CN1226202C - 利用微生物净化养殖水体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用微生物净化养殖水体的方法，将硝化细菌和亚硝化细菌、反硝化细菌中的脱氮硫杆菌、硫化细菌、和光合细菌这四类不同生理类群的微生物功能菌投放到有剩余饵料并经不同微生物分解后产生出不同污染物——氨或/和铵、还原态硫化物、和小分子有机物的养殖水体中，投放量为养殖水体的0.05～0.20%，各类菌群投入的体积比为，硝化细菌和亚硝化细菌∶反硝化细菌中的脱氮硫杆菌∶硫化细菌∶光合细菌＝(1～4)∶(1.6～3)∶(2～3.6)∶(1～4)，本发明利用多种细菌对养殖水体中的多种污染成分进行同时治理，以使养殖水体中的污染成分达到一次同时净化的要求，可以显著减少养殖水体中的污染物及其对鱼虾的毒害作用。

Description

利用微生物净化养殖水体的方法

技术领域

本发明要求保护的技术方案涉及以微生物为特征的水的生物处理，具体地说是利用微生物净化养殖水体的方法。

背景技术

养殖业的日益发展提高了人民的生活水平。然而，养殖业发展中存在的问题是：投放的饵料有一部分被水体中存在的好氧微生物所分解，最终产生出对鱼虾有毒害作用的氨或/和铵、还原态硫化物、小分子有机酸等污染成分。

近年来，已经有人开展将微生物应用于养殖水体净化的研究，通过微生物对污染物的吸收利用，使污染物对鱼虾的毒害降低。从已经公开的专利或非专利文献来看，目前利用微生物对养殖水体进行净化的方法只限于利用一种或两种细菌作用于受污染的养殖水体使其净化。CN 1245151介绍了一种改善养殖池水质的微生物处理系统，主要是用光合细菌、好氧细菌及其混合菌挂膜来改善养殖水水质；RU 2168220提出利用绿藻和硫化细菌净化鱼塘水体环境；US 5054424提出通过光合细菌和硝化细菌，来净化水体；KR 9603924，wO 0104060提出通过培养芽孢杆菌、假单孢菌等微生物共同净化废水。

以上所述的各种方法，都只能对造成养殖水体污染的某一、二种污染成分进行一定程度的治理。然而养殖水体中往往同时存有多种的污染成分，其中既有氧化性污染成分，又有还原性污染成分，采用以上所述的各种方法均达不到一次同时净化多种污染成分的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用多种细菌对养殖水体中的多种污染成分进行同时治理的微生物净化方法，以使养殖水体中的多种污染成分达到一次同时净化的要求。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：将亚硝化细菌和硝化细菌、反硝化细菌中的脱氮硫杆菌、硫化细菌、和光合细菌这四类不同生理类群的微生物功能菌投放到有剩余饵料并经不同微生物分解后产生出不同的污染物——氨或/和铵、还原态硫化物和小分子有机物的养殖水体中，其中用硝化细菌和亚硝化细菌去除氨；用硫化细菌去除还原态硫化物；用反硝化细菌中的脱氮硫杆菌同时去除硝酸盐氮和还原态硫化物；用光合细菌中的红硫细菌去除小分子有机酸和还原态硫化物，总投放量为养殖水体体积的0.05～0.20％，各类菌群投入的体积比为，亚硝化细菌和硝化细菌∶反硝化细菌中的脱氮硫杆菌∶硫化细菌∶光合细菌＝(1～4)∶(1.6～3)∶(2～3.6)∶(1～4)。

上述四类功能菌均从养殖污染水体中直接筛选而来，并对筛选而来的功能菌用改良培养方法加以培养。

本发明的有益效果是：运用本发明方法不但对养殖水体中的多种污染成分达到一次同时净化的要求，而且运用本发明改良培养方法培养出来的细菌其对污染物的去除效果明显高于非改良培养方法培养出来的细菌对污染物的去除效果，具体可参看实施例表中的数据。本发明还具有以下优点：

