CN1225683A - 血管活性胺结合分子 - Google Patents

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Abstract

按照本发明,提供以低于10－7M的解离常数与血管活性胺类特异性结合的血管活性胺结合蛋白(VABP),它们与MS－HBP1、FS－HBP1、FS－HBP2及D.RET6属于同一蛋白家族。

Description

血管活性胺结合分子
本发明涉及血管活性胺结合分子(VABM)及其在调节血管活性胺类作用中的用途。本发明特别涉及来源于寄生虫蛋白或其衍生物的VABM。本发明还涉及血管活性胺的检测与定量以及对由动物和人类中的寄生虫引起，尤其是那些由家畜的外寄生虫引起的疾病或损伤的控制。也涉及到血管活性结合分子在疾病和变态反应治疗中的用途。本发明也涉及运用重组DNA技术生产VABM。
血管活性胺类如组胺和5-羟色胺是动物中(包括人类)炎症的介质及特定生理过程的调节物。组胺存在于肥大细胞及嗜碱细胞的分泌颗粒中并经组氨酸脱羧作用形成。它还存在于麦角及植物中并可从组氨酸或枸橼酸合成。
在人类中组胺的主要作用是刺激胃的分泌、收缩大多数平滑肌、刺激心脏、舒张血管以及增强血管通透性。除它在免疫反应及炎症过程中的调节作用外，组胺还调节机体内许多细胞因子(包括那些调节炎症的的细胞因子)的产生，并能够干扰细胞因子受体的表达。另外，组胺促进伤口愈合。
组胺最主要的病理生理作用是作为胃酸分泌的刺激物以及作为Ⅰ型超敏反应(例如荨麻疹及枯草热)的介质。组胺或其受体也可以直接或间接地参与自身免疫病，如关节炎或与肿瘤生长(Falus,1994)。
组胺通过作用于特定的组胺受体(其三个主要类型H1、H2、H3可通过选择性拮抗物以及激动剂来鉴别)而产生作用。组胺H1和H2受体拮抗物在临床上有用，但在目前主要用组胺H3受体拮抗物作为研究工具。
H1受体拮抗物(抗组胺类)被广泛用于治疗包括变应性鼻炎(枯草热)、荨麻疹、昆虫叮咬以及药物过敏性在内的变态反应。优选缺乏镇静药或毒蕈碱性受体拮抗药活性的药物。H1受体拮抗药还被用作预防晕动病或其它恶心原因(包括严重的孕妇晨吐)的抗催吐药。一些抗组胺类的毒蕈碱性受体拮抗作用也许有助于疗效，但也引起副反应。一些H1受体拮抗药是十分有力的镇静药因此或可用于这种作用。
H1受体拮抗物具有许多不良作用。当纯粹用于抗组胺作用时，所有的CNS效应均是不希望有的。当用于其镇静药或抗催吐作用时，一些CNS效应如头晕、耳鸣以及疲倦是不想要的。多余剂量能够引起兴奋并可在儿童中产生抽搐。外周抗毒蕈碱作用一直是不受欢迎的。这些中最普通的是口干，但视力模糊、便秘以及尿潴留也可能发生。也已观察到与药物的药理学功能无关的不想要的作用。因此虽然局部应用这些药物后可以发生变应性皮炎，但胃肠紊乱也相当普遍。
H2受体拮抗物被频繁用作胃酸分泌抑制剂。它们被用作治疗消化性溃疡的选择药物，用作佐林格-埃利森综合症的二线药物以及用于治疗回流性食管炎。据报道不想要的效应包括腹泻、头晕、肌痛、一过性疹子以及血胃泌素过多症。一些H2受体拮抗物可在男性中引起男性女性型乳房，并在老年人中引起精神混乱。
除这些非期望的效应以外，一些组胺拮抗物如果与酒精或药物共同服用会造成麻烦。例如，将抗组胺特非那定与抗生素、抗真菌药联用可能引起危及生命的副反应。
用于控制组胺作用的药物并非常常奏效。它们的功效有限的原因也许与这些药物的专一性仅仅针对一个亚类的组胺受体有关，特别是在某些疾病要求干扰广谱受体时。组胺结合分子(HBM)可以与所有的受体竞争组胺结合，因此也许更适于治疗某些疾病。
激素血清素(也称为5-羟色胺)不但是血管收缩剂还是神经递质。它也能够增强血管通透性，诱导毛细管扩张并导致非血管性平滑肌收缩。5-羟色胺存在于大脑和肠组织，并由松果体和血小板产生。涉及5-羟色胺的病理学方面包括血压异常、偏头痛、精神失常、呼吸系统疾病以及冠状心脏病。5-羟色胺的激动剂和拮抗物用于治疗一部分这些疾病，但也常常存在人们不希望的副反应。
因此，十分需要血管活性胺类的有效拮抗物，其中所述拮抗物不产生偏离其治疗人类及动物疾病适用性的副反应。
也需要在例如食品、各种体液(如血浆或尿)或细胞培养上清液中定量检测组胺，以便监测如特定变应原的作用，或对某种变态反应确定特定的拮抗治疗。目前所运用的系统(放射免疫测定和ELISA)采用抗组胺或对抗组胺衍生物的抗体。但是，组胺的免疫原性并不十分强，使得难以产生对其高亲和性的抗体，并且大多数目前所运用的定量系统并非十分灵敏，或者需要对待测组胺进行修饰(例如酰化作用或甲基化作用)。在类似这些的检测中用HBM取代抗体将为未修饰组胺的测定提供一个高灵敏度系统。
HBM优于抗组胺抗体的另一优点在于，在研究某些生物学过程时，它们能够用作例如从细胞培养物中去除游离(未结合)组胺形式的研究工具。由于在大多数细胞上存在抗体受体，因此抗体可能干扰这些细胞发挥正常功能。
众所周知，例如蜱的吸血性外寄生虫可产生许多生物活性蛋白，这类蛋白免疫调节宿主对寄生虫嗜食反应的并因此促进寄生虫吸血。这些免疫调节蛋白包括产生于蜱血淋巴和唾液中并结合于有脊椎动物宿主免疫球蛋白上的免疫球蛋白结合蛋白(IGBP)(Wang和Nuttall,1995)。它们还包括锥蝽长红猎蝽的唾液携带一氧化氮血的血红素蛋白(nitrophorin)，该蛋白除携带一氧化氮外，还能够结合组胺(Ribeiro和Walker,1994)。免疫调节蛋白还可由其它吸血性寄生虫产生，这些寄生虫例如为蚊子和水蛭以及产生毒液的动物，如蛇和蜘蛛。
我们已发现例如蜱的吸血性外寄生虫产生能够结合于血管活性胺类、特别是组胺和5-羟色胺的蛋白质。这些蛋白质在下文中称为血管活性胺结合蛋白(VABP)。
