CN1231695A - HBV聚合酶,起源于HBV聚合酶的RNaseH,其制备过程和在筛选抗病毒剂中的应用 - Google Patents
HBV聚合酶,起源于HBV聚合酶的RNaseH,其制备过程和在筛选抗病毒剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及含有组氨酸末端的乙型肝炎病毒聚合酶,衍生于HBV聚合酶的RNase H以及它们的制备方法。更具体地说,本发明涉及重组HBV聚合酶,它的具有酶活性的RNase H区域,在大肠杆菌中产生该酶的表达载体,以及制备HBV聚合酶和RNase H酶的方法,它们由于具有组氨酶末端而可容易地被纯化。本发明涉及HBV聚合酶和RNase H酶的筛选抗病毒剂中的应用。
Description
发明领域
本发明涉及含有组氨酸末端的乙型肝炎病毒(下面称为HBV)的聚合酶，起源于HBV聚合酶的RNase H酶，和它们的制备过程。
更具体地说，本发明涉及重组HBV聚合酶，它的具有酶活性的RNase H区，在大肠杆菌中产生该酶的表达载体，和制备HBV聚合酶和RNase H酶的过程，这两种酶可以容易地纯化，因为它们具有组氨酸末端。
本发明涉及使用HBV聚合酶和RNase H酶筛选抗病毒试剂。
HBV是肝炎病毒中的主要病毒，在世界范围内感染了超过3亿人口。HBV引起急性或慢性肝炎，导致肝硬变或肝癌(Tiollais和Buenda，美国科学，264:48-54,1991；Blumberg,B.S.,研究，F.V.Chisari，编辑，纽约，Mason出版，1984)。由于HBV的分子特征和它与肝病的密切关系，对HBV已经进行了各种研究。
HBV是DNA病毒，是肝炎病毒家族的成员，具有由核蛋白壳和核心组成的球状结构。HBV基因组是部分双链DNA，只有3.2kb大小，不是环状。详细地说，HBV基因组是由四个交迭的基因组成的，它们是聚合酶(P)基因，表面蛋白质(HBsAg；S,pre-S1,pre-S2)基因，核心蛋白质(HBcAg；pre-C,C)基因和X蛋白质(HBx)基因。在这些基因之间，X蛋白质基因编码调节蛋白质，其它基因编码HBV的结构蛋白质。聚合酶基因在总基因组中占有80％，编码由845个氨基酸组成的94KD大小的蛋白质。
HBV通过下面所述的过程感染肝细胞。肝细胞的特异受体识别病毒颗粒表面的表面蛋白，并与它们结合，以便将病毒粒子拉进肝细胞。然后，HBV聚合酶合成部分双链DNA的单链部分，以得到完整的HBV基因组。利用细胞RNA聚合酶转录3.2kb大小的HBV基因组，产生约3.5kb的前基因组mRNA，核心蛋白质(c)mRNA，表面蛋白质mRNA和X蛋白质mRNA。从这些mRNA可以翻译病毒蛋白质。特异地，HBV聚合酶利用它的逆转录酶活性合成RNA中间产物，以便提供DNA基因组的模板，产生含有前基因组mRNA，核心蛋白质和诸如此类的复制体结构，这个过程称为包壳化过程。HBV基因组可以容易地包壳，因为含有连续的谷氨酸残基的聚合酶的3’末端与核酸有亲和力。上面在复制子中的RNA中间产物的作用是负DNA链合成的模板，然后通过依赖于DNA的DNA聚合酶(DDDP)活性，将全长的负链作为正链DNA合成的模板，以便最后产生整个前基因组mRNA。通过重复上面的过程，产生了200-300个拷贝以上的基因组DNA的集合上面提到的病毒蛋白质因而得到表达(Tiollais和Buenda，美国科学，264:48-54,1991；Ganem,D.和Varmus,H.E.，生物化学年评，56:651-693,1987)。
有趣的是，利用RNA中间产物和逆转录，HBV复制了它的基因组，即使它是DNA病毒。已知逆病毒利用逆转录复制它的基因组。特别是，有人报道逆病毒的聚合酶是多功能酶，它显示出依赖DNA的DNA聚合酶活性，逆转录酶活性，和RNase H活性。显然，HBV聚合酶含有一系列病毒基因组复制必须的功能。也就是下面的功能：(Ⅰ)蛋白质引物，(ⅱ)依赖RNA的DNA聚合酶(RT)，(ⅲ)依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP),(ⅳ)包括在一个多肽中的RNase H活性。Kaplan等人首次报道了HBV聚合酶的逆转录酶活性，并且已经探索阐明了HBV复制的机制。
如上文所述，逆转录酶通常具有一个活性的RNase H区，它识别RNA/DNA复合物，有选择性地只水解RNA链。RNase H活性对逆转录是必需的，因为只有在RNase H活性水解了RNA中间产物后逆转录酶才能连续地复制DNA。虽然最近知道RNase H酶是逆转录酶的一个区域，RNase H酶首次是在小牛胸腺中由Hausen和Stein发现的，并且存在于各种原核生物和真核生物中(Stein,Hans和Hausen,P.科学，166:393-395,1969)。
一般地说，活化的HBV聚合酶的RNase H区域定位于它的C末端。据报道该聚合酶的氨基酸序列和核苷酸序列与莫洛尼氏小鼠白血病病毒的聚合酶非常相似。另外，已知HBV聚合酶的活化RNase H区合成推断可能起源于前基因组RNA的正链引物。具体地说，这是对病毒增殖必需的RNase H酶中的保守序列进行诱变鉴定的。另外，RNase H区起的作用是合成负链DNA以及正链DNA，并进行RNA包装，这是通过突变鸭子HBV聚合酶的RNaseH区鉴定的。但最近有报道鸭子HBV聚合酶不能识别人HBV前基因组RNA内的结合区∈。
