CN1216995A - 作为胆固醇和其它脂类摄取抑制剂的两亲分子 - Google Patents

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Abstract

胆固醇生物合成可被适宜的抑制剂抑制。然而,无论是家族性的或饮食诱导的高胆固醇血症,更一般地说是高脂血症不能仅由胆固醇生物合成抑制剂来彻底解决,因为体内的胆固醇通过从饮食以及内源性合成来获得。脂类也从消化道摄取。这个问题通过提供一个或多个具有两亲性区域的分子以抑制从消化道摄取胆固醇和其它脂类来解决。也可用这种方法治疗或预防肥胖以及动脉粥样硬化。具有两亲性区域的适宜分子的实例包括天然或变异体脱辅基蛋白质以及具有由至少约15个氨基酸组成的两亲性α－螺旋的其它蛋白和肽。

Description

作为胆固醇和其它脂类摄取抑制剂的两亲分子
本发明涉及一些分子在药物，尤其是作为从消化道摄取胆固醇和其它食物脂类的抑制剂中的用途。因此本发明应用于包括高胆固醇血症的高脂血症，以及肥胖症的治疗。
胆固醇为贾纳斯面(Janus-faced)分子。一方面，虽然其确切的功能性作用仍然未定，但它为细胞质膜的一个必需组成。另一方面，如果它存在太多，血液胆固醇水平高，它则沉积在动脉壁上，导致动脉粥样斑块并最终导致心肌梗死和中风。在西方工业国家，由动脉粥样硬化导致的死亡数量大于任何其它疾病。
动物细胞大约三分之二的胆固醇在细胞中通过从头合成来提供；剩下的三分之一为饮食来源，通过消化道的上皮细胞摄取。由于胆固醇在水和水性介质如血液中为不溶性的，因此它不得不以稳定的形式来分散。这个过程称为乳化，产生的稳定的颗粒被称为血清脂蛋白。血液中最重要的胆固醇的运输载体为低密度脂蛋白(LDL)颗粒(Brown等，科学232 34-47(1986))。细胞对胆固醇的需求是通过如上所述的细胞合成胆固醇的能力或另一方面通过已知为受体介导的胞吞作用由细胞从血流内化LDL颗粒来维持。在血液高水平LDL与动脉粥样硬化和随后的心肌梗死和中风之间存在着一个明确的因果关系。需要强调LDL的双重作用：一方面LDL颗粒为细胞提供胆固醇，另一方面它们导致胆固醇在动脉壁的沉积以及动脉粥样斑块的产生。
LDL的高血液水平是由于称为家族性高胆固醇血症(FH)的遗传疾病或高脂肪饮食。Brown和Goldstein(Brown等，科学232 34-47(1986))的工作强调了LDL受体在高胆固醇血症中的中心作用。在这两种情况下，细胞表面上的LDL受体的数同明显减少：在FH的情况下，由于遗传性的基因缺陷，LDL受体仅部分可运转或在最坏的情况下完全不发挥作用；和在高脂肪富含胆固醇饮食的情况下，LDL受体的合成在转录水平上被抑制。在各种情况下，无论是遗传性的或获得性的，产生了相同的结果，即LDL受体缺乏。结果，LDL颗粒不再有效地被从循环中除去，其血液水平增高，导致动脉粥样硬化的发生。
患有杂合FH的病人已用一类统称为抑制素的药物来治疗，它们一个实例为西伐他停(simvastatin)，由Merck以ZOCORTM出售。这类化合物抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶，后者是胆固醇合成的限速酶，从而抑制细胞生物合成途径。抑制素通常与描述为胆汁盐螯合剂的树脂如胆甾胺一起给药。后者口服并以很大的量给药时显示出对血液胆固醇水平具有降低作用。然而，由于不得不大量使用以达到该效果且这些量导致不希望的副作用，因此这类化合物病人一直不欢迎并且未被广泛使用。然而Brown和Goldstein表明(Brown等，科学232 34-47(1986))如果将这些病人用抑制素和树脂如胆甾胺的混合物治疗，患有杂合FH的病人的LDL受体数量可被提高至正常水平。
在1988年，美国全国胆固醇教育工程宣布了对全血胆固醇和LDL胆固醇水平的分类以及对被划为高胆固醇血症的人推荐的饮食治疗。除开饮食措施，导致血液胆固醇降低的预防方法将是极受欢迎的。
降低或抑制胆固醇在消化道中的吸收并从而以这种方式降低胆固醇的血液水平的想法是原有的，针对此目的制药工业已投入了大量的努力，然而，目前收效甚微。作为一个实例，服用皂苷类作为饮食的补充，被显示在实验动物中降低血液胆固醇水平并预示可用于治疗高胆固醇血症(Harwood等，脂类研究杂志(34 377-395(1993))。然而，由于皂苷类来源困难，该方法失败了。从自然来源中获得大量纯的皂苷类从实践上来说是不可能的。而至少到目前为止，使用合成的皂苷类的类似物以及取代物的方法也没有成功。
在1990年，我们报导消化道上皮细胞的刷状缘膜(“BBM”)对胆固醇的摄取是蛋白质介导的(Thurnhofer等，生物化学29 2142-2148(1990))。这对于胆固醇酯(Compassi等，生物化学34 16473-(1995))和其它饮食脂类(Thurnhofer等，生物化学生物物理学杂志1024 249-262(1990))也是如此。我们的发现与教科书及综述文章中证实的被广泛接受的观点不同，即脂类的摄取是一个包含沿浓度梯度的饮食脂类扩散的被动过程。我们的发现开辟了干扰和可能抑制消化道中胆固醇摄取的新途径和可能性。在1990年以前，针对该目标采取的方法可被划分成非特异性的。实例为用聚合物如胆甾胺或植物皂苷类治疗。这些化合物被推测与消化道中将胆固醇和其它饮食脂类转运到摄取位点的胆汁盐相互作用，这种相互作用使胆固醇和其它脂类不能进行脂类的摄取。在这种相互作用中需要大量的这些试剂表明该反应是非特异性的。相反，在BBM中是蛋白质催化胆固醇(或更一般地说脂质)摄取，这种途径是不同的并且可被划分为特异性的。这里，目标是发现或设计特异性与参与脂类摄取的蛋白质相互作用的试剂，从而抑制脂类摄取。
目前已发现一族蛋白质可起胆固醇或其它脂类摄取抑制剂的作用，其中该蛋白质的存在已为人熟知，其功能被认为已确定，但没有提出其肠道的医药用途。这种蛋白为脱辅基蛋白质。
还发现脱辅基蛋白质在本发明中看来有效的原因是由于在它们的结构中存在两亲性α-螺旋，因此其它包含一个或多个具有蛋白质两亲性α-螺旋的相关特性(尤其是大小，几何学和极性)的两亲性区域的分子可用于本发明。
因此，根据本发明的第一个方面，提供包含一个或多个两亲性区域，尤其是两亲性螺旋的分子在制备用于抑制从消化道中摄取胆固醇或其它脂类的药物中的用途。
根据本发明的第二个方面，提供包含一个或多个两亲性区域，尤其是两亲性螺旋的分子在制备用于经肠道给药的治疗或预防高脂血症，尤其是高胆固醇血症和/或肥胖的药物中的用途。
这个或各个两亲性区域具有由至少13,14，或15个氨基酸残基组成的蛋白质两亲性螺旋的相关特性(尤其是大小，几何学和极性)，其中13、14和15个氨基酸残基数目中优选性递增。
因此，本发明能提供一种抑制从消化道摄取胆固醇或其它脂类的方法，该方法包括给予病人或个体包含一个或多个两亲性区域，尤其是两亲性螺旋的分子。
