CN1225130A - 人类b细胞抗原,及相关试剂 - Google Patents

Abstract

一个编码人类B细胞抗原的基因的纯化和分离。提供了细胞发育,例如,淋巴样细胞,调节中有用的核酸,蛋白,抗体,和其它试剂,以及其应用方法。

Description

人类B细胞抗原，及相关试剂

                      发明领域

本发明涉及可用于调节人类免疫反应的多种生物试剂。更优选，它指有用的组合物和方法，例如，在B和T细胞相互作用中有用。

                      发明背景

白血病，淋巴瘤，癌，和其它恶性病在，例如，Wilson等(编)Harrison医学原理，McGraw-Hill，纽约，1599-1612页)中描述。作为此类疾病的例子，恶性淋巴瘤是主要存在于淋巴样组织中的新生转化细胞，(参见，例如，Nadler,L.M.Harrison)。百分之九十的非何杰金氏淋巴瘤，在美国每年发生约30000新病例，是B细胞淋巴瘤。少于25％的这些病例被治愈。另一例子是白血病，在美国每年发生约30000新病例。这样就存在对B和T细胞淋巴瘤，白血病，癌和其它恶性疾病的更有效治疗的需求。

正常的静息B细胞(也称为B淋巴细胞)的生长包括性质不同的两步。首先，静息细胞被激活通过细胞周期的G0期至G1期。参见，例如，Alberts，等(编1989)细胞分子生物学Garland出版，NY；和Daenell，等(1990)分子细胞生物学Freeman,NY。第二步，激活的细胞被诱导开始增生。参见，例如，Paul，等编(1989)基础免疫学第二版，RavenPress,NY；和第三版。已发现几种因子诱导B细胞生长，包括白细胞介素-1(IL-1),IL-2,IL-4,IL-10，和IL-13。另外针对某些B细胞表面分子的抗体也被证实促进B细胞增生。T细胞(也称作T淋巴细胞)也可被某些因子诱导增生，包括植物血凝素，抗T细胞受体单抗，抗CD3单抗，和其它试剂。

若干研究提示CD40分子可作为生长因子受体和人类B细胞增生和发育的重要调节剂。B淋巴细胞可由B淋巴细胞表面上CD40分子与激活的辅助T细胞瞬时表达的配体的相互作用而被激活。

CD40是膜相关糖蛋白，在正常B淋巴细胞，恶性B细胞，交错突细胞，滤泡树突细胞，胸腺上皮细胞，和一些癌中被表达。人类CD40于1985年作为几乎唯一表达于B淋巴细胞的一单抗决定簇被首次发现，因此是B细胞的有用的标记物。人类CD40是一45-50Kd糖蛋白。

抗CD40抗体提供一由乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)，抗CD20抗体，或抗免疫球蛋白抗体诱导的B细胞增殖之强共刺激信号。将抗人类CD40抗体和IL-4加入活化的B细胞中，当培养基进一步补充以CD32转染的L细胞时，亦可产生许多效应，包括短期复制，IgE合成的诱导，和长期增殖。

B7(CD80)和B70(CD86)是第二类强烈介导B细胞和T细胞相互作用的分子。这些分子，在B细胞上，与T细胞上它们的配体CD28和CTLA-4相作用。这些相互作用是主要的B细胞和T细胞活化的共刺激信号。

在过去的15年中，很明显这两类表面分子在T细胞和B细胞的活化中具有重要的作用。大量的体外和体内试验已论证了这两类分子代表了重要的免疫抑制靶点。参见，如，Banchereau，等(1994)免疫学年度综述12:881-922；Van Kooten，等(1996)高等免疫学61:1-77；Linsley和ledbetter(1993)免疫学年度综述11:191-212)。

免疫抑制代表一类非常重要的用于抑制和治疗自身免疫疾病和移植过程中的排斥反应的免疫学介入。免疫抑制可通过a)抗增殖药物(环磷酰胺，15-脱氧精胍菌素，等)；b)甾类糖皮质激素；c)细胞内信号传导的抑制剂(如环孢菌素)；d)免疫抑制细胞因子(如TGF-β,IL-10)；e)由抗原诱导的特异性耐受；及f)涉及T和B淋巴细胞活化的细胞表面分子，如CD40/CD40配体和具有CD28/CTLA-4的B7/B70的抑制来实现。

1995年，从鼠的脾细胞中克隆出另一个称为RP105的分子。参见Miyake等(1995)“RP105，一种新的存在于B细胞活化过程中的B细胞表面分子，是富含亮氨酸重复蛋白家族的一个成员”免疫学杂志154:3333-3340。抗RP105的单克隆抗体诱导鼠B细胞的强烈增殖，并以与抗CD40抗体或CD40配体类似的方式保护鼠B细胞免于射线诱导的细胞编程性死亡。见Miyake，等(1994)“抗一105kDa分子的抗体使鼠B细胞增殖并保护其免于细胞编程性死亡：X-关联的免疫缺陷B细胞的无反应性”试验医学杂志180:1217-1224。

RP105及其假设配体可能是在T细胞和B细胞活化中起关键作用的第三类分子。然而迄今，还未得到人类序列，其结构和活性还未测定。本发明提供了这些及很多其它有用的进展。

                      发明概述

本发明提供了一种组合物，选自：一种编码人类BAS-1蛋白或其片段的分离的或重组的核酸；一基本纯的BAS-1蛋白或其肽；一包含BAS-1蛋白序列的融合蛋白；及一抗重组或纯化的灵长类BAS-1蛋白的抗体。

在分离或重组核酸的实施方案中，核酸可包括在SEQ ID NO1中定义的一个序列。

蛋白实施方案中，蛋白可为基本纯的BAS-1蛋白或其肽；可选自：来自灵长类动物包括人的一个蛋白或肽；包含至少SEQ ID NO2中所定义的一个多肽片段的一个蛋白或肽；与天然BAS-1蛋白显示不同的翻译后修饰模式的一个蛋白或肽；及缺乏BAS-1胞内区的蛋白；亦可为包含一蛋白及一可药用载体的组合物。

抗体实施方案包括BAS-1蛋白为灵长类蛋白的那些方案，所述灵长类蛋白包括人类蛋白的；抗体抗SEQ ID NO2所定义的肽序列；抗体具有至少约10μM的Kd；抗体为单克隆抗体；或抗体被标记。进一步的实施方案包括其中的抗体诱导B细胞强烈的增殖；及/或保护B细胞免于射线或甾类激素诱导的细胞编程性死亡。

本发明还包括一些试剂盒，如试剂盒包含如一编码BAS-1蛋白或肽的一段核酸；一基本纯的BAS-1蛋白或片段；特异结合BAS-1蛋白的一个抗体或受体。包含核酸的试剂盒可以包含SEQ ID NO1所定义的编码序列。对于包括蛋白或其片段的试剂盒，多肽常选自：来自灵长类包括人的蛋白或肽；包含至少SEQ ID NO2中所定义的一个多肽片段的一个蛋白或肽；与天然BAS-1蛋白显示不同的翻译后修饰模式的一个蛋白或肽。

另一试剂盒可以包括一抗体或受体，其中：BAS-1蛋白为灵长类蛋白，包括人类蛋白；抗体抗SEQ ID NO2所定义的肽序列；抗体具有至少约10μM的Kd；抗体为单克隆抗体；或抗体被标记。

本发明还提供了筛选BAS-1结合配偶体的样品的方法，包括生产纯化的或重组的BAS-1蛋白，及在样品中筛选能特异与BAS-1蛋白的结合配偶体结合的样品的步骤。在某些实施方案中，样品包括来自T细胞，树突状细胞包括滤泡树突状细胞，或基质细胞包括成纤维细胞，内皮细胞，和上皮细胞的蛋白。在另外的实施方案中，结合配偶体为一抗体，样品为杂交瘤上清。

本发明的其它方面包括调控细胞生理或发育的一种方法，包括将细胞与BAS-1蛋白的激动剂或拮抗剂接触。通常，生理学选自：免疫抑制；细胞毒性杀伤的激活；细胞因子产生的调控；或淋巴瘤生长。拮抗剂通常为抗灵长类BAS-1蛋白的抗体。方法可包括这些与信号传导介质通过抗原受体的结合，CD40:CD40配体途径，或CD28/CTLA-4:B7/B70途径，如抗CD3，抗CD40，抗CD40配体，抗CD28，抗CTLA-4；抗B7，抗B70，或适当表面信号分子的可溶性部分。

                  发明详述

Ⅰ．概论

本发明提供了显示活化抗原性质的一种人类蛋白的氨基酸序列和DNA序列。该蛋白被命名为B细胞活化和存活抗原-1(BAS-1)。本文描述的灵长类序列是在一鼠基因被首先描述后获得的。见Miyake等(1995)免疫学杂志154:3333-3340。其它灵长类动物中类似的蛋白序列亦应存在。以下描述旨在示例所述人类BAS-1天然等位基因，但同样适用于如来自其它个体的等位基因和/或多态变体，亦适于拼接变体，如天然形式。

这些基因将使分离编码与此相关的其它灵长类蛋白的基因成为可能，进一步扩展了本发明所述具体实施方案之外的种系。方法在下面概括给出。

人类B细胞活化和存活抗原1(BAS-1)，因其生物活性而得名。其鼠同源物的单克隆抗体，RP105，诱导鼠B细胞的强烈增殖，并以类似于抗CD40抗体或CD40配体的方式保护鼠B细胞免于射线诱导的细胞编程性死亡。

人类的BAS-1cDNA用基于来自鼠RP105序列的核酸序列分离。相应编码蛋白的分析表明人BAS-1为包括富含亮氨酸部分的蛋白家族中的一员。该家族的其它成员包括CD14-LPS受体，FSH/LH/TSH受体，亲神经受体。这些受体显示参与信号传导。

人类的BAS-1cDNA用鼠RP105的不同区域的序列推断得来。鼠和人类BAS-1开放阅读区的同源性比较显示了约67％的DNA序列和约73％的氨基酸序列与鼠RP105完全一致。

人类的BAS-1可能还具有免疫系统之外的功能，如在其它细胞类型中的发育调控，见，如，Gilbert(1991)发育生物学(3版)，SinauerAssociates,Sunderland,MA；Browder等(1991)，发育生物学(3版)，Saunders,Phildelphia,PA.；Russo等(1992)发育：分子基因途径，Spinger-Verlag，纽约，N.Y.；及Wilkins(1993)动物发育的基因分析(2版)Wiley-Liss，纽约，N.Y.人类BAS-1配体的确认将有助于回答这些观察中提出的一些问题。

Ⅱ．纯化的人类BAS-1

SEQ ID NO1揭示了cDNA的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。氨基酸序列在SEQ ID NO2中亦列出。信号序列显示由蛋氨酸(1)至缬氨酸(20)；氨基侧翼区域由半胱氨酸(28)至亮氨酸(58)，包括精氨酸上两个潜在的N-连接的糖基化位点(残基34,53)；富含亮氨酸部分的串联重复序列从苏氨酸(55)到酪氨酸(592)，包括精氨酸上9个潜在的N-连接的糖基化位点(残基70,78,201,234,244,394,402,451，及573)；羧基侧翼区域由亮氨酸(574)到半胱氨酸(625)；跨膜区从丙氨酸(629)至缬氨酸(650)；胞内区从赖氨酸(651)到苯丙氨酸(661)，包括酪氨酸上两个潜在的磷酸化位点(652和658)。

下表显示了SEQ ID NO2中列出的人类BAS-1蛋白的富含亮氨酸重复单元的排列。

                        表1

                C    I   I

共有区         LXXLXLXXNXLXXLXXXXXXXLXX

1:     55-78   TEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMN

2:    79-102   LTFLDLTRCOINWIPEDTFQSHHQ

3:   103-126   LSTLVLTGNPLIFMAETSLNGPKS

4:   127-150   LKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLEN

5:   151-174   LESLYLGSNHISSIKFPKDFPARN

6:   175-198   LKVLDFONNAIHYISREDMRSLEQ

7:   199-223   AINLSLNFNGNN-VKGIELGAFDSTV

8:   224-246   FQSLNFGGTPNL-SVIFNGLQNST

9:   247-275   TQSLWLGTFEDIDDEDISSAMLKGLCEMS

10:  276-299   VESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQ

11:  300-322   LQELDLTATHLKGLPSGMKG-LNL

12:  323-346   LKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPS

13:  347-371   LTHLYIRGN-VKKLHLGVGC-LEKLGN

14:  372-397   LQTLDLSHNDIEASDCCSLQ-LKNLSH

15:  398-421   LQTLNLSHNEPLGLQSQAFKECPQ

16:  422-446   LELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHF

17:  447-470   LQVLNLTYCFLDTSNQHLLAGLPV

18:  471-497   LRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQTVGS

19:  498-521   LEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGK

20:  522-544   MSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLK

21:  545-568   GIYLNLAANSINIISPRLLPILSQ

22:  569-592   QSTINLSKNPLDCTCSNIHF-LTWY

本文所用术语“人类BAS-1”指，当用于蛋白定义时，具有SEQ ID NO2所显示氨基酸序列的蛋白。本发明还包括含其片段，如突变体及多态变体，和显示相同生物学功能或与人类BAS-1特异结合组分相互作用的人源性多肽的蛋白。这些结合组分通常以高亲和性结合人类BAS-1，如至少约100nM，通常好于大约30nM，优选好于大约10nM，更优选好于大约3nM。在除人外的其它物种如灵长类，发现同源蛋白。

