CN1240842C - 寡核苷酸促进的凝聚 - Google Patents

Abstract

本发明提供了带有互补的突出寡核苷酸的细胞，脂质体和脂质颗粒，所述的寡核苷酸作为促进有效融合的辅助手段通过杂交使上述的细胞，脂质体和脂质颗粒聚集在一起，上述过程可进一步由渗透或电休克辅助。本发明进一步提供含有可将其锚定于细胞或脂质体膜中的锚定部分的互补的寡核苷酸对，以及载有待引入细胞中的试剂和带有结合膜的突出寡核苷酸的脂质体。

Description

寡核苷酸促进的凝聚

本申请中的研究报告由国家的卫生研究所授予号为ES10536的文件支持。美国政府享有可能通过本发明所确定的权利。

                      技术领域

本发明涉及细胞间的凝聚或融合，脂质体的融合，膜小泡或脂质颗粒与细胞或它们彼此间的融合。本发明还涉及非膜渗透的化合物，例如亲水的药物和染料向细胞和组织中的送递。

                        背景

生物膜构成一种屏障，这个屏障是大多数亲水的或带电的化合物所不能穿过的。将这些化合物封装到脂质体内，然后可通过该脂质体与细胞膜的融合将这些化合物递送到细胞内。这一过程可在药物送递和基因治疗中发挥作用。

也由于它们的膜，细胞处于彼此分离的状态，并且在正常状况下不相融合。然而，在许多应用，如杂交瘤的克隆和产生中需要两细胞间相互融合。融合需要使相分离的膜合并成单一的膜结构，尽管借助于化学试剂及其他方法例如电击，可实现融合，但这一过程的效率通常很低。这是因为膜上带有类似的电荷，因而彼此排斥，或者膜的脂质头基团附近的水化壳在紧密接触时相互干扰。需迫使两个膜长时间接触以产生融合，而这通常是被布朗运动所阻止的。

本发明的一个方面是提供一种改进的细胞、脂质体、脂质颗粒和脂双层小泡与细胞，以及它们彼此间的融合或凝聚的方法，该方法使它们彼此接近并使它们处于紧密相邻的状态以便它们的膜可以融合，并且它们的内容物可以混合。

本发明的另一方面是寡核苷酸包被的脂质体，所述的脂质体中包含被捕获的、待向细胞内递送的物质。

本发明的又一方面是含有在本发明的方法中有用的寡核苷酸构建体的试剂盒。

                        概述

本发明涉及膜包围实体，如细胞、脂质体和脂双层小泡的凝聚或融合。此处所用到的术语″脂质体″指一种封闭的结构，其外部的脂双层(或多层)膜包围着内部的含水间隙。在本发明中有用的合成脂质体的例子是在美国专利号6,110,490中公开的阳离子脂多胺(lipopolyamines)/中性脂质结合体。脂质体可用于包装任何待递送到细胞中的生物活性剂。可包装到脂质体内以递送到细胞中的核酸的例子可以是寡核苷酸探针，其包括但不限于荧光探针，例如在美国专利5,925,517中公开的分子标记；反义试剂；核酶；干扰RNAs和基因治疗试剂，例如质粒和病毒载体。该核酸可以是DNA、RNA、PNA及其混合物，并可进一步包含经修饰的核苷酸和经修饰的核苷酸间键。脂质体还可用于在体内或在体外包装″货物″并将其运送到细胞或细胞区室中，所述的″货物″如治疗剂、化疗剂、药品、染料、探针和亲水化合物。

尽管不含围绕内部含水间隙的脂双层膜，脂质颗粒，即脂质分子簇在本发明中可用于代替脂质体以将与之复合的物质，如用于转染的DNA、蛋白质、治疗剂、化疗剂及其他核酸运输到细胞内。可商购的脂质混合物包含，例如N[1(2，3-二油酰氧基)-丙基]N，N，N-三甲基-氯化铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、2，3-二油酰氧基-N[2-(精素酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵(propanaminium)三氟乙酸酯(DOSPA)，二甲基二十八烷基氯化铵(DDAB)和1-2-二油酰氧基-3(三甲铵)丙烷。利用脂质颗粒向细胞内递送DNA是已知的，例如Fergner，P.L，，et al..Proc.Nat).Acad.Sci.USA 84.7413-74l7(1987)；Barthel，F.，et al.，DNACell Biol.12，553-560(1993)；和Zhu.N..et al.，Science 961909-911(1993)。

