、疱疹病毒、乳头瘤病毒、HIV-1、HIV-2、HHV-6、HHV-8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HSV-1、HSV-2、CMV、埃希杆菌属、嗜血杆菌属、嗜肺军团菌、利斯特菌、支原体、分枝杆菌、奈瑟菌、假单孢菌、立克次体、沙门氏菌、志贺菌、链球菌、葡萄球菌、耶尔森氏菌、念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌、隐孢子虫属、弓形体属、毛滴虫属、衣原体、肺孢子虫属、锥虫属、利什曼原虫、疟原虫属、血吸虫属、粪类圆线虫、胃肠寄生虫、微孢子虫或等孢子球虫的组、种或属引起的感染。
17.权利要求16的应用,其中所述感染是HIV-1感染、HIV-2感染、分枝杆菌感染和疟原虫感染中的一种或多种。
18.权利要求16的应用,其中所述感染是HIV-1感染或HIV-2感染。
19.权利要求16的应用,其中所述感染是隐球菌感染、曲霉菌感染、隐孢子虫感染、肺孢子虫感染和弓形体感染中的一种或多种。
20.权利要求16的应用,其中所述感染是念珠菌感染、毛滴虫感染和衣原体感染中的一种或多种。
21.权利要求12的应用,其中所述免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与炎症或过敏有关。
22.权利要求21的应用,其中所述炎症或过敏为过敏性呼吸道疾病、过敏性皮炎、在呼吸道超应答中的上皮下纤维变性、慢性窦炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、慢性腹泻或纤维变性肺泡炎。
23.权利要求22的应用,其中所述过敏性呼吸道疾病为过敏性支气管肺曲霉病、过敏性哮喘、过敏性鼻炎。
24.权利要求23的应用,其中所述过敏性鼻炎为慢性过敏性鼻炎。
25.权利要求21的应用,其中所述炎症或过敏为过敏性哮喘或在呼吸道超应答中的上皮下纤维变性。
26.权利要求12的应用,其中所述免疫抑制疾病或不需要的免疫反应与自体免疫疾病有关。
27.权利要求26的应用,其中所述自体免疫疾病为系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、格氏病、糖尿病、风湿性关节炎或骨关节炎。
28.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于调节患者的细胞因子、白介素或转录因子。
29.权利要求28的应用,其中细胞因子、白介素或转录因子为IL-1、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、γIFN、IGF-1、NFAT、TNFα或AP-1。
30.权利要求29的应用,其中白介素为IL-6或IL-12。
31.权利要求29的应用,其中细胞因子为TNFα。
32.权利要求29的应用,其中转录因子为AP-1。
33.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于调节IGF-1、PPARα、SF-1或LXR。
34.权利要求29-33中任一项的应用,其中患者患有免疫抑制疾病或不需要的免疫反应,所述免疫抑制疾病或不需要的免疫反应其任意一种或二种与病原体感染、癌、癌前期、化疗、放疗、创伤或烧伤有关。
35.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于增加人Lin-HLA-DR+CD123+树突细胞、Lin-HLA-DR+CD11c+树突细胞、CD8+CD69+CD25+T细胞或CD8+CD69+CD25-T细胞的数目或活性。
36.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于增加人CD8+CD16+CD38+淋巴因子激活的杀伤细胞、CD8-CD16+CD38+淋巴因子激活的杀伤细胞、CD8-CD16+天然杀伤细胞、CD8+CD16+天然杀伤细胞、调节依赖抗体的细胞介导细胞毒性的CD8-CD16+细胞、调节患者的依赖抗体的细胞介导细胞毒性的CD8+CD16+细胞、CD45RA+T细胞或CD45+R0+T-细胞或CD8+CD69-CD25+T细胞。
37.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于增加患者先天免疫力。
38.权利要求37的应用,其中所述药物适用于患有或易患有与病原体感染、癌、癌前期、化疗、放疗、创伤或烧伤有关的先天免疫抑制疾病的患者。
39.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于增强患者血液中的嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞的数量或生物活性。
40.16α-溴-3β-羟基-5α-雄烷-17-酮半水合物在制备药物中的应用,该药物用于治疗神经系统紊乱。
41.权利要求40的应用,其中所述神经系统紊乱选自与AIDS有关的痴呆、老年性痴呆和帕金森氏病。
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Cited By (2)
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CN106565654B (zh) * | 2016-10-14 | 2018-08-31 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种从白云参中提取的新型黄酮类化合物、其制备方法及其用途 |
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