我们已从蜱中分离到四种VABP，在此将其命名为MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6，它们彼密切相关。这些蛋白质是全新的，并未显示与任何以前所描述的蛋白质有明显相同之处。编码这些蛋白质或其片段的DNA序列可被用来从相同或不同种中分离相同家族中的其它相关蛋白质。
本发明提供血管活性胺结合蛋白(VABP)，其解离常数小于10- 7M，它们特异性结合于血管活性胺类，且与MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2及D.RET6属于同一蛋白家族。
如果在单独的四种VABP序列对比中作为相似残基完全保守的40％或更多氨基酸，在该蛋白被包括在该序列对比中时仍然作为相同残基完全保守，则该蛋白被认为属于该家族，所述VABP的序列对比采用GCG’S堆集法则(威斯康辛软件包程序手册，1994；间隙产生补偿值=2.50；间隙扩张补偿值=0.05)获得]。作为VABP家族成员的还包括那些来源于吸血节肢动物的以亲和力结合于组胺的蛋白质，其特征在于其解离常数小于10-7M，并含有序列基元D/EAWK/R及Y/CE/DL/IW。
本发明的VABP包括天然的生物学变异体(如衍生VABP的种内的等位基因变异体或在地域性变异体)。
本发明还包括与血管活性胺结合蛋白、或与VABP属于同一蛋白家族的蛋白质功能相当的其衍生物或其片段。本发明的VABP，衍生物及片段在下文中称为血管活性胺结合分子(VABM)。
根据本发明的VABP是强的特异性血管活性胺结合物，其解离常数低于10-7M。先前所描述的高亲和性组胺或5-羟色胺受体是形成组胺或5-羟色胺靶细胞膜部分的蛋白质(Falus 1994)。因此它们与本发明的非膜结合蛋白不同。
本发明的VABP与以上所讨论的已知免疫调节蛋白无关，而是具有不同的作用方法。本发明的VABP从外源器官中分泌至哺乳动物宿主动物中，并作为该宿主炎症和免疫应答的调节物发挥功能。在吸血性外寄性虫中，这样的炎症和免疫应答反而会抑制寄生虫吸血。这种功能获自VABP特异性结合于血管活性胺类的能力。
本发明的VABP可来源于吸血性寄生虫以及产生毒液的动物，如毒蛇和毒蜘蛛。本发明VABP优选来源于吸血性外寄生虫。最优选的是，它们来源于蜱类。
如前所述，本发明还包括功能性相当的VABP衍生物和片段。用于此处的“功能性相当”是表明所述衍生物和片段保留结合血管活性胺类的能力，或者它们含有可以用于导向膜的疫苗开发的如上所定义的VABP蛋白家族的表位。可以通过单个或多个氨基酸置换、添加、插入和/或缺失，或者通过例如以去糖基化或糖基化方式化学修饰一个或多个氨基酸，从天然VABP获得这些衍生物和片段。
例如，一种衍生物可以包括其氨基端或羧基端与VABP相融合或者已添加到VABP内部的额外蛋白质或多肽。额外多肽的目的可以是有助于所述VABM的检测、表达、分离或纯化，或者可以是赋予所述VABP所期望的额外特性。潜在的融合伙伴的例子包括β-半乳糖苷酶、谷胱苷肽-S-转移酶、荧光素酶、多组氨酸标记、T7聚合酶片段以及分泌信号肽。
本发明的VABM可以采用公知的分子生物学及蛋白质化学技术来制备。例如，所述VABM可用化学肽合成法制备。该技术对于生成用作免疫原的VABP来源的短肽特别有用。VABM也可以用公知的基因工程技术如Sambrook等1989等所述的定点诱变或随机诱变制备。VABM还可以用合成法制备，即运用有机化学技术，产生在结构和功能上模仿任何VABP家族成员的组胺结合位点的分子。
本发明的VABM可以通过在宿主细胞中表达以重组形式制备。这类表达方法本领域技术人员众所周知的，并且Sambrook等人(1989)对其中的许多方法都进行了详述。可为所选择的宿主挑选适合的表达载体。该载体可以包含一个操作性地连接于表达控制序列的编码VABM的重组DNA分子，所述表达控制序列由宿主转录机制所识别。
适合的宿主包括常用的如大肠杆菌的原核生物种类、或者能够使之表达高水平重组蛋白且能够容易大量生长的真核酵母。体外生长的细胞系也合适，特别是运用病毒驱动的表达系统时，如涉及使用昆虫细胞为宿主的杆状病毒表达系统。VABM也可以在体内表达，例如在昆虫幼虫或哺乳动物组织中。
按照再一方面，本发明提供在哺乳动物中这种VABM的用途，以结合于组胺并由此调节其作用并控制其病理效应。
本发明还包括将本发明的VABM作为抗炎药物的用途。首先，所述VABM可作为包括一种或多种惰性载体的药用组合物提供。所述VABM可以组成该药用组合物的唯一活性成分，或者可以形成治疗包的部分，如作为针对昆虫、蛇或蝎子叮咬，或针对皮炎引起的皮肤表面用药的乳膏的一个组分。所述蛋白还可用作乳膏、油类、粉剂或丸剂中组胺或组胺相关化合物的载体分子，以供接合组分缓释。
本发明还包括本发明VABM在组胺水平(例如在血、鼻灌洗液、组织或食品中)定量方面的用途。所述VABM可以与检测工具一起作为试剂盒的一部分，所述检测工具(例如放射标记的组胺、抗VABM抗体或如碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶的酶类)允许准确定量待测样品中的组胺。这种试剂盒与放射免疫测定、闪烁亲近测定或ELISA试剂盒相类似，将VABM作为结合分子取代直接导向组胺或导向组胺类似物的抗体。本发明的一个方面包括加入本发明VABM的这种试剂盒。
本发明VABM还能够用于血管活性胺类的检测。任何本领域常用的技术均可用于这种检测方法，可以包括印迹技术(Towbin等，1979)，凝胶阻滞或亲和层析的运用。可以使用完整的VABP，或为了探测低物只用活性结合片段。在另一个实施方案中，为了有助于检测，将所述VABM与另一种蛋白质(如碱性磷酸酶、荧光素酶或过氧化物酶)以基因工程方式或合成方式相融合。
本发明还包括将本发明VABM作为结合在支持体上的组胺结合实体的用途，所述组合接合实体可用来去除、分离或提取组胺(从机体组织、血液或食品)。该支持物可以包括任何适合的惰性材料，如凝胶、磁珠或其它小珠、微球体、结合柱或树脂。