无论是在体内还是在体外，为了使细胞间、或脂质体(或者脂质颗粒)与细胞间的融合发生，膜包围的实体间必须首先相互接触。由于所述的实体典型地是水合物，甚至电性相似，所以，这一过程需要能量。鉴于此，融合效率往往偏低。

本发明通过核酸杂交迫使膜包围实体聚在一起以促进融合。这是通过向每一膜包围实体加入具有锚定到膜内的寡核苷酸来实现的。这样的寡核苷酸可以通过在其末端连接一疏水的部分，如胆固醇来构建。所述锚定于膜的部分将自身包埋在膜的疏水区域，将寡核苷酸作为突出物暴露并伸到表面以外。由第一个实体(如细胞或脂质体)中伸出的寡核苷酸设计为与由第二个实体(如细胞或脂质体)中伸出的寡核苷酸互补，寡核苷酸之间的杂交可迫使上述的两实体聚在一起。为实现相接触的两个膜更加紧密，优选地所述锚定于膜的部分与一个寡核苷酸的3′端相连，与另一个寡核苷酸的5′端相连。这些互补的寡核苷酸的远端足以彼此捕获。初次接触后两寡核苷酸退火，从而将两实体相拖近。第一对寡核苷酸间的杂交体形成后使其他对寡核苷酸杂交体更易于形成，原因是它们彼此间更为接近了。由于两个膜实质上都是流体，有大量的寡核苷酸汇集到两膜的接触位点并在那里与它们的互补寡核苷酸配对。在多对寡核苷酸的“缝合”下，所述的两个膜彼此间可进行极其紧密的接触。最终，所述的两个膜彼此融合，一个膜包围实体的内容物与另一个膜包围实体的内容物相混合。

作为促进剂的寡核苷酸应该至少有五个核苷酸长。优选地至少有二十五个核苷酸的长度。它们可以是脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA、肽核酸PNA或其混合物。它们可以包括经修饰的核苷酸。它们可以包括经修的核苷酸间键，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或膦酸酯。

所述的锚定于膜的部分是一种疏水的部分，它可以容易地溶入到所述膜的疏水核心，例如：胆固醇、脂肪酸、疏水的肽、麦角固醇或脂质中。

所述两个膜包围实体的融合效率可通过被我们称作″半融合去稳定剂″的物质提高，所谓的″半融合去稳定剂″是指促进从半融合中间状态进行至完全融合状态的试剂。所述的半融合去稳定剂可能是一种足够长以至于能够跨越膜双层的两层的锚定于膜的部分。所述的实体能使膜融合过程更快地从半融合状态(这是一种膜双分子层的外层彼此融合而内层仍相互分离的状态)转变为完全融合状态。跨越膜双分子层的锚定于膜的部分使中间半融合状态去稳定。长度足以跨越膜双层的锚定于膜的部分的例子是55个碳原子长的脂质类异戊二烯undecaprenol，膜蛋白的跨膜节段，和胆固醇多聚体。

另一种使中间半融合状态去稳定并促进完全融合的方法使用分离的半融合去稳定剂，例如锥形的两亲分子，其优选地在膜双分子层的内层进行分割并与外层相对。例如，膜渗透性的阳离子两亲的分子氯丙嗪是一有用的试剂，其可促进已通过寡核苷酸的作用聚在一起的膜包围实体的融合。这些单独的剂可以简单地添加到融合反应介质中。

由于杂交是特异性的，因此可进行靶向融合。可使细胞群中的某些细胞带上突出的寡核苷酸，这些寡核苷酸可与呈现在脂质体上的寡核苷酸杂交。可同时使用带有多种不同的寡核苷酸的脂质体的组合来靶定细胞群中带有不同互补寡核苷酸的不同的细胞。除锚定于膜的部分外，所述的寡核苷酸还可以包括一种细胞特异性的部分，如单克隆抗体。或者，可使用一种细胞特异性的，如对真菌细胞，比如酵母特异的锚定部分靶定，例如麦角固醇。这些方法可使脂质体选择性地与特定的细胞，例如肿瘤细胞相融合。由于细胞或脂质体可以发现带有突出的互补寡核苷酸的“靶”，所以可以在给定的群体中进行多重平行融合。