(1)养殖水体中的污染成分可直接作为上述功能菌的营养源，无需另加营养。

(2)运用本发明方法可以对用已报道的生物净化方法不能达到净化目的的污染养殖水体进行治理。

(3)本发明与现有生物净化水质的方法相比，可以明显减少养殖水体中的污染物及其对鱼虾的毒害作用。

从已经公开的文献可以看出，以往利用微生物对污染水体的净化多是采用一到两种功能菌来进行。本发明则同时采用四种功能菌对污染水体进行一次性达标的净化。当然，这并不是说加入的功能菌越多，所产生的效果越好。本发明发明人通过反复实验才得出了利用本发明改良培养方法培养出来的四种功能菌处理养殖水体的污染物，要比同时用已有的三种或五种或更多种功能菌处理养殖水体的污染物效果都要好的结果，有以下实施例8、9为证。

具体实施方式

实施例1

光合细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制光合细菌的液体培养基：

光合细菌富集与分离的基础培养基组分

(A)NH₄C1 1.0、K₂HPO₄ 0.5、MgCl₂ 0.2、NaCl 2.0、CH₃COONa 0.5、酵母膏 0.1、Na₂S 0.2、FeCl₃ 0.1，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，

(B)经过滤除菌的重量百分比浓度为10％NaHCO₃水溶液，

将(A)和(B)按体积比20∶1的比例混合，调节pH值为7.2～7.5，配制成光合细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：取上述光合细菌的液体培养基70～80ml，装入1个100ml大试管中，在121℃温度下灭菌30分钟，然后取被污染的养殖水10ml，倒入该大试管中，放入目前实验室中厌氧条件最严格的厌氧工作站内光照培养，培养条件如下：

培养时间：7天           光照强度：1050～1200Lux

光源类型：白炽灯4×60W  光照距离：  20cm

培养温度：30℃          倾斜度：  60°

由此培养出来的光合细菌富集培养液若出现红色，则进行分离培养，若不出现红色，则再富集一次，直到成为出现红色的光合细菌富集培养液；

第三步，分离培养：在100ml光合细菌的培养基组分(A)中加入1.5g的琼脂，灭菌，待培养基温度降到45℃左右时，在无菌条件下，按体积比(A)∶(B)＝20∶1的比例加入(B)液，调节pH值为7.2～7.5，然后，迅速加入上述第二步制得的光合细菌富集培养液10ml，再在第二步培养条件下培养，当琼脂中出现红色菌落时，在无菌条件下进行单个菌落的转液体培养，培养条件与第二步的培养条件相同。

实施例2

硝化细菌分为亚硝化细菌和硝化细菌两个亚类。亚硝化细菌将氨氧化成亚硝态氮，硝化细菌则将亚硝态氮氧化成硝态氮。

亚硝化细菌培养体和硝化细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制亚硝化细菌和硝化细菌的液体培养基：

(1)亚硝化细菌富集与分离培养的基础培养基组分

(NH₄)₂S0₄ 2.0、NaCl 2.0、MgSO₄·7H₂O 0.5、K₂HPO₄1.0、FeSO₄·7H₂O 0.4、CaCO₃5.0，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调节溶液的pH值为pH7.0～7.4，配制成亚硝化细菌的液体培养基；

(2)硝化细菌富集与分离的基础培养基组分

KNO₂ 1.3、NaCl 2.0、MgSO₄·7H₂O 0.5、K₂HPO₄ 1.0、FeSO₄·7H₂O 0.4、CaCO₃ 5.0，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调溶液的pH值为7.0～7.4，配制成硝化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：取上述亚硝化细菌和硝化细菌的液体培养基各200ml，分别装入内壁具有褶皱的500ml培养瓶中，再分别加入污染的养殖水20ml，进行通气摇瓶培养，培养时间约为2～3周，分别制成亚硝化细菌和硝化细菌的富集培养液；