本发明也包括VABP用作研究炎症、炎症相关过程或其它血管活性胺类生理学效应的工具的用途，所述生理学效应如在胃溃疡形成过程中组胺的作用或组胺在免疫反应中的作用。例如，为了研究组胺或5-羟色胺在细胺培养物或有炎症的动物组织中的重要性，可将所述VABM用于这些系统中组胺或5-羟色胺的排除。
后生动物寄生虫，特别是节肢动物和蠕虫，也是传染病及在人类医学药和兽医医学中具有主要影响的其它有害效应的来源。对节肢动物和蠕虫寄生虫的控制主要依赖于化学药品如杀螨剂和抗蠕虫剂的运用。也曾试图使用通过运用疫苗技术的免疫学控制方法。在鉴别某些保护性抗原为潜力疫苗候选者方面已取得一些成功，但是迄今仅有几种最终形成了商业化成果，最值得注意的是用于牛肺蠕虫胎生网尾线虫和牛蜱微小牛蜱的疫苗。尽管取得了这些发展，然而还继续需要用于后生动物寄生虫的疫苗以及特别是用于可以跨越节肢动物和/或蠕虫属的大范围而使用的疫苗。
因此本发明还提供了按以上所定义的VABP作为后生动物寄生虫疫苗的免疫原、特别是在控制节肢动物和其它后生动物寄生虫引起的疾病中用作保护性免疫原的用途。适用于接种疫苗的候选者包括如牛、山羊、绵羊、狗、猫的家畜及需要受保护抵抗后生动物寄生虫(特别是蜱类)的其它动物。所述疫苗可以包括在本领域技术中所熟知类型的佐剂。
含有本发明VABM编码核苷酸序列的核酸分子构成本发明的又一方面。这些分子包括DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸种类。
编码四种特定VABP的cDNA通过实施例在本文中公开，它们的氨基酸序列示于图1至图4(核苷酸和氨基酸以其标准的单子母缩字形式给出)。
根据本发明，优选核酸分子含有与图1至图4和图6的核苷酸序列中的任何一个VABM或任何VABM编码部分、任何一个序列相同或互补的核苷酸序列，或含有简并的或与其大致同源的或与所述序列相杂交的序列。“大致同源”的意思是序列显示至少60％序列同源性。根据本发明的核酸序列可以是单链或双链DNA、cDNA或RNA。所述核酸序列最好是DNA。
包括在本发明范围内的“杂交序列”是指那些杂交序列，它们在非严格条件下(6×SSC/50％甲酰胺，室温)结合并在低严格条件下(2×SCC，室温；或2×SSC,42℃)或高严格条件下(如2×SSC,65℃(其中SSC=0.15M NaCl、0.015M枸橼酸钠，pH7.2))漂洗。
本发明还包括含有本发明DNA序列的克隆载体和表达载体。这种表达载体将加入在框架内与本发明的核酸分子连接的适合的转录和翻译控制序列，例如增强子元件、启动子-操纵子区、终止序列、mRNA稳定序列、起始密码子和终止密码子或核糖体结合位点。
另外，使得重组蛋白从特定宿主中分泌也许是便利的。据此，这种载体的其它组分可以包括编码分泌信号及加工序列的核酸序列。
根据本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)。许多这类载体和表达系统是本领域所熟知的并有所报道。尤其适合的病毒载体包括基于杆状病毒、腺病毒及牛痘病毒的载体。
多种技术已公知并可用来将根据本发明的载体导入原核细胞或真核中。文献(Sanbrook等，1989)中已充分描述了适合的转化或转染技术。在真核细胞中，根据所述系统的需要，表达系统或者为瞬时的(如附加体)或者为长久的(染色体整合)。
根据本发明的核酸分子也可以用于产生转基因动物。这可通过在修饰体细胞或通过种系治疗加入可遗传的修饰而局部进行。
因此本发明也包括经转化或转染的原核或真核宿主细胞或含有如上所定义的本发明核酸分子的转基因生物体。
本发明的再一方面提供制备本发明VABM的方法，包括在表达所述蛋白质的条件下培养含本发明核酸分子的宿主细胞，并将由此产生的蛋白质回收。
所有在文章中提到的资料均通过引用结合到本文中。
现在通过实施例，具体参考从蜱、尤其是从具尾扇头蜱中分离的VABP，将本发明的各方面及实施方案加以详述。应该认识到，可以修改细节而不偏离本发明范围。
附图简述
图1是FS-HBP1的序列，表明测序引物及所采用的测序策略。
图2是FS-HBP2的序列，表明测序引物及所采用的测序策略。
图3是MS-HBP1的序列，表明测序引物及所采用的测序策略。
图4是D.RET6的序列，表明测序引物及所采用的测序策略。
图5是经考马斯染色的12％SDS-PAGE凝胶，显示已经在组胺结合柱上纯化的蜱唾液腺提取物。纯化之前(泳道A)和纯化之后(泳道B；1=FS-BHP1,2=FS-HBP2)的雌性蜱的唾液腺提取物；纯化之前(泳道C)和纯化之后(泳道D；3=MS-HBP1)的雄性蜱唾液腺提取物。标明了分子量标记。
图6表明用GCG威斯康辛软件包的堆集(pileup)命令和整齐描绘(prettyplot)命令产生的所述VABP的四种cDNA推导氨基酸序列的序列对比。
图7是经考马斯染色的12％SDS-PAGE凝胶，显示用重组法产生的VABP。泳道A，为rMS-HBP1；泳道B，为rFS-HBP2；泳道C，为rFS-HBP1。从顶部至底部，分子量标记标明为66、48.5、29、18.4及14.2kDa。
图8是取自雌性及雄性蜱的唾液腺提取物的蛋白质印迹。
图9显示描绘纯化VABP的组胺结合特性的饱和曲线和Scatchard图。
图10是描述在豚鼠回肠上进行的收缩-抑制试验的图。所用的缩写：H=组胺(1.25nmol)；漂洗=Krebs溶液。加入约2nmol FS-HBP2；使用约4nmol(单体的量)MS-HPB1。
实施例蜱
按Jones等(1988)的方法饲养蜱。除成年网纹革蜱(Dermacenterreticularis)在兔身上饲养以外，所有三个发育阶段的具尾扇头蜱和网纹革蜱均在Dunkin Hartley豚鼠身上饲养。在不进食时，所有的蜱均保持在21℃和85-90％的相对温度下。实施例1：蛋白质鉴别