所以，除了利用鸭子HBV聚合酶间接研究外，应该直接研究人HBV聚合酶和它的RNase H区，目的是阐明人HBV和它的聚合酶的机制。到目前为止已对疫苗开发和肝癌进程中转录的调节所必需的表面蛋白和X蛋白进行了深入的研究。虽然HBV聚合酶能用于开发抗病毒试剂，但很少有人使用HBV聚合酶。因为HBV聚合酶难于从病毒颗粒分离，并难于得到足够的量，特别是活性形式(Radziwill,G.等人，病毒学，163:123-132,1988)。目前，为了开发肝炎的新的治疗剂，曾将用HBV感染的细胞系用于筛选抗病毒试剂。但是，仍然没有开发出有效的治疗剂，因为利用细胞系的筛选方法比利用HBV聚合酶或它的RNase H酶的筛选方法需要更长时间，耗费更多。
最近，为了阐明HBV，如上所述已经研究了HBV聚合酶和它的RNase H区。特别是已经尝试了利用重组DNA技术大量生产上面的酶的研究。本发明的发明人已经通过从大肠杆菌转化体表达，生产了重组HBV聚合酶，并且测量了该酶的酶活性，递交了专利申请(韩国专利申请94-3918)。在大肠杆菌中重组HBV聚合酶以含有麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白的形式产生，并且能够容易地通过MBP亲和柱色谱层析纯化。但是，大量地得到活化的HBV聚合酶是困难的，因为聚合酶可以在C末端降解并且纯度是低的。
通过重组DNA技术在蛋白质中插入组氨酸末端可以大量得到外源蛋白质。编码组氨酸末端的核苷酸序列被插入在基因的5’末端或3’末端，组氨酸末端防止了重组蛋白质的降解，可以制备稳定的酶。另外，利用组氨酸末尾亲和柱作为金属螯合亲和柱可以容易地纯化高度活化的重组蛋白。
为了开发有效的治疗试剂，通过本发明的方法已经生产了HBV聚合酶和它的RNase H酶。本发明人构建了含有HBV聚合酶基因的表达载体，该基因含有编码重组蛋白质的C末端的组氨酸末尾，本发明人同时构建了含有起源于HBV聚合酶基因的3’末端的RNase H区基因的表达载体。另外，利用该表达载体在大肠杆菌中已经大量地以融合蛋白质的形式生产出了HBV聚合酶和它的RNase H区，并利用直链淀粉柱和组氨酸末尾亲和柱将它们容易地纯化了。所以可以制备没有降解的高度活化和稳定的HBV聚合酶和它的RNase H酶。另外，本发明人已经开发了新的筛选抗病毒试剂的方法，其中利用了本发明的HBV聚合酶和它的RNase H区。
发明概要
本发明的目的是提供一种含有组氨酸末尾的HBV聚合酶，起源于HBV聚合酶的RNase H酶和它们的制备方法。
具体地说，本发明提供了含有HBV聚合酶基因的表达载体和在大肠杆菌中制备HBV聚合酶的方法。
另外，本发明提供了含有起源于人HBV聚合酶基因的RNase H基因的表达载体和在大肠杆菌中制备RNase H酶的方法。
以及，本发明的目的是提供HBV聚合酶和RNase H酶在筛选抗病毒试剂中的用途。
具体地说，本发明提供了筛选HBV聚合酶和RNase H酶的抑制剂的方法。
附图的简要说明
图1描述了构建产生含有组氨酸末尾的HBV聚合酶的表达载体pMPH的方案。
图2描述了已经通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从大肠杆菌NM522/pMPH转化体生产和纯化的HBV聚合酶。
道1：通过直链淀粉柱初步纯化HBV聚合酶
道2：然后通过组氨酸末端亲和柱纯化HBV聚合酶
图3：描述了构建产生起源于HBV聚合酶的RNase H酶的表达载体pMPRL的方案。
图4：描述了构建产生起源于人HBV聚合酶的活化的具有组氨酸末尾的RNase H酶的表达载体pMRH的方案。
图5：描述了已经通过SDS-PAGE从大肠杆菌NM522/pMRH产生和纯化的RNase H酶。
道1：标准分子量标记(分子量分别是97,68,43和29千道尔顿)；
道2：大肠杆菌转化体的粗提取物
道3：通过直链淀粉柱初步纯化的RNase H酶
道4：然后通过组氨酸末尾亲和柱纯化的RNase H酶
图6：描述了已经通过Western影印分析从大肠杆菌NM522/pMRH转化体生产和纯化的RNase H酶。
A：利用抗麦芽糖结合蛋白的结果
B：利用抗组氨酸末尾(MRGSHIS)的抗体的结果
每道如上面的图5中说明。
图7：描述了用于测试本发明的RNase H活性中的RNA/DNA复合物。
图8：表示了比较下面的样品的RNase H的活性的结果，(ⅰ)麦芽糖结合蛋白，(ⅱ)培养的大肠杆菌转化体的粗提取物，(ⅲ)利用表达载体pMPRL表达和直链淀粉柱纯化的RNase H,(ⅳ)利用表达载体pMRH表达和直链淀粉柱，组氨酸亲和柱纯化的RNase H,(ⅴ)莫洛尼氏白血病病毒的逆转录酶。
图9表示根据RNase H酶的量增强的RNase H活性。
图10表示根据RNase H酶的反应期而增强的RNase H的活性。
图11表示根据反应温度而变化的RNase H活性。
图12表示根据反应溶液的pH而变化的RNase H活性。
图13表示根据氯化钾的浓度而变化的RNase H的活性。
图14表示根据镁离子的浓度而变化的RNase H的活性。
图15表示根据锰离子的浓度而变化的RNase H的活性。
优选实施方案的详细说明
本发明提供了含有组氨酸末尾的HBV聚合酶，它是通过在HBV聚合酶基因的末端插入组氨酸末尾的核苷酸序列制备的。
因为含有组氨酸末尾的HBV聚合酶是稳定的，并且容易纯化，可较适当地测量它的逆转录酶活性等。通过利用位点特异插入诱变和其它，可以将含有组氨酸末尾的核苷酸序列插入HBV聚合酶基因的5’末端和3’末端。
特定地，本发明利用已经建立的病毒载体(韩国专利申请94-3918)，它产生与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的HBV聚合酶。6个组氨酸残基的核苷酸序列被插入在HBV聚合酶基因的3’末端。特别是因为该组氨酸密码子连续地插入在终止密码之前，HBV聚合酶基因的开放读码框架(ORF)准确地定位了。组氨酸末尾可以插入在聚合酶的C末端，但保留了酶活性。结果是，构建了表达载体pMPH，这可以产生与麦芽糖结合蛋白和组氨酸末尾融合的HBV聚合酶(参见图1)。