本发明还可提供一种治疗或预防高脂血症，尤其是高胆固醇血症，和/或肥胖的方法，该方法包括经肠内给予病人或个体有效量的包含一个或多个两亲性区域，尤其是两亲性螺旋的分子。
包含几个两亲性α-螺旋的特殊的蛋白质分子为脱辅基蛋白质。
如上所述，低密度脂蛋白(LDL)是血液中胆固醇的最重要的运输载体。LDL是脂蛋白族系中的一员，该脂蛋白族系根据密度递增被划分为：乳糜微粒、乳糜微粒残余物、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)。各种脂蛋白都有其自身功能；例如，如上所述，LDL在血液中胆固醇的转运中非常重要，HDL被认为是细胞和血管中胆固醇的清除剂，且它们在那些方面的作用是非常明确的。脂蛋白是一种由极性脂类的壳包围的疏水性脂类中心和脱辅基蛋白质(也称为脱辅基脂蛋白，有时简写为apos)组成的颗粒。十种主要的脱辅基蛋白质A-1,A-2,A-4,B-48,B-100,C-1,C-2,C-3,D和E已被分离并表征；它们通过肝脏和肠合成并分泌。Goodman和Gilman在“治疗学的药理学基础”McGraw-Hill，第8版，1992中给出了如下的在各种脂蛋白中的脱辅基蛋白质的分布。
脂蛋白类型 主要脱辅基蛋白质
乳糜微粒 A-1,A-2,A-4,B-48
乳糜微粒残余物 B-48,E
VLDL B-100,C,E
IDL  B-100,E
LDL B-100
HDL A-1,A-2
设想在原则上任何脱辅基蛋白质可用于本发明。脱辅基蛋白质A和C(apoA和apoC)已表明在体外BBM模型中尤为有效。鉴于它们很大的大小以及由于它们在脱脂形式下相对缺乏可溶性，B脱辅基蛋白质可能不是优选的。
虽然本发明在治疗或预防人类疾病中具有特殊的应用，但它还可用于其它动物(尤其是哺乳动物)。很有可能来自任何特定种类(包括人类)的脱辅基蛋白质可能最适宜于治疗同种的动物，但脱辅基蛋白质的种间交叉使用也在本发明的范围内。
天然脱辅基质白质(包括所有等位基因变异体)及其变异体的用途在本发明的范围内。变异体包括插入、缺失和取代突变体；至少从胆固醇(更普通地说为脂类)摄取抑制来看，突变体可通常为保守突变体，并通常将与天然序列显示显著的氨基酸同源性。显著的氨基酸同源性可包括在最佳配对基础上至少40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或甚至99％的同源性，增加的同源性是优选的。可加入非干扰氨基酸序列，可缺失非必需氨基酸序列。简而言之，适宜的突变体包括其二级结构足以复制或模拟能抑制脂类尤其是胆固醇从消化道摄取的天然脱辅基蛋白质的那些蛋白质。
在本发明的内容中，具有其特性(如大小，几何学和极性)相当于天然脱辅基蛋白质的两亲性α-螺旋的一个或多个两亲性区域的其它分子可被认为是脱辅基蛋白质的变异体。然而，通过参考它们所属的那些化合物类别来考虑包含适宜两亲性区域的各种非脱辅基分子则更加方便。
这些类别中最通用的一个是能形成一个两亲性螺旋或多个两亲性螺旋的天然或合成肽和蛋白。鉴于形成螺旋的氨基酸的侧链的性质和构型，两亲性螺旋具有疏水面和亲水面。在A类两亲性螺旋中，亲水面的阳离子残基靠近疏水面，阴离子残基远离疏水面。在R类两亲性螺旋中，亲水性构型被逆转，这样亲水面的阴离子残基靠近疏水面，阳离子残基远离疏水面。天然脱辅基蛋白质包含A类两亲性螺旋：ApoA-1具有8个。由于这个原因，包含一个或多个A类两亲性螺旋的化合物是优选的。
在肽或蛋白质的右手α-螺旋中，一圈由3.6个氨基酸构成。每圈的高度为5.4埃，这样由18个氨基酸组成的α-螺旋的长度为27埃。15个氨基酸的α-螺旋的长度为22.5埃。该α-螺旋的肽骨架围绕直径为约5埃(±0.5埃)的理论上的圆柱体的表面(大约为环形截面)。考虑氨基酸残基的向外凸出的侧链，圆柱体的直径为约5-8埃。可能为极性、带电或不带电的侧链伸出几乎垂直于圆柱体的长轴。约一半的圆柱体表面被带电和极性氨基酸残基所覆盖，另一半被非极性残基覆盖。如上所述，两亲性α-螺旋(A类或R类，视情况而定)具有平行朝向圆柱体轴的相反极性和非极性面。
可用于本发明的肽和蛋白质包括公开在EP-A-0162414和US-A-4643988中的那些，其中它们的内容以法律所允许的最大程度被本文引作参考。能形成两亲性螺旋的优选肽和蛋白质包含序列：
A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(Ⅰ)其中
A1,A2,A3和A4各自独立地代表天冬氨酸或谷氨酸或其同系物或类似物；B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8和B9各自独立地代表色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或类似物；C1,C2,C3和C4各自独立地代表赖氨酸或精氨酸；和D代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸或组氨酸，或其同系物或类似物。
这些肽显示出导致理想化的两亲性螺旋的特异性的氨基酸残基排列。带负电、正电以及疏水性残基的特异性定位对于形成两亲性螺旋非常重要，并因此对于肽的预期的功能发挥也非常重要。具有与在天然脱辅基脂蛋白中的带电残基定位相反的阳离子和阴离子残基的类似物显示出很小的或不显示脂类相关性。在上面肽的18残基序列中，带正电的残基(式Ⅰ中的“C”组)应在位置4,9,13和15，带负电的残基(或Ⅰ中的“A”组)应在位置1,8,12和16。疏水性残基(式Ⅰ中的“B”组)应放置在位置2,3,6,7,10,11,14,17和18。残基丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸或组氨酸优选在位置5(“D”)。选择用来占据特殊功能位置(如带正电位置)的特异性残基可发生变化，只要不对肽活性产生过分不利影响。例如，在其中需要带负电残基的序列的任何位置可将带负电残基天冬氨酸和谷氨酸互换。类似地，赖氨酸或精氨酸可排列在任何带正电位置。优选的疏水性残基为色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和α-萘基丙氨酸。
在一些优选的肽中，许多疏水性残基位置被α-萘基丙氨酸占据。尤其优选的具体实例包括序列为下面的那些：
Asp-Trp-αNal-Lys-Ala-Phe-αNal-Asp-Lys-αNal-Ala-Glu-
Lys-αNal-Lys-Glu-Ala-Phe(18naA)；或
Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-
Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-18A-NH2).