从已在豚鼠上饲养3天的雌性成年具尾扇头蜱样品中切取唾液腺。雄性蜱饲养4天。在磷酸缓冲盐溶液(PBS；pH7.4)中均浆腺体，以10,000g离心3分钟去除细胞碎片，然后将上清液上含有400ml组胺-琼脂糖悬浮液(Sigma)的柱。未结合的蛋白质用含有5％甘油的10mlPBS从柱上洗出，然后用含100mM组胺的PBS(2ml)洗脱结合蛋白质。用centricon 3超滤装置(Amicon)浓缩洗脱液。
将提取物在12％SDS-PAGE凝胶上电泳，鉴别来自雌性蜱的两种主要蛋白质和来自雄性蜱的一种主要蛋白质(见图5)。这些蛋白质被称作磁性特异性组胺结合蛋白1和2(FS-HBP1和FS-HBP2)及雄性特异性组胺结合蛋白1(MS-HBP1)。从未在雌性组织中检测到MS-HBP1，但在雄性唾液腺和蛹及幼虫整个身体匀浆中清楚地存在MS-FBP1。实施例2：基因克隆1)cDNA文库的构建
为了克隆编码实施例中三种蛋白质的cDNA，构建了一个cDNA文库。从已在豚鼠上饲养2天的20个雄性及20个雌性成年具尾扇头蜱样本中切取唾液腺。在干冰中将腺体收集在Eppendorf管中。用FastTrack mRNA分离试剂盒(2nvitrogen)分离信使RNA。
为了合成cDNA及将其单向插入λZapⅡ载体，使用了Zap cDNA合成试剂盒(Stratagene)。在插入λ载体之前，在Sephacryl S-400(Pharmacia)柱上分级分离cDNA。用低分子量cDNA(大约100bp至2,000bp)构建DNA文库(命名为d2-Ⅰ)。较高分子量组分被用于构建第二个文库(d2-Ⅱ)。用Packagene(Promega)包装提取物，按厂商的说明进行包装。每个文库的大约1.5×106个噬菌斑形成单位(PFU)在XL-1蓝(XL-1 Blue)细胞(stratagene)上扩增。
用来自已在兔上饲养3天的成年雌性网纹革蜱的唾液腺mRNA构建其文库。分离mRNA，按用于以上所述的d2-Ⅱ文库的方法分离mRNA和构建cDNA文库，不同之处在于采用了Zap表达(预消化载体)克隆试剂盒(Stratagene)代替λZapⅡ试剂盒。2a)d2-ⅡcDNA文库的筛选
从该文库的一个组分中体内切下噬菌粒，并按Short等(1988)所述，将其用于在XLl-蓝细胞(Stratagene)中产生双链pBluescript SK(-)质粒。将菌落铺在补充有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal,Melford实验室，英国)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Novabiochem)的含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，进行蓝色/白色菌落选择。选择来自白色克隆的大约75个质粒进行测序。通过用PvuⅡ消化并在1％琼脂糖凝胶上电泳测定，插入的DNA大小的范围为250个碱基对至1000个碱基对。
获得了克隆FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1并进行了部分测序。然后通过噬斑影印膜(Sambrook等，1989)与洋地黄毒苷标记探针(Boehringer Mannheim)的DNA杂交，筛选d2-Ⅱ文库的其它克隆。用来自原始克隆的纯化插入片段以随机引物标记法构建探针，并用与碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)缀合的抗洋地黄毒苷抗血清检测。对于每个原始克隆，分离并测序了3个额外的克隆。2b)网纹革蜱cDNA文库的筛选
首先，构建DNA探针。不是将革蜱属文库的一个组分插入Zap表达载体，而是用简并引物5’-AAYGGNGARCAYCARGAYGCNTGGAA(正向)及5’-KTRTMRTCNGTNRYCCANARYTCRTA(反向)进行PCR。这些引物基于FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1的cDNA和蛋白质的保守域。
该PCR包括35个循环，于95℃30秒的解链步骤，于50℃30秒的引物-退火步骤及于72℃30秒的延伸步骤(Taq聚合酶购自PerkinElmet，脱氧核苷购自Pharmacia)。获得了预期不小(400碱基对左右)的单个DNA条带，用洋地黄毒苷将其标记，以筛选该文库(如上所述)。D.RET6是几个阳性克隆之一。3)测序
对FS-HBP1、FS-HBP2及D.RET6插入片段的整个编码链或非编码链进行测序。按Good和Feinstein(1992)的方法从过夜培养物中纯化质粒，经碱变性(Mierendorf和Pfeffer,1987)并用Sanger的双脱氧介导的链终止反应法(Sanger和Coulson,1975)测序。测序策略示于图1-4。3a)FS-HBP1
如图1所示，从邻接pBluescript SK(-)多接头区的T3(正向)和T7(反向)引物位点对原始克隆进行测序。另外，从T3位点处对亚克隆ⅩⅧa(包含原始插入片段的核苷酸221-770)及亚克隆ⅩⅧb(核苷酸509-770)进行测序(由图中的T3a和T3b标明的反应)。从T7位点处对亚克隆ⅩⅧc(核苷酸1-221)和亚克隆ⅩⅧd(核苷酸1-509)进行测序(T7c和T7d)。
通过用PstⅠ消化原始克隆(在插入片段221位及上游多接头区中切割)，然后将其重新连接产生Ⅹⅷa；通过用XbaⅠ消化(在插入片段509位及上游切割)产生Ⅹⅷb。用EcoRⅠ(在插入片段上游切割)分别与PstⅠ和XbaⅠ消化，并将切下的片段重新连接回pBluescript(SK-)质粒中，获得Ⅹⅷc及Ⅹⅷd。信号序列在图中以粗体字母给出，信号切割位点以竖直箭头(↑)标出。下划线序列也是通过对所表达蛋白进行氨基端测序而获得。3b)FS-HBP2