融合辅助手段也可以应用于本发明的方法中，或在杂交之后，或与杂交同时进行。几种融合辅助手段是公知的，包括渗透压休克，电击和添加钙离子。

本发明还包括含有突出的寡核苷酸的脂质体产品。这种产品优选地包含亲水的承载物，例如前面所讨论过的药物，或DNA探针。另外，本发明还包括改变脂质体和细胞的试剂盒，其至少包含一对互补的寡核苷酸，每个寡核苷酸还包括附着的胆固醇或其他锚定于膜的部分。

结合附图和下述描述对本发明的一个或多个实施方案的细节进行阐述。本发明的其他特征、目的和有益之处可从说明书和附图以及权利要求中体现出来。

                     附图说明

图1是表示包含锚定寡核苷酸拷贝的膜包围实体，如细胞或脂质体的示意图。

图2是已经开始杂交的、包含互补的锚定寡核苷酸拷贝的两个膜包围实体的示意图。

图3是杂交后锚定的寡核苷酸已经迁移到接触区的，包含互补的锚定寡核苷酸拷贝的两个膜包围实体的示意图。

图4是两膜已融合为一个膜，配对的寡核苷酸分开，所述融合实体的内容物已相混合的两个膜包围实体的融合产物的示意图。

在不同附图中的同样的参考符号表示同样的元件。

                      发明详述

图1示意性地描绘出本发明的膜包围实体。实体1、其可能是细胞、脂质体或脂双层小泡，包含围绕亲水的容积或负载物空间3的膜或脂双层2。实体1包括多拷贝的锚定寡核苷酸6、其包含末端附着于寡核苷酸4的锚定于膜的部分5。膜锚部分5包被在脂双层2的疏水的区域中。寡核苷酸4从膜向外突出。由于锚定于膜的部分5、例如胆固醇，对膜2疏水的区域的亲合力，可通过寡核苷酸6与所述膜包围实体的温育简单地制备实体1。

图2示意性地描述了本发明的杂交过程。围绕亲水容积或含有亲水负载物18的负载物空间17的实体10包含膜11和多拷贝的锚定寡核苷酸16，每个锚定寡核苷酸包含锚定于膜的部分15和突出的寡核苷酸14。围绕亲水容积或含有亲水负载物28的负载物空间27的膜包围实体20包含膜21和多拷贝的锚定寡核苷酸26，每个锚定寡核苷酸包含锚定于膜的部分25和突出的寡核苷酸24。突出的寡核苷酸14和24是彼此互补的。它们相杂交形成杂交体30、31。在如图2所示的优选的构建体中，一个突出的寡核苷酸具有突出的3′端，另一个具有突出的5′端。通过这一构建体的杂交可从突出端开始，沿分支向锚定于膜的部分迁移，从而使实体10、20彼此接近。可以按需要调节杂交体30、31的强度来促进融合，正如很容易理解的那样，通过改变所述锚定寡核苷酸16、26中的核苷酸含量和长度。

图3示意地描绘了杂交在促进凝聚的过程中的作用。我们已经观察到锚定的寡核苷酸在膜或脂双层内部是可移动的。当杂交进行时，锚定的寡核苷酸向接触区迁移，两个膜包围实体总体上成为“哑铃”形，杂交体的环绕它们的连接处。参照图3，其描绘了包含负载物空间41、51和负载物42、52的膜包围实体40、50。实体40、50被锚定寡核苷酸的杂交体60，61，62拉在一起(参见图2)。同时，实体40、50呈″哑铃″形，其具有狭窄的中央区域，所述的实体在那里相接触并通过所述的杂交体叠加起来。通过对锚定寡核苷酸之一进行荧光标记，我们观察到观围绕狭窄的部位形成荧光环，在其他区域荧光递减，这表明锚定寡核苷酸已迁移到连接区域。显微镜检表明两膜彼此非常接近。