本文所用术语“多肽”包括一个片段或部分，包括一段氨基酸残基，至少约8个氨基酸，通常至少10个氨基酸，更常见12个氨基酸，更常见至少14个氨基酸，更常见至少16个氨基酸，典型的至少约18个氨基酸，更典型的至少约20个氨基酸，常常至少约22个氨基酸，更常常至少约24个氨基酸，优选至少约26个氨基酸，更优选至少约28个氨基酸，在尤其优选的实施方案中，至少约30个或更多氨基酸，如33,37,41,45,49,53,57，等。

术语”配体”或”结合组分”指那些能特异性与BAS-1结合的分子，如，以抗体-抗原型方式。其它相互作用包括，如，配体-受体型，或与BAS-1相关的化合物，例如通过蛋白-蛋白相互作用，共价或非共价结合。该分子可为一聚合物或化学试剂。除相互作用具有特异的亲和性外，关于在配体-受体相互作用中BAS-1是配体还是受体没有指定。功能性类似物可能是结构修饰的配体，或完全无关的一个分子，它具有与适当的配体结合决定区相互作用的分子形状。配体可为激动剂或拮抗剂，见如，Goodman，等(编)(1990)Goodman和Gilman：治疗学的药理学基础(8版)，Pergamon出版社。

多肽或其片段的溶解度取决于环境及多肽。许多参数影响多肽的溶解度，包括温度，电解质环境，多肽的大小及分子特征，以用溶剂的性质。通常，多肽所用温度为约4℃至约65℃的范围。常用温度大于约18℃，更常见大于约22℃。用于诊断目的时，常用温度为约室温或更热，但低于试验中组分的变性温度。用于治疗目的时，温度常为体温，对人通常为大约37℃，尽管在一定条件下原位或体外温度可能会升高或降低。

电解质通常接近原位生理条件，但也可能修改至更有利的更高或更低的离子强度。实际离子强度可被调整至与生理或分析条件下所用标准缓冲液一致。

多肽的大小和结构通常应该处于基本稳定状态，通常不处于变性状态。多肽可在四级结构上与其它多肽相关联，如，来调节溶解性，或以类似天然磷脂双分子层相互作用方式与磷脂或去污剂相关联。特别地，人们深信，天然蛋白常通过PI键与脂质相连。

溶剂通常为生物学可相容的缓冲液，用于保持生物活性的类型，并且通常接近于生理溶剂。溶剂通常具有中性pH值，一般在约5和10之间，优选约7.5。有些情况下，加入去垢剂，通常为温和的，非变性的，如CHS(胆甾醇单琥珀酸酯)或CHAPS(3-([3-胆胺丙基]二甲氨基)-1-丙基硫酸酯)，或以足够低的去垢剂浓度而不至影响蛋白的三级结构。

溶解性通过以Svedberg单位测定的沉降反映，即测定在特定条件下分子的沉降速度。典型的沉降速度测定在分析用超速离心机中进行，但目前常在标准超速离心机中进行。参见，Freifelder(1982)物理生物化学(2版)，W.H.Freeman；和Cantor及Schimmel(1980)生物物理化学1-3部分，W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco.粗略测定时，含推定的可溶多肽的样品在标准全尺寸的超速离心机上以大约50Krpm的速度旋转约10分钟，可溶性分子保留在上清中。可溶性的微粒或多肽通常低于约30S，更常见低于约15S，通常低于约10S，更常见低于约6S，在一特定的实施方案中，优选低于约4S，更优选低于约3S。

Ⅲ．物理变种

本发明还包括具有基本上与人类BAS-1的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白或肽。包括，如，1倍，2倍，和3倍保守的取代。优选取代远离保守的半胱氨酸，通常在远离螺旋结构区的区域。这样的变种对于产生特异抗体有用，并且常有许多或全部共同的生物学性质。

氨基酸序列的同一性通过优化残基配对测定。当将保守取代作为配对物时有所变化。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；及苯丙氨酸，酪氨酸。在各个代表性蛋白序列中还以类似的氨基酸序列来包含天然的等位基因变种。典型的同源蛋白或肽具有85-100％(若可引入分歧)至90-100％的同一性(若包括保守取代)，而测定人类BAS-1的氨基酸序列同一性是至少约85％，通常至少约87％，常常至少约89％，典型的至少约91％，常至少约93％，更常见至少约95％，优选至少约97％，更优选至少约98％，在一特别优选实施方案中至少约99％或更多。还可参见，Needleham，等(1970)分子生物学杂志48:443-453；Sankoff等(1983)Time Wrps,String Edits，及大分子：序列比较的理论和实践第一章Addison-Wesley,Reading,MA；及IntelliGenetics软件包，Mountain View,CA；及Wisconsin遗传学计算机组，Madison,WI。

分离的人类BAS-1DNA可被核苷酸取代，核苷酸缺失，核苷酸插入，核苷酸延伸的颠倒来修饰。这些修饰可导致编码有用抗原，其衍生物，或具有相似或相反活性的蛋白的新DNA序列。这些修饰序列可用来产生突变抗原或增强表达。增强的表达可涉及基因扩增，转录增强，翻译增强，和其它机制。这样的BAS-1突变衍生物包括各个蛋白或其片段预定的或位点特异突变。“突变BAS-1”包括一多肽，其另外具有和上述人类BAS-1相同的重要特点，却通过缺失，取代，或插入的方法具有与天然发现的BAS-1不同的氨基酸序列。特别地，“位点特异突变BAS-1”定义为与SEQID NO2定义的抗原同源，且具有这些抗原的各种生物学功能。类似的概念用于不同的BAS-1蛋白，特别是在其它灵长类中发现的。如前指出，应当强调描述一般是指包括另外的BAS-1蛋白，而不仅仅局限于具有讨论的人类的实施方案。

尽管位点特异突变点是预先确定的，突变并不需是位点特异的。人类BAS-1突变可通过氨基酸插入或缺失来实现。可以发生取代，缺失，插入，或任何组合以得到最终构建物。插入包括氨基或羧基端融合。随机突变可引入靶密码子，然后对表达突变物筛选预期活性。在具有已知序列的DNA预定位点进行取代突变的方法是本领域熟知的，例如，通过M13引物突变。参见Sambrook，等(1989)和Ausubel，等(1987和附录)。

DNA的突变一般不应使编码序列置于读码框架之外且优选不产生可杂交产生二级mRNA结构如环或发夹互补区。

本发明还提供重组蛋白，例如，利用这些蛋白片段的异源重组蛋白。异源融合蛋白是自然中不以相同方式正常融合的蛋白或片段的融合物。这样，免疫球蛋白和BAS-1多肽的融合产物是一连续的蛋白分子，具有以典型肽键连接的序列，一般作为单一的翻译产物并具有每一种源肽产生的性质。相似的概念用于异源核酸序列。

另外，还可通过结合其它蛋白的相似功能区来产生新构建物。例如，配体结合或其它片段可在不同的新融合多肽或片段间交换。参见，如，Cunningham，等(1989)科学243:1330-1336；和O’Down，等(1988)生物化学杂志263:15985-15992。这样，显示新的特异性结合的新的嵌合多肽将来自配体结合特异性和其它功能区的功能连接。

由Beaucage和Carruthers(1981)四面体通讯22:1859-1862描述的亚磷酰胺法，可产生合适的合成DNA片段。通常通过合成互补链并在合适条件下使链退火或通过利用带有合适引物序列的DNA聚合酶加入互补链得到双链片段。

Ⅳ．功能变种

阻断对BAS-1抗原的生理反应可通过抑制配体和BAS-1的结合得到，可能通过竞争抑制。由此，本发明的体外测定经常使用分离的蛋白，表达重组BAS-1细胞的膜，含有这些抗原的配体结合片段的可溶性片段，或连于固相底物的片段。这些测定也允许诊断性测定结合片段突变和修饰或配体突变和修饰，例如配体类似物。

本发明也解释了候选药物的筛选方法的应用，例如，其中抗原或抗原片段的中和抗体与受试化合物竞争结合蛋白。用这种方式，抗体可用于检测任何具有一或多个抗原结合位点的多肽的存在，并可用于占据蛋白另外被配体占据的结合位点。

另外，针对含有高亲和力结合位点的BAS-1和BAS-1可溶性片段的中和抗体，可用于抑制组织中的配体功能，例如，组织的非正常生理。

BAS-1抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突变，糖化变异体，和共价或聚集连于其它化学部分。共价衍生物可通过BAS-1氨基酸侧链或N-或C-末端中发现的功能基团连接，用本领域熟知的方法制备。这些衍生物包括，不限定，羧基未端的脂肪酯或酰胺，或含羧基侧链的残基，含羟基残基的O-酰基衍生物，和氨基末端氨基酸或含氨基残基的N-酰基衍生物，例如，.赖氨酸，精氨酸.酰基基团从包括C3到C18正常烷基的烷基部分，以形成烷酰基芳酰基种类的组中选取。

特别的，糖化改变包括，例如在多肽的合成或加工，或进一步加工过程中改变糖化的方式。特别优选完成此步的方法是将多肽暴露于源自正常产生这些加工的细胞的糖基化酶，如人类糖基化酶。去糖基化酶也如此考虑。具有其它最小修饰的，包括磷酰基化氨基酸残基例如磷酪氨酸，磷丝氨酸，或磷苏氨酸相同一级氨基酸序列的版本也可接受。

衍生物的一主要组是BAS-1抗原或其片段和其它蛋白或多肽的共价接合物，这些衍生物可在重组培养中合成，例如N-或C-末端融合或应用本领域熟知的试剂通过反应性侧链基团交联蛋白。优选的交联试剂配体衍生化位点为游离氨基，糖部分，和半胱氨酸残基。

也提供了BAS-1抗原和其它同源或异源蛋白的融合多肽。同源多肽由不同的表面标记融合，产生，例如，具有一个或更多标记蛋白配体特异性的杂化多肽。类似的，异源融合可构建具有衍生蛋白的特性或活性结合。典型的例子为融合报告多肽，例如，荧光素酶，有抗原的片段或区域，例如，配体结合片段，这样目的配体的存在和定位可以容易地测定。参见，例如，Dull，等美国专利4,859,609此处引为参考文献。其它基因融合配偶体包括细菌β-半乳糖苷酶，trpE，蛋白A,β-乳糖酶，α淀粉酶，乙醇脱氢酶，和酵母α结合因子。参见，例如，Godowski，等(1988)科学241:812-816。

由Beaucage和Carruthers(1981)四面体通讯22:1859-1862描述的亚磷酰胺法，可产生合适的合成DNA片段。经常通过合成互补链并在合适条件下退火或通过利用带有合适引物序列的DNA聚合酶加入互补链得到双链片段。

这样的多肽也可以具有已被磷酸化，磺酰化，生物素化，或加入或去掉其它部分，特别是与磷酸基团形状类似的分子而化学修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰可作为有用的标记试剂，或作为纯化靶点，例如，亲和配体。

融合蛋白一般可通过重组核酸方法或合成多肽方法制备。核酸制备和表达的技术在，例如，Sambrook，等(1989)分子克隆：实验室手册(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室中一般性描述。合成多肽的技术在，例如，Merrifield(1963)美国化学会杂志85:2149-2156；Merrifield(1986)科学232:341-347；和Atherton等(1989)固相多肽合成：操作方法，IRL出版社，Oxford中描述。

本发明也涉及了BAS-1抗原的衍生物而不只是氨基酸序列或糖化的变种的应用。这些衍生物可涉及化学部分的共价或聚集联系。这些衍生物一般分为三类：(1)盐，(2)侧链和末端残基的共价修饰，和(3)吸附复合物，例如，和细胞膜吸附。此类共价或聚合衍生物可用作免疫原，作为免疫测定试剂，或纯化方法例如配体或其它结合配体的亲和纯化中的试剂。例如，BAS-1抗原可通过本领域熟知的方法，共价结合固定于固相载体如溴化氰活化的葡聚糖，或吸附至聚烯烃表面，有或没有戊二醛交联，用于检测或纯化抗BAS-1抗体或其配体。BAS-1抗原也可用可检测基团标记，例如用氯胺T法放射性碘标记，共价结合于稀土螯合物，或缀合与另一荧光部分用于诊断测定。