图2显示FS-HBP2克隆的cDNA序列及推导出的氨基酸序列。从T3(正向)及T7(反向)引物位点处对原始克隆进行测序，同样通过用HincⅡ对52-1进行消化(在254位切割，所示反应由T3b及T7a表示)获得两个亚克隆(52a和52b)。HincⅡ与XhoⅠ(在插入片段的多接头下游切割)联用，构成52a(包含核苷酸1-254),HinclⅡ与SmaⅠ(在上游切割)联用构成52b(含有核苷酸254-793)。消化后用T4聚合酶(NewEngland Biolabs)平端化，并重新连接质粒。最后，我们使用与图中下划线序列相同或互补的正向(→)及反向(←)插入片段特异性引物。
聚腺苷酸尾以斜体表示，推定的聚腺苷酸化信号以下加双线表示。信号序列以粗体字母给出，信号切割用竖直箭头(↑)标明。下划线序列也是通过对所表达的蛋白进行氨基端测序而获得的。3c)MS-HBP1
图3显示MS-HBP1克隆的cDNA序列及所推导的氨基酸序列。从邻接pBluescript SK(-)多接头区的T3(正向)及T7(反向)引物位点对该克隆进行测序。另外，我们使用与图中下划线序列相同或互补的正向(→)及反向(←)插入片段特异性引物。
三线表示推定的N-糖基化位点。斜体表示聚腺苷酸尾，双线标明推定的聚腺苷酸化信号。信号序列以粗体字母给出，信号切割以竖直箭头(↑)标明。下划线序列也是通过对所表达蛋白质进行氨基端测序而获得。3d)D.RET6
图4给出克隆D.RET6的cDNA序列和所推导的氨基酸序列。从邻接pBK-CMV多接头区的T3(正向)和T7(反向)引物位点及从与图中下划线序列相同或互补的正向(→)及反向(←)插入片段特异性引物对所述DNA插入片段进行测序。用粗体字母表示推定的信号序列，用竖直箭头(↑)标明信号切割。3e)序列分析
用GCG序列分析软件(威斯康辛软件包程序手册，1994)分析序列数据。在国家生物技术信息中心(NCBI)运用BLAST网络服务对蛋白数据资料库进行检索。
从cDNA推导出的VABP氨基酸序列的序列对比示于图6。这通过运用GCG软件的堆集命令和整齐描绘命令而产生。通过对所分泌的VABPS进行N末端测序测定，所述成熟蛋白起始于下划线氨基酸(见下文)，提示其前面的区域代表信号序列。除去信号序列之后，对于计算的分子量，FS-HBP1为19,442,FS-HBP2为19,471,MS-HBP1为21,026,D.RET6为21,025。计算的等电点分别为4.0、3.9、5.0及4.6。
MS-HBP1与FS-HBP1有40％的同一性(57％相似性)，与FS-HBP2的同一性为43％(62％)，与D.RET6的同一性为32％(50％)。FS-HBP1与FS-HBP2有66％的同一性(78％相似性)，与D.RET6的同一性为32％(49％)。FS-HBP2与D.RET6有39％的同一性和56％的相似性。这些百分比用GCG软件的最佳拟合命令(使用的间隙权为3，长度权为0.1)获得。
所预期的四种蛋白质的二极结构相同，即在所述分子的氨基端一半以α-螺旋为主，而在羧基端一半β-折叠和转角相对较多。FS-HBP1(带正电荷)与组胺的亲和性较低提示在这些位置处的残基可能组成结合位点的一部分。实施例3：重组蛋白的表达1)克隆的构建
FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1在草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)中作为组氨酸标记蛋白(rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1)表达。
为了加进His6标记，用聚合酶链式反应(PCR)首先对FS-HBP1的编码区进行了扩增。该PCR包括20个循环，每个循环为于95℃30秒的解链步骤，于50℃30秒的引物-退火步骤，及于72℃30秒的延伸步骤。所用的正向引物为：
5’-GCAGGAGCTCGGCACGAG；
反向引物为：
5’-TTTACTAGTGATGGTGATGATGATGGATCCCTTCTGGGAGGCAATCACTT。
设计所述引物使得在起始密码子上游加进一个SacⅠ位点，而将终止密码子用一个BamHⅠ位点所取代，之后是6个组氨酸密码子和含有TAG终止密码子的一个SpeⅠ位点。用SacⅠ和SpeⅠ切割该PCR产物。后一种酶产生与XbaⅠ匹配的突出端，使该片段连接在pAcC129.1转移载体(Livmgstone和Jones,1989)的SacⅠ位点和XbaⅠ位点之间，产生质粒pACC129.1-FS1.HIS。因此这个质粒含有加在FS-HBP1翻译产物羧基端的序列Gly-Ile-(His)6。
质粒pACC129.1-FS1.HIS也被用于表达组氨酸标记的FS-HBP2和MS-HB3P1。用SacⅠ和BamHⅠ使FS-HBP1 cDNA缺失，从而使氨酸密码子保持完整。将上游SacⅠ位点及下游BglⅡ位点(BglⅡ和BamHⅠ产生匹配突出端)通过PCR加到FS-HBP2和MS-HBP1的编码区。该PCR包括20个循环，每个循环有于95℃30秒的解链步骤，于50℃30秒的引物-退火步骤及于72℃30秒的延伸步骤。对于FS-HBP2，正向引物为：5’-AAGGAGCTCAGCATGAAGCTTCTCAT；反向引物为：5’-TATAGATCTCTAGGCAAGCACTTGTG。
对于MS-HBP1，正向引物为：5’-GCAGGAGCTCGGCACGAG，反向引物为：5’-TATAGATCTGGTTCTGAGCTGGTGCTG。
