CN1219213C - 牛奶中体细胞含量的检测方法及其检测样品采集器 - Google Patents

牛奶中体细胞含量的检测方法及其检测样品采集器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛奶体细胞含量的检测方法及其被检样品的采集器。方法：采样时将牛奶挤滴在滤纸片上，滤纸片含乙二胺四乙酸以络合二价离子，降低牛奶中有关酶的活性。检测时，将含牛奶的滤纸片置蒸馏水中，并振摇以释出细胞中的脱氧核糖核酸，然后用一种荧光染料对溶液中的DNA进行染色，再用荧光光度计检测荧光强度，从荧光强度推算牛奶中的体细胞含量。采集器由采集杆和杆套两部分组成。本发明的优点是：(1)由于滤纸片含EDTA，可以络合牛奶中的二价离子，降低有关酶活性，滤纸片上的水分可以被干燥剂吸收，从而使滤纸片上的被检测成分可以保存较长时间；(2)本发明所用的荧光染料可特异性和DNA结合，不受牛奶中蛋白质的干扰，从而保证检测结果的准确性。

Description

牛奶中体细胞含量的检测方法及其检测样品采集器
                              技术领域
本发明涉及一种牛奶中体细胞含量的检测方法及其检测样品采集器。
                              背景技术
奶牛乳房炎会引起牛奶产量和质量下降，是奶牛的常见病，给养牛者造成巨大经济损失。该病通常分为临床型和隐性型两类。临床型乳房炎能被肉眼觉察，可引起人们的重视；而隐性型则不易被肉眼觉察，容易被忽视。牛群中的乳房炎主要以隐性乳房炎的形式存在。隐性乳房炎虽无临床症状，但可导致产奶量下降，引起经济损失；此外，如不妥善处理，隐性乳房炎会发展成临床型乳房炎，造成更大的损失。因此，及时而准确地检出奶牛隐性乳房炎，采取适当措施防止病情进一步恶化，可使养牛者挽回经济损失。
乳房炎主要由细菌感染乳腺组织引起。乳腺发生炎症时，体内白细胞向炎症部位聚集，导致牛奶中体细胞数量升高。因此，牛奶中的体细胞数是乳腺是否发生炎症的一个重要指标。为了准确诊断奶牛隐性乳房炎，通常需要综合乳汁体细胞数和细菌学检查两方面的结果。乳汁体细胞数超过20万/毫升表示乳腺有炎症。细菌学检查结果可揭示引起乳房炎的病原，使临床兽医在治疗疾病中准确用药，并采取相应预防措施。一般直接计数牛奶中的体细胞数需要昂贵的仪器，不适宜牛场使用。间接计数法虽然简单，但结果比较粗放，不够准确。乳汁细菌学检查过程比较复杂，并需要专门实验室和专业人员，基层单位很难做到。解决的方法之一是采集牛奶样品，然后将奶样寄往有关实验室进行检测。但液体牛奶样品邮寄不方便，若邮寄时间过长并在邮寄过程中保存不当，奶样容易腐败变质，失去了检验价值。因此，采用适当方法采集和保存奶样，将奶样从奶牛场安全邮寄到实验室进行诊断就显得十分重要。
                              发明内容
本发明的目的是提供一种牛奶中体细胞含量的检测方法及其检测样品采集器。
牛奶中体细胞含量的检测方法：采集样品时，将牛奶挤滴在滤纸片上，滤纸片含乙二胺四乙酸ethylene-diaminetetraacetic acid，EDTA)以络合二价离子，降低牛奶中有关酶的活性，使样品在较长时间保存。检测时，将含牛奶的滤纸片置蒸馏水中，并振摇以释出细胞中的脱氧核糖核酸，用荧光染料(二苯甲亚胺，bis-benzimide，代号Hoechest 33258)对溶液中的DNA进行染色，用荧光光度计检测溶液的荧光强度，进而推算体细胞含量。
牛奶样品采集器具有采集杆和杆套两部分，采集杆的内腔装有变色硅胶干燥剂，采集杆的一端封闭，采集另一端是开有小孔的圆形滤片，在滤片中央向外垂直有一细杆，细杆的远端设有两个圆形滤纸片，杆套一端封闭，另一端开口，杆套腔之间由一开有小孔的圆形滤片隔成两部分，滤片至封闭端部分内装干燥剂，另一部分为空腔。