为了表达重组聚合酶，利用表达载体pMPH转化微生物，以便制备转化子。上面提到的微生物包括适于表达重组蛋白的所有种类的大肠杆菌。
具体地说，利用表达载体pMPH转化大肠杆菌NM522菌株，并且将转化体于1996年7月19日保藏于在韩国微生物培养物中心，汉城，韩国(登记号：KCCM-10084)。
本发明提供了大量制备重组HBV聚合酶的方法。诱导含有该表达载体的大肠杆菌转化体表达重组蛋白质，并裂解得到粗提取物，然后，将HBV聚合酶利用组氨酸末端亲和柱层析和其它层析的方法纯化。
准确地说，因为含有表达载体pMPH的大肠杆菌转化体产生了与N末端的MBP融合的重组HBV聚合酶，利用直链淀粉树脂柱纯化了融合蛋白质形式的HBV聚合酶。利用蛋白酶因子Xa等处理分离MBP才能得到具有组氨酸末端的聚合酶。
另外，将金属螯合亲和柱作为组氨酸末尾亲和柱可以高度地，方便地纯化组氨酸为末端的HBV聚合酶。在纯化过程中组氨酸末端保持了重组HBV聚合酶的酶活性，因为它防止了蛋白质降解，并且简化了HBV聚合酶的纯化过程。
本发明提供了起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
因为人HBV聚合酶在N末端含有具有酶活性的RNase H区，通过在表达载体中插入HBV聚合酶基因的3’末端，并诱导大肠杆菌转化体制备本发明的RNase H区。
本发明提供了产生与MBP融合的RNase H酶的表达载体，以便制备起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
准确地说，进行聚合酶链式反应(PCR)可以得到HBV聚合酶的RNase H亚区基因，该反应利用了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作为引物(参见序列表)和已建立的表达载体pMPLX作为模板。表达载体pMPLX可以生产形式为与MBP融合的HBV聚合酶(韩国专利申请94-3918)。已经将上面得到的RNase H酶基因插入质粒载体pMAL-c2构建表达载体pMPRL(参见图3)。
具体地说，利用表达载体pMRH转化了大肠杆菌NM522菌株，在韩国微生物培养物中心，汉城，韩国，在1996年11月29日已经保藏了该转化体(登记号：KCCM-10092)。
另外，本发明提供了表达载体，该载体产生与MBP和组氨酸末端融合的RNase H酶，目的是制备起源于HBV聚合酶的RNase H酶。
准确地说，从表达载体pMPH得到含有组氨酸末端的核苷酸序列的HBV聚合酶的基因片断，并插入表达载体pMPRL以便构建表达载体pMRH(参见图4)。
具体地说，利用表达载体pMPH转化大肠杆菌NM522菌株，将该转化体于1996年11月11日保藏于汉城，韩国，微生物培养物中心(登记号：KCCM-10091)。
本发明提供了制备起源于HBV聚合酶的RNase H酶的方法，其中利用了表达载体和如上所述的转化体。
准确地说，为了纯化HBV聚合酶的RNase H区，在含有表达载体的大肠杆菌转化体中诱导该蛋白质表达，并裂解得到粗提取物，然后利用直链淀粉树脂和含有麦芽糖的缓冲液纯化融合蛋白形式的RNase H酶。组氨酸为末端的RNase H酶通过蛋白酶因子Xa等的处理分离MBP才能得到。通过如上所述同样的过程，进行组氨酸末端亲和柱层析高度纯化组氨酸为末端的RNaseH酶。
利用SDS-PAGE和Western印迹已经确定了上面纯化的RNase H酶和HBV聚合酶的分子量和纯度。结果本发明的HBV聚合酶和RNase H酶被鉴定为没有降解的完整的形式(参见图2，图5，和图6)。
已经检测了在本发明的HBV聚合酶中的逆转录酶活性。结果是，含有MBP和组氨酸末尾的重组聚合酶已经显示了比没有组氨酸末尾的聚合酶更高的逆转录酶活性。详细地说，依赖于DNA的DNA聚合酶(DDDP)和依赖于RNA的DNA聚合酶(RDDP)的活性在组氨酸为末端的形式中比完整形式中高19倍(参见表1)。
准确地说，为了研究由RNase H活性的RNA降解，可以将RNA/DNA复合物用作酶反应的底物。选择起源于质粒pBS的质粒pBS-oligo作为制备RNA/DNA复合物的DNA模板，在T7启动子下游102个核苷酸处的限制性位点SmaⅠ内消化，然后利用T7 RNA聚合酶，放射性核苷酸和其它进行体外翻译。利用QIAquick核苷酸除去试剂盒得到102个核苷酸的RNA，加入QIAGEN和合成的SEQ ID NO:4的DNA低聚核苷酸(43-mer)以便制备图7显示的RNA/DNA复合物(参见序列表)。
为了测量RNase H酶活性，将放射性活性的RNA/DNA复合物与RNase H酶反应，利用闪烁鸡尾酒和诸如此类测量反应混合物中的放射性活性。在这时，利用了作为对照样品的麦芽糖结合蛋白，粗提取物部分，作为比较样品的商业可得莫洛尼氏小鼠白血病病毒的逆转录酶和其它。结果是，本发明的RNase H酶比莫洛尼氏小鼠白血病病毒的逆转录酶更加活化，高约90％的活性(参见图8)。
为了检测RNase H区的酶特性，利用适当的缓冲液和放射性活化RNA/DNA复合物，在各种反应条件下测量RNase H活性。
结果是，根据酶量RNase H区的酶活性增加(参见图9)，并化了约3小时的反应时期显示出来(参见图10)。优选地，酶反应的温度范围是32-42℃(参见图11)，pH范围是较宽的，如7.5-8.8(参见图12)。优选地，酶反应的反应混合物应该含有20-100毫摩尔范围的KCl浓度(参见图13)，4-8毫摩尔范围的镁浓度(参见图14)，和4-12毫摩尔范围的锰浓度(参见图15)。