该后一序列为Venkatachalapathi等，蛋白质：结构、功能和遗传学15 349-359(1993)的主题，它们的内容在被法律所允许的最大程度上被本文引作参考。相应的未封闭的肽18A也是优选的化合物。
采用的氨基酸可为天然存在的形式，或者可采用显示所需意外特性的合成氨基酸。例如，合成的氨基酸α-萘基丙氨酸比任何天然存在的氨基酸都显示出更大程度的疏水性，并在本发明的肽中特别有用。类似地，被取代的氨基酸二甲基赖氨酸比未取代的赖氨酸带正电更多，并在一些具体实例中是优选的。因此，还考虑到在目标肽中天然存在的氨基酸的有用的类似物或同系物的取代。D-或L-型氨基酸均适宜用于本发明。D-氨基酸的一个可能的优点是在肠道中包含它们的肽和蛋白质的酶解趋势降低。如上所预测，C-或N-末端氨基酸可被以非干扰方式适当地进行封闭或以其它方式衍生化；例如N-末端氨基酸可被乙酰化，C-末端氨基酸可被酰胺化。如在优选肽Ac-18A-NH2中以这种方式封闭的N-和/或C-末端可在脂类存在的情况下稳定α-螺旋。
虽然上述优选肽的功能性两亲性螺旋由18个氨基酸的序列组成，但在基本上不影响螺旋形成能力的情况下，可向18残基肽的任一末端增添氨基酸。例如，在碱性两亲性肽链的各个末端可加上一个延伸三肽以将螺旋末端的作用减至最小。多个两亲性螺旋区也可证实是有用的。由例如脯氨酸连接的两个18残基肽组成的37残基肽也显示出与磷脂形成盘状复合物并替代来自HDL的天然脱辅基蛋白的能力。
然而，对于目前方案，总体看来这种18残基单元对于形成适当的螺旋是重要的。例如在序列的第10位的氨基酸缺失将导致极性-非极性界面旋转100°，并导致本质上缺乏替代来自HDL的天然脱辅基质蛋白质能力的肽。然而，存在其中两亲性螺旋的一部分(如残基A4-B8-B9)缺失的有用和功能性的分子。一个实例为Ac-15A-NH2，它包含Ac-18A-NH2的15个N-末端氨基酸，且其结构如下：
Ac-lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-15A-NH2)
如在刷状缘膜小泡模型中所测得，Ac-15A-NH2具有Ac-18A-NH2的油酸胆固醇酯摄取抑制活性的85％。
可通过任何目前可用来合成简单和复杂低分子量蛋白质的方法来合成上述肽。一般来说，这些方法包括通过连续加入氨基酸的逐步产生较大分子的逐步合成法。通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间的缩合以形成肽键来将氨基酸连在一起。为控制这些反应，必须封闭一个氨基酸的氨基和另一个的羧基。选择封闭基团应易于被去除而对多肽没有不利影响，不会产生外消旋化或所形成肽键的水解。一些氨基酸具有另外的功能性基团，例如酪氨酸的羟基。通常必须用容易被去除的封闭剂来封闭这些另外的基团，这样它不干扰用于形成肽键的所希望的缩合作用。
现有许多用于合成多肽的方法，并且也提出了许多封闭剂。这些方法大部分适用于本发明的肽。目前优选的用于合成目标肽的方法为Merrifield方法。在此方法中，一个氨基酸以酯键与树脂颗粒结合，通过向生长链中连续加入被保护的氨基酸以逐步合成的方式来产生肽。这种一般方法已为人熟知，并被描述于许多文章中，例如：Merrifield,R.B.美国化学协会杂志(J.Amer.Chem.Soc)96 2986-2993,(1964)。
然而，已知方法的改进通过用甲酸替代作为酸供体的转移氢化方法从固体载体释放肽避免了通常的HF步骤。该方法导致了几乎是纯肽的释放以及保护基团从赖氨酸的ε-NH2基，苄基酯从酪氨酸中释放。
本发明设计的另一可能性是例如通过本领域已知的方法，通过非肽键的氨基酸残基连接，该方法有可能导致肠中的酶水解降低。
更概括地说，用于本发明的天然脱辅基蛋白质可通过从天然来源(如血清)中分离，或通过其它方法来制备，如重组DNA技术或上面讨论的肽合成法。脱辅基蛋白质优选但不必须被分离成为蛋白质匀一性的(即意味着在制备物中不存在其它蛋白质)；而且，它们可以但不必须被分离成为完全匀一性的(即意味着根本不存在显著量的其它分子)。分离至蛋白质匀一性可能是最佳方案，因为一些脂类将在体内自然地与脱辅基蛋白质结合。确实，已发现apoA-1的脂化形式比脱脂形式更具活性，并且其由于此原因而被优选。脂化可以是天然的，在这种情况下脱辅基蛋白质可以其天然的脂蛋白等同物的形式来给药。然而，部分脂化(或脱脂)的脱辅基蛋白质或用另一种方式脂化(以非天然脂蛋白模式结合)的脱辅基蛋白质也可能是有用的。
重组DNA技术可能用来在任何适宜的宿主中产生脱辅基蛋白。如下面的代表性而非穷举性列表所示，一些脱辅基蛋白质的蛋白质和DNA序列已被确定：大鼠apo D:               Spreyer等，EMBO J 9(8)2479-2484
                        (1990)；大鼠apo A-4:              Bogusli等，Proc.Nat′1.Acad.Sci.
                         USA 81(16)5021-5025(1984)；大鼠apo A-1:              Boguski等，Proc.Nat′1.Acad.Sci.
                         USA 82 992-996(1985)；人apo E(ε-4等位基因)：   Das等，生物化学杂志260(10)6240-
                         6247(1985)人apo E(ε-2和ε-3等位基因)：Zannis等，生物化学杂志259(9)
                         5495-5499(1984)；人apo C-2:                   Wei等，生物化学杂志260(28)
                         15211-15211(1985)和(erratum)
                         261(8)3910(1986)；人apo B-100:                 Knott等，科学230(4721)37-43
                         (1985)；人apo A-1:                   Shoulders等，核酸研究11(9)2827-
                          2837(1983)；人apo C-3:                    Protter等，DNA 3(6)449-456
                (1984)；人apo A-4:           Elshourbagy等，生物化学杂志
                 262(17)7973-7981(1987)；及人apo A-2:           Knott等，核酸研究13(17)6387-
                 6398(1985)。
更全面的参考文献可使用“apo”路径从NIH ENTREZ分子生物学数据库中获得。现有的序列信息应能使得通过标准方法克隆任何仍未克隆的脱辅基蛋白质的基因(如cDNA或基因组)。
重组脱辅基蛋白质、其它蛋白质或肽的表达可在任何适宜宿主中进行，无论微生物(如细菌，例如大肠杆菌，或真菌，例如酿酒酵母)，昆虫或哺乳动物。取决于所采用的宿主，任何翻译后修饰(如糖基化)的性质和程度可能是天然的，不同于天然的或不存在。任何功能性脱辅基蛋白质，无论是否被按天然方式进行了翻译后修饰，均可用于本发明。
在本发明的实践中可用一种或多种不同分子给药。事实上，如果用一些天然的脂蛋白(包括乳糜微粒，乳糜微粒残余物，VLDL,IDL,LDL和HDL)，将存在一种以上类型的脱辅基蛋白质；例如，如上所述，在用HDL时，可一起施用apo A-1和apo A-2，在用乳糜微粒时，可一起施用apo A-1,A-2,A-4和B-48。
应理解本发明不局限于肽和蛋白质的用途。而且，本发明包括具有适宜大小、几何学和极性，或具有如此的一个区域的任何分子的用途。合成肽模拟物或其它有机分子可能是有用的，如可以是基于糖、脂类或其它生物单位的分子。
可用于本发明的分子通常与药物学或兽医学可接受的载体结合而配制以通过任何方便的途径给药。该制剂构成了本发明的第三个方面。