第三步，分离培养：先制作硅胶平板培养基，取比重为1.84g/ml的浓H₂SO₄ 5ml、比重为1.19g/ml的浓HCl 20ml、蒸馏水140ml、硅酸钠51.7g溶于156ml水中的溶液，混合后立即倒成平板，几分钟后即可凝固成性能良好的培养基基质，同样制作2个，然后，用蒸馏水轻轻冲洗该平板培养基至用0.1％Ag₂SO₄检验无白色沉淀产生为止，放入50～60℃烘箱中稍烘干；再后在每个硅胶平板培养基上加入5ml亚硝化细菌的液体培养基和5ml硝化细菌的液体培养基，烘干，紫外灯下杀菌30分钟；取由第二步制得的亚硝化细菌富集培养液和硝化细菌富集培养液各2ml，在无菌操作条件下，分别加入到相应的硅胶平板培养基内，涂平板，通入无菌空气培养，培养时间约为2～3周；挑取经富集培养的亚硝化细菌和硝化细菌单菌落，分别接入相应的内壁具有褶皱的500ml培养瓶中并进行通气摇瓶培养，培养瓶内相应培养基的量分别为150～200ml，培养时间为2～3周。

实施例3

反硝化细菌中的脱氮硫杆菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制反硝化细菌的液体培养基：

反硝化细菌中的脱氮硫杆菌富集与分离的基础培养基组分

(A)KNO₃ 0.4、Na₂S₂O₃·5H₂O 1.0、K₂HPO₄ 0.4、NH₄Cl 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.12、NaHCO₃0.2、FeSO₄·7H₂O 0.002，其中所有数量单位均为g/200ml水溶液，

(B)经过滤除菌的重量百分比浓度为10％NaHCO₃水溶液，

将(A)和(B)按100∶1的体积比例混合，调节pH值为7.0～7.4，配制成反硝化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：在无菌操作条件下，在100ml无菌大试管中接入上述液体培养基70～80ml，再接入污染养殖水20ml，放入厌氧工作站中培养，温度为30℃，培养7天左右，制成反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的富集培养液；

第三步，分离培养：先配制反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的液体培养基(A)组分100ml，加入1.2g琼脂，于121℃灭菌30分钟，冷却到45℃左右，此时加入无菌10％NaHCO₃水溶液1ml，调pH值为7.0～7.4，立即倒平板；然后涂上由第二步制得的反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的富集培养液2ml，放入厌氧工作站，30℃培养7天左右，培养基上长出半透明的圆形菌落；再后，挑取单菌落接入100ml深层液体培养基中，液体培养基中倒立一个杜氏小管，放入厌氧工作站培养，培养条件同第二步富集培养，培养结束时看到，杜氏小管顶部有一小气泡，此为脱氮硫杆菌产生的氮气。

实施例4

硫化细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制硫化细菌的液体培养基：

硫化细菌富集与分离基础的培养基组分

Na₂S 2.0、Na₂S₂O₃·5H₂O 5.0、K₂HPO₄ 2.0、NH₄Cl 0.5、MgSO₄·7H₂O 0.6、NaHCO₃ 1.0、FeSO₄·7H₂O 0.01，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调溶液的pH值为7.0～7.4，配制成硫化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：配制上述液体培养基200ml，装入1个内壁具有褶皱的500ml锥形瓶中，接入污染的养殖水20ml，于30℃下摇瓶培养2天，制成硫化细菌的富集培养液；

第三步，分离培养：配制硫化细菌的液体培养基100ml，加入琼脂1.2g，调节pH值为7.0～7.4，灭菌，倒平板，涂上由第二步制得的硫化细菌的富集培养液2ml，于30℃下培养2天，培养基上长出菌落，挑取单菌落，接入装在内壁具有褶皱的500ml培养瓶中的100ml硫化细菌的液体培养基中，摇瓶培养，培养条件同第二步富集培养。

实施例5

将自实施例1-4培养出来的光合细菌、硝化细菌、硫化细菌、反硝化细菌四类生理功能菌培养体，按体积比1∶1∶1∶1的比例混合取20ml接入20L水产养殖污染水体中，在光照强度1000～1280Lux、30℃下培养，定时取样测试COD、铵态氮、总氮、还原态硫化物和有机酸含量，结果见表1。