更优选地，RNase H的酶反应的最适温度是37℃，最适pH是7.9，最适NaCl浓度是40毫摩尔，镁离子是4毫摩尔和锰离子是8毫摩尔。
本发明提供了HBV聚合酶和起源于HBV聚合酶的RNase H酶在筛选抗病毒试剂中的用途。
为了利用HBV聚合酶选择在HBV的增殖时期起作用的HBV抑制剂，
(a)将HBV聚合酶与同聚物模板，放射性核苷酸和抗病毒试剂反应，
(b)使(a)步骤中的反应溶液吸附到阴离子吸附滤纸上，并干燥，
(c)利用闪烁鸡尾酒测量吸附滤纸的放射性活性和，
(d)将(c)步骤的结果与比较样品的比较，该比较样品在反应混合物中不含有抗病毒试剂，并被用于计算HBV增殖的抑制效应。
然后，优选地将poly(dA)/oligo(dT)12 18用作DDDP活性的同聚物模板，将poly(rA)/oligo(dT)12 18用作RDDP活性的同聚物模板，优选使用DE-81阴离子吸附滤纸。
另外，为了利用起源于HBV聚合酶的RNase H酶筛选抗病毒试剂，首先，通过如下所述的过程制备酶底物，然后测量底物的放射性活性。
为了选择利用HBV聚合酶的RNase H区在HBV的增殖时期起作用的HBV抑制剂
(a)将RNase H酶与反应底物和抗病毒试剂反应，
(b)加入乙酸铵终止(a)步骤的反应并加入乙醇沉淀和离心，
(c)测量沉淀的上清液的放射性活性和，
(d)将(c)步骤的结果与比较样品的那些比较，该比较样品在反应混合物中不含有抗病毒试剂，并用于计算HBV增殖的抑制效应。
如下面的实施例所示，说明了本发明的实践和当前的优选实施方案。
但是，本领域的技术人员在考虑了本公开物的基础上，在本发明的精神和范围内可以作出一些修改和改进。实施例<实施例1>构建表达载体pMPH
为了构建表达载体pMPH，通过位点特异的插入诱变，将6个组氨酸残基的核苷酸序列插入已经确立的表达载体pMPLX(韩国专利申请94-3918)的HBV聚合酶基因的3’末端。
由表达载体pMPLX转化大肠杆菌CJ236菌株(ung-,dut-)，培养直到OD600为0.3，然后用M13 K07辅助噬菌体感染。在1小时后，在生长培养基中加入卡那霉素，在培养过夜后，得到含有尿嘧啶的DNA。通过进行体外DNA聚合化构建含有6个组氨酸残基，(His)6为末端的突变体表达载体，其中根据Kunkel的方法利用了含有SEQ ID NO:1(参见序列表)核苷酸序列的诱变引物和上面的单链DNA(Kunkel,T.A.，美国核酸科学进程，82:488,1985)。利用插入的限制酶EcoRⅠ位点和DNA序列分析选择上面所述的突变体表达载体。
具体地说，制备了诱变引物使HBV聚合酶基因的开放读码框架中含有紧接终止密码上游的6个组氨酸密码。所以，将组氨酸末端插入而在HBV聚合酶基因中没有任何序列变化。另外，将表达载体pMPLX中缺乏的EcoRⅠ位点(GAATTC)导入，紧接着终止密码的下游，所以，可以容易地选择突变体表达载体和转化体。突变体表达载体可以含有恰当的开放读码框架和表达方向，这通过分析DNA序列可以检测。
结果是，构建了本发明的表达载体pMPH，它可以产生重组蛋白，即与MBP和组氨酸末尾融合的HBV聚合酶(参见图1)。<实施例2>HBV聚合酶的表达
为了得到大量的HBV聚合酶，利用表达载体pMPH转化了大肠杆菌NM522菌株，该菌株可以产生转化体蛋白，即与MBP和组氨酸末端融合的HBV聚合酶。
在3毫升，2X YT培养基中接种如上所述的转化体，培养16-20小时，将生长培养基稀释1∶100，再次接种，进入400毫升的LB培养基。然后，在37℃，温育生长培养基直到OD600达到0.5，在大肠杆菌培养基中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再次在20-37℃培养6-18小时。<实施例3>纯化HBV聚合酶
为了纯化HBV聚合酶，在4,000RPM离心实施例2中诱导表达的大肠杆菌培养物20分钟。在5毫升缓冲液A(10毫摩尔Tris-Cl,pH7.4,200毫摩尔NaCl,1毫摩尔EDTA)中再悬浮细胞沉淀，并通过超声波裂解20秒，5次。为了利用MBP分离HBV聚合酶，离心粗提取物，将上清液加载到直链淀粉树脂柱(新英格兰生物实验室)，用缓冲液A,50倍上清液体积的体积洗涤该柱的树脂。利用含有10毫摩尔麦芽糖的缓冲液A洗脱与MBP融合的HBV聚合酶。
另外，为了利用组氨酸末端高度纯化HBV聚合酶，如上再次加载到Ni2+-NTA树脂(QIAGEN)得到蛋白质部分。在加载蛋白质样品通过柱后，利用含有10毫摩尔咪唑的10倍树脂体积的缓冲液B(50毫摩尔NaHPO4,300毫摩尔NaCl,10％甘油，10毫摩尔咪唑，pH6.0)，洗涤柱，然后再用30倍树脂体积的缓冲液B洗涤柱。利用10-200毫摩尔浓度梯度的咪唑洗脱和纯化HBV聚合酶。<实施例4>鉴定HBV聚合酶的分子量和纯度
为了鉴定实施例3中得到的HBV聚合酶的分子量和纯度，将纯化的HBV聚合酶在SDS-PAGE上根据Laemmli的方法电泳，同时进行了Western影印，并根据Bradford的方法定量HBV聚合酶的量。
将可以结合组氨酸为末端的蛋白质的MRGSHis-Ag用于Western影印分析。以1∶2,000的比例稀释的MRGSHis-Ag(QIAGEN)用作第一个抗原，和1∶16,000比例稀释的兔抗小鼠IgG(Sigma)用作第二个抗原。