本发明的增溶BAS-1抗原可用作产生抗原或其片段特异抗体或抗血清的免疫原。纯化抗原可用来筛选用不同形式含有该蛋白的不纯制剂免疫而制备的单克隆抗体或抗原结合片段。特别是，“抗体”一词也包括天然抗体的抗原结合片段。纯化的BAS-1可用作检测应答于提高水平的BAS-1或含抗原的细胞片段的存在而产生的抗体的试剂，两者都对非正常或特异的生理或疾病状态有诊断意义。另外，BAS-1片段也可作为产生本发明抗体的免疫原，如下描述。例如，本发明涉及针对SEQ ID NO1的氨基酸序列，或由SEQ ID NO1所示核苷酸编码的氨基酸序列或其片段的抗体。特别的，本发明涉及对被预测位于脂双层以外的特异片段具有结合亲和性或针对被预测位于脂双层以外的特异片段的抗体。另外，不同的构建物可通过融合膜相关片段和该分子的细胞外暴露部分而产生。

本发明涉及另外的紧密相关的变种的分离。很可能存在于不同个体的等位变种具有，例如，与本文描述的实施方案超过90-97％的同一性。

本发明也提供了分离一组在结构，表达和功能上有明显和相似的相关抗原的方法。通过抗原独特的物种对应物的分离和定性，将大大促进抗原的许多生理功能的阐明。特别的，本发明提供了用于分辨其它不同物种中另外的同源遗传物的有用的探针。

分离的基因可转染无BAS-1表达的细胞，例如，缺乏相应的抗原且具有阴性背景活性的物种或细胞。转化基因的表达可分离具有定义的或单一的物种变种的抗原纯细胞株。此过程可允许更敏感的检测和区分任何配体的生理效果。亚细胞片段，例如，细胞质或膜片段，可被分离应用。

分析影响配体提供的各种不同功能的关键结构元件，利用标准现代分子生物学技术是可能的，特别是在相关类的成员比较中。参见，例如，类似物扫描突变技术，Cunningham等描述，(1989)科学243:1339-1336；和O’Dowd等所用方法(1988)生物化学杂志263:15985-15992；和Lechleiter等(1990)EMBO J.9:4381-4390。

特别的，配体结合片段可在物种变种间取代以测定哪一个结构特征是对配体结合亲和性和特异性都重要的。一列不同的BAS-1变种用于筛选具有与不同变种相互作用结合特性的配体。

细胞内功能可能涉及正常可进入细胞溶胶的抗原片段。然而，抗原内化可能发生于某种情况，且细胞内元件和指定的细胞外片段的相互作用可能发生。BAS-1和细胞内其它元件相互作用的特殊片段可提供突变或直接生化方法分辨，例如交联或亲和的方法。通过结晶或其它物理方法分析结构也是可行的。信号传导机制的进一步研究将包括用亲和方法可分离的相关组分的研究。

将进行BAS-1抗原的表达和控制的进一步研究。与抗原相关的控制元件具有差别发育，组织特性，或其它表达方式。上游或下游基因区，例如，控制元件，是令人感兴趣的。

BAS-1抗原的结构研究将导致设计新配体，特别是具有激动或拮抗特性的类似物。这可结合以前描述的筛选方法分离具有期望特性谱的配体。

在其它细胞类型中的表达往往导致特定抗原的糖化区别。不同变种显示基于结构区别而非氨基酸序列区别的不同功能。不同修饰可能导致不同功能，影响的阐明目前是可能的。

由此，本发明提供重要的发展的抗原和从它们发展来的试剂。尽管以前的描述主要集中在人类BAS-1，本发明技术熟练人员将立即认识到本发明包括其它BAS-1抗原，例如，灵长类和其它哺乳动物物种变种。

Ⅴ．抗体

抗体可从BAS-1抗原和其片段不同等位变种，以天然存在形式或重组方式获得。另外，抗BAS-1抗体可以活性形式或失活形式获得。也涉及抗独特型抗体。

抗体，包括结合片段和单链模型，针对预先决定的BAS-1片段可通过用片段和免疫原蛋白的接合物免疫动物获得。单克隆抗体从分泌期望抗体的细胞制备。这些抗体可筛选结合于正常或缺陷BAS-1，或筛选激活或拮抗配体活性。这些单克隆抗体通常以至少好于大约1mM的KD结合，更通常好于约300μM，典型地好于约10μM，更典型的好于约30μM，优选好于约10μM，更优选好于约3μM，如，1μM,300nM,100nM,30nM,10nM,3nM,1nM,300pM,100pM,30pM等。

本发明的抗体，包括抗原结合片段，具有显著的诊断或治疗价值。它们可以是强拮抗剂，与BAS-1结合并抑制配体的结合或抑制配体产生生物学应答的能力。它们亦可用作非中和抗体，并且可以与毒素或放射性核素偶连，从而使当抗体与抗原结合时，细胞被自身杀死。进一步地，这些抗体可直接或通过一连接臂间接地缀合于药物或其它治疗试剂。

本发明的抗体还可用于诊断应用中。作为捕获或非中和抗体，它们能结合于BAS-1而不抑制配体结合。作为中和性抗体，它们可用于竞争结合试验。它们还可用于检测或定量BAS-1或其配体。

BAS-1片段可连接于其它材料，特别是多肽，如融合或共价结合多肽以用作免疫原。BAS-1和其片段可融合或共价连接于各种免疫原，如匙孔血蓝蛋白，牛血清白蛋白，破伤风毒素，等。见微生物学，HoeberMedical Division,Harper and Row,1969；Landsteiner(1962)血清学反应的特异性，Dover Publications，纽约，和williams，等(1967)免疫学和免疫化学方法，第一卷，Academic Press，纽约，描述了制备多克隆抗血清的方法。典型方法涉及用抗原对动物超免疫法。重复免疫后立即收集动物的血并分离γ球蛋白。或，收集细胞以产生杂交瘤。

某些情况下，期望从不同的哺乳动物宿主中制备单克隆抗体，例如小鼠，啮齿类，灵长类，人类，等。制备这些单克隆抗体的技术的描述可在以下找到，例如，Stites，等(eds)基础和临床免疫(第四版)，LangeMedical Publication,Los Altos,CA，和其中所引用文献；Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，CSH出版；Goding(1986)单克隆抗体：原理和实践(第二版)Academic Press，纽约；特别是Kohler和Milstein(1975)自然256:495-497，讨论了一种产生单克隆抗体的方法。简要地总结，此方法涉及用免疫原注射动物。然后处死动物并取脾细胞，和骨髓瘤细胞融合。产生杂交细胞或杂交瘤能在体外复制。然后筛选杂交瘤以分离单克隆，每一株分泌对免疫原的单一一种抗体。以此方法，获得的单个抗体是应答识别免疫原物质的特异位点，而产生的免疫动物的无限增殖化的和克隆的单一B细胞的产物。

其它适合的技术涉及体外将淋巴细胞暴露与抗原多肽或可选择地选择噬菌体或类似载体中的抗体库。见，Huse，等，(1989)“λ噬菌体中产生的巨大免疫球蛋白所有组成成分的重组库”科学246:1275-1281：和Ward，等(1989)自然341:544-546。本发明的多肽和抗体修饰或未修饰均可应用，包括嵌合或人源化抗体。经常的，多肽和抗体通过连接，共价或非共价，以产生有可检测信号的物质进行标记。大量的标记和缀合技术已在科学和专利文献中广泛报道。合适的标记包括，放射性同位素，酶，底物，协同因子，抑制剂，荧光素部分，化学发光部分，磁性颗粒，诸如此类。提供这些标记的使用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。重组免疫球蛋白也可产生，见Cabilly，美国专利4,816,567。

本发明的抗体还可用于亲和层析分离蛋白。抗体连接于固相载体，例如，颗粒如琼脂糖，葡聚糖，或此类，制备柱子，其中细胞裂解液可过柱，洗柱，接着以升高浓度的温和变性液过柱，由此纯化的BAS-1蛋白会被释放。

抗体还可用于对表达文库筛选特定的表达产物。通常用于此法的抗体用使通过抗体结合而易于检测抗原的存在的部分标记。

针对BAS-1抗原的抗体也可用于产生抗独特型抗体。这可用于检测或诊断和各个抗原表达相关的不同的免疫球蛋白条件。

Ⅵ．核酸

人类BAS-1探针，或其片段，可用于从其它物种中识别或分离编码同源蛋白的核酸，或同一或其它物种中的其它相关蛋白。

本发明涉及用分离的DNA或片段编码生物活性相关BAS-1多肽的应用。另外，本发明涉及编码生物活性蛋白或多肽的分离或重组的DNA，其能在适合条件下与这里所描述的DNA序列杂交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的BAS-1，或片段，具有SEQ ID NO1所示的核酸编码的氨基酸序列。进一步，本发明涉及分离或重组的DNA，或其片段的应用，其编码与BAS-1同源的蛋白或用编码人类BAS-1的cDNA作为探针分离得到。分离的DNA具有独立的5’和3’侧翼调控序列，例如，启动子，增强子，聚腺苷酸附加信号，和其它。

“分离”的核酸是一种核酸，例如，一种QNA,DNA或混合的聚合物，其基本上从出发物种的天然伴随一天然序列的其它成分的核糖体，聚合酶，和侧翼基团组序列中分离。本发明涉及从天然发生环境中分离的核酸序列，并包括重组或克隆DNA分离物和化学合成类似物或异源系统合成的生物类似物。基本上纯的分子包括分子的分离形式。

分离的核酸一般是分子的同源组分，但，在某些实施方案中含有少量异源。异源性一般在聚合物末端或对预期生物功能和活性不关键的部分。

“重组”核酸通过其产生方法或其结构而定义。根据其产生的方法，例如，通过一种方法制备的一种产物，该过程利用重组核酸技术，例如，涉及人工干预核酸序列。或者，可以是一核酸序列，通过含有天然并不相连的两个片段的融合，但是指排除天然产物，例如，天然发生的突变，的序列产生。由此，例如，包括用任何非天然发生的载体转化的细胞的来制备产物，如用含有利用任何合成寡核苷酸方法得来序列的核酸。经常这样做，用其它编码同一或保守氨基酸的丰余密码子取代某一密码子，同时一般引入或去除，例如，限制性或序列识别位点。或者，将预期功能的核酸序列连起来以产生具有普通天然形式中没有的结合功能的单一遗传物。限制性内切酶识别位点经常是这样的人工操作的靶点，但其它位点特异靶点，例如启动子，DNA复制位点，调控序列，控制序列，或其它有用特点可设计掺入。类似的概念推广至重组，例如，融合，多肽。特别包括合成核酸，通过遗传密码的丰余性编码这些抗原的类似多肽或片段，和不同物种变种来源的融合序列。

核酸中的“片段”是至少17个核苷酸的连续部分，一般至少20个核苷酸，更一般至少约23个核苷酸，通常至少约26个核苷酸，更通常至少约29个核苷酸，经常至少约32个核苷酸，更经常至少约35个核苷酸，典型至少约38个核苷酸，更典型至少约41个核苷酸，普遍至少约44个核苷酸，更普遍至少约47个核苷酸，优选至少约50个核苷酸，更优选至少约53个核苷酸，在特别优选的实施方案中将至少约56个或更多的核苷酸，例如60,75,100,150,200,250,300，等。

编码BAS-1蛋白的DNA特别可用于识别编码相关或同源抗原的基因，mRNA,cDNA种类，同样用于鉴别编码不同物种的同源蛋白的DNA。不同的BAS-1蛋白序列类似并在此涉及。然而，即使与BAS-1有更远的进化关系的蛋白也可用这些序列稳定分离，若其具有足够的相似性。最感兴趣的是原始BAS-1蛋白。

本发明进一步包括具有与此前的分离DNA序列一致或高度同源的DNA序列的重组DNA分子和片段。特别是，序列经常操作连于控制转录，翻译，DNA复制的DNA片段。或者，衍生自基因组序列的重组克隆，例如，含有内含子的重组克隆，可用于转基因研究，包括，例如转基因细胞或器官，和基因治疗。见，例如，Doodnow(1992)“转基因动物”Roitt(编)免疫学全书Academic Press,San Diego,1502-1504页；Travis(1992)科学256:1392-1394；Kuhn，等(1991)科学254:707-710；Capecchi(1989)科学244:1288Robertson(1987)(编)畸肽瘤和胚胎干细胞：操作指南IRLPress,Oxford；和Rosenberg(1992)临床肿瘤杂志10:180-199。

比较同源核酸序列，表现出显著的序列相似性。核酸同源性的标准一般或通过本领域常用的序列比较或者以基因杂交条件为基础来测定同源性。以下更详细描述了杂交条件。

核酸序列比较的基本同一性指比较该片段，或其互补链，当插入或缺失适当的核苷酸而最优匹配时，至少约50％核苷酸，一般至少约56％核苷酸，更一般至少约59％核苷酸，通常至少约62％核苷酸，更通常至少约65％核苷酸，经常至少约68％核苷酸，更经常至少约71％核苷酸，典型至少约74％核苷酸，更典型至少约77％核苷酸，普遍至少约80％核苷酸，更普遍至少约85％核苷酸，优选至少约90％核苷酸，更优选至少约95％至98％或更多核苷酸，在特别实施方案中高达99％或更多的核苷酸，是一致的。或者，当片段在选择的杂交条件下与一条链，或其互补链，典型用SEQ IDNO1衍生的序列杂交时存在基本的同一性。典型的，当存在至少约14个核苷酸的链上至少约55％同源性时，优选至少约65％，更优选至少约75％，最优选至少约90％，选择性杂交可以发生。见，Kanehisa(1984)核酸研究12:203-213。同源性比较的长度，如述，可以是更长的链，在某实施方案中是至少约17核苷酸的链，一般至少约20个核苷酸，更一般至少约24个核苷酸，典型至少约28个核苷酸，更典型至少约40个核苷酸，优选至少约50个核苷酸，更优选至少约75-100或更多个核苷酸，例如125,150,200,250,300，等。