表1 0.1％多功能菌群投入量对水产养殖水体污染物去除效果

表1说明，在上述条件下，COD的7天去除率为62.2％，铵态氮的去除率为56.5％，总氮去除率为70％，还原态硫化物的去除率为68.8％，有机酸去除率为86.5％。各种菌的作用效果都较明显，能在较大程度上去除养殖水体中的污染物，说明该方法适合于各种受污染的养殖水体净化。

实施例6

将自实施例1-4培养出来的光合细菌、硝化细菌、硫化细菌及反硝化细菌培养液，按体积比1∶1∶1∶1的比例混合，取40ml接入20L水产养殖污染水体中，在光照强度为1000～1280Lx、30℃下培养，定时取样测水体COD、铵态氮、总氮、还原态硫化物及有机酸含量，结果见表2。

表2 0.2％多功能菌群投入量对水产养殖水体污染物去除效果

本实验结果(表2)表明，增加多功能菌群的投入量，可更有效去除水产养殖水体中的各种污染物，被污染的水体用该菌群处理5天或7天，COD的去除率为60.8％和78.9％，铵态氮的去除率为56.2％和72.5％，总氮去除率为73％和87.6％，还原态硫化物的去除率为64.5％和79.1％，有机酸去除率为82.1％和98.5％，使水产养殖水体得到更充分的净化。

实施例7

将自实施例1-4培养出来的多功能菌群光合细菌、硝化细菌、硫化细菌及反硝化细菌培养液，按体积比1∶2∶2∶1的比例混合，取40ml接入20L水产养殖污染水体中，在光照强度为1000～1280Lx、30℃下培养，定时取样测水体COD、铵态氮、总氮、还原态硫化物及有机酸含量，结果见表3。

表3 多功能菌群配比的改变对水产养殖水体污染物去除效果

表3结果表明，多功能菌群的投入量不变(0.2％)，改变菌群间的配比，可相应改变水体某些污染物的去除效果，本实验加大了硝化细菌和硫化细菌的投入比例，因而增强了污染水体中铵态氮和还原态硫化物的去除效果。在使用多功能菌群处理水产养殖污染水体时，应根据水体污染指标，适当调配菌群间的配比，以达到更有效净化水体的目的。

实施例8

只运用其中的三种功能菌如光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌对指定的污染养殖水体进行净化，其净化效果如表4数据，其它培养条件与上述培养条件相同，均为最适培养条件。

表4三种功能菌对养殖水体污染物的去除效果

注：表中实验数据为0.2％的接种量的测得值。

由表4数据可以看出，只运用三种功能菌，如光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌对指定的污染养殖水体进行净化，其净化效果与表2数据相比较，相对较差。即四种菌的净化效果明显好于三种菌的净化效果。

实施例9

运用五种功能菌光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌、芽孢杆菌等五种菌对污染养殖水体进行净化，其净化效果如表5数据所示。其它培养条件与上述培养条件相同，均为最佳培养条件。

表5五种功能菌对养殖水体污染物的去除效果

注：表中实验数据为0.2％的接种量的测得值。

由表5数据可以看出，五种菌光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌、芽孢杆菌对污染物的去除效果与表2数据相比较，并不太明显。有些测得值反而呈下降趋势。故可以得出结论，四种菌对养殖水体污染物的去除效果要比五种菌的去除效果好的多。因此采用四种功能菌：光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌对污染养殖水体进行净化是最佳的方案。

表6各专利文献报道的相应污染物去除率与本实验中各污染物去除率比较

注：表中本实验数据是0.2％的接种量的测得值。

由表6数据可以看出两点差别：

(1)本发明采用四种生理菌-光合细菌、硝化细菌、硫化细菌、反硝化细菌进行养殖水体污染物---氨、还原态硫化物和小分子有机酸的去除，从已公开的专利来看，还没有任何一个专利同时采用这四种菌进行污染水体的净化处理。