结果是，鉴定了含有组氨酸末尾的本发明的HBV聚合酶含有144KD大小的蛋白质，加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，该大小的蛋白质因为蛋白质的水解在已经纯化的HBV聚合酶的情况中不能检测到(参见图2)。表达的蛋白质浓度是400微克/升，该浓度与已经纯化的HBV聚合酶相同。<实施例5>鉴定HBV聚合酶的活性
为了鉴定在上面的过程中纯化的重组HBV聚合酶的活性，在含有底物的7.5％SDS-PAGE上电泳重组的HBV聚合酶(4.5％浓缩胶)。在电泳后，在复性缓冲液溶液(50毫摩尔Tris-Cl,pH7.4)中浸泡凝胶，并振摇在4℃，温育24小时。
将通过除去SDS复性的凝胶与100毫升反应溶液(50毫摩尔Tris-Cl,pH7.4,5毫摩尔DTT,5毫摩尔MgCl2,0.01％NP-40,10毫摩尔dGTP,10毫摩尔dATP,10毫摩尔dCTP,20微居里32P-dTTP)混合，将反应混合物在37℃温育16小时。然后，在如上所述的反应混合物中加入500毫升5％的TCA-1％Na4P2O7，在4℃洗涤凝胶20小时，将干燥的凝胶在X射线的胶片上曝光。
结果是，推测为HBV聚合酶的144KD的蛋白质与MBP和显示逆转录酶活性的组氨酸末尾融合。另外，含有组氨酸末尾的HBV聚合酶的逆转录酶活性比没有组氨酸末尾的HBV聚合酶更加有活性。<实施例6>测试HBV聚合酶活性
为了测试如上所述的过程纯化的HBV聚合酶的活性，将含有0.5微克纯化的HBV聚合酶，标准聚合酶反应缓冲液，50纳克同聚物模板，和2微居里的32P-d TTP(～3000居里/毫摩尔)的反应混合物在37℃温育1小时。在DDDP活性的测试中，将poly(dA)/oligo(dT)12-18用作模板，在RDDP活性的测试中，将poly(rA)/oligo(dT)12-18用作模板。将这一反应混合物吸附于盘状滤纸，洗涤盘状滤纸，闪烁现象鸡尾酒(5.5克/升PP0,0.15克/升P0P0P)混合，利用液体闪烁计数器测量32P-dTTP的放射性活性。
结果是，本发明的含有组氨酸末端的HBV聚合酶相对显示了比已经纯化的聚合酶的活性更高的DDDP和RDDP特异活性(cpm/微克)。特定地说，本发明的表达载体产生的重组HBV聚合酶的DDDP活性比已经纯化的聚合酶高19倍，本发明的表达载体产生的重组HBV聚合酶的RDDP活性比已经纯化的聚合酶高5.6倍(参见表1)。<表1>比较重组HBV聚合酶的酶活性
<实施例7>构建表达载体pMPRL
| pMPLX | pMPH | |||
| 直链淀粉柱 | 直链淀粉柱 | Ni-NTA柱 | ||
| C.P.M. | 12,757 | 44,134 | 239,850 | |
| DDDP | 特异活性 | 1 | 3.4 | 18.8 |
| C.P.M. | 11,689 | 32,713 | 65,935 | |
| RDDP | 特异活性 | 1 | 2.79 | 5.64 |
为了构建表达载体pMPRL，该载体产生起源于HBV聚合酶的RNase H酶，通过PCR扩增了编码RNase H区(亚区)的HBV聚合酶基因的3’末端的基因部分。5’末端的引物含有SEQ ID NO:2的序列，3’末端的引物含有SEQ IDNO:3的序列(参见序列表)。表达载体pMPLX(韩国专利申请94-3918)用作DNA模板。已经扩增的DNA部分的大小鉴定为0.5kb。通过XmnⅠ限制酶位点切割上面大小的DNA部分，与质粒pMAL-c2连接。通过限制酶EcoRⅠ切割连接的产物，这样，分离了对应于RNase H酶的DNA部分。将上面的DNA部分与利用EcoRⅠ限制酶切割的质粒pMAL-c2连接，最后构建7.2kb大小的表达载体pMPRL(参见图3)。质粒pMAL-c2的MBP基因的开放读码框架和RNase H基因准确地连接，这通过连接的EcoRⅠ位点序列分析得到了鉴定。<实施例8>构建表达载体pMRH
为了构建表达载体pMRH，它产生了起源于含有组氨酸末尾的HBV聚合酶的RNase H区，利用了表达载体pMPH，它产生含有组氨酸末尾的HBV聚合酶。通过限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割表达载体pMPH，所以得到了含有编码组氨酸末尾的DNA序列的DNA部分。在通过限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割实施例7中构建产生RNase H酶的表达载体pMPRL，在上面的表达载体pMPRH中插入了编码组氨酸末尾的DNA序列。结果是，构建了表达载体，它能产生重组蛋白，与MBP和C末端的组氨酸末端融合的RNase H区(参见图4)。<实施例9>表达起源于人HBV聚合酶的RNase H区
利用表达载体pMPRL和pMRH，在大肠杆菌中表达了起源于HBV聚合酶的RNase H区。分别利用表达载体pMRH和pMPRL转化大肠杆菌NM522，在2X YT培养基中过夜培养转化体。将这一生长培养基稀释1∶100，接种进入富葡萄糖的培养基，温育直到OD600达到0.5。在培养基中加入IPTG，它的最后浓度是0.5毫摩尔。将上面生长的培养基再次在23℃温育12小时，并且表达RNase H区。
在3,000rpm离心上面培养的肉汤，用10毫升柱缓冲液(10毫摩尔Tris-HCl,pH7.4,200毫摩尔NaCl,1毫摩尔EDTA)洗涤细胞沉淀，再次离心并再悬浮。重复冷冻，熔化细胞4次，然后，通过超声波处理裂解10秒3次。在13,000rpm,4℃离心上面的过程中制备的粗提取物，分离上清液。重复上面的过程3次，然后将上清液通过直链淀粉树脂。利用50倍树脂体积的柱缓冲液洗涤柱，利用含有10毫摩尔麦芽糖的缓冲液洗脱RNase H区。通过用蛋白酶因子Xa处理，将纯化的重组蛋白质水解成MBP和RNase H区。