用于胃肠外给药的制剂通常将是无菌的。适用于胃肠外给药的药物制剂包括可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质的含水和不含水的无菌注射溶液，可能包含悬浮剂和增稠剂的含水和不含水的无菌悬浮液也在本发明的范围内。该制剂可存在于单剂或复剂容器中。例如密封的安瓿瓶或管形瓶中，并且可贮存在仅需要在使用前立即加入无菌液体载体例如注射用水的冻冷干燥(冷干)的条件下。可从无菌粉剂、颗粒剂和片剂来制备即时用注射溶液和悬浮液。
然而，优选可用于本发明的分子经肠道给药，尤其是口服，因为它们在本发明中的作用是防止或至少抑制从肠道的摄取。
口服和其它肠道制剂不需要为无菌的，可以单剂或多剂形式存在。口服制剂可为固体形式，如粉剂，粒剂，片剂，胶囊剂(如硬或软明胶胶囊剂)或锭剂，或液体剂，如糖浆或酏剂。填料和/或载体可在适当时存在，药物制剂领域的技术人员将能提供这些另外或其它可能为必需或所需的赋形剂；芳香剂为一个实例。打算口服给药的任何制剂可配制成肠抗性的，以便通过避免或减轻脱辅基蛋白在胃或小肠近端的消化来辅助运输至小肠。片剂或胶囊剂可例如通过常规方法进行肠衣包被。液体制剂可通过包含有或与适宜的试剂如中等链甘油三酯共同给药来有效地提供肠抗性。
非口服组合物的经肠组合物包括可为拴剂形式的直肠组合物。拴剂通常包括拴剂基质，如可可脂。包含活性成分的特殊制剂可通过药物制剂领域技术人员按常规制备。
在预防或治疗中给药的脱辅基蛋白质或其它活性分子的量将受医生或临床大夫的控制。常规临床试验可确定最佳水平。本发明仅要求给药量是有效的。然而，作为参考，体外实验表明应给予足够量的脱辅基蛋白质(以脱辅基蛋白质A-1计)以提供肠中局部浓度1-5μM；在此基础上，可给予1-10μM apo A-1，最佳值可能在2-5μM范围内。其它活性成分可以在上面的范围内或以确定为有效和能良好耐受的其它剂量来进行给药。
本发明可用于预防或治疗任何起因的高胆固醇血症或其它高脂血症，无论是家族性的或饮食诱导的。口服给药对于两者可能是优选的。因此本发明提供对动脉粥样硬化的可口服(或其它经肠途径)给药的治疗或预防。
由于胆固醇的提供取决于内源胆固醇的生物合成与从肠道外源胆固醇的摄取之间的平衡，同时给予胆固醇生物合成抑制剂可能是适宜的。甚至可将胆固醇生物合成抑制剂与可用于本发明的脱辅基蛋白质或其它分子共同配制，但这不是必需的：它可被分别或依次给药，这样它可通过包括上面讨论的那些的任何常规方法独立配制。根据本发明的第四个方面，提供在高胆固醇血症，或其它高脂血症的预防或治疗以及预防或治疗肥胖中用于混合、分别或依次给药的包含如上定义的具有两亲性区域的分子和胆固醇生物合成抑制剂的产品。
胆固醇生物合成抑制剂可为HMG-CoA还原酶抑制剂。抑制素为这些化合物的实例。尤其有意义的HMG-CoA还原酶抑制剂包括天然发酵产物密实菌素(compactin)和mevinolin(也称为洛伐他汀)、二氢密实菌素，二氢洛伐他汀，eptastatin，公开在US-A-4293496中的mevinolin的半合成类似物及公开在US-A-4444784,US-A-4661483,US-A-4668699和US-A-4771071的化合物(包括西伐他停)以及公开在WO-A-9100280和WO-A-9115482中的那些作为一些实例。适当时可使用一种或多种胆固醇生物合成抑制剂。
如果需要，可存在或至少另外施用胆汁酸螯合物，如胆甾胺。然而，由于本发明优点之一是可避免或至少减少它们的应用，因此这些试剂通常不存在。
本发明各个方面的优选的特征对于其它各个方面也是优选的，反之亦然。
本说明书中参考的所有专利或文献资料在此被以法律允许的最大限度地引作参考。
本发明现将通过下面的实施例来说明。实施例使用各种缩写，其含义如下：
apo A-1脱辅基脂蛋白A-1(或A-Ⅰ)
apo A-2脱辅基脂蛋白A-2(或A-Ⅱ)
BBM    刷状缘膜
BBMV    刷状缘膜小泡
DMPC    二肉豆寇酰磷脂酰胆碱
EDTA    二乙胺四乙酸二钠盐
FH    家族性高胆固醇血症
HDL    高密度脂蛋白
LDL    低密度脂蛋白
PAGE   聚丙烯酰胺凝胶电泳
PC     磷脂酰胆碱
rpm    每分钟的转数
SDS    十二烷基硫酸钠
SUV    单层小泡
TCA    三氯乙酸
Tris   三[羟基甲基]氨基甲烷
实施例还提到附图，其中
图1表明部分纯化的甾醇摄取抑制剂蛋白在PBE 94上的层析聚焦。条件描述在实施例1中。在级分28洗脱活性峰。用Pierce BCA*蛋白分析试剂测定蛋白浓度。正方形代表蛋白质的量，菱形代表抑制活性。
图2表明实施例1中描述的从PBE 94柱中洗脱的级分的SDS 15％PAGE凝胶图。根据制造商的说明，在Mini-Protean Ⅱ Dual Slab Cell中进行电泳。银染凝胶。在凝胶的每一侧，标准蛋白的电泳迁移率与它们的分子量(kDa)一起给出。Ap：用于PBE 94柱的部分纯化的甾醇摄取抑制剂蛋白。FT：通过级分的流速。11-42：从PBE94柱中洗脱的级分。存在于各泳道中的在45和66K之间的双带为人为银染物。
图3棒状直方图显示在实施例3中描述的条件下，脱辅基蛋白质A-1的不同形式对从包含1mol％放射性标记的胆固醇作为供体及兔BBMV作为受体的卵PC SUV中摄取胆固醇的影响。棒条表示相对于缺乏抑制时的胆固醇摄取的胆固醇摄取的抑制百分数。由顶端的黑色棒条给出三次不同测定的标准偏差。Apo A-Ⅰ：人脱辅基蛋白质A-1。Apo A-1/DMPC：重新掺入DMPC双层的人脱辅基蛋白质A-1(2.5mg DMPC/mg apo A-1)。Fr.28-PBE94：在PBE94层析聚焦柱的级分28中洗脱出的纯化的抑制剂。HDL3：密度d=1.125-1.21g/ml的人高密度脂蛋白。
图4A表明从包含1mol％油酸胆固醇酯和痕量[3H]-胆固醇油酰醚的卵PC SUV作为供体及兔BBMW作为受体油酸胆固醇酯的摄取对抑制剂蛋白递增量的剂量应答。菱形：由于人脱辅基蛋白质A-1的抑制。正方形：由于fr.28-PBE 94的抑制。误差棒条表明三次独立测定的标准偏差。
图4B以类似于图4A的方式表明作为递增浓度的人apo A-1、人apoA-2和羊HDL函数的抑制效果。
图5表明在不存在抑制剂(●)和存在60μM Ac-18A-NH2(■)时，由正常人十二指肠制备的BBMV对胆固醇的摄取。将包含1mol％[14C]胆固醇的0.01mg脂类/ml的磷脂小泡和为0.25mg脂类/mL的BBMV一起保温，并如实施例7所描述的测定胆固醇的摄取。将Ac-18A-NH2加入至供体和受体小泡的悬浮液中。数据点代表3次测定的平均值±标准偏差。虚线代表单指数计算机配合。
图6表明增加Ac-18A-NH2浓度对正常(●)和无β脂蛋白(O)BBMV的蛋白介导的胆固醇摄取的影响。在存在递增浓度的Ac-18A-NH2时，使用天然和蛋白酶K处理的BBMV来测定从磷脂小泡的[14C]胆固醇的摄取。通过天然和蛋白酶K处理的BBMV的胆固醇摄取之间的差异被称为蛋白质介导的胆固醇摄取。实验条件如实施例7中所描述；保温时间为20分钟。正常BBMV的数据点代表3次测定的平均值±标准偏差，虚线代表由根据Rodbard等，酶学方法37 3-22(1975)的实验数据拟出的曲线。
实施例材料：葡聚糖硫酸钠，Phenyl SEPHAROSE6 Fast Flow(low sub),SEPHADEXG-50,PBETM 94和POLYBUFFER74购自Pharmacia(Dubendorf，瑞士)，卵PC和二肉豆蔻酰PC购自Lipid Products(Nutfield,UK)，小鼠单克隆抗人脱辅基脂蛋白A-1抗体(未偶联)及BCATM蛋白质分析试剂购自Pierce(Lausanne，瑞士)，胆固醇(纯度≥99％)和牛磺胆酸钠(纯度≥97％)购自Fluka(Buchs，瑞士)，油酸胆固醇酯(纯度≥98％)，油酸(纯度≈99％)和羊抗小鼠免疫球蛋白G(与碱性磷酸酶偶联的)购自Sigma(Buchs，瑞士)，使用的所有放射性化学物质购自Amersham(Bucks,UK)，聚丙烯ECONO-COLUMNSTM(0.7*4cm)，MINI-PROTEINⅡDual Slab Cell，低分子量标准物和30％丙烯酰胺/bis溶液购自BioRad实验室(Glattbrugg，瑞士)。所有其它化学品为现有最好的质量。水总是双蒸馏水。冷冻羊血清从Basle免疫研究所(Basle，瑞士)获得并在使用前在-80℃下贮存。人脱辅基蛋白质A-1和A-2及人HDL3是宾西法尼亚医学院(费城，PA,USA)M.C.Phillips博士的赠品。实施例1：胆固醇摄取抑制剂的分离