严格的条件，考虑到杂交过程中的一致，是盐，温度，有机溶剂，和其它杂交反应中通常控制的常数的严格条件结合。严格的温度条件通常包括超过约30℃的温度，更通常超过约37℃的温度，一般超过约45℃，更一般超过约55℃，优选超过约65℃的温度，更优选超过约70℃的温度。严格的盐条件一般少于约500mM，通常少于约350mM，更通常少于约200mM，典型少于约150mM，优选少于约100mM，更优选少于约50mM。然而这些常数的结合比任何单独常数的测定重要的多。参见，例如Wetmur和Davidson(1968)分子生物学杂志31:349-370。

来自其它人类个体的BAS-1可通过杂交或PCR被克隆和分离。或者，在表达克隆过程中制备具有较少等位基因特异性的抗体是有用的。等位变种可用，例如过量PCR和序列分析结合，例如，用特定引物，测定，以提供人群中等位变种的信息。

Ⅶ．制备BAS-1；模拟

编码BAS-1抗原或片段的DNA可通过化学合成，筛选来自多种细胞株或组织标本的cDNA文库，或基因组文库得到。

此DNA可在多种宿主细胞中表达以合成全长抗原或片段，其反过来可用于产生单克隆或多克隆抗体；用于结合研究；用于构建和表达修饰分子；用于结构/功能研究。每一抗原或其片段可在用合适表达载体转化或转染的宿主细胞中表达。这些分子可以是基本上纯化的，不含蛋白或细胞内容物，例如，重组宿主来源的，且当结合可药用载体和/或稀释剂时特殊用于药物组合物。抗原，或其部分，可作为与其它蛋白融合表达。

表达载体是典型的含有目的抗原或其片段的自身复制DNA或RNA构建物。通常可操作地连于合适的适当宿主细胞中识别的合适的遗传控制元件。这些控制元件可影响合适宿主中的表达。影响表达所需的特异类型控制元件依赖于所用可能发生的宿主细胞。通常，遗传控制元件可包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，且典型包括转录启动子，控制转录起始的任选的操纵子，提高mRNA表达水平的转录增强子，编码合适的核糖体结合位点的序列，终止转录和翻译的序列。表达载体通常也含有一个复制起始点使载体能不依赖于宿主细胞而复制。

本发明的载体含有编码人类BAS-1抗原，或其片段的编码生物活性多肽的DNA。DNA可在病毒启动子控制下并可编码选择标记。本发明进一步涉及能在原核或真核宿主中表达编码人类BAS-1抗原的真核cDNA的表达载体的应用，其中载体相容于宿主且编码抗原的真核cDNA插入载体以便含有载体的宿主生长表达所述cDNA。通常，表达载体设计为可在其宿主细胞中稳定复制或扩增以大大增加每一细胞中的目的基因的拷贝总数。并不是总需要表达载体在宿主细胞中复制，例如，用不含宿主细胞可识别复制起始点的载体影响抗原或其片段在不同宿主中瞬时表达是可能的。用引起人类BAS-1基因或其片段通过重组整合入宿主DNA的载体也是可能的。

载体，如此处所用，包括质粒，病毒，细菌噬菌体，可整合DNA片段，和其它能将DNA片段整合入宿主基因组中的载体。表达载体是含有遗传控制元件影响操作相连基因的表达的特殊载体。质粒是最普遍载体应用形式但具有相同功能其它所有其它载体形式，是，或正被，本领域所熟知，适合此处应用。参见，例如，Pouwels，等(1985和附录)克隆载体：实验室手册，Elsevier，纽约，和Rodriquez，等(1988)(编)载体：分子克隆载体和其应用纵览，buttersworth,Boston,MA。

转化的细胞是那些以重组DNA技术构建的人类BAS-1载体转化或转染的细胞，优选哺乳动物细胞。转化的宿主细胞通常表达抗原或其片段，但对于克隆，扩增，和操纵其DNA的目的，不需表达此蛋白。本发明进一步涉及在营养培养基中培养转化的细胞，这样允许蛋白在培养基中积累。蛋白可从培养物或培养基中回收。

为本发明的目的，彼此功能相关的DNA序列可操作地连接起来。例如，前序列或分泌引导物的DNA被可操作地连于多肽，若它被以前蛋白表达或参与指导多肽到细胞膜或多肽分泌。若控制多肽的转录，启动子被可操作地连接于编码序列；若定位允许翻译，核糖体结合位点被可操作地连于编码序列。通常合适的操作连接指连续并符合读码框架，然而，某些遗传元件，如阻遏基因并不是连续连接，但仍结合操纵子序列，随之控制表达。

合适的宿主细胞包括原核生物，低等真核和高等真核生物。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物，例如，大肠杆菌和枯草杆菌。低等真核生物包括酵母，例如，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)和毕赤氏酵母属(pichia)，和网状原虫(Dictyostelium)属的物种。高等真核生物包括从动物细胞建立的组织培养细胞株，包括非哺乳动物来源，例如昆虫细胞，鸟，和哺乳动物来源例如，人类，灵长类和啮齿类。

原核宿主载体系统包括许多不同物种的各种载体。如此处所用，大肠杆菌和其载体被普遍应用，包括其它原核生物中所用相应载体。用于扩增DNA的代表性载体是pBR322或其许多衍生物。可用于表达人类BAS-1抗原或其片段的载体包括，但不限于，这些含有lac启动子(pUC系列)的启动子；trp启动子(pBR322-trp)；Ipp启动子(pIN系列)；λ-pP或pR启动子(pOTS)；或杂交启动子，如ptac(pDR540)。参见Brosius，等(1988)“用λ-,trp-,lac-,Ipp衍生启动子的表达载体”，Rodriguez和Denhardt(编著)载体：分子克隆载体和其应用纵览，Butersworth,Boston，第10章，205-236页。

低等真核生物，例如，酵母和网状原虫，可用含人类BAS-1抗原序列载体转化。为本发明的目的，最普遍的低等真核生物宿主是面包酵母，啤酒糖酵母。尽管也可用若干其它株或种，而它们一般被用作低等真核生物代表。典型的酵母载体包括复制起始点(除整合型)，选择基因，启动子，编码目的蛋白或其片段的DNA，翻译终止序列，聚腺苷酸和转录终止序列。酵母合适的表达载体包括如3-磷酸甘油酸激酶和各种其它糖解酶基因启动子的基本启动子，或如乙醇脱氢酶2启动子或金属巯蛋白启动子的可诱导启动子。合适的载体包括以下类型的衍生物：自身复制低拷贝数(如YRp系列)，自身复制高拷贝数(如YEp系列)；整合型(如YIp系列)，或微小染色体(如YCp系列)。

高等真核组织培养细胞是表达功能活性人类BAS-1抗原蛋白的优选宿主细胞。原则上，许多高等真核组织培养细胞系是可行的，如，昆虫杆状病毒表达系统，无论来自脊椎动物或无脊椎动物。然而，在此过程中协同翻译和后翻译都优选哺乳动物细胞。转化或转染并繁殖这些细胞已成为常规方法。有用细胞系的例子包括HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，幼鼠肾(BRK)细胞系，昆虫细胞系，鸟细胞系和猴(COS)细胞系。这些细胞系的表达载体通常包括复制起始点，启动子，翻译起始点，RNA剪切位点(若用基因组DNA)，聚腺苷酸位点，和转录终止位点。这些载体还通常含有选择基因或扩增基因。合适的表达载体可为质粒，病毒，含有衍生启动子的反转录病毒，例如，从腺病毒，SV40，小球病毒，痘苗病毒，涎腺病毒来源的。合适的表达载体的代表性例子包括pCDNA1；pCD，参见Okayama，等(1985)分子细胞生物学，5:1136-1142；pMClneo polyA，参见Thomas等(1987)细胞51:503-512和杆状病毒载体如pAC373或pAC610。

经常期望在提供特殊或限定糖基化方式的系统中表达人类BAS-1抗原多肽。这种情况下，将由表达系统天然提供一般方式。然而，通过把多肽，例如，未糖基化形式暴露于引入异源表达系统的合适的糖基化蛋白，该方式可被修饰。例如，BAS-1抗原基因可和一个或多个编码哺乳动物或其它糖基化酶的基因共转染。用这种方法，在原核或其它细胞中可获得某种哺乳动物糖基化方式。

BAS-1抗原亦可以和磷脂酰肌醇(PI)连接的方式产生并可通过用磷脂酰肌醇剪切酶，例如，磷脂酰肌醇磷脂酶C处理，从膜上除去。这使抗原以生物活性形式释放，并允许用标准蛋白化学方法纯化。参见，例如，Low(1989)生物化学生物物理年鉴988:427-454；Tse等(1985)科学230:1003-1008；和Brunner，等(1991)细胞生物杂志114:1275-1283。或者，纯化片段可经基因工程进入序列，例如，在N末端或C末端，以帮助蛋白产物的纯化或检测。去除这样片段的方法也可是基因工程性的，例如，蛋白酶剪切位点。

既然整个序列已知，人类BAS-1抗原，片段或其衍生物可通过合成多肽的方便方法制备。这包括如Stewart和Young(1984)固相肽合成Pierce Chmical Co.,Rockford,IL；Bodanszky和Bodanszky,(1984)多肽合成实践，Springer-Verleg，纽约和Bodanszky,(1984)多肽合成原理，Springer-Verleg，纽约所描述的方法。例如，可用叠氮方法，酰氯方法，酸酐方法，混合酸酐法，活化酯法(例如，对-硝基苯酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯，或氰甲酯)，羰基二咪唑法，氧化还原法，或环己基碳二亚胺(DCCD)/添加法。固相和液相合成均适用上述方法。

人类BAS-1抗原，片段，或衍生物根据上述肽合成中常用的相同的方法能合适地合成，一般或者通过所谓的逐步合成方法，包括按顺序逐一将氨基酸与末端氨基酸缩合，或将肽片段与末端氨基酸偶联。偶联反应中不用的氨基必须保护以免在不恰当的位置偶联。

如果采用固相合成，C末端氨基酸通过其羧基结合于一不溶性的载体或支持物上，不溶性载体只要能与活性羧基结合，没有其它特殊限制。这些不溶性载体例子包括卤甲基树脂，如氯甲基树脂或溴甲基树脂，羟甲基树脂，苯酚树脂，三烷氧羰基-酰肼树脂，等。

氨基保护的氨基酸通过其活化羧基与已形成的肽或链的反应性氨基缩合来结合到序列中，从而逐步合成肽，全序列合成完毕后从不溶性载体上切下肽而产生肽。该固相合成方法由Merrifield，等(1963)美国化学会会志85:2149-2156一般性描述。

所制备的抗原及其片段可通过肽分离方法从反应混合物中分离和纯化，例如。通过提取，沉淀，电泳和各种色谱等。根据其期望的用途可得到不同等级纯度的本发明的人类BAS-1抗原。可用本文所述的蛋白纯化技术或用本文所述的抗体在免疫吸附亲和色谱上完成纯化。免疫吸附亲和色谱的进行是通过首先将抗体连于固相载体，然后用小细胞肺癌细胞的可溶性裂解液，表达BAS-1抗原的其它细胞裂解液，或DNA技术导致的产生BAS-1抗原的细胞的裂解液或上清与连接的抗体接触，见下文。

Ⅷ．用途

本发明提供如本文其它处所述的具有诊断应用的试剂，例如，在发育或生理异常的一般描述，或下文诊断试剂盒的描述。

本发明也提供具有显著治疗价值的试剂。人类BAS-1(天然存在或重组)，其片段及其抗体，具有人类BAS-1结合亲和活性的化合物，在对异常B细胞反应相关症状的治疗中有用，包括异常增生，例如，肿瘤情况或退化情况。异常增生，再生，退化，和萎缩可用此处提供的组合物通过适当治疗来调节。例如，和BAS-1的异常表达或失调应该终止相关的疾病或失调应该是该抗原激动剂或拮抗剂的可能靶点。BAS-1可能在激活或调节B细胞中起作用，其影响免疫反应，例如，自身免疫失调或变态反应。

另外，BAS-1:BAS-1结合配偶体相互作用可能涉及T:B细胞相互作用以允许激活，增生，和/或如高IgM综合症中观察到的天然B细胞分化。若如此，可用干扰BAS-1:BAS-1结合配偶体信号传导来治疗。可有效阻断其信号，例如，通过可溶性BAS-1或BAS-1抗体。