PCR之后，将所得到的cDNA插入所述载体。然后将Gln-Ile-(His)6序列加到MS-HBP1翻译产物的羧基端，并将Ile-(His)6加到FS-HBP2的翻译产物上。
用杆状病毒表达系统表达三种标记的多肽。用所述转化载体和杆状病毒(BacPak6；Clontech)转染斜纹夜蛾(Sf21)细胞。按Kitts和Possee(1993)的方法扩增重组病毒。所述VABP显然是分泌产物，因为它们主要发现于被转染细胞的培养基及唾液腺中。
将(成熟)FS-HBP2的编码区也克隆进pET-23a(+)表达载体中。将图7中从位置(a)至(b)以及从位置(c)至(d)的序列在大肠菌所表达的截短形式的FS-HBP2中缺失。通过在含有FS-HBP2的pACC129.1-HIS质粒上进行PCR而获得N-末端截短的蛋白质，PCR所用的正向引物为：5’-TATGGATCCTTCACTTGCGTGGGTGTT，反向引物为：5’-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切该PCR产物，并将其插入pET-23a(+)载体的BamHⅠ位点和NotⅠ位点之间。
在羧基端截短的情况下，将完整的FS-HBP2编码区插入pET 23a(+)载体中，所用的正向引物为：5’-TATAGGATCCGGGAGCTCCAATCAGCCAGATTGGGC；反向引物为：5’-TATAGCGGCCGCCCGGGCTAGTGATGGTGATGATGAT。用BamHⅠ和NotⅠ酶切该PCR方法，并将其插入pET-23a(+)载体的BamHⅠ位点和NotⅠ位点之间。然后将该质粒(以及插入片段)作为模板用反向引物进行PCR，所述反向引物为：5’-TATATGGTACCCATCATCATCACCATCAC及5’-ATATATGGTACCGTTGTCGTAATCCGTAGTC。这就产生了减去待缺失区的完整的质粒扩增产物。用KpnⅠ(引物含有KpnⅠ位点)酶切之后进行重新连接。最初的未扩增质粒在转化之前通过用DpnⅠ消化而将其破坏。所有的PCR均包括20个循环，每一循环有于95℃30秒的解链步骤，于50℃30秒的引物-退火步骤及于72℃30秒的延伸步骤。2)蛋白质纯化及抗血清的产生
Sf21细胞转染60小时之后，收集培养基，离心除去细胞及细胞碎片(2,000g,10分钟)，用(NH4)2SO4沉淀法分级分离上清液。rFS-HBP1和rFS-HBP2在50-80％(NH4)2SO4组分中沉淀，MS-HBP1-His在65-100％组分中沉淀。在重溶解于PBS的100％(NH4)2SO4中漂洗沉淀，并按Janknecht等(1991)的方法在Ni-琼脂糖柱(Qiager)上纯化。用咪唑洗脱带组酸标记的蛋白质。用Centricon 10浓缩器(Amicon)浓缩洗脱液并用来更换缓冲液。将纯化蛋白在PBS中贮存于-20℃。
为产生多克隆抗血清，将纯化的重组蛋白(在150μlPBS中约2μg)与等体积的Montanide ISA 50佐剂(Seppic，法国)相混合，并皮下注射到Dunkin Hartley豚鼠体内。每隔10天重复该过程。第4次注射10天之后收集血清。3)电泳及蛋白质印迹法
于饲养期从不同时间点切取蜱的唾液腺(及其它组织)，并在PBS中将其匀浆。于10,000g离心匀浆液5分钟，并将上清液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；Laemmli,1970)。
图7显示rFS-HBP1、rFS-HBP2及rMS-HBP1电泳的12％SDS-PAGE凝胶。rFS-HBP1和rFS-HBP2在琼脂糖上分别以～21kDa和～24kDa的表观分子量泳动，而rMS-HBP2则以～22kDa泳动。
为进行蛋白质印迹，用AE-6675水平印迹装置(Atto Corporation,日本)，通过半干电印迹(Kyhse-Anderson,1984)将蛋白质转至硝化纤维素(Gelman Sciences)上。将豚鼠中产生的抗血清(见上文)与缀合于碱性磷酸酶(Sigma)的山羊抗豚鼠免疫球蛋白联用，鉴别FS-HBP1、FS-HBP2及MS-HBP1。用氮蓝四咪盐及磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯(Blake等，1984)显现激酶活性。
通过迁移率变动分析研究最终天冬酰胺连接的蛋白质糖基化作用。在用水解所有普通类型的糖蛋白Asn-聚糖链的酶切糖苷酶(Maley等，1989)N-糖苷酶F(PNGase F,New England Biolabs)处理之前和之后，用唾液腺提取物和重组蛋白样品进行SDS-PAGE及免疫印迹。用N-糖苷酶F处理时，在SDS-PAGE凝胶上只有MS-HBP1显示出迁移率下降，表明它是一个糖蛋白。下降值相应于分子量2-3kDa的变动。
图8显示蛋白质印迹，包含在饲养期的不同时间点从雌性蜱(A和B)及雄性蜱(C)获取的唾液腺提取物，并在12％SDS-PAGE凝胶上分离。抗FS-HBP1(A)和抗FS-HBP2(B)血清从附着后(p.a.)第1天至第3天起显示阳性反应。从附着后第一天一直到饲养期结束，抗-MS-HBP1血清(C)可检测到MS-HBP1。4)N-端测序
在牛津大学生物化学系的MRC免疫化学装置上测定纯化的rFS-HBP1、rFS-HBP2和rMS-HBP1的氨基端序列。按Schger和VonJagow(1987)的方法在SDS-PAGE凝胶上电泳样品，并电印迹至Pro-Blott膜上(Applied Biosystems,Warrington，英国)。用考马斯亮蓝染色所述膜，并将目的条带切下，按Matsudaira(1987)法进行测序。用Applied Biosystems的“小型印迹”软片(cartridge)(所述膜片已插至其上)，在Applied Biosystems的494A型“Procise”蛋白测序仪(Perkin-Elmer,Applied Biosystems Division,Warrington，英国)上电泳电印迹的样品。采用厂商推荐的膜结合样品程序进行测序。实施例4：蛋白的特征记述1)组胺结合分析