在使用包含1mo1％[3H]-胆固醇的卵PC SUV作为供体和兔BBMV作为受体的交换反应中测定甾醇摄取活性的抑制。根据Hauser等生物化学生物物理学杂志602 567-577(1980)制备兔BBMV。通过如前面描述的(Thurnhofer等，生物化学生物物理学杂志1024 249-262(1990))，将脂类分散体在Tris/NaCl(50mM Tris,pH=7.4,150mM NaCl,0.2％NaN3)中进行顶端超声破碎来制备分别包含痕量胆固醇和胆固醇油醇醚的卵PC的SUV。4℃下，将在Tris/NaCl中的供体和受体分散体在BeckmanAIRFUGETM中以100000g离心2分钟。受体分散体产生一沉淀，该沉淀被用Tris/NaCl重新悬浮至1.7mg蛋白/ml的最终浓度并在相同缓冲液中变化抑制活性的量。在起始时将该悬浮液与供体分散体的上清(顶端80％)的等分试样混合。混合物中的供体的最终浓度为0.2mg总脂类/ml。25℃下，将混合物保温20分钟，通过用两体积的Tris/NaCl稀释样品来终止交换反应，通过4℃下，在airuge中以100000g离心2分钟来分离供体和受体。在Beckman LS 7500闪烁计数器中测定包含供体小泡的上清和包含BBMV(受体)的沉淀中的放射活性。结果以与在不存在抑制活性时的摄取相比，在存在抑制活性时受体摄取的甾醇的百分数来表示。
从羊血清中分离抑制活性。如下用葡聚糖硫酸盐将血清进行分级分离：室温下将100ml血清解冻，并与0.5ml 10％葡聚糖硫酸钠的0.15MNaCl溶液和5ml 1M MaCl2溶液混合。除非另有说明，所有操作均在室温下进行。沉淀立即开始并通过将样品以6000rpm离心10分钟完成沉淀过程，产生上清S1和沉淀P1。回收S1，并加入6ml10％葡聚糖硫酸盐溶液和15ml 1M MnCl2。将混合物保温2小时，接着以20000g离心30分钟。轻轻倒出上清(S2)。通过用50ml包含0.1％葡聚糖硫酸盐和0.1MMnCl2的Tris/NaCl重新悬浮并如上进行离心来洗涤沉淀(P2)。弃去上清(S3)，将沉淀(P3)用10ml包含1％NaCl的2％柠檬酸钠来分散，并在搅拌下滴加1M NaOH将pH调至8。将浑浊分散体的6000rpm离心10分钟以除去MnO。回收上清(S4)。将P1用2ml 10％NaHCO3重新溶解。形成MnCO3，并通过在MSE旋转离心机中以500g离心2分钟将它除去。回收上清(S5)，并通过加入100ml 50mM Tris pH 7.4和2.5ml 2MMgCl2将其沉淀，以6000rpm离心10分钟。将沉淀(P6)用2ml 5％NaCl重新悬浮并如上重新沉淀两次。将最终的沉淀(P7)用1.5ml 10％柠檬酸钠重新悬浮并对包含1％NaCl的Tris pH7.4进行透析以除去Mg2+。将S2，S4和透析过的P7对1％BaCl2,1％NaCl进行透析，以6000离心10分钟以除去沉淀的葡聚糖硫酸钡盐并对Tris/NaCl进行透析。测定蛋白浓度及抑制活性，结果总结于表1中。
表1
    样品      蛋白质(mg)     抑制(au)     比活(抑制/mg蛋白)
血清     9724(100) 4180000(100)     430
S2     7035(72) 370000(9)     53
S4     667(7) 1260000(30)     1889
P7     39(0.4) 138000(3)     3540
产率(％)       80     42
表1-注解。羊血清葡聚糖硫酸盐分级分离：如本实施例上面所描述的，将羊血清用葡聚糖硫酸盐依次进行分级分离。用Pierce BCATM蛋白质分析试剂测定蛋白浓度。抑制活性定义为相对于在不存在抑制剂时的摄取，在存在抑制剂时由受体摄取的甾醇的百分数，并且以任意单位(au)来表示。括号中的值为该量相对于羊血清的百分数。
通过疏水作用层析进一步纯化包含最大抑制活性的S4。将柱(内经=2.8cm)用40ml Phenyl Sepharose 6 Fast Flow填装，并平衡在包含2MNaCl的50mM Tris pH 7.4中。在整个层析实验中使用4ml/分的流速。将足够的固体NaCl加入S4(600mg蛋白)以达到2M NaCl的浓度。将流过蛋白用相同缓冲液洗脱。然后将NaCl浓度降至0.15M(级分1)洗涤该柱，并用水(级分2)和15％乙醇(级分3)来进行洗脱。测定蛋白浓度和抑制活性，结果总结在表2中。
表2
级分    蛋白质(mg-％)     抑制(au)     比活(抑制/mg蛋白)
S4   600(100)  11334400(100)     1889
流过   362(59)  28289(2)     78
级分1   72(12)  31148(2)     44
级分2   35(6)  955172(72)     27290
级分3   4(0.6)  162750(12)     40688
产率(％)    78     88
表2-注解。S4的疏水作用层析：将从羊血清的葡聚糖硫酸盐分离获得并富含甾醇摄取抑制活性的级分S4进一步通过如本实施例上面描述的在Phenyl Sepharose 6 Fast Flow上的疏水作用层析来进行纯化。用PierceBCA*蛋白质分析试剂来测定蛋白浓度。抑制活性以相对于不存在抑制活性时的摄取，在存在抑制活性时由受体摄取的甾醇的百分数来定义并以任意单位(au)来表示。括号中的值为该量相对于级分S4的百分数。
级分2最后通过层析聚焦纯化。柱(内径≈1cm)用20ml PBE 94装填，并平衡在25mM咪唑-HCl pH7.3中。在整个层析实验中使用0.5ml/分的流速。将级分2(34mg蛋白)上柱，洗涤柱直至280nm的吸光率达到基线(级分PBE-FT)。将蛋白用通过将POLYBUFFER 74用水以1∶8稀释并用HCl平衡在pH=4.0而产生的线性pH梯度来进行洗脱。收集8ml的各级分。在确定级分的蛋白和抑制活性之前，通过向2.0ml填装在用Tris/NaCl平衡的聚丙烯ECONO-COLUMN中的SEPHADEX G-50中加入0.5ml级分来除去Polybuffer 74。蛋白和抑制活性的回收分别为100％和82％(图1)。如图2所示，通过SDS-PAGE分析各级分。实施例2：被纯化的抑制剂鉴定为脱辅基蛋白质A-1
从如实施例1描述的PBE94柱获得的级分28(fr.28-PBE94)的物理特性总结在表3中。
表3
    蛋白质   等电点     分子量(kDa)
fr.28-PBE94     5.40  28.2(SDS-PAGE法)27.57(MS法)
人apo A-1     5.52     28.3
兔apo A-1     5.50     25-27
表3-注解。被纯化的抑制剂(fr.28-PBE94)的一些物理特性：测定了fr.28-PBE94的等电点，即为从PBE 94柱洗脱的pH，通过SDS-PAGE或质谱法(MS)测定了分子量。这里包括了从Chapman,Academic Press,Inc.San Diego,New York,Roston,London,Sydney,Tokyo,Toronto 70-143(1986)获得的人和兔apo A-1的数值以用于比较。
由于仍未报导羊apo A-1的特性，所以这里报导了人和兔apo A-1的物理特性以用于比较(Chapman.Academic Press,Inc.San Diego,NewYork,Boston,london,Sydney,Tokyo,Toronto 70-143(1986))。将Fr.28-PBE94进行N-末端氨基酸分析。fr 28-PBE94的头29个氨基酸的79.3％与大鼠apo A-1相同，69.0％与兔apo A-1相同，86.2％与牛apoA-1相同及65.0％与人apo A-1相同。在蛋白质印迹实验中，Fr.28-PBE94与小鼠单克隆抗人apo A-1抗体发生交叉反应。Fr.28-PBE94被显示包含0.26mg总胆固醇(游离和酯化)/mg蛋白，在密度d=1.21g/ml的NaBr溶液离心时浮起。这是高密度脂蛋白的漂浮密度。在将fr.28-PBE94根据Nichols等(Nichols等，生物化学生物物理学杂志446 226-239(1976))进行盐酸胍处理后，fr.28-PBE94被脱脂，显示出与人apo A-1相同的行为。为了证明抑制活性的确是由于蛋白质的缘故，将Fr28-PBE94和作为对照的人apo A-1用10％三氯乙酸沉淀或经过四次煮沸5分钟并在冰上冷却5分钟的循环。离心除去变性的蛋白，测定留在上清中的蛋白和抑制活性(表4)。