BAS-1:BAS-1结合配偶体相互作用还可涉及B细胞母细胞和中心母细胞在生发中心的暗区大量增生的起始和/或调节。参见，例如,Banchereau和Rosset(1992)免疫学进展125:68-877。涉及信号引发和/或调节Ig体细胞突变过程的细胞表面相互作用可能也涉及BAS-1，还可能受激活和拮抗作用所调节。

各种细胞类型中其它异常发育情况中显示具有，这BAS-1mRNA通过Nothern印迹分析得知。参见Berkow(编)Merck诊断和治疗手册，Merck＆Co.,Rahway,N.J.；和Thorn，等Harrison,s医学原理，McGraw-Hill，纽约。例如，可通过此分子阻断B淋巴细胞和T淋巴细胞相互作用获得治疗性免疫抑制。这代表了对自身免疫疾病和器官移植中移植排斥的控制的重要治疗手段。或者，可通过阻断B细胞上的BAS-1的生长或存活结果来达到抗B细胞肿瘤治疗目的。阻断可受阻断结合组分，例如中和抗体，或干扰BAS-1和其反受体相互作用的分子影响。可溶性BAS-1可阻断反受体相互作用。

重组BAS-1或BAS-1抗体可被纯化并然后用于病人。这些试剂为治疗应用可和其它活性组分结合，例如与适合的可药用的载体或稀释剂，例如，免疫佐剂，和生理无害的稳定剂和赋形剂结合。这些结合物可过滤除菌并分为剂量形式通过冻干于剂量小瓶或以稳定的水制剂储存。本发明还涉及不完全结合的抗体或结合片段的应用。

用BAS-1或其片段进行药物筛选可进行以发现具有对BAS-1结合亲和性的化合物，包括相关化合物的分离。接着可用生物学检测以测定该化合物是否具有内在的刺激活性及是否在阻断配体活性时是阻断剂或拮抗剂。类似的，具有内在刺激活性的化合物可以活化抗原并在刺激BAS-1活性时是激动剂。本发明进一步涉及BAS-1抗体作为拮抗剂的治疗应用。此方面对其它BAS-1物种变种特别有用。

有效治疗所需的试剂的定量依赖于许多不同的因素，包括给药方法，靶点，病人的生理状态，和其它医疗措施。由此，治疗剂量应滴定至最安全有效。典型的，体外应用剂量可提供这些试剂体内给药量的有用的指导。对动物特定疾病治疗有效量试验将提供对人类剂量的进一步指导。描述了不同的考虑，例如，Gilman，等(编)(1990)Goodman和gilman’s：治疗药物学基础。第八版，Pergamon Press；和Remington’s药学科学，第17版(1990),Mark Publishing Co.,Easton,Penn.此处和下文讨论了给药方法，例如，口服，静脉给药，腹膜内给药，肌肉内给药，经皮扩散，和其它。药用可接受载体包括水，盐水，缓冲液，和其它所述化合物，例如，Merck目录中，Merck&Co.,Rahway,New Jersey。剂量范围一般预期低于1mM浓度的量，典型低于约10μM浓度，通常低于约100nM浓度，优选低于约10pM(皮摩尔picomolar)，最优选低于约1fM(femtomolar)，和合适的载体一起。缓释剂，或缓释装置常常应用以持续给药。

人类BAS-1，及其片段，和其或其片段的抗体，拮抗剂，和激动剂，可直接对受试宿主给药，或依据化合物的大小，可预期在给药前将其连与载体蛋白如卵清蛋白或血清白蛋白。治疗制剂可以多种合适的剂量制剂给药。一旦活性成分可以单独给药，优选将其作为药用制剂存在。制剂典型包括至少一种活性成分，如上定义，和一种或多种其可接受载体。每一载体考虑到和其它成分相容并不对病人有害，都是药用和生理可接受的。制剂包括适合表面，口服，直肠，鼻腔，或非肠道(包括皮下，肌内，静脉内，和皮内)给药的那些制剂。制剂常规下以单位剂量形式存在并以药学领域熟知的方法制备。参见，例如，Gilman，等(编)(1990)Goodman和gilman’s：治疗药物学基础，第八版，Pergamon Press；和Remington’s药学科学，第17版(1990),Mark Publishing Co.,Easton,Penn.本发明的治疗可与其它化疗或化学保护试剂结合或与其它化疗或化学保护试剂相关进行应用。

本发明的天然存在和重组形式的BAS-1可以特别用于能筛选对该蛋白有结合活性的化合物的试剂盒和试验方法。最近已发展了几种自动试验方法可允许短期内筛选数万种化合物。参见，例如，Fordor，等(1991)科学251:767-773，描述了通过固相支持物上多步特定多聚物合成测试结合亲和性的方法。合适的试验发展可通过得到本发明提供的大量的纯化的，可溶性BAS-1而大大地有利进行。

例如，一旦BAS-1的结构确定，可以正常找到其拮抗剂。用纯化的BAS-1的高度自动试验方法的发展使测试潜在的配体拮抗剂成为可能。特别的，用此处实现的筛选技术可发现新的激动剂和拮抗剂。找到具有和多个BAS-1蛋白结合亲和力的化合物，例如，可作为BAS-1等位变种的拮抗剂的化合物，具有特别的重要性。

进一步，由于通过BAS-1:BAS-1结合配偶体的信号可以和其它信号结合起作用，例如CD28/CTLA-4:B7/B70和/或CD40:CD40配体通路，结合组合物和此通路的结合治疗也被考虑。由此，多个信号途径的拮抗理机，或多个通路的刺激可能是有用的。

本发明通过在任一药物筛选技术中利用重组抗原特别用于筛选化合物。用重组蛋白筛选特异配体的优点包括；(a)改进的特定来源的BAS-1的可更新源；(b)试验中每个细胞潜在含有的更多抗原分子数提供更好的信噪比；且(c)物种变种特异性(理论上给出更高的生物和疾病特异性)。

药物筛选的一种方法利用用表达BAS-1的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。将以分离形式表达BAS-1的细胞和其它细胞分离。此细胞，以生存的或固定形式存在，可用于标准抗原/配体结合试验。参见，Parce，等(1989)科学246:243-247；和Owicki，等(1990)美国国家科学院院刊87:4007-4011，描述了检测细胞反应的敏感方法。竞争性试验特别有用，其中细胞(BAS-1源)和具有已知的抗原结合亲和力的标记配体，如¹²⁵I配体，及待测与BAS-1结合亲和力的受试化合物接触并共孵育。接着分离结合配体和游离配体以测定配体结合程度。受试化合物结合的量和测得的标记配体结合的量成反比。数种技术中的任一种可用于从游离配体中分离结合配体以测定配体结合程度。此分离步骤通常可涉及程序如粘附于滤纸然后洗涤，粘附于塑料然后洗涤，或细胞膜离心。生存的细胞也可用于筛选药物对BAS-1介导的功能的影响，例如，第二信使水平，即，Ca⁺⁺；细胞增生；肌醇磷酸池变化；和其它。一些测定方法可以省略分离步骤，例如，接近敏感检测系统。钙敏感染色可用于检测Ca⁺⁺水平，用荧光计或荧光细胞排列装置。

另一方法应用转化真核或原核宿主细胞的膜作为人类BAS-1的来源，这些细胞用指导人类BAS-1抗原表达的DNA载体稳定转化。基本的，从细胞制备膜并用于任何受体/配体结合试验如前述竞争试验中。

还有一种方法是使用来自转化的真核或原核宿主细胞的可溶的，未纯化的或可溶的，纯化的BAS-1。这允许“分子”结合试验，具有提高特异性的优点，自动的能力，和高的药物试验产率。

另一药物筛选技术涉及在筛选具有和人类BAS-1合适结合亲和力的化合物时提供高产率的方法，并在Geysen，欧洲专利申请84/03564,1984,9,13发布中详细描述。首先，大量的不同的小肽试验化合物在固相支持物上合成，例如，塑料针或其它合适的表面，参见Fodor，等(1991)。接着所有的针和未纯化的增溶的或纯化的增溶的BAS-1反应，并洗涤。下一步涉及检测结合的BAS-1。

合理的药物设计也可基于BAS-1和其它效应剂或配体的分子形状的结构研究。效应剂可以是介导反应于配体结合的其它功能的其它蛋白，或通常和抗原作用的其它蛋白。测定特异和其它蛋白作用的位点的一种方法是物理结构测定，例如，X射线晶体衍射图或二维NMR技术。这些将提供哪个氨基酸残基形成分子接触区的提示。蛋白结构测定的详细描述，参见，例如，Blundell和Johnson(1976)蛋白晶体图，Academic Press，纽约。

纯化的BAS-1可直接包被于板上用于前述药物筛选技术。然而，这些抗原的非中和抗体可用作捕获抗体来使各个BAS-1固定在固相上。

Ⅸ．试剂盒

本发明还涉及BAS-1蛋白，其片段，肽，和其融合产物在各种检测BAS-1或配体的存在的诊断试剂盒和方法中的应用。典型的，试剂盒包括含有限定的BAS-1肽或基因片段或识别其中之一或另一的试剂的部分。

测定受试化合物和BAS-1的结合亲和力的试剂盒通常含有试验化合物；标记化合物，例如已知具有对BAS-1结合亲和力的配体或抗体；BAS-1源(天然存在或重组)；和从游离标记化合物中分离结合形式的方法，如固定BAS-1的固相。一旦筛选了化合物，具有对BAS-1合适结合亲和力的化合物可在适合的生物学试验中评价，如本领域所熟知，以测定其是否可作为激动剂或拮抗剂起作用。利用重组BAS-1多肽也提供校正此试验的良好限定标准。

测定浓度，例如，样品中BAS-1，的优选试剂盒通常包括标记化合物，例如配体或抗体，其具有已知的BAS-1结合活性，BAS-1源(天然存在或重组)；和从游离标记化合物中分离结合形式的方法，如，固定BAS-1的目相。一般提供含有试剂，和说明的组分。

测定样品中BAS-1浓度的方法通常包括步骤：(1)从含有BAS-1源的样品中制备膜；(2)洗膜并重悬于缓冲液；(3)通过与加入适当去垢剂的培养基共同孵育膜而增溶BAS-1；(4)调整增溶的BAS-1中的去垢剂浓度；(5)将所述稀释液接触并和放射性标记的配体共孵育以形成复合物；(6)通过滤过聚乙烯亚胺处理的过滤膜回收复合物；并(7)测量恢复的复合物的放射活性。

特异针对人类BAS-1或BAS-1片段的抗体，包括抗原结合片段，可应用于诊断，例如，检测升高的BAS-1和/或其片段水平的存在。此诊断试验可用裂解液，活细胞，固定细胞，免疫荧光，细胞培养，体液，和进一步可涉及血清中BAS-1相关抗原的检测，或此类。诊断试验可以是同源(没有游离试剂和抗原-配体复合物的分离步骤)或异源(有分离步骤)。存在多种商业试验，如放射免疫测试(RIA)，酶联免疫试验(ELISA)，酶免疫试验(EIA)，酶多聚免疫试验技术(EMIT)，底物标记的荧光免疫试验(SLFIA)，和此类。例如，未标记的抗体可通过用标记的识别BAS-1或其特定片段抗体的第二抗体来应用。这些试验已在文献中详细讨论。参见，例如，Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，CSH。

抗独特型抗体可类似的用于诊断抗人类BAS-1抗体的存在，这在多种异常状态下是可诊断的。例如，过量产生的BAS-1可导致产生各种各样的可诊断异常生理状态，特别是如癌或异常分化等增生细胞条件时的免疫反应。

经常，诊断试验试剂以试剂盒提供，以优化试验的敏感性。对本发明，根据试验的原理，方法，和标记，提供标记抗体或未标记抗体，或标记BAS-1。通常还有与其它附加物，如缓冲液，稳定剂，产生信号所需的材料如酶底物，和此类结合。优选的，试剂盒还含有正确使用和使用后处理的说明。典型的，试剂盒分隔每一有用试剂。可以预期，试剂以冻干粉末提供，其中试剂可以重溶于含水基质提供合适的试剂浓度以进行试验。

任何前述的药物筛选和诊断试验的部分可不修饰使用或以多种方法修饰。例如，通过共价或非共价连接直接或间接提供可检测信号的部分进行标记。在任一这些试验中，配体，试验化合物，BAS-1，或抗体可直接或间接标记。可能的直接标记包括标记基团：放射性标记如¹²⁵I，酶(美国专利3,645,090)，如过氧化物酶和碱性磷酸酶，和荧光标记(美国专利3.940,465)，可监测荧光强度，波长迁移，或荧光极化的改变。两项专利此处都引为参考。间接标记的可能包括生物素化的一个组分然后结合偶联有以上标记基团的亲和素。