(2)通过本发明培养出来的各功能菌对污染水体中的污染物去除效果明显高于已公开的专利中报道的各功能菌的去除效果，对污染物的去除较彻底。

Claims (6)

1.利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：将亚硝化细菌和硝化细菌、反硝化细菌中的脱氮硫杆菌、硫化细菌、和光合细菌这四类微生物功能菌投放到有剩余饵料并经不同微生物分解后产生出不同的污染物——氨或/和铵、还原态硫化物和小分子有机物的养殖水体中，总投放量为养殖水体体积的0.05～0.20％，各类菌群投入的体积比为，亚硝化细菌和硝化细菌∶反硝化细菌中的脱氮硫杆菌∶硫化细菌∶光合细菌＝(1～4)∶(1.6～3)∶(2～3.6)∶(1～4)。

2.根据权利要求1所述的利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：上述四类功能菌均从养殖污染水体中直接筛选而来，并对筛选而来的功能菌用改良培养方法加以培养。

3.根据权利要求1或2所述的利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：光合细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制光合细菌的液体培养基：

光合细菌富集与分离的基础培养基组分

(A)NH₄Cl 1.0、K₂HPO₄ 0.5、MgCl₂ 0.2、NaCl 2.0、CH₃COONa 0.5、酵母膏0.1、Na₂S 0.2、FeCl₃ 0.1，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，

(B)经过滤除菌的重量百分比浓度为10％NaHCO₃水溶液，

将(A)和(B)按体积比20∶1的比例混合，调节pH值为7.2～7.5，配制成光合细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：取上述光合细菌的液体培养基70～80ml，装入1个100ml大试管中，在121℃温度下灭菌30分钟，然后取被污染的养殖水10ml，倒入该大试管中，放入目前实验室中厌氧条件最严格的厌氧工作站内光照培养，培养条件如下：

培养时间：7天               光照强度：1050～1200Lux

光源类型：白炽灯4×60W      光照距离：20cm

培养温度：30℃              倾斜度：60°

由此培养出来的光合细菌富集培养液若出现红色，则进行分离培养，若不出现红色，则再富集一次，直到成为出现红色的光合细菌富集培养液；

第三步，分离培养：在100ml光合细菌的培养基组分(A)中加入1.5g的琼脂，灭菌，待培养基温度降到45℃左右时，在无菌条件下，按体积比(A)∶(B)＝20∶1的比例加入(B)液，调节pH值为7.2～7.5，然后，迅速加入上述第二步制得的光合细菌富集培养液10ml，再在第二步培养条件下培养，当琼脂中出现红色菌落时，在无菌条件下进行单个菌落的转液体培养，培养条件与第二步的培养条件相同。

4.根据权利要求1或2所述的利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：亚硝化细菌培养体和硝化细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制亚硝化细菌和硝化细菌的液体培养基：

(1)亚硝化细菌富集与分离培养的基础培养基组分

(NH₄)₂SO₄ 2.0、NaCl 2.0、MgSO₄·7H₂O 0.5、K₂HPO₄ 1.0、FeSO₄·7H₂O 0.4、CaCO₃ 5.0，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调节溶液的pH值为pH7.0～7.4，配制成亚硝化细菌的液体培养基；

(2)硝化细菌富集与分离的基础培养基组分

KNO₂ 1.3、NaCl 2.0、MgSO₄·7H₂O 0.5、K₂HPO₄ 1.0、FeSO₄·7H₂O 0.4、CaCO₃ 5.0，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调溶液的pH值为7.0～7.4，配制成硝化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：取上述亚硝化细菌和硝化细菌的液体培养基各200ml，分别装入内壁具有褶皱的500ml培养瓶中，再分别加入污染的养殖水20ml，进行通气摇瓶培养，培养时间约为2～3周，分别制成亚硝化细菌和硝化细菌的富集培养液；