表4
    蛋白质(％)     抑制(％)
人apo A-1     0     7.5±1.3
TCA沉淀之后
煮沸/冷却之后     27     18.7±5.1
fr.28-PBE94     0     -13.1±4.8
TCA沉淀之后
煮沸/冷却之后     66     50.3±3.1
表4-注解。抑制活性的变性：通过暴露于10％TCA或经如本实施例中所描述的4次煮沸/冷却循环将抑制活性变性。这里产生的结果以在用离心除去变性蛋白后留在上清中的蛋白和甾醇摄取抑制活性的百分数来表示。实施例3：apo A-1和apo A-2对兔BBMV胆固醇摄取的影响
在存在人apo A-1、重新掺入到DMPC双层中的人apo A-1(2.5mgDMPC/mg apo A-1)、fr28-PBE94和人HDL3各20μg时，如实施例1所描述测定兔BBMV从作为供体的SUV中摄取的胆固醇(游离或酯化的胆固醇)：图3为显示在存在下面物质时的胆固醇摄取被抑制的棒形直方图：(a)人apo A-1；(b)根据Brouillette和Anantharamaiah，生物化学生物物理学杂志1256 103-109(1995)；从人apo A-1和DMPC(1∶25=重量比)重新组成的脂蛋白复合物；(c)如上面实施例1所述纯化的羊apo A-1；和(d)密度范围为d=1.125-1.21g/ml的人HDL3。在25℃下，在不存在和存在抑制剂时，使用包含1mol％放射性标记的胆固醇的卵PC的SUV作为供体和兔小肠BBMV作为受体来测定胆固醇的摄取。将分散在50mM Tris缓冲液pH7.4,0.15m NaCl,0.2％NaN3中的供体和受体混合至最终浓度分别为0.05mg总脂类/ml和1.7mg蛋白/ml。在所有这些样品中的apo A-1的量保持恒定在20μg蛋白/ml。存在apo A-1时的抑制以占不存在抑制剂时测得的胆固醇摄取的百分数来表示。各个棒条顶端的黑色部分代表三次测定的标准偏差。
图4A表明在存在递增量的fr.28-PBE94(正方形)和人apo A-1(菱形)时，甾醇摄取的抑制。如实施例1中所述制备作为供体的包含1mol％油酸胆固醇酯和痕量[1,2-3H2(N)]-胆固醇油醇醚(37ci/mmol，来自Amersham,UK)的卵磷脂酰胆碱的小单层小泡，作为受体的BBMV从兔小肠制备(参见实施例1)。在起始时将分散在Tris/NaCl缓冲液(0.05M TrisHCl pH7.4,0.15M NaCl,0.02％NaN3)中的供体和受体和人apo A-1或羊HDL的相同缓冲液溶液混合(总体积：0.1ml)，这样供体和受体的最终浓度分别为0.05mg/ml总脂类和1.7mg蛋白/ml。在25℃下，在存在抑制剂时，将供体和受体的悬浮液保温20分钟，通过用2体积Tris/NaCl缓冲液稀释来终止反应。4℃下，通过在airfuge中以115000g离心2分钟分离供体和受体，在BECKMANTM LS7500闪烁计数器中测定包含供体小泡的上清和包含BBMV的沉淀的放射活性。通过脱脂(Scanu和Edelstein，分析性生物化学(Anal.Biochem)44 576-588(1971))和在Q-SepharoseTM上离子交换层析(Weisweiler，临床化学杂志169 249-254(1987))从人HDL制备纯人apo A-1和apo A-2。用8-25％梯度凝胶的SDS-PAGE，使用PHASTTM电泳系统(来自Pharmacia)检查apo A-1和apoA-Ⅱ的纯度。在过载的凝胶上两种蛋白产生一条带。使用前，将蛋白溶解在3M盐酸胍中并对Tris/NaCl缓冲液透析。
图4B显示作为递增浓度的人apo A-1、人apo A-2、羊HDL和人LDL函数的抑制剂效果。实验条件如图4A所描述。将不存在抑制时测得的BBMV的胆固醇摄取活性作为100％，在存在抑制剂时的观察到的活性的损失以％表示。通过Rodbard和Frazier(酶学方法37 3-22(1975)的方法拟合实验点，产生实线。羊HDL(◆)，人apo A-1(■)，人apo A-2(△)，羊LDL(▲)。
IC50为观察到50％抑制时的抑制剂浓度。IC50值来自图4B显示图的曲线拟合，并示于下表5中：
       表5
抑制剂    IC-50(μg/ml)
羊HDL        17
apo A-Ⅰ     25
apo A-Ⅱ     66
LDL         143实施例4：兔BBMV与apo A-1预保温的效果
为了证明甾醇摄取的抑制不是简单地由于apo A-1(无脂类或部分脱脂形式的Fr.28-PBE94)与供体的相互作用，将兔BBMV以1.7mg蛋白/ml与0.46μM人apo A-1或0.59μM fr.28-PBE94一起保温5分钟。4℃下，将分散体在Beckman airfuge中以100000g离心2分钟，除去上清，并将包含兔BBMV沉淀和结合的抑制剂蛋白重新悬浮在等体积的Tris/NaCl中。加入供体SUV，如实施例2所述测定胆固醇的摄取。测定在存在0.46μM人apo A-1或0.59μM fr.28-PBE94时的摄取抑制作为对照。在摄取测定之前暴露于抑制剂蛋白的兔BBMV保留在对照样品中测得的抑制剂活性的30±4％。实施例5：使用混合的胆汁盐微团为供体的甾醇摄取的抑制
由于胆汁盐微团是小肠中最重要的脂类载体，使用混合的胆汁盐微团作为供体测定甾醇摄取抑制是有意义的。如下制备由50mM牛磺胆酸盐，6mM油酸和20μM放射性标记的胆固醇组成的供体微团：将脂类以这些浓度混合在2∶1氯仿：甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂。高真空下将产生的脂膜干燥至少1小时。将干燥的膜分散在适量的Tris/NaCl中以产生所需的微团浓度。将如实施例2所述制备的受体兔BBMV与1.56μM人apo A-1或1.98μM fr.28-PBE94混合。将供体混合微团加入受体/抑制剂分散体中至最终浓度为5mM牛磺胆酸盐，0.6mM油酸和2μM放射性标记的胆固醇中。25℃下，将混合物保温10分钟。通过4℃下，在Beckmanairfuge中以100000g将混合物离心2分钟来终止反应。测定沉淀和上清中的放射活性，如实施例2中所述评价结果。与apo A-1的保温产生在相同的抑制剂浓度下，使用SUV作为供体所测得的抑制活性的12％，与fr.28-PBE94的保温产生在相同的抑制剂浓度下，使用SUV作为供体测得的抑制活性的23％。实施例6：各种天然和变异体脱辅基蛋白质对刷状缘膜油酸胆固醇酯摄取的IC50值。
测定天然(人)脱辅基蛋白质apo A-Ⅰ,apo A-Ⅱ,apo A-Ⅲ,apo A-Ⅳ,apo C-I,apo C-Ⅱ,apoC-Ⅲ1,apo C-Ⅲ2和apo E及变异体脱辅基蛋白质Ac-18A-NH2的IC50值。Ac-18A-NH2为：
Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2并公开在Venkatachalapathi等，蛋白质：结构、功能和遗传学15 349-359(1993)中。
起始时，在Eppendorf试管中将溶解在84.5μl缓冲液(0.05M TrispH7.4,0.15M NaCl)的适宜量的抑制剂与5μl在相同缓冲液溶液中的供体分散体和10.5μl受体分散体(即刷状缘膜小泡(BBMV))混合。供体小泡的最终浓度为0.1mg总脂类/ml，受体的最终浓度为2mg蛋白/ml。25℃下，将产生的混合物保温20分钟，通过将60μl保温物质加入airfuge管中120ul冰冷缓冲液中来停止反应。4℃下，立即在airfuge中以100000g将稀稀的分散体离心2分钟以将BBMV与供体小泡分离。在Beckman LS 7500液体闪烁计数器中计数两份60μl供体(上清)的等分试样以确定留在供体中的放射活性。供体小泡的制备
通过将适量的脂类溶解在CHCl3/CH3OH(2∶1，体积比)中来制备包含1mol％油酸胆固醇酯和痕量的3H-胆固醇油醇醚的小单层卵磷脂酰胆碱(PC)小泡，溶解后在旋转蒸发仪上将溶液蒸发至干，并真空干燥残留物。通过手摇将干燥的脂膜分散在适宜体积的缓冲液中。如Brunner等，生物化学杂志253 7538-7546(1978)所描述，将脂类分散体进行顶端超声破碎。4℃下，在airfuge中以100000g将产生的供体在缓冲液中的分散体离心2分钟。离心后仅供体分散体顶部的80％被用于脂类摄取实验。BBMV分散体的制备