另外，从本发明的表达载体pMRH产生的RNase H区通过利用组氨酸为末端的亲和柱得到纯化，因为RNase H在C末端具有组氨酸末尾。利用超声波处理缓冲液(50毫摩尔磷酸钠，pH8.0,300毫摩尔氯化钠)活化组氨酸末端亲和柱中使用的树脂(Ni-NTA,QIAGEN)，在直径约为1厘米的玻璃管中装载4-5毫升活化的树脂。从上面的叙述得到的蛋白质样品以0.1毫升/分钟的流速通过树脂，利用100-200倍蛋白质样品的体积的洗涤缓冲液(50毫摩尔磷酸钠，pH6.0,300毫摩尔氯化钠，10％甘油)洗涤柱。利用浓度梯度为0.01-0.5摩尔的咪唑洗涤柱洗脱重组蛋白质。
结果是，从组氨酸末尾的亲和柱在50毫摩尔咪唑时分离活化的RNase H区。进行SDS-PAGE和Western影印鉴定起源于人HBV聚合酶的纯化RNaseH区(参见图5和图6)。<实施例10>制备RNase H酶的底物
为了鉴定本发明的RNase H活性，利用T7RNA聚合酶进行体外转录制备了用作RNase H酶的底物的RNA/DNA复合物。用于制备流出转录物的模板是起源于质粒pBS的质粒pBS-oligo。利用质粒pBS-oligo转化的大肠杆菌，大量培养转化体以便利用碱性裂解方法得到大量质粒pBS-oligo。限制酶SmaⅠ位点定位于质粒pBS-oligo的T7启动子的下游的102个核苷酸处。
利用限制酶SmaⅠ切割质粒pBS-oligo，在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，从凝胶上洗脱，用于进行体外转录。利用反应混合物进行体外转录，反应混合物由下面物质组成：30微升蒸馏水，20微升5X反应缓冲液(200毫摩尔Tris-HCl，片。5,30毫摩尔氯化镁，10毫摩尔亚精胺，50毫摩尔氯化镁)，10微升DTT,10微升含有2-5微克限制酶SmaⅠ消化的质粒pBS-oligo的溶液，5微升2.5毫摩尔ATP,5微升2.5毫摩尔GTP,5微升2.5毫摩尔UTP,5微升0.1毫摩尔CTP,3微升RNasin,5微升[32P]CTP50微居里，2微升T7RNA聚合酶。将总体积调整到100微升，将上面的反应混合物在37℃温育1-2小时。然后，产生的RNA是102个核苷酸长，利用QIAquick核苷酸除去试剂盒(QIAGEN)分离出来，将其中的1-5微升在8摩尔脲-6％TBE凝胶上电泳，然后干燥凝胶，在X射线胶片上曝光48小时以上。显影X射线胶片以便检测放射性活性信号。
鉴定102个核苷酸RNA的放射性活性信号，将其与等摩尔的合成DNA低聚物(43-mer)混合，该低聚物具有SEQ ID NO:4的DNA序列，在70-80℃加热3-10分钟，然后冷却至室温。最后通过上面过程制备了具有放射性活性信号的RNA/DNA复合物，图7显示了RNA/DNA复合物的结构。<实施例11>鉴定RNase H活性
利用实施例9中纯化的RNase H酶和实施例10中制备的含有放射性信号的RNA/DNA复合物鉴定RNase H活性。为了鉴定本发明的RNase H活性，将本发明的1微克RNase H酶与40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),4毫摩尔氯化镁，40毫摩尔氯化钾和RNA/DNA复合物混合，在37℃温育上面的反应混合物3小时，然后在反应混合物中加入50毫摩尔EDTA终止反应。在小体积的反应溶液中加入同样量的10％的冰冷的TCA。在4℃温育上面的反应混合物1小时，在13,000rpm,4℃离心15分钟。得到上清液，利用闪烁鸡尾酒测量20微升上清液的放射性活化信号。
作为对照，在同样条件下将与RNase H区融合的MBP反应，但没有检测到的放射性活化信号。另外，在同样条件下相互比较下面蛋白质的RNase H活性，下面的蛋白质包括实施例9得到的粗提取物，莫洛尼氏小鼠白血病病毒的商业可得逆转录酶，在从表达载体pMPRL表达后从直链淀粉柱纯化的RNase H酶，在从表达载体pMRH表达后，首先利用直链淀粉柱，然后利用组氨酸为末端的亲和柱纯化的RNase H酶。结果是，RNase H区的活性是商业可得的莫洛尼氏白血病病毒的逆转录酶中含有的RNase H的活性的90％(参见图8)。<实施例12>根据RNase H酶的量变化的RNase H活性
为了测量根据反应条件变化的RNase H活性，改变RNase H酶的反应条件，测量RNase H酶的活性。详细地说，当酶量从0变化到1.6微克，将本发明的RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),4毫摩尔氯化镁，40毫摩尔氯化钾，30,000cpm RNA/DNA复合物，并将反应混合物在37℃温育3小时。结果是，当酶量增加时，RNase H酶活性变得更高(参见图9)。<实施例13>根据反应时期而变化的RNase H活性
将1微克RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),4毫摩尔氯化镁，40毫摩尔氯化钾和30,000cpmRNA/DNA复合物，如实施例11所述将反应混合物在37℃温育，测量显示足够的酶活性的反应时期。大约需要3小时活化RNase H酶(参见图10)。<实施例14>根据反应温度而变化的RNase H活性
当温度从0变化到52℃，将1微克RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),4毫摩尔氯化镁，40毫摩尔氯化钾，30,000cpmRNA/DNA复合物，将反应混合物如实施例11所述温育3小时。