图4显示两融合实体在它们的膜和内容物彼此融合之后的状态。融合实体70包含围绕着单一的负载物空间72的单一的融合的膜71。来自一个亲本实体的负载物73和来自另一个亲本实体的负载物74在负载物空间72中混合在一起(参见图3)。杂交体75现在可以在整个膜71上自由迁移。

在图3中描绘的状态保持的时间的长短依赖于两实体天然状态的不稳定情况。由于它们的高面积/体积比所导致的张力，脂质体是热动力学不稳定的，而细胞是更稳定的。所以，当两细胞相配对时，如图3所示的状态维持得更长，而脂质体容易通过寡核苷酸促进剂的作用与其所结合的细胞融合。在渗透膨胀或电学干扰的情况下配对的细胞也容易融合。如图4所示，在融合完成后配对的寡核苷酸或杂交体离开“赤道面”均匀地遍及所述的膜。

通过荧光标记的寡核苷酸显示：两膜包围实体的融合形成单一的球状结构(在显微镜下呈现环形)，其带有包含两种锚定寡核苷酸的突出的杂合体。

                       实施例1

制备一对互补的锚定寡核苷酸。第一个包含68个核苷酸长的DNA寡核苷酸。其5′末端添加胆固醇，其3′末端用荧光素标记。第二寡核苷酸包含74个核苷酸长的DNA寡核苷酸。其3′末端添加胆固醇，其5′末端用四甲基罗丹明标记。其3′末端的前68个核苷酸与第一锚定寡核苷酸互补。所述的两寡核苷酸彼此杂交后，有一个突出的6-核苷酸将两荧光团分开。这一突出物可允许通过测定荧光素到罗丹明的共振能量传递来监控两荧光团间的距离。

将每种含胆固醇的寡核苷酸添加到单独的THP1细胞悬液中。向10微升的细胞悬液中添加5ng每种寡核苷酸。在细胞培养基(RPMI 1640培养基)中，这种混合物包含大约100,000个细胞。将所述混合物在室温下温育10分钟。通过下述方式去除过量的寡核苷酸，用100微升细胞培养基将所述混合物浸没3次，将所述细胞旋转缩减为20微升体积，去除上清液。

含有荧光素标记寡核苷酸的混合物置于显微镜用载玻片上，在491纳米波长下激发，在515纳米下记录图像。所述细胞具有图1所示的外形，带有一圈绿色荧光。类似地，将包含四甲基罗丹明标记的寡核苷酸的混合物置于显微镜用载玻片上，在555纳米下激发，在575纳米下记录图像。除荧光颜色为红色外，这些细胞具有类似的外形。

混合两细胞悬液，一起在室温下温育10分钟。将混合物置于显微镜用载玻片上，记录在491纳米波长下激发和在515纳米下发射，在555纳米下激发和在575纳米下发射，以及在491纳米下激发和575纳米下发射的图像。第一图像仅显示出荧光标记的细胞，彼此并不配对。第二图像仅显示出四甲基罗丹明标记的细胞，彼此并不配对。第三图像仅显示在红绿细胞连接处能量从荧光素向四甲基罗丹明的转移。观察到许多伴有能量转移的哑铃形复合物，如图3所示荧光集中于细胞的连接处。这些结果确证了DNA突出部分使带有互补寡核苷酸的细胞聚在一起并使它们保持紧密接触。

                      实施例2

用其中的核被DAPI染色(蓝)的细胞重复实施例1中的过程。在这一实施例中没有用四甲基罗丹明标记。将细胞混合物悬液温育后，然后用蒸馏水十倍稀释，以便将所述混合物渗透休克。在室温下温育10分钟后，所述的稀释混合物旋转缩减至20微升，去除上清液，将剩余的悬液静置1小时。然后将所述混合物置于显微镜用载玻片上检查。观察到许多具有两个核的细胞，但没有看到哑铃形的细胞对。在491纳米波长下激发样品，记录在515纳米的发射，所观察到的具有两个核的细胞具有如图1所示的形状，具有环绕着它们的荧光环。这一实验表明两膜包围实体通过DNA促进剂聚在一起并在张力下易于融合。