本发明的优点是：(1)由于滤纸片含EDTA，可以络合牛奶中的二价离子，降低有关酶活性，滤纸片上的水分可以被干燥剂吸收，从而使滤纸片上的被检测成分可以保存较长时间，使样品从奶牛场邮寄到实验室的过程中不变质；(2)采集器做成笔状，便于奶牛场兽医使用，也有利于样品从偏远的奶牛场通过邮局寄往乳房炎诊断市进行诊断；(3)本发明所用的荧光染料可特异性和DNA结合，不受牛奶中蛋白质的干扰，从而保证检测结果的准确性。
                              附图说明
附图是牛奶中体细胞含量的检测样品采集器结构示意图。
                           具体实施方式
如附图所示，采集器由采集杆1和杆套5两部分组成。采集杆的内腔装有干燥剂(如变色硅胶)2，杆的一端封闭，一端是开有小孔的圆形滤片6。在滤片中央向外垂直有一细杆，细杆的远端设有两个圆形滤纸片3，每个滤纸片含乙二氨四乙酸(EDTA)。杆套一端封闭，一端开口，两端之间由一开有小孔的圆形滤片6隔成两部分。滤片至封闭端部分的腔内装有干燥剂2，另一部分为空腔。采集杆与杆套之间设有密封件4。
每片检测纸片上含适量EDTA，以络合二价离子，降低牛奶中有关酶的活性，从而使牛奶中的DNA和细菌可在干燥的纸片上保存较长的时间。
本发明通过检测奶样采集器纸片上牛奶DNA含量来诊断奶牛乳房炎。乳房发生炎症时，牛奶中的体细胞含量升高，DNA含量随之增加。因此，通过检测纸片上DNA含量来间接判断牛奶中的体细胞含量。具体方法是将含牛奶的纸片置蒸馏水中，并振摇一定时间以释出细胞核物质，用荧光染料对溶液中的DNA进行染色，然后检测荧光强度，推算出细胞含量。
使用时，将牛奶挤在两个纸片上，然后套紧笔套。干燥剂吸收纸片上的水分使其容易干燥。
拧开采集器笔套，将患乳房炎奶牛的病奶挤在笔杆的两个纸片上，轻轻甩动以除去多余牛奶，套上笔套，拧紧，标上奶牛的牛号和采样时间后即可放入信封邮寄往乳房炎实验室进行诊断。
在实验室以无菌操作，将采集器上的两个滤纸片分别放入两个已灭菌的试管。
细菌学检验
在其中一个试管中加入2毫升营养肉烫培养基，置37C进行增菌培养18小时。将培养液接种到血平皿，置37C培养18-24小时后，进行细菌学鉴定。
牛奶体细胞估算
在另一个含滤纸片的试管中加入3毫升蒸馏水，震荡10分钟以释出DNA，然后加入荧光染料，震荡10分钟使DNA充分染色，用荧光光度计检测液体荧光强度。荧光值越大，表示牛奶中的DNA含量越高，体细胞含量越多，奶牛乳房的炎症越严重。

Claims (3)

1.一种牛奶中体细胞含量的检测方法，其特征在于：采集样品时，将牛奶挤滴在滤纸片上，滤纸片含乙二胺四乙酸，检测时，将含牛奶的滤纸片置蒸馏水中，并振摇以释出细胞中的脱氧核糖核酸，用荧光染料对溶液中的DNA进行染色，用荧光光度计检测溶液的荧光强度，进而推算体细胞含量。
2.根据权利要求1所述的一种牛奶中体细胞含量的检测方法，其特征在于所说的荧光染料为二苯甲亚胺。
3.一种牛奶样品采集器，其特征在于，它具有采集杆(1)和杆套(5)两部分，采集杆的内腔装有变色硅胶干燥剂(2)，采集杆的一端封闭，采集杆另一端是开有小孔的圆形滤片(6)，在滤片中央向外垂直有一细杆，细杆的远端设有两个圆形滤纸片(3)，杆套一端封闭，另一端开口，杆套腔之间由一开有小孔的圆形滤片(6)隔成两部分，滤片至封闭端部分内装干燥剂，另一部分为空腔，采集杆与杆套之间设有密封件(4)，细杆上的圆形滤纸片上含有乙二胺四乙酸。
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