还有多种方法从游离配体中分离结合形式，或另外从游离试验化合物中分离结合形式。BAS-1可固定于各种各样的基质，然后洗涤。合适的基质包括塑料如ELISA板，滤纸，和珠。固定BAS-1于基质的方法包括，不限定于，直接粘附于塑料，用捕获抗体，化学偶联，和生物素-亲和素。本方法的最后一步涉及用几种方法中的一种沉淀抗原/配体复合物，包括这些用，例如有机溶剂如聚乙二醇或盐如硫酸铵。其它合适的分离技术包括，不限定于，荧光抗体磁化颗粒法，Rattle等描述，(1984)临床化学30:1457-1461，和双抗体磁化颗粒分离，美国专利4,659,678描述。

连接蛋白或其片段与各种标记的方法已在文献中详细报道。许多技术涉及应用活化的羧基基团，或利用碳二亚胺或利用活化酯，来形成肽键，通过巯基与活化的卤素如氯乙酰，或活化的烯烃如马来酰亚胺反应，作为连接，来形成硫醚，或类似。融合蛋白在这些应用中亦有用。

本发明的另一诊断方面涉及来自BAS-1序列的聚核苷酸或寡核苷酸序列的应用。这些序列可用作探针检测怀疑有异常情况的病人的标本中抗原的水平，例如，癌或发育问题。RNA和DNA核苷酸序列的制备，序列的标记，和优选序列大小都已在文献中描述和讨论。普通的一个寡核苷酸探针应该至少有大约14个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，且聚核苷酸探针可长达几千碱基对。可使用不同的标记，最一般为放射性核苷酸，特别是³²P。然而，其它技术也可应用，如用生物素修饰的核苷酸引入聚核苷酸中。生物素可作为结合亲和素或抗体的位点，可用各种各样的多种标签来标记，如放射性核苷酸，荧光素，酶，或此类。或者，可使用识别特异的双链体，包括DNA双链体，RNA双链体，DNA-RNA杂交双链体，或DNA-蛋白双链体的抗体。接着抗体可被标记，试验可以进行，其中双链体结合于表面，这样通过表面上双链体的形成，结合于双链体的抗体的存在可被检测到。新的反义RNA的探针可用于任何常规技术如核酸杂交，加数和减数筛选，重组检测，杂交释放翻译(HRT)，和杂交局限翻译(HART)。这还包括扩增技术如聚合酶链反应(PCR)。

也涉及定性或定量检测其它标记存在的诊断试剂盒。诊断或预测依赖于用作标记的多指示剂的结合。这样，试剂盒可检测标记的结合。参见，例如，Viallet，等(1989)生长因子研究进展1:89-97。

Ⅹ．配体或反受体。

此处BAS-1蛋白的描述提供了分辨配体或反受体的方法。这样的配体或反受体可以相当高的亲和力结合于BAS-1。制备不同的构建物允许标记BAS-1检测其配偶体。例如，直接标记BAS-1，融合标记物来二次标记，例如，FLAG或其它附加表位，Ig区融合，等，可以检测结合配偶体。这可以是组织学的，作为生化纯化的亲和方法，或在表达克隆过程中标记或筛选。双杂交选择系统也可用于可得到的BAS-1序列制备合适的构建物。参见，例如，Fields和Song(1989)自然340:245-246。

本发明的宽广范围参考以下实施例可被最好理解，并不试图将本发明限定于具体实施方案。

实施例

Ⅰ．一般方法

描述或参考了一些标准方法，例如，Maniatis，等(1982)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港出版社；Sambrook，等(1989)分子克隆，实验室手册，(第二版)，第1-3卷，CSH出版，纽约；Ausubel，等生物学，Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY；或Ausubel，等(1987和增刊)分子生物学方法综览，Greene/Wiley，纽约。蛋白纯化的方法包括如硫酸铵沉淀，色谱柱，电泳，离心，结晶，和其它。参见，例如，Ausubel，等(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)“蛋白纯化指南”酶学方法，182卷，和此系列中的其它卷；和生产商关于蛋白纯化产品使用说明，例如，Pharmacia，Piscataway,N.J.,或Bio-Rad,Richmond,CA.结合重组技术可融合于适当的片段，例如，FLAG序列或通过蛋白酶可去除序列融合的相应物。参见，例如，Hochuli(1989)化学工业12:69-70；Hochuli(1990)“通过金属螯合吸收纯化重组蛋白”Setlow(编)基因工程：原理和方法12:87-98.PlenumPress，纽约；和Crowe，等(1992)QIAexpress：高水平表达和蛋白纯化系统QUIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA.

进行计算机序列分析，例如，用适用的软件程序，包括来自GCG(U.Wisconsin)和GenBank来源的。也利用来自GenBank和其它的公共序列数据库。

Ⅱ．用PCR扩增人类BAS-1片段

根据小鼠RP105序列设计两个引物。参见Miyake，等(1995)免疫学杂志154:3333-3340。指定核酸从其中CTT序列数起。5’引物A(TTG…)相应于162至185位的24个核苷酸且3’引物F(…TTC)相应于1462-1485位的24个核苷酸。从人类扁桃体B细胞未得到PCR产物。

制备3个5’引物：引物B(ACA…)含321-344位核苷酸，引物C(AAG…)含568-591位核苷酸，引物D(TCT…)含859-882位核苷酸，制备另外3个3’引物：引物G(…TTA)含1765-1788位核苷酸，引物H(…GAA)含2024-2027位核苷酸，引物E(…TGG)含1164-1187位核苷酸。

为增加从人类扁桃体B细胞获得PCR产物的机会，通过用一个5’引物和四个3’引物结合来进行PCR反应。这四组PCR反应中，只获得一300bp的清晰产物，跨过5’引物D和3’引物E。纯化此产物，亚克隆入pCR^TM载体(Invitrogen,San Diego CA)，接着测序。参见SEQ ID NO1。

根据300bp的人类序列，设计3个引物：5’引物K；3’引物I和L.利用类似的PCR方法，另外300bp人类片段通过结合引物C和I得到(参见SEQ ID NO1)

Ⅲ．人类BAS-1的组织分布

利用引物对D-E扩增的PCR产物(参见SEQ ID NO1)用作探针(D-E探针)研究BAS-1在人类组织中的组织分布。通过Northern印迹从人脾中检测到一个2.6kb mRNA并在心脏中以低水平存在。未在人脑，胸腺，肺，肝，骨骼肌，肾，前列腺，睾丸，卵巢，小肠，结肠，和外周血淋巴细胞容易检测到它。另外，此2.6kb信使RNA通过Northern印迹可在sIgD+淋巴瘤细胞系B104中检测到并在Burkitt’s淋巴瘤细胞系BL2中有低水平，而不存在于肾上皮癌细胞系CHA，肺上皮癌细胞系MRC-5,EBV细胞系JY，或单核细胞细胞系U937。

通过PGR，人类BAS-1信使RNA被发现存在于sIgD⁺CD38^-天然B细胞，sIgD⁺CD38⁺生发中心B细胞，sIgD^-CD38⁺生发中心B细胞，sIgD^-CD38^-记忆B细胞，sCD38⁺⁺CD20^low浆细胞，用GM-CSF加IL-4培养的CD14+单核细胞产生的树状细胞，用GM-CSF加TNF-α培养的CD34+索血细胞产生的树状细胞。通过PCR在人类T细胞系MT9未检测到此信使。

Ⅳ．筛选来自人类sIgD+淋巴瘤细胞系B104的质粒cDNA文库

从Northern印迹分析结果，在6μg B104细胞系的poly-A mRNA中检测到BAS-1的表达。由此，在质粒pSPORT1质粒中构建B104 cDNA文库(Gibco Life Technologies,Cergy Pontoise，法国)。筛选150.000细菌菌落后，用D-E探针没有获得阳性克隆。这可能反映BAS-1在人类细胞中的表达很低。

Ⅴ．筛选人类脾脏的λgt10细菌噬菌体文库

为筛选更多克隆，使用人类脾脏的λgt10细菌噬菌体文库(Clontech)。筛选2.4×10⁶克隆后，获得8个阳性克隆。将这些克隆分离，纯化，亚克隆入pME18S质粒(DNAX,Palo Alto,CA)。测序后，发现两个克隆S2和L1代表全长人类BAS-1(参见SEQ ID NO1)。分离的人类全长BAS-1 cDNA含有约2635bp，编码约661氨基酸的蛋白。此蛋白产物含有约11个潜在的糖基化位点和约22个亮氨酸丰富重复结构域。人类BAS-1cDNA的编码区和小鼠RP105序列的编码区有约72％的同源性，且此完整BAS-1cDNA和完整小鼠cDNA序列有大约67％同源性。人类BAS-1和小鼠RP105之间的氨基酸同源性约为73.5％。

Ⅵ．人类BAS-1蛋白的表达

通过去除5’和3’非编码区并加入Marylin Kozak(参见：生物化学杂志266:19867,1991)共有序列(ACCATGG；SEQ ID NO3)以增强翻译水平来制备所有构建物。

可溶性BAS-1-FLAG蛋白已在Cos 7细胞中瞬时表达，如下。在羧基端显示FLAG肽(Hoppe，等(1988)生物技术6:1205-1210)的BAS-1重组形式引入表达载体pME18S并接着电穿孔转染到Cos-7细胞中。电穿孔的细胞在单独DMEM或加入1％Nudridoma HU(Boehringer Mannheim,Mennheim，德国)的DMEM培养基中生长5天。

Ⅶ．可溶性BAS-1 Flag蛋白的纯化

典型的，280ml含有可溶性BAS-1FLAG的上清通过连于ChelatingSepharose Fast F1ow基质的(Pharmacia,Upsalla,Sweden)20ml Cu++离子柱。用16体积结合缓冲液(His-Bind Bufferkit,Novagen,Madison,WI)洗涤后，金属离子滞留的蛋白用20-100mMImidazole梯度洗脱。洗脱组分中的人类BAS-1FLAG内含物通过用抗-FLAG单抗M2(Eastman Kodak,New Haven,CT)点印迹和考马斯蓝和银染色还原SDS-PAGE测定。含BAS-1FLAG蛋白的部分接着合并并对PBS透析。通过Western印迹，富集的人类BAS-1相应于约95-97kd蛋白，和氨基酸序列所预测的一样。

Ⅷ．在NIH-3T3细胞中稳定表达膜BAS-1

天然膜形式被亚克隆入表达载体pMAMneo(Clontech,Palo Alto,California)，此载体含有连于地塞米松-可诱导MMTV-LTR启动子的RSV-LTR增强子。此构建物接着电穿孔转染NIH-3T3细胞。转染的NIH-3T3细胞接种于加入10％胎牛血清的选择性0.5mg/ml Geneticin(G418)(Boehringer-Mannheim,Mannheim，德国)DMEM。

稳定转染的NIH-3T3细胞中膜BAS-1蛋白的生化特性有代谢标记。接着细胞在含10％胎牛血清和1μM终浓度地塞米松(Sigma,SaintQuentin Fallavier，法国)的DMEM培养基中培养24小时。接着细胞在后12小时与³⁵S-Met和³⁵S-Cys孵育以标记细胞蛋白。分析还原条件下的SDS-PAGE的蛋白显示转染NIH-3T3细胞裂解液中有预测的110kDa蛋白，而未转染的NIH-3T3细胞裂解液中没有。

Ⅸ．制备BAS-1特异的抗体

近交Balb/c小鼠用人类蛋白的重组形式腹膜内免疫。首先接受纯化的可溶性BAS-1FLAG且第二次接受稳定转染的NIH-3T3细胞。动物在适当的时候用蛋白加强，有或没有附加佐剂以进一步刺激抗体产生。收集血清，或用得到的脾制备杂交瘤。

或者，Balb/c小鼠用基因或其片段转化的细胞免疫，内源或外源细胞，或用分离的富集的表达抗原的膜。适当时候收集血清，典型经过多次进一步免疫后。多种基因治疗技术是有用的，例如，原位产生蛋白以产生免疫反应。

可制备单克隆抗体。例如，脾细胞和合适的融合配偶体融合且以标准程序在培养基中筛选杂交瘤。筛选杂交瘤上清中结合人类BAS-1的抗体的存在，例如，通过ELISA或其它试验。也可选择或制备特异识别人类BAS-1而不识别物种变异的抗体。

另一方法中，合成多肽或纯化蛋白提供给一免疫系统以产生单克隆或多克隆抗体。参见，例如，Coligan(1991)免疫学方法Wiley/Greene；和harlow和Lane(1989)抗体：实验室手册冷泉港出版。在合适情况下，结合试剂如上述标记，例如，荧光或其它，或固定于底物用于Panning法。核酸也可引入动物中的细胞以产生抗原，它用于引起免疫反应。参见，例如，Wang，等(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.90:4156-4160；Barry，等(1994)生物技术16:616-619；和Xiang，等(1995)免疫学2:129-135。