根据Hauser等(生物化学生物物理学杂志602 567-577(1980))，从冷冻的兔小肠制备BBMV。在用于摄取实验测定IC50之前，洗涤BBMV以除去BBM释放的任何游离蛋白。为了此目的，在airfuge中将BBMV分散体用缓冲液以1∶1稀释，4℃下，在airfuge中以100000g将稀释的分散体离心2分钟。小心倒去上清，并将沉淀重新悬浮在缓冲液中至BBMV分散体的最初体积，该分散体是均质的。脱辅基脂蛋白溶液的制备
通过将脱辅基脂蛋白溶解在3M盐酸胍中至约1mg/ml并使用8kDa截留值的透析管将产生的溶液对缓冲液彻底进行透析制得脱辅基脂蛋白在缓冲液中的溶液。
IC50值示于下面表6中。
表6对刷状缘膜的油酸胆固醇酯摄取的IC50值
脱辅基脂蛋白 IC50(μg/mL) IC50(μM)
Apo A-1Apo A-2Apo A-4Apo C-1Apo C-2Apo C-31Apo C-32Apo E 14±366±532±412±219±14.8±0.84.2±0.295±7 0.5±0.13.8±0.30.7±0.11.8±0.42.1±0.10.6±0.10.5±0.12.9±0.2
Ac-18A-NH2      35±2            16±1Ac-D W L K A F Y D K V A E K L K E A F-NH2
实施例7：对Ac-18A-NH2的进一步实验小泡的制备
将20-30mg湿组织的来自人十二指肠的各个活检样品悬浮在200ul缓冲液中(12mM Tris-HCl pH7.2,300mM甘露醇，5mM EGTA,1mM苯甲基磺酰氟)，液氮冷冻并在使用前贮存在-80℃。通过如Booth等(柳叶刀1 1066-1069(1985))中详述的Mg2+沉淀法来制备BBMV。根据Thurnhofer和Hauser(生物化学生物物理学杂志1024 249-262(1990))来进行BBMV的蛋白酶K处理。蛋白酶解处理将蛋白含量和BBMV的蔗糖酶比活性降低约60％。通过顶端超声破碎(Schulthess，生物化学334500-4508(1994))来制备小单层磷脂小泡。动力学实验
根据公开的方法(Compassi，生物化学34 16473-16482(1995)和Tso等，美国生理学杂志241 G487-497(1981))进行动力学实验。
(Ⅰ)室温下保温包含分散在10mM Tris-HCl pH7.2,0.15M NaCl,5mMEDTA中的含1mol％[14C]胆固醇的卵PC小单层小泡和BBMV。规定的时间间隔后，通过在Beckman airfuge中以115000g离心2分钟分离磷脂小泡和BBMV。通过在Beckman LS 7500液体闪烁计数器中计数等分试样来测定存在于沉淀和上清中的放射活性。如在以前研究中详细讨论的(Thurnhofer和Hauser，生物化学29 2142-2148(1990)；Compassi，生物化学34 16473-16482(1995)和Schulthess，脂类研究杂志37 2405-2419(1996))，排除了卵PC单层小泡与BBMV融合作为胆固醇摄取的可能机制。
(Ⅱ)类似地，室温下保温作为供体的包含1mol％[14C]胆固醇的卵PC单层小泡和作为受体的卵PC/卵PA(85∶15，摩尔比)的单层小泡。在规定的时间间隔后，将保温混合物的等分试样通过DEAE Sepharose C1-CB柱过滤，其中该柱保留带负电小泡。洗脱纯卵PC运输小泡并测定它们的放射活性。
结果示于图5中。
使用适用于单指数交换反应如下等式将实验数据进行计算机校正：X=X∞+[Xo-X∞]e-k1[(a+b)/a]t，其中XO,X和X∞分别代表在时间O,t及平衡时在供体中的被标记脂类的级分。K1为反应的准一级反应速率常数，a和b分别为受体和供体的脂类总和(McKay，自然142 997-998(1938)和Mutsch等，生物化学25 2134-2140(1986)。
还在存在抑制剂时进行了动力学测定；将合成肽或脱辅基脂蛋白加入作为供体和受体小泡的抑制剂。在存在递增浓度的Ac-18A-NH2时，测定天然和蛋白酶K处理的BBMV的胆固醇摄取，天然和蛋白酶K处理的BBMV之间的胆固醇摄取的差值为图6中的蛋白介导的胆固醇摄取。根据“酶学方法”37 3-22(1975)测定IC50值。结果
在存在两亲性肽化合物Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-18A-NH2)时，测定人十二指肠BBMV的胆固醇摄取。该肽形成A类的两亲性α-螺旋，并显示出模拟脱辅基脂蛋白A-1(apo A-1)的一些特性(酶学方法128 627-647(1986))。在溶液中以及当与脂类结合时，氨基末端的酰化和羧基末端的酰胺化被显示出增加肽的螺旋性(蛋白质15 349-359(1993))。Ac-18A-NH2有效地完全抑制蛋白介导的胆固醇摄取(图3和4)。将蛋白介导的胆固醇摄取降低50％所需的Ac-18A-NH2的浓度(IC50)经测定为23±1μM(图6)。使用正常无β脂蛋白BBMV观察到类似的抑制(图6)。相反，Ac-18A-NH2对被动胆固醇转运没有抑制效果。在Ac-18A-NH2浓度为60μM时不能被抑制的天然BBMV的残余胆固醇摄取活性是由于被动胆固醇摄取的缘故(图3中的正方形)。它在实验误差内与蛋白酶K处理的BBMV的胆固醇摄取相等，特征在于半数时间为6.7±1.4h。同样，Ac-18A-NH2的无抑制效果可用蛋白酶K处理的BBMV的胆固醇摄取及磷脂小泡之间的胆固醇转移得以说明(表7)。
表A人小肠刷状缘膜运输小泡摄取的[14C]胆固醇及其由Ac-18A-NH2导致的抑制：供体                 受体           胆固醇摄取的半       抑制(0.01mg脂/ml)     (0.25mg脂/ml)        数时间(*)      IC50(**)卵PC小泡          正常人BBMV          1.0±0.2h        23±1μM卵PC小泡          无β脂蛋白BBMV      1.1±0.2h        23±3μM卵PC小泡          蛋白酶K处理的正常   7.4±1.2h        没有抑制
              BBMV卵PC小泡          卵PC/卵PA小泡       7.8±1.6h        没有抑制(*)平均值±4次实验的标准偏差(参见图1)；对于无β脂蛋白BBMV，实验误差是给定的。(**)将蛋白介导的胆固醇摄取降低50％所需的抑制剂浓度。
误差来自剂量应答曲线的拟合(参见图6)。
肽Ac-Asp-Trp-Leu-Ala-Lys-Asp-Tyr-Phe-Lys-Lys-Ala-Leu-VaL-Glu-Glu-Phe-Ala-Lys-NH2无活性的观察支持两亲性α-螺旋是决定抑制的结构基础这一观点。该肽为“杂序Ac-18A-NH2”，指它具有与Ac-18A-NH2相同的氨基酸组成，但其氨基酸序列被随机化以消除该肽的两亲性特征。
体外观察到的抑制作用的生物相关性被体内实验所证实，其中该体内实验表明在Sprague-Dawly大鼠的小肠中的胆固醇摄取可被两亲性结构抑制大于80％。由于Apo A-Ⅰ可从人血清以足够的量纯化，故该蛋白可加入到饮食中用作抑制剂。根据存在的实验证据，我们提出对胆固醇摄取的抑制效果不局限于特定的两亲性分子。可能两亲性化合物的化学性质是次要的，而化合物的几何学和极性是主要的决定因素。这里给出的结果具有重要的意义，因为属于生物化合物任何类型的两亲性分子，如脂类、蛋白质或糖类可能抑制刷状缘膜的胆固醇摄取。实施例8不同长度的两亲性螺旋肽的抑制效果
测定Ac-15A-NH2,Ac-12A-NH2和Ac-9A-NH2的活性(抑制效果)。这些肽的氨基酸序列如下：
Ac-18A-NH2:CH3CO-DWLKAFYDKVAEKLK-EAF-NH2
Ac-15A-NH2:CH3CO-KAFYDKVAEKLKEAF-NH2
Ac-12A-NK2:CH3CO-YDKVAEKLKEAF-NH2
Ac-9A-NH2:CH3CO-VAEKLKEAF-NH2在一个肽和另一个肽之间(从上至下)，从N-末端除去3个氨基酸。比较上面列出的四个肽在120μg肽/ml时的抑制效果。如下所描述，在存在120μg肽/ml时，测定BBMV的脂类摄取。