结果是，鉴定了具有RNase H活性的温度范围是相当宽的范围32-42℃(参见图11)。<实施例15>随着反应溶液的pH而变化的RNase H活性
当pH从pH6.0变化到pH10.0时，将1微克RNase H酶与下面的物质混合：40毫摩尔Tris-Cl,4毫摩尔氯化镁，40毫摩尔氯化钾，和30,000cpmRNA/DNA复合物混合，将反应混合物在37℃如实施例11所述温育3小时。RNase H活性在pH范围7.5-8.8具有最高的值(参见图12)。<实施例16>根据氯化钾的浓度而变化的RNase H活性
当氯化钾的浓度从0变化到400毫摩尔，将1微克RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),4毫摩尔氯化镁和30,000rpmRNA/DNA复合物，将反应混合物在37℃如实施例11所述温育3小时。当氯化钾的浓度在20-100毫摩尔时RNase H的活性的值最高(参见图13)。<实施例17>根据镁离子的浓度而变化的RNase H活性
当镁离子(Mg2+)的浓度从0变化到50毫摩尔时，将1微克RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9),40毫摩尔氯化钾和30,000cpmRNA/DNA复合物，将反应混合物在37℃如实施例11所述温育3小时。当镁离子的浓度为4到8毫摩尔时RNase H活性的值最高(参见图14)。<实施例18>根据锰离子的浓度而变化的RNase H活性
当反应溶液的阳离子(Ⅱ)用锰离子(Mn2+)替代时，将1微克RNase H酶与下面物质混合：40毫摩尔Tris-Cl(pH7.9)，40毫摩尔氯化钾，和30,000cpmRNA/DNA复合物，将反应混合物在37℃如实施例11所述温育3小时。当锰离子的浓度为4-12毫摩尔时，RNase H活性最高(参见图15)。<实施例19>利用HBV聚合酶筛选HBV抗病毒试剂
利用本发明的HBV聚合酶，为了筛选抗病毒试剂进行下面的反应。将50微升反应混合物在37℃温育1小时，该反应混合物分别含有下面物质：0.5微克纯化的HBV聚合酶，50毫摩尔Tris-Cl,pH7.4,50毫摩尔氯化钾，0.5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔DTT,0.01％NP-40,50纳克同聚物模板(RDDP:poly(rA)/oligo(dT)12-18；DDDP:poly(dA)/oligo(dT)12-18)和2微居里[α-32P]TTP(3,000居里/毫摩尔)。然后，通过TCA沉淀反应溶液，吸附于DE-81阴离子吸附滤纸。用0.1摩尔磷酸缓冲液洗涤含有样品的吸附滤纸，用红外射线干燥已洗涤的滤纸。然后，在与闪烁鸡尾酒混合后，通过测量放射性活性测试RNase H活性(cpm)。
为了利用上面的过程选择抗病毒试剂，在上面的反应混合物中加入了10微升推测的抗病毒试剂，测量抗病毒活性，并与不含有抗病毒试剂的反应样品的酶活性比较。<实施例20>利用RNase H酶筛选HBV抗病毒试剂
利用本发明的RNase H酶，为了筛选抗病毒试剂通过下面的过程制备酶底物。
为了制备RNA转录物，利用大肠杆菌RNA聚合酶纯化和转录M13噬菌体的单链DNA。将下面的反应混合物在37℃与1微升大肠杆菌RNA聚合酶温育15小时：4微升缓冲液溶液(200毫摩尔Tris-Cl,pH7.5,30毫摩尔氯化镁，10毫摩尔亚精胺，和50毫摩尔氯化钠)，2微升100毫摩尔DTT,1微升RNasin(Promega),1微升2.5毫摩尔ATP,1微升2.5毫摩尔GTP,1微升2.5毫摩尔UTP,0.6微升没有RNase的蒸馏水，2.4微升0.1毫摩尔CTP,1微升M13mp19的单链DNA(约1微克/微升)和5微升[α-32P]CTP(10微居里/微升，Amersham)。将上面的反应混合物通过SephadexG-50柱，以便除去残留的核酸。检测通过上面的柱的反应溶液的体积，在上面的反应混合物中加入2×乙醇的体积，在-20℃沉淀1小时。通过离心和用70％的乙醇洗涤得到上面沉淀的RNA转录物。然后，在100微升10毫摩尔Tris-Cl,pH8.0中再悬浮RNA转录物，检测1微升RNA转录物溶液中的放射性活性信号。
另外，将通过上面的过程得到了RNA转录物和M13mp19的单链DNA悬浮于缓冲液溶液(10毫摩尔Tris-Cl,pH8.0,1毫摩尔EDTA,80毫摩尔氯化钾)中，将同样的量在85℃加热2分钟，然后在室温下冷却上面的反应混合物。结果是，通过用乙醇沉淀得到RNA/DNA复合物，并在100微升TE缓冲液(pH8.0)中悬浮。
为了测量上面的RNase H活性，制备含有下面物质的反应混合物：25微升2×缓冲液溶液(40毫摩尔Tris-Cl,pH8.0,20毫摩尔氯化钾，2毫摩尔氯化镁，4毫摩尔DTT)，5微升RNase H区，5微升酶底物(大约50,000cpm)和15微升蒸馏水，并将反应混合物在37℃温育30分钟。利用25微升7.5摩尔乙酸铵终止反应，并利用230微升乙醇沉淀。为了测量抗病毒活性，在上面的反应混合物中加入了5微升抗病毒试剂，测量抗病毒活性并与不含有抗病毒试剂的的反应样品的RNase H的酶活性比较。
正如上面的叙述说明的，在大肠杆菌中可以大量生产高度活化的HBV聚合酶，因为本发明的HBV聚合酶由于它的组氨酸末尾是稳定的。利用组氨酸末端亲和柱色谱层析可以容易地纯化本发明的HBV聚合酶。准确地说，该HBV聚合酶显示了高度特异的活性，如比已经纯化的聚合酶高5-20倍的活性，因为通过开发MBP和组氨酸末端可以成倍地纯化HBV聚合酶。在大肠杆菌中也可以大量地产生起源于HBV聚合酶的RNase H酶，并容易地纯化。另外，在纯化过程中高度地保留了RNase H活性。