Ⅹ．在NSO细胞中大量生产BAS-1

大量可溶性BAS-1和可溶性BAS-1FLAG可从制备好的稳定转化的NSO细胞产生，例如，根据Celltech(Slough,Berkshire，英国；国际专利申请WO86/05807,WO87/04462,WO89/01036和WO89/10404)发展的方法。BAS-1和BAS-1FLAG被亚克隆入pEE12并接着通过电穿孔转染NSO细胞。转染NSO细胞接种于含10％胎牛血清的选择性无谷氨酰胺DMEM，如Celltech的方法所述。最好的生产细胞系的上清用于生物试验并纯化可溶性BAS-1和可溶性BAS-1-FLAG。

其它表达系统可用于产生大量重组蛋白。

Ⅺ．用BAS-1产生融合蛋白

用BAS-1细胞外区制备不同融合构建物。该基因的此部分融合于另一蛋白，例如，FLAG附加表位，Ig区，或融合于双杂交系统构建物。参见，例如，Field和Song(1989)自然340:245-246。

附加表位可用于表达克隆程序用抗FLAG抗体检测以检测结合配偶体，例如，BAS-1的配体。或者，Ig区可用于用抗原类似亲和性纯化配体。双杂交系统也可用于分离特异结合BAS-1的蛋白。

Ⅻ．通过原位杂交对人BAS-1制图。

制备伸展染色体。在培养72小时的植物血凝素刺激的人类淋巴细胞来源的染色体制剂上进行原位杂交。培养的最后7小时加入5-溴脱氧尿苷(60μg/ml培养基)，以确保杂交后染色体带的高质量。

用引物，例如，相应于核苷酸395-411和1027-1050，以总B细胞cDNA为模板，帮助扩增的一655碱基对PCR片段，克隆入合适载体。载体用³H通过缺口平移标记。放射性标记的探针和中期伸展的染色体以终浓度200ng/ml杂交液杂交，如Mattei，等(1985)人类遗传69:327-221描述。

用核示踪乳胶(KODAK NTB2)覆盖后，胶片在4℃曝光18天。为避免银粒在显带过程中滑动，染色体伸展首先用缓冲Giemsa溶液染色并中期照相。R显带然后用荧光相裂解-Giemsa(FPG)法进行并在分析前中期再照相。

原位杂交后检测的100个中期细胞中，20％银染颗粒定位于5号染色体。颗粒分布不是随机的，67％位于5号染色体长臂q11.2-q13.1区。由此定位人类BAS-1于人类基因组5q11.2-q13.1区。

ⅩⅢ．人类BAS-1受体的分离

人类BAS-1可用作特异结合试剂来分辨其结合配偶体，通过利用其结合特异性，更象使用抗体。结合试剂如上描述标记，例如，荧光或其它，或固定于底物用于panning法。

用结合组合物筛选表达结合配偶体，即受体的细胞系制备的表达文库。标准染色技术用来接触或分辨细胞内或表面表达受体，或用panning筛选表面表达转化细胞。筛选细胞内表达用染色或免疫荧光方法进行。也参见Mcmahan，等(1991)EMBO J.10:2821-2832.

例如，第0天，每室1ml用纤维结合素，10ng/ml于PBS中，室温30分钟，预先包被2室permanox板。用PBS漂洗一次。然后每室加2-3×10⁵COS细胞，于1.5ml生长培养基中平板培养。37℃孵育过夜。

第一天对于每一样品，准备0.5ml66μg/ml DEAE-葡聚糖溶液，66μM氯喹，和血清中4μg无DME DNA。为每一套准备一个阳性对照，例如，人类BAS-1-FLAG cDNA的1和1/200稀释液，和阴性模型。无DME血清漂洗细胞。加入DNA溶液在37℃孵育5小时。移去培养基并加0.5ml DME中的10％DMSO孵育2.5分钟。移去并用DME漂洗一遍。加1.5ml生长培养基并孵育过夜。

第二天，更换培养基。第三或四天，细胞固定并染色。用Hank’sBuffered Saline Solution(HBSS)漂洗细胞两遍并用4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖固定5分钟。用HBSS洗三遍。移去所有液体后载玻片保存于-80℃。对于每一室，0.5ml孵育物进行如下操作。加HBSS/皂甙(0.1％)和32μl/ml 1M NaN3放20分钟。然后细胞用HBSS/皂甙洗一遍。向细胞加人类BAS-1或BAS-1/抗体复合物放30分钟。用HBSS/皂甙洗两遍。若合适，加一抗放30分钟。加二抗，例如，Vector抗小鼠抗体，1/200稀释液，孵育30分钟。准备ELISA溶液，例如，VectorElite ABC辣根过氧化物酶溶液，并预热30分钟。对于每2.5ml HBSS/皂甙使用例如一滴溶液A(亲和素)和一滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂甙洗两遍细胞。加ABCHRP溶液并孵育30分钟。用HBSS洗细胞两遍，第二遍两分钟，封闭细胞。然后加二氨基苯甲酸(DAB)放5到10分钟。每5ml玻璃双蒸水用2滴缓冲液加4滴DAB加2滴H₂O₂，小心移去室并在水中洗板。晾干几分钟，然后加一滴Crystal Mount并加盖玻片。85-90℃孵育5分钟。

评价池中的阳性染色并进一步亚克隆到分离的引起结合的单基因。

或者，BAS-1试剂可用于亲和纯化或列出表达受体的细胞。参见，例如，sambrook，等或Ausubel等。

筛选膜结合受体的另一策略为淘洗法。受体cDNA如上述构建。配体可被固定并用于固定表达细胞。通过使用合适的抗体，例如识另 BAS-1融合构建物的FLAG序列，或通过应用针对一抗的抗体可以获得固定。选择和放大的循环导致合适克隆的富集和受体表达克隆的最后分离。

可用人类BAS-1筛选噬菌体表达文库。合适的标记技术，例如，抗FLAG抗体，将允许对合适克隆的特异性标记。

每一单独的出版物或专利申请具体而独立地被指明作为参考，此处所有引用由同样范围在此引作参考。

本发明的许多修饰和变化可以不背离其精神和范围实现，这对于本领域的技术人员是显而易见的。此处描述的具体实施方案只是以实施例的方式提出，而本发明由附加的权利要求的范围所限定，同时给与伴随这些权利要求的相同物的整个范围以权利。

                     序列列表：(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：Schering Corporation

(ⅱ)发明题目：人类B细胞抗原；相关试剂

(ⅲ)序列数目：3

(ⅳ)联系地址：

   (A)收件人：Schering-plough Corporation

   (B)街道：2000 Galloping Hill Road

   (C)城市：Kenilworth

   (D)州：New Jersey

   (E)国家：USA

   (F)邮政编码：07033

(ⅴ)计算机可读类型：

   (A)介质类型：软盘

   (B)计算机：Macintosh

   (C)操作系统：7、5、3

(ⅵ)目前申请资料：

   (A)申请号：

   (B)申请日期：

(ⅶ)优先申请数据：

   (A)申请号：OS 08/649553

   (B)申请日：17-MAY-1996

(ⅷ)代理人/委托人信息：

   (A)姓名：Cynthia L.Koulke,Esq.

   (B)登记号：32364

   (C)文献/摘要号：DX0580PCT

(ⅸ)通讯信息

   (A)电话：908-298-2987

   (B)传真：908-298-5388(2)SEQ ID NO:1 信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：2635碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅸ)特点：

   (A)名称/关键词：CDS

   (B)定位：97..2082(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:1:ATTCCGGCGG CTGCCAAATT GCCAGGGCCT TCACAGTTTG ATTCCATTTC TCAGCTCCAA60GCATTAGGTA   AACCCACCAA   GCAATCCTAG   CCTGTG    ATG  GCG  TTT  GAC  GTC  AGC114

                                             Met  Ala  Phe  Asp  Val  Ser

                                               1                   5TGC  TTC  TTT  TGG  GTG  GTG  CTG  TTT  TCT  GCC  GGC  TGT  AAA  GTC  ATC  ACC162Cys  Phe  Phe  Trp  Val  Val  Leu  Phe  Ser  Ala  Gly  Cys  Lys  Val  Ile  Thr

            10                       15                       20TCC  TGG  GAT  CAG  ATG  TGC  ATT  GAG  AAA  GAA  GCC  AAC  AAA  ACA  TAT  AAC210Ser  Trp  Asp  Gln  Met  Cys  Ile  Glu  Lys  Glu  Ala  Asn  Lys  Thr  Tyr  Asn

       25                       30                       35TGT  GAA  AAT  TTA  GGT  CTC  AGT  GAA  ATC  CCT  GAC  ACT  CTA  CCA  AAC  ACA258Cys  Glu  Asn  Leu  Gly  Leu  Ser  Glu  Ile  Pro  Asp  Thr  Leu  Pro  Asn  Thr

  40                       45                       50ACA  GAA  TTT  TTG  GAA  TTC  AGC  TTT  AAT  TTT  TTG  CCT  ACA  ATT  CAC  AAT306Thr  Glu  Phe  Leu  Glu  Phe  Ser  Phe  Asn  Phe  Leu  Pro  Thr  Ile  His  Asn55                       60                       65                       70AGA  ACC  TTC  AGC  AGA  CTC  ATG  AAT  CTT  ACC  TTT  TTG  GAT  TTA  ACT  AGG354Arg  Thr  Phe  Ser  Arg  Leu  Met  Asn  Leu  Thr  Phe  Leu  Asp  Leu  Thr  Arg

                 75                       80                       85TGC  CAG  ATT  AAC  TGG  ATA  CAT  GAA  GAC  ACT  TTT  CAA  AGC  CAT  CAT  CAA402Cys  Gln  Ile  Asn  Trp  Ile  His  Glu  Asp  Thr  Phe  Gln  Ser  His  His  Gln

            90                       95                      100TTA  AGC  ACA  CTT  GTG  TTA  ACT  GGA  AAT  CCC  CTG  ATA  TTC  ATG  GCA  GAA450Leu  Ser  Thr  Leu  Val  Leu  Thr  Gly  Asn  Pro  Leu  Ile  Phe  Met  Ala  Glu

      105                      110                      115ACA  TCG  CTT  AAT  GGG  CCC  AAG  TCA  CTG  AAG  CAT  CTT  TTC  TTA  ATC  CAA498Thr  Ser  Leu  Asn  Gly  Pro  Lys  Ser  Leu  Lys  His  Leu  Phe  Leu  Ile  Gln

 120                      125                      130ACG  GGA  ATA  TCC  AAT  CTC  GAG  TTT  ATT  CCA  GTG  CAC  AAT  CTG  GAA  AAC546Thr  Gly  Ile  Ser  Asn  Leu  Glu  Phe  Ile  Pro  Val  His  Asn  Leu  Glu  Asn135                      140                      145                      150TTG  GAA  AGC  TTG  TAT  CTT  GGA  AGC  AAC  CAT  ATT  TCC  TCC  ATT  AAG  TTC594Leu  Glu  Ser  Leu  Tyr  Leu  Gly  Ser  Asn  His  Ile  Ser  Ser  Ile  Lys  Phe

                155                      160                      165CCC  AAA  GAC  TTC  CCA  GCA  CGG  AAT  CTG  AAA  GTA  CTG  GAT  TTT  CAG  AAT642Pro  Lys  Asp  Phe  Pro  Ala  ArG  Asn  Leu  Lys  Val  Leu  Asp  Phe  Gln  Asn

           170                      175                      180AAT  GCT  ATA  CAC  TAC  ATC  TCT  AGA  GAA  GAC  ATG  AGG  TCT  CTG  GAG  CAG690Asn  Ala  Ile  His  Tyr  Ile  Ser  Arg  Glu  Asp  Met  ArG  Ser  Leu  Glu  Gln

      185                      190                      195GCC ATC AAC CTA AGC CTG AAC TTC AAT GGC AAT AAT GTT AAA GGT ATT738Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn Asn Val Lys Gly Ile

200                 205                 210GAG CTT GGG GCT TTT GAT TCA ACG GTC TTC CAA AGT TTG AAC TTT GGA786Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe Gln Ser Leu Asn Phe Gly215                 220                 225                 230GGA ACT CCA AAT TTG TCT GTT ATA TTC AAT GGT CTG CAG AAC TCT ACT834Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val Ile Phe Asn Gly Leu Gln Asn Ser Thr

            235                 240                 245ACT CAG TCT CTC TGG CTG GGA ACA TTT GAG GAC ATT GAT GAC GAA GAT882Thr Gln Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe Glu Asp Ile Asp Asp Glu Asp

        250                 255                 260ATT AGT TCA GCC ATG CTC AAG GGA CTC TGT GAA ATG TCT GTT GAG AGC930Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly Leu Cys Glu Met Ser Val Glu Ser

    265                 270                 275CTC AAC CTG CAG GAA CAC CGC TTC TCT GAC ATC TCA TCC ACC ACA TTT978Leu Asn Leu Gln Glu His Arg Phe Ser Asp Ile Ser Ser Thr Thr Phe

280                 285                 290CAG TGC TTC ACC CAA CTC CAA GAA TTG GAT CTG ACA GCA ACT CAC TTG1026Gln Cys Phe Thr Gln Leu Gln Glu Leu Asp Leu Thr Ala Thr His Leu295                 300                 305                 310AAA GGG TTA CCC TCT GGG ATG AAG GGT CTG AAC TTG CTC AAG AAA TTA1074Lys Gly Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu Asn Leu Leu Lys Lys Leu