第三步，分离培养：先制作硅胶平板培养基，取比重为1.84g/ml的浓H₂SO₄ 5ml、比重为1.19g/ml的浓HCl 20ml、蒸馏水140ml、硅酸钠51.7g溶于156ml水中的溶液，混合后立即倒成平板，几分钟后即可凝固成性能良好的培养基基质，同样制作2个，然后，用蒸馏水轻轻冲洗该平板培养基至用0.1％Ag₂SO₄检验无白色沉淀产生为止，放入50～60℃烘箱中稍烘干；再后在每个硅胶平板培养基上加入5ml亚硝化细菌的液体培养基和5ml硝化细菌的液体培养基，烘干，紫外灯下杀菌30分钟；取由第二步制得的亚硝化细菌富集培养液和硝化细菌富集培养液各2ml，在无菌操作条件下，分别加入到相应的硅胶平板培养基内，涂平板，通入无菌空气培养，培养时间约为2～3周；挑取经富集培养的亚硝化细菌和硝化细菌单菌落，分别接入相应的内壁具有褶皱的500ml培养瓶中并进行通气摇瓶培养，培养瓶内相应培养基的量分别为150～200ml，培养时间为2～3周。

5.根据权利要求1或2所述的利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：反硝化细菌中的脱氮硫杆菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制反硝化细菌的液体培养基：

(A)KNO₃ 0.4、Na₂S₂O₃·5H₂O 1.0、K₂HPO₄ 0.4、NH₄Cl 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.12、NaHCO₃0.2、FeSO₄·7H₂O 0.002，其中所有数量单位均为g/200ml水溶液，

(B)经过滤除菌的重量百分比浓度为10％NaHCO₃水溶液，

将(A)和(B)按体积比100∶1的体积比例混合，调节pH值为7.0～7.4，配制成反硝化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：在无菌操作条件下，在100ml无菌大试管中接入上述液体培养基70～80ml，再接入污染养殖水20ml，放入厌氧工作站中培养，温度为30℃，培养7天左右，制成反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的富集培养液；

第三步，分离培养：先配制反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的液体培养基(A)组分100ml，加入1.2g琼脂，于121℃灭菌30分钟，冷却到45℃左右，此时加入无菌10％NaHCO₃水溶液1ml，调pH值为7.0～7.4，立即倒平板；然后涂上由第二步制得的反硝化细菌中的脱氮硫杆菌的富集培养液2ml，放入厌氧工作站，30℃培养7天左右，培养基上长出半透明的圆形菌落；再后，挑取单菌落接入100ml深层液体培养基中，液体培养基中倒立一个杜氏小管，放入厌氧工作站培养，培养条件同第二步富集培养，培养结束时看到，杜氏小管顶部有一小气泡，此为脱氮硫杆菌产生的氮气。

6.根据权利要求1或2所述的利用微生物净化养殖水体的方法，其特征在于：硫化细菌培养体的培养方法具体如下：

第一步，配制硫化细菌的液体培养基：

硫化细菌富集与分离基础的培养基组分

Na₂S 2.0、Na₂S₂O₃·5H₂O 5.0、K₂HPO₄ 2.0、NH₄Cl 0.5、MgSO₄·7H₂O 0.6、NaHCO₃ 1.0、FeSO₄·7H₂O 0.01，其中所有数量单位均为g/1000ml水溶液，调溶液的pH值为7.0～7.4，配制成硫化细菌的液体培养基；

第二步，培养富集培养液：配制上述液体培养基200ml，装入1个内壁具有褶皱的500ml锥形瓶中，接入污染的养殖水20ml，于30℃下摇瓶培养2天，制成硫化细菌的富集培养液；

第三步，分离培养：配制硫化细菌的液体培养基100ml，加入琼脂1.2g，调节pH值为7.0～7.4，灭菌，倒平板，涂上由第二步制得的硫化细菌的富集培养液2ml，于30℃下培养2天，培养基上长出菌落，挑取单菌落，接入装在内壁具有褶皱的500ml培养瓶中的100ml硫化细菌的液体培养基中，摇瓶培养，培养条件同第二步富集培养。