将纯化的重组蛋白按Warlow和Bernard(1987)提出的方法进行组胺结合试验。这种方法通过加入聚乙二醇(Mw 8000)和离心法，运用蛋白质沉淀从结合配体分离游离配体(放射标记的组胺)。在所有实验中，在温育4个小时确保无组胺代谢发生后，在醋酸铵溶剂系统中进行薄层层析。
用全部3种rVABP获得3H-组胺的饱和结合(图9Aⅰ、9Bⅰ和9Cⅰ)。Scatchard图(图9Aⅱ、9Bⅱ和9Cⅱ)显示rMS-HBP(Kd=1.2×10-9M；SD=0.4；3次测量)及rFS-HBP2(Kd=1.7×10-8M；SD=0.9)的高亲和性，但rFS-HBP1的亲和性较低(Kd=7.8×10-8M；SD=1.5)，提示结合组胺可能不是该蛋白的首要功能。
对于rMS-HBP1，存在协同结合的证据。当含有3H-组胺(～0.3pmol；11,200cpm)和过量rMS-HBP1(～100pmol)的样品补充有少量组胺(0.5pmol)时，检测到结合放射性配体明显增加(7,560±110cpm，比之于6,840±150cpm；5次测定)，表明结合容量有所增强。协同结合与MS-HBP1的二聚体或多聚体的性质相一致。事实上，MS-HBP1似乎形成分子间二硫桥；当在SDS凝胶的上样缓冲液中不包括还原剂时，它在SDS凝胶上的迁移率较低。看来FS-HBPS只具有分子内二硫键，正如缺少还原剂时较高迁移率所提示的。
在竞争试验中(一式三份进行)，将一系列组胺样化合物[组胺、咪唑、5-羟色胺、多巴胺、H1受体激动剂β-组氨酸、H1拮抗物氯苯那根及新胺替根、H2激动剂dimaprit及H2拮抗物糠硝烯二胺和西咪替丁]以1000倍的量加到每种rVABPS中，在1000倍量下冷组胺可以从结合位点置换95％以上的3H-组胺。组胺样化合物几乎不引起或不置换放射性配体，表明VABP特异性地并以不同于H1受体和H2受体的方式结合组胺。
将FS-HBP2在AD494(DE3)pLysS细菌(Novagen)中的pET-23a(+)载体上表达。细菌表达的FS-HBP2与在杆状系统中所表达的FS-HBP2相比，与组胺结合的亲和性略低(Kd=0.6-0.9×10-8M)。缺乏45个N-端氨基酸或28个C-端氨基酸的截短形式的蛋白质(见上文)根本不与组胺结合。这提示FS-HBP2的完整结构对于结合组胺是重要的，并且结合位点更可能由分散的残基所决定，而不是由α-螺旋或β-折叠上某处的一段连续氨基酸序列所决定。2)收缩-抑制
在悬于含有充氧Krebs溶液的10ml室中的豚鼠回肠上进行收缩-抑制试验(图10)。通过向该室中加入1.25nmol组胺(H)来诱导收缩(记录为峰形)。达峰值后再用Krebs溶液洗去组胺(W)，使回肠松弛。通过加入～2nmol rFS-HBP2(F2)和组胺实际上减少收缩。～2nmol rFS-HBP1未产生明显效应(数据未示)。甚至在加入超量组胺(XH)之后，～4nmol(单体量)rMS-HBP1(M)与组胺一起加入后完全抑制了收缩。
rMS-HBP1蛋白和rFS-HBP2蛋白是强结合物，足以与组胺竞争豚鼠回肠的H1受体(见图10)。与它们相对较低的亲和性一致的是，用rFS-HBP1几乎没有或没有观察到对回肠收缩的抑制。
参考文献
Blake,M.S.,Johnston,K.H.,Russell-Jones,G.J.,Gotschich,E.C.(1984)在蛋白质印迹上检测碱性磷酸酶缀合的抗抗体的快速灵敏的方法。Anal.Biochem.136,175-179.
Falus A.(1994)Histamine and Inflammation.R.G.Landes Company,Austin，第139页.
Goode,B.L.和Feinstein,S.C.(1992)双链DNA测序模板的“Speedprep”纯化。BioTechniques 12,374-375.
Janknecht,R.,de Martynoff,G.,Lou,L.,Hipskind,R.A.,Nordheim,A.和Stunnenberg,H.G.(1991)重组牛痘病毒表达的天然组氨酸标记蛋白的快速有效的纯化。PNAS 88,8972-8976.
Jones,L.D.,Davies,CR.,Steele,G.M.和Nuttall,P.A.(1988).实验室中硬蜱和隐喙蜱的饲养和保持。Animal Technology 39,99-106.
Kitts,PA.和Possee,R.D.(1993)以高频率产生重组杆状病毒表达载体的方法。BioTechniques 14,810-817.
Kyhse-Anderson,J.(1984)多个凝胶的电印迹：用于将蛋白质从聚丙烯酰胺快速转移至硝化纤维素的无缓冲液槽的简单装置。J.Biochem.Biophys.Mehtods 10,203-209.
Laemmli,V.K.(1970)在T4噬菌体头部装配期间结构蛋白的切割。Nature 177,680-685.
Livingstone,C.和Jones,I.(1989)具有单链容量的杆状病毒表达载体。Nucleic Acids Res.17，第2366页.
Maley,F.,Trimble,R.B.,Tarentino,A.L.和Plummer,T.H.,Jr.(1989)通过使用内切糖苷酶进行的糖蛋白及其相关寡糖的特征鉴定。Anal.Biochem.180,195-204.
Matsudaira,P.(1987)电印迹到聚偏二氟乙烯膜上的皮摩尔量蛋白的序列。J.Biol.Chem.262,10035-10038.