            315                 320                  325GTT CTC AGT GTA AAT CAT TTC GAT CAA TTG TGT CAA ATC AGT GCT GCC1122Val Leu Ser Val Asn His Phe Asp Gln Leu Cys Gln Ile Ser Ala Ala

        330                 335                 340AAT TTC CCC TCC CTT ACA CAC CTC TAC ATC AGA GGC AAC GTG AAG AAA1170Asn Phe Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile Arg Gly Asn Val Lys Lys

    345                 350                 355CTT CAC CTT GGT GTT GGC TGC TTG GAG AAA CTA GGA AAC CTT CAG ACA1218Leu His Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys Leu Gly Asn Leu Gln Thr

360                 365                 370CTT GAT TTA AGC CAT AAT GAC ATA GAG GCT TCT GAC TGC TGC AGT CTG1266Leu Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala Ser Asp Cys Cys Ser Leu375                 380                 385                 390CAA CTC AAA AAC CTG TCC CAC TTG CAA ACC TTA AAC CTG AGC CAC AAT1314Gln Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gln Thr Leu Asn Leu Ser His Asn

            395                 400                 405GAG CCT CTT GGT CTC CAG AGT CAG GCA TTC AAA GAA TGT CCT CAG CTA1362Glu Pro Leu Gly Leu Gln Ser Gln Ala Phe Lys Glu Cys Pro Gln Leu

        410                 415                 420GAA CTC CTC GAT TTG GCA TTT ACC CGC TTA CAC ATT AAT GCT CCA CAA1410Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu His Ile Asn Ala Pro Gln

    425                 430                 435AGT CCC TTC CAA AAC CTC CAT TTC CTT CAG GTT CTG AAT CTC ACT TAC1458Ser Pro Phe Gln Asn Leu His Phe Leu Gln Val Leu Asn Leu Thr Tyr

440                 445                 450TGC TTC CTT GAT ACC AGC AAT CAG CAT CTT CTA GCA GGC CTA CCA GTT1506Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gln His Leu Leu Ala Gly Leu Pro Val455                 460                 465                 470CTC CGG CAT CTC AAC TTA AAA GGG AAT CAC TTT CAA GAT GGG ACT ATC1554Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His Phe Gln Asp Gly Thr Ile

            475                 480                 485ACG AAG ACC AAC CTA CTT CAG ACC GTG GGC AGC TTG GAG GTT CTG ATT1602Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Thr Val Gly Ser Leu Glu Val Leu Ile

        490                 495                 500TTG TCC TCT TGT GGT CTC CTC TCT ATA GAC CAG CAA GCA TTC CAC AGC1650Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser Ile Asp Gln Gln Ala Phe His Ser

    505                 510                 515TTG GGA AAA ATG AGC CAT GTA GAC TTA AGC CAC AAC AGC CTG ACA TGC1698Leu Gly Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Cys

520                 525                 530GAC AGC ATT GAT TCT CTT AGC CAT CTT AAG GGA ATC TAC CTC AAT CTG1746Asp Ser Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys Gly Ile Tyr Leu Asn Leu535                 540                 545                 550GCT GCC AAC AGC ATT AAC ATC ATC TCA CCC CGT CTC CTC CCT ATC TTG1794Ala Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro Arg Leu Leu Pro Ile Leu

            555                 560                 565TCC CAG CAG AGC ACC ATT AAT TTA AGT CAT AAC CCC CTG GAC TGC ACT1842Ser Gln Gln Ser Thr Ile Asn Leu Ser His Asn Pro Leu Asp Cys Thr

        570                 575                 580TGC TCG AAT ATT CAT TTC TTA ACA TGG TAC AAA GAA AAC CTG CAC AAA1890Cys Ser Asn Ile His Phe Leu Thr Trp Tyr Lys Glu Asn Leu His Lys

    585                 590                 595CTT GAA GGC TCG GAG GAG ACA CGT GTG CAA AAC CCG CCA TCT CTA AGG1938Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gln Asn Pro Pro Ser Leu Arg

600                 605                 610GGA GTT AAG CTA TCT GAT GTC AAG CTT TCC TGT GGG ATT ACA GCC ATA1986Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly Ile Thr Ala Ile615                 620                  625                630GGC ATT TTC TTT CTC ATA GTA TTT CTA TTA TTG TTG GCT ATT CTG CTA2034Gly Ile Phe Phe Leu Ile Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Leu

            635                 640                 645TTT TTT GCA GTT AAA TAC CTT CTC AGG TGG AAA TAC CAA CAC TTT TAG2082Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gln His Phe

        650                 655                 660TGCTGAAGGT TTCCAGAGAA AGCAAATAAG TGTGCTTAGC AAAATTGCTC TAAGTGAAAG2142AACTGTCATC TGCTGGTGAC CAGACCAGAC TTTTCAGATT GCTTCCTGGA ACTGGGCAGG2202GACTCACTGT GCTTTTCTGA GCTTCTTACT CCTGTGAGTC CCAGAGCTAA AGAACCTTCT2262AGGCAAGTAC ACCGAATGAC TCAGTCCAGA GGGTCAGATG CTGCTGTGAG AGGCACAGAG2322CCCTTTCCGC ATGTGGAAGA GTGGGAGGAA GCAGAGGGAG GGACTGGGCA GGGACTGCCG2382GCCCCGGAGT CTCCCACAGG GAGGCCATTC CCCTTCTACT CACCGACATC CCTCCCAGCA2442CCACACACCC CGCCCCTGAA AGGAGATCAT CAGCCCCCAC AATTTGTCAG AGCTGAAGCC2502AGCCCACTAC CCACCCCCAC TACAGCATTG TGCTTGGGTC TGGGTTCTCA GTAATGTAGC2562CATTTGAGAA ACTTACTTGG GGACAAAGTC TCAATCCTTA TTTTAAATGA AAAAGAAAA2622GAAAAGCATA ATA2635(2)SEQ ID NO:2信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：661氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:2：(略)Met Ala Phe Asp Val Ser Cys Phe Phe Trp Val Val Leu Phe Ser Ala1               5                  10                  15Gly Cys Lys Val Ile Thr Ser Trp Asp Gln Met Cys Ile Glu Lys Glu

         20                  25                  30Ala Asn Lys Thr Tyr Asn Cys Glu Asn Leu Gly Leu Ser Glu Ile Pro

     35                  40                  45Asp Thr Leu Pro Asn Thr Thr Glu Phe Leu Glu Phe Ser Phe Asn Phe

 50                  55                  60Leu Pro Thr Ile His Asn Arg Thr Phe Ser Arg Leu Met Asn Leu Thr65                  70                  75                  80Phe Leu Asp Leu Thr Arg Cys Gln Ile Asn Trp Ile His Glu Asp Thr

             85                  90                  95Phe Gln Ser His His Gln Leu Ser Thr Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro

        100                 105                 110Leu Ile Phe Met Ala Glu Thr Ser Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys

    115                 120                 125His Leu Phe Leu Ile Gln Thr Gly Ile Ser Asn Leu Glu Phe Ile Pro

130                 135                 140Val His Asn Leu Glu Asn Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His145                 150                 155                 160Ile Ser Ser Ile Lys Phe Pro Lys Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys

            165                 170                 175Val Leu Asp Phe Gln Asn Asn Ala Ile His Tyr Ile Ser Arg Glu Asp

        180                 185                 190Met Arg Ser Leu Glu Gln Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly

    195                 200                 205Asn Asn Val Lys Gly Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe

210                 215                 220Gln Ser Leu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val Ile Phe Asn225                 230                 235                 240Gly Leu Gln Asn Ser Thr Thr Gln Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe Glu

            245                 250                 255Asp Ile Asp Asp Glu Asp Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly Leu Cys

        260                 265                 270Glu Met Ser Val Glu Ser Leu Asn Leu Gln Glu His Arg Phe Ser Asp

    275                 280                 285Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gln Cys Phe Thr Gln Leu Gln Glu Leu Asp

290                 295                 300Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu305                 310                 315                 320Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Ser Val Asn His Phe Asp Gln Leu

            325                 330                 335Cys Gln Ile Ser Ala Ala Asn Phe Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile

        340                 345                 350Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys

    355                 360                 365Leu Gly Asn Leu Gln Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala

370                 375                 380Ser Asp Cys Cys Ser Leu Gln Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gln Thr385                 390                 395                 400Leu Asn Leu Ser His Asn Glu Pro Leu Gly Leu Gln Ser Gln Ala Phe

            405                 410                 415Lys Glu Cys Pro Gln Leu Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu

        420                 425                 430His Ile Asn Ala Pro Gln Ser Pro Phe Gln Asn Leu His Phe Leu Gln

    435                 440                 445Val Leu Asn Leu Thr Tyr Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gln His Leu

450                 455                 460Leu Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His465                 470                 475                 480Phe Gln Asp Gly Thr Ile Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Thr Val Gly

            485                 490                 495Ser Leu Glu Val Leu Ile Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser Ile Asp

        500                 505                 510Gln Gln Ala Phe His Ser Leu Gly Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser

    515                 520                 525His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys

530                 535                 540Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro545                 550                 555                 560Arg Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Gln Ser Thr Ile Asn Leu Ser His

            565                 570                 575Asn Pro Leu Asp Cys Thr Cys Ser Asn Ile His Phe Leu Thr Trp Tyr

        580                 585                 590Lys Glu Asn Leu His Lys Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gln

    595                 600                 605Asn Pro Pro Ser Leu Arg Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser

610                 615                 620Cys Gly Ile Thr Ala Ile Gly Ile Phe Phe Leu Ile Val Phe Leu Leu625                 630                635                  640Leu Leu Ala Ile Leu Leu Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp

            645                 650                 655Lys Tyr Gln His Phe

        660(2)SEQ ID NO:3信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：7碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链类型：单链

   (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:3:ACCATGG7

Claims (26)

1．编码人类BAS-1蛋白或其片段的分离或重组核酸。

2．权利要求1的分离或重组核酸，其中所述核酸含有SEQ ID NO1限定的序列。

3．权利要求2的核酸，其中所述核酸与编码所述片段的天然cDNA有至少约80％同一性。

4．权利要求2的分离或重组核酸，它至少编码SEQ ID NO2的8个连续残基。

5．权利要求4的核酸，它编码至少12个连续残基。

6．权利要求4的核酸，其中所述核酸与编码所述片段的天然cDNA有至少约80％同一性。

7．基本上纯的BAS-1蛋白或其肽。

8．权利要求7的蛋白或肽，选自：

a)来自灵长类，包括人类，的蛋白或肽；

b)包含至少一个SEQ ID NO2限定的多肽片段的蛋白或肽；

c)具有同天然BAS-1蛋白不同的翻译后修饰方式的蛋白或肽；和

d)缺乏BAS-1细胞内区的蛋白。

9．权利要求8的蛋白或肽，包含和人类BAS-1相应部分有序列同源性的片段，其中；

a)所述同源性是至少约90％同一且所述部分是至少约9个氨基酸；

b)所述同源性是至少约80％同一且所述部分是至少约17个氨基酸；或

c)所述同源性是至少约70％同一且所述部分是至少约25个氨基酸。

10．包含有权利要求7 BAS-1肽的融合蛋白。

11．含有权利要求7蛋白和可药用载体的组合物。

12．抗体或抗体结合片段，它特异结合重组或纯化的灵长类BAS-1蛋白或其片段。

13．权利要求12的抗体，其中所述BAS-1蛋白是灵长类蛋白，包括来源于人类的一种。

14．权利要求12的抗体，其中所述抗体是针对SEQ ID NO2限定的肽序列。

15．权利要求12的抗体，其中所述抗体具有至少约10μM的Kd。

16．权利要求12的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

17．权利要求12的抗体，其中所述抗体被标记。

18．权利要求12的抗体，其：

a)诱导B细胞强增殖；和/或

b)保护B细胞免于辐射引起的编程性死亡。

19．包含权利要求1核酸的表达载体。

20．包含权利要求19载体的宿主细胞。

21．筛选样品中BAS-1结合配偶体的方法，包括产生纯化或重组BAS-1蛋白，筛选所述样品中所述BAS-1蛋白特异结合的所述结合配偶体的步骤。

22．权利要求21的方法，其中所述样品含有来自T细胞，树状细胞，包括滤泡树状细胞，或基质细胞，包括成纤维细胞，内皮细胞，和上皮细胞的蛋白。

23．权利要求21的方法，其中所述结合配偶体是抗体，且所述样品是杂交瘤上清。

24．调节细胞的生理或发育的方法，包括用BAS-1蛋白的激动剂或拮抗剂触所述细胞。

25．权利要求24的方法，其中所述拮抗剂是针对灵长类BAS-1蛋白的抗体。

26．权利要求24的方法，其中所述接触是通过抗原受体，CD40:CD40配体通路，或CD28/CTLA-4:B7/B70通路和信号的介体结合。