所以，可以利用本发明的HBV聚合酶和它的RNase H区，以便有效地选择各种抗病毒试剂。可以利用本发明的筛选方法选择的抗病毒试剂以便理解HBV复制的机制，并治疗HBV感染引起的肝炎，肝硬化，和肝癌。序列表(1)总的资料
(ⅲ)序列数：4(2)SEQ ID NO:1的资料：
(Ⅰ)序列特征：(A)长度：50个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)几何结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GGAGACCACC GCATCACCAT CACCATCACT GAGAATTCAC GCCCATCAGG(2)SEQ ID NO:2的资料：
(Ⅰ)序列特征：(A)长度：35个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)几何结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:CCCCGTTGCC CGGGAATTCC GAACAGGTCT CTGCC(2)SEQ ID NO:3的资料：(Ⅰ)序列特征：(A)长度：18个碱基对 (B)类型：核酸(C)链数：单链(D)几何结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:TCACGGTGGT CTCCATGC(2)SEQ ID NO:4的资料：(Ⅰ)序列特征：(A)长度：43个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)几何结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(合成的低聚核苷酸)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:AATTGCGTGC GAGGCGATTG GTTTGGGGCC AGAGTGGGCC AGG
Claims (23)
1．含有组氨酸末端的HBV聚合酶。
2．根据权利要求1所述的HBV聚合酶，它与麦芽糖结合蛋白融合。
3．根据权利要求2所述的HBV聚合酶，在C末端含有组氨酸末端。
4．在大肠杆菌中产生权利要求1所述的HBV聚合酶的表达载体。
5．根据权利要求4所述的表达载体，它是表达载体pMPH。
6．利用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞而制备的大肠杆菌转化体。
7．根据权利要求6所述的大肠杆菌转化体，它是利用表达载体pMPH(KCCM-10084)转化寄主细胞而制备的。
8．制备根据权利要求1所述的HBV聚合酶的方法，包括如下步骤：(a)培养权利要求6所述的大肠杆菌转化体，(b)诱导HBV聚合酶的表达，(c)对大肠杆菌转化体的粗提取物进行组氨酸末端亲和柱色谱层析。
9．制备根据权利要求8所述的HBV聚合酶的方法，还含有如下步骤：(a)进行直链淀粉亲和柱色谱层析，(b)利用蛋白酶因子Xa处理。
10．起源于人HBV聚合酶的RNase H酶。
11．根据权利要求10所述的RNase H酶，它与麦芽糖结合蛋白融合。
12．根据权利要求11所述的RNase H酶，在C末端含有组氨酸末端。
13．根据权利要求10所述的RNase H酶，它在32-42℃，在pH范围7.5-8.8，在含有20-100毫摩尔的氯化钾，4-8毫摩尔的镁离子或4-12毫摩尔的锰离子的反应溶液时是活化的。
14．产生权利要求11所述的RNase H酶的表述载体pMPRL。
15．利用权利要求14所述的表达载体pMPRL(KCCM-10092)转化寄主细胞而制备的大肠杆菌转化体。
16．生产权利要求12的RNase H酶的表达载体pMRH。
17．利用权利要求16所述的表达载体pMRH(KCCM-10091)转化寄主细胞而制备的大肠杆菌转化体。
18．制备权利要求10所述的RNase H酶的方法，包括如下步骤：(a)在培养权利要求15或权利要求17所述的大肠杆菌转化体后诱导RNase H酶的表达，(b)对粗提取物进行直链淀粉亲和柱色谱层析，(c)用蛋白酶因子Xa处理。
19．根据权利要求18制备权利要求10的RNase H酶的方法，还包括另外一个步骤：对权利要求17所述的大肠杆菌转化体进行组氨酸末端的亲和柱色谱层析。
20．权利要求1所述的HBV聚合酶在筛选人HBV的抗病毒剂中的应用。
21．权利要求10所述的RNase H酶在筛选RNase H酶的抑制剂和人HBV的抗病毒中的应用。
22．筛选抗病毒剂的方法，包括如下步骤：
(a)将权利要求1所述的HBV聚合酶与放射性核苷酸和抗病毒剂反应，
(b)将反应溶液吸附于阴离子吸附滤纸，并干燥滤纸，
(c)利用闪烁鸡尾酒测量(b)步骤的吸附滤纸的放射性活性，
(d)将(c)的结果与(a)中没有抗病毒试剂反应的比较样品的结果进行比较。
23．筛选抗病毒试剂的方法，包括如下的步骤：
(a)将权利要求10的RNase H酶与RNA/DNA复合物和抗病毒剂反应，
(b)加入乙酸铵终止(a)步骤的反应，利用乙醇沉淀，并离心，
(c)测量(b)步骤的上清液的放射性活性。
(d)将(c)步骤的结果与(a)步骤中没有抗病毒剂反应的比较样品的结果进行比较。
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