Mierendorf,RC.和Pfeffer,D.(1987)变性质粒DNA的直接测序。Methods Enzymol.152,556-562.
威斯康辛软件包程序手册，第8版(1994)Genetics ComputerGroup,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711.
Protein Expression in Current Protocols in Molecular Biology(第16章)。编辑：F.M.Ausubel.R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman.JA.Smith,K.Struhl.John Wiley and Sons Inc.出版。
Ribeiro,J.M.和Walker,FA.(1994)长红猎蝽唾液携带一氧化氮的血红素蛋白(nitrophorin)的高亲和组胺结合和抗组胺活性。J.Exp.Med.180,2251-2257.
Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.(1989)分子克隆：实验室手册。冷泉港实验室。
Sanger F.和Coulson AR.(1975).通过用DNA聚合酶引发的合成快速测定DNA序列的方法。J.Mol.Biol.94,441-448.
Schgger,H.和von Jagow,G.(1987)用于分离1-100kDa的蛋白的麦黄酮(tricine)-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。Anal.Biochem.166,368-379.
Short,J.M.,Femandez J.M.,Sorge JA.和Huse W.D.(1988)λZAP：一个具有体内切除性质的λ噬菌体表达载体。Nucl.acids.Res.16,7583-7600.
Towbin,H,Staeholin,T.和Gordon,J.(1979)将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝化纤维素纸上：方法和某些应用。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354.
Wang,H.和Nuttall,PA.(1995).雄性具尾扇头蜱的免疫球蛋白G结合蛋白。Parasite Immunology 17:517-524.
Warlow,R.S.和Bemard,C.CA.(1987)人类血单核细胞上中等亲和性和高亲和性组胺结合位点的溶解和特征鉴定。Molec.Immun.24,27-37.

Claims (29)

1．血管活性胺结合蛋白(VABP)，它以小于10-7M的解离常数与血管活性胺类特异性地结合，并且与MS-HBP1、FS-HBP1、FS-HBP2和D.RET6属于同一蛋白家族。
2．根据权利要求1中的VABP，它来源于吸血性外寄生虫、蜘蛛、蝎、蛇或有毒动物。
3．根据权利要求1中的VABP，它来源于蜱类。
4．根据权利要求1中的VABP，它来源于蜱类具尾扇头蜱或网纹革蜱(Dermacenter reticularis)。
5．根据前述权利要求中任一项的VABP，它与组胺特异性地结合。
6．FS-HBP1、FS-HBP2、MS-HBP1及D.RET6中的任何一种VABP。
7．权利要求1-6中任一项的任一种VABP的功能相当的衍生物或片段。
8．根据任一前述权利要求的VABP、衍生物或片段(VABM)，它以重组形式表达。
9．根据权利要求7或权利要求8的VABM，其中已将VABP以基因工程方式或化学方式与一个或多个肽或多肽相融合。
10．根据权利要求1-9中任一项的VABM，它结合到如树脂的支持物上。
11．核酸分子，它编码根据权利要求1-9中任一项的VABM，或与这种VABM编码分子相杂交。
12．权利要求11的核酸，它包括DNA、cDNA或RNA。
13．权利要求11或权利要求12的核酸，它包括DNA。
14．包含根据权利要求11-13中任一项的核酸分子的克隆载体或表达载体。
15．权利要求14的载体，它基于病毒。
16．权利要求15的载体，它基于杆状病毒。
17．用权利要求14-16中任一项的载体转化或转染的宿主细胞。
18．已经用根据权利要求11-13中任一项的核酸分子转化的转基因动物。
19．制备根据权利要求1-9中任一项的蛋白方法，包括在宿主细胞中表达根据权利要求14至16中任一项的载体，并在表达所述蛋白的条件下培养所述宿主细胞及回收如此产生的所述蛋白。
20．适用于在人类或动物体液中检测组胺水平的试剂盒，包含根据权利要求1至10中任一项的VABM及检测工具。
21．根据权利要求1至10中任一项的用于治疗的VABM。
22．根据权利要求1至10中任一项的VABM，用于在人类或动物中结合血管活性胺类。
23．根据权利要求1至10中任一项的VABM，用于在人类或动物中结合组胺。
24．根据权利要求1至10中任一项的VABM的用途，用于在人类或动物中探测血管活性胺类。
25．根据权利要求1至10中任一项的VABM的用途，用于在人类或动物中探测组胺。
26．根据权利要求1至10中任一项的VABM在疫苗的用途。
27．根据权利要求1至10中任一项的VABM，用作抗组胺剂。
28．根据权利要求1至10中任一项的VABM，用作抗炎药。
29．根据权利要求1至10中任一项的VABM的用途，与药学上可接受载体结合用于治疗人类或动物炎症的药物的生产中。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1325645C (zh) * 1997-11-26 2007-07-11 发展技术有限公司 组胺及血清素结合分子

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9920674D0 (en) 1999-09-01 1999-11-03 Evolutec Limited Treatment of conjunctivitis
GB9920673D0 (en) 1999-09-01 1999-11-03 Evolutec Limited Treatment of allergic rhinitis
GB0307544D0 (en) * 2003-04-01 2003-05-07 Evolutec Ltd Treatment method
GB0522298D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Natural Environment Res Agents that bind IgE
GB0809279D0 (en) * 2008-05-21 2008-06-25 Varleigh Ltd Histamine binding protein
GB0816976D0 (en) * 2008-09-16 2008-10-22 Natural Environment Res Council Protein
GB201004850D0 (en) 2010-03-23 2010-05-05 Natural Environment Res Council Proteins
WO2012158831A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Prometheus Laboratories Inc. Performance of a biomarker panel for irritable bowel syndrome
GB201720505D0 (en) * 2017-12-08 2018-01-24 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Methods for treatment of neuropathic pain

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2283239A (en) * 1993-10-29 1995-05-03 Ucb Sa Human H1 histamine receptor
NZ331212A (en) * 1994-10-07 2000-03-27 Heska Corp Ectoparasite (flea) saliva proteins and their use screening for dermatological allergy

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1325645C (zh) * 1997-11-26 2007-07-11 发展技术有限公司 组胺及血清素结合分子

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Publication number Publication date
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