                    实施例3

以85∶15的比例混合1-棕榈酰-2-油酰基-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(popc)和1，2-二油酰基-Sn-甘油基-3-(磷酸-L-丝氨酸)(dops)制备脂质体。购买的脂质处于氯仿中。在两玻璃管的底部通过氩气使它们混合、干燥。第一管中的脂质在3′端包含荧光素部分的寡核苷酸存在下水合，第二管中的脂质在与第一寡核苷酸互补并在其3′端包含DABCYL的部分的寡核苷酸存在下水合。标记的寡核苷酸代表图2中的负载物18、28或图3中的负载物42、52。它们被设计为，其内容物的混合可通过伴随其杂交的荧光减弱来检测。所述的混合物经超声处理后产生包含被捕获寡核苷酸的脂质体。为保证所得的脂质体具有统一的尺寸，它们反复地穿过50nm孔径的滤膜。

如实施例1所述，向第一管脂质体中加入第一含胆固醇的锚定寡核苷酸。如实施例1中所述，向第二管脂质体中添加含第二胆固醇的互补的锚定寡核苷酸。这些寡核苷酸均不含任何荧光的标记。非复合的寡核苷酸和脂质分子经凝胶排阻层析去除。并行的，不含任何寡核苷酸促进剂，但内部包含被捕获的寡核苷酸的对照脂质体保留下来。

制备两混合物：一种含带有被捕获寡核苷酸、而不含促进剂寡核苷酸的两种脂质体的对照混合物，一种含带有被捕获寡核苷酸和促进剂寡核苷酸的两种脂质体的混合物。将所述混合物置于荧光计，在491纳米在激发在515纳米下读数。对照混合物的发射水平在整个过程中保持相对稳定，但另一混合物由于被捕获寡核苷酸之间的杂交及其所引起的淬火和凝聚，使发射水平极剧下降。这一实验表明促进剂寡核苷酸催化了脂质体融合及其内容物的混合。

Claims (13)

1.一种促进两种组分凝聚的方法，所述的组分选自：细胞，脂双层小泡，脂质体和脂质颗粒，该方法包括：

a.向所述的第一种组分中掺入第一种向外部突出的锚定寡核苷酸，所述的锚定寡核苷酸含有第一个末端疏水锚定部分，

b.向所述的第二种组分中掺入与上述第一种锚定寡核苷酸互补的第二种向外突出的锚定寡核苷酸，所述的第二种锚定寡核苷酸还含有第二个末端疏水锚定部分，和

c.在促进所述的第一种和第二种向外突出的锚定寡核苷酸杂交的条件下温育上述的第一和第二种组分。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的第一和第二种组分是细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中，第一种组分是细胞，第二种组分是脂质体或脂质颗粒，其含有被捕获的待插入所述细胞中的亲水物质。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述的亲水物质选自DNA、药物、治疗剂、化疗剂、反义试剂、染料和寡核苷酸探针。

5.如权利要求1所述的方法，其中，第一和第二个末端疏水锚定部分选自胆固醇、脂肪酸、疏水肽和脂质。

6.如权利要求1所述的方法、其中，所述的第一和第二个末端疏水锚定部分中的至少一个是半融合去稳定剂。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述的温育是在半融合去稳定剂存在下进行的。

8.一种包含被捕获的亲水物质的脂质体或脂质颗粒，其具有掺入其中的向外突出的锚定寡核苷酸，所述的锚定寡核苷酸包含末端疏水锚定部分。

9.如权利要求8所述的脂质体或脂质颗粒，其中，所述的锚定部分是一种半融合去稳定剂。

10.如权利要求8所述的脂质体或脂质颗粒，其中，所述的被捕获亲水物质选自DNA、药物、治疗剂、化疗剂、反义试剂、染料和寡核苷酸探针。

11.一种试剂盒，其包含一对独立包装的互补寡核苷酸，其中的每种寡核苷酸均包含末端疏水锚定部分。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其中末端疏水锚定部分中的至少一个是半融合去稳定剂。

13.如权利要求11所述的试剂盒，其进一步包含单独的半融合去稳定试剂。

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