4℃下，在Beckman airfuge中以115000g将分散在Tirs/NaCl缓冲液中的供体和受体颗粒离心2分钟。供体分散体产生一沉淀，该沉淀被重新悬浮在Tris/NaCl缓冲液中。将溶解在相同缓冲液中的变化量的抑制剂加入受体分散体中，起始时，将含或不含抑制剂的受体分散体与通过离心供体分散体而获得的上清的顶端80％混合。供体的最终浓度为0.05mg总脂类/ml，受体的最终浓度为5mg蛋白/ml。在23℃下，保温所产生的分散体，在规定的时间间隔后，通过将保温物质用2体积Tris/NaCl缓冲液稀释来终止胆固醇的摄取。4℃下，通过在Beckman airfuge中以115000g离心2分钟分离供体和BBMV。在Beckman LS 7500闪烁计数器中测定包含供体的上清和包含BBMV(受体)的沉淀中的放射活性。
结果以抑制百分数来表示，并总结在下面表8中。
表8
序号     肽 油酸胆固醇酯摄取抑制的百分数
    1234 Ac-18A-NH2Ac-15A-NH2Ac-12A-NH2Ac-9A-NH2     10085200
使用1号和2号肽见到了有用的抑制效果。

Claims (53)

1．包含一个或多个两亲性区域的分子在制备用于抑制从肠道摄取胆固醇或其它脂类的药物中的用途。
2．包含一个或多个两亲性区域的分子在制备用于经肠道给药治疗或预防高脂血症，尤其是高胆固醇血症，和/或肥胖的药物中的用途。
3．权利要求1或2所述的用途，其中该分子为具有一个或多个两亲性α-螺旋的肽或蛋白质。
4．权利要求3所述的用途，其中该分子为脱辅基蛋白质。
5．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质A。
6．权利要求5所述的用途，其中脱辅基蛋白质的脱辅基蛋白质A-1。
7．权利要求5所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质A-2。
8．权利要求5所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质A-4。
9．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质B。
10．权利要求9所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质B-48。
11．权利要求9所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质B-100。
12．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质C。
13．权利要求12所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质C-1。
14．权利要求12所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质C-2。
15．权利要求12所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质C-3。
16．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质D。
17．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脱辅基蛋白质E。
18．权利要求3所述的用途，其中分子为天然脱辅基蛋白质的变异体。
19．权利要求3所述的用途，其中该肽或蛋白质包含一个或多个，但少于8个两亲性螺旋。
20．权利要求3,18或19所述的用途，其中该分子包含具有下列序列的一个或多个肽：
A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(Ⅰ)其中A1,A2,A3和A4各有独立地代表天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或类似物；B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8和B9各自独立地代表色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或类似物；C1,C2,C3和C4各自独立地代表赖氨酸或精氨酸；和D代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸或组氨酸，或其同系物或类似物；及其中残基A4,B8和B9为可存在或不存在。
21．权利要求20所述的用途，其中该分子为Ac-18A-NH2或Ac-15A-NH2或其相应的未封闭或用其它方式封闭的形式。
22．权利要求4-17任一项所述的用途，其中脱辅基蛋白质已从天然来源分离。
23．权利要求22所述的用途，其中脱辅基蛋白质已被分离至蛋白质均一性(即意味着不存在其它蛋白质)。
24．权利要求22所述的用途，其中脱辅基蛋白质已被分离至完全均一(即意味着不存在显著量的其它分子)。
25．权利要求3-21任一项所述的用途，其中肽或蛋白质通过重组DNA技术或肽合成法制得。
26．权利要求4所述的用途，其中脱辅基蛋白质为脂蛋白形式。
27．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括乳糜微粒。
28．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括乳糜微粒残余物。
29．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白质包括VLDL。
30．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括IDL。
31．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括LDL。
32．权利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括HDL。
33．权利要求1或2所述的用途，其中该分子包含至少其中一些通过非肽键连接的氨基酸残基。
34．权利要求3所述的用途，其中至少一个氨基酸为D-氨基酸。
35．权利要求1或2所述的用途，其中该分子为或包含一个合成的肽模拟物。
36．权利要求1或2所述的用途，其中该分子包含糖和/或脂部分。
37．一种制剂，包含一个或多个如权利要求1-36任一项所定义的分子和药物学或兽医学可接受的载体，该制剂适于经肠道给药。
38．权利要求37所述的制剂，它为单位剂量形式。
39．权利要求37或38所述的制剂，它适合于口服给药。
40．权利要求37,38或39所述的制剂，它为固体形式。
41．权利要求39或40所述的制剂，它被配制成肠道抗性的。
42．权利要求37所述的制剂，它被配制成适于经直肠给药。
43．权利要求37至42任一项所述的制剂，包括胆固醇生物合成抑制剂。
44．权利要求43所述的制剂，其中胆固醇生物合成抑制剂为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶的抑制剂。
45．权利要求44所述的制剂，其中HMG-CoA还原酶抑制剂为抑制素。
46．权利要求45所述的制剂，其中抑制素为西伐他停。
47．一种在预防或治疗高胆固醇血症，或其它高脂血症和/或预防或治疗肥胖中用于混合、分别或依次给药的包含如权利要求1-36任一项所述分子和胆固醇生物合成抑制剂的产品。
48．权利要求47所述的产品，其中胆固醇生物合成抑制剂为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂。
49．权利要求48所述的产品，其中HMG-CoA还原酶抑制为抑制素。
50．权利要求49所述的产品，其中抑制素为西伐他停。
51．一种治疗或预防高脂血症或高胆固醇血症的方法，该方法包括对病人或个体经肠道给药有效量的包含一个或多个两亲性区域的分子。
52．一种治疗或预防肥胖的方法，该方法包括对病人或个体经肠道给药有效量的包含一个或多个两亲性区域的分子。
53．一种治疗或预防动脉粥样硬化的方法，该方法包括对病人或个体经肠道给药有效量的脱辅基蛋白质。
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