CN121249552B - 一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用，属于生物技术领域；所述枯草芽孢杆菌工程菌命名为ZMBSB H‑1，保藏编号为CCTCC NO:M 20252077；本发明在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基础上敲除基因组spoOA基因与ccpA基因，将ribBA‑ribD突变基因簇整合到spoOA基因位点中，定向改造的purF突变基因整合到ccpA基因位点中，并用强启动子P43表达ribBA‑ribD突变基因簇及purF突变基因，构建得到所述枯草芽孢杆菌工程菌；所述枯草芽孢杆菌工程菌能够以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物高效生产核黄素。

Description

一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用。

背景技术

核黄素（Riboflavin），又称维生素B2，是一种水溶性维生素，在活细胞中虽然不直接参与代谢过程，但它是两种关键辅酶——黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的前体物质。这两种辅酶在多种代谢酶的催化过程中扮演着重要角色，尤其是在氧化还原反应中，它们是电子传递链的必要组成部分。因此，核黄素对维持正常的新陈代谢至关重要，它参与了能量代谢、脂肪酸氧化、氨基酸分解及细胞呼吸等多个生理过程。在自然界中，核黄素广泛存在于植物和微生物中，它们可以通过内源性生物合成途径自主生成。然而，人类和大多数动物则缺乏这种合成能力，必须通过饮食摄取以满足生理需求。

目前，核黄素的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成法其工艺以化学原料为基础，通过多步反应合成核黄素，但存在生产成本较高，尤其是原料和能源消耗大；反应过程中可能产生有害副产物，对环境造成一定污染；工艺复杂，步骤繁琐，生产周期较长等问题。微生物发酵法通过基因工程改造微生物代谢途径直接生产核黄素，具有生产成本低、周期短、环境友好、副产物少等特点，逐渐成为主流生产方式。与化学合成相比，微生物发酵法不仅降低了能耗和原料成本，还减少了有害副产物的生成，符合绿色化学和可持续发展的理念。

随着合成生物学和代谢工程技术的不断进步，微生物合成核黄素的效率和产量持续提升。但现有技术仍存在诸多瓶颈，如发酵过程对菌种遗传稳定性、培养基组成及发酵条件极为敏感，工艺控制难度大，易受杂菌污染，导致生产重现性与规模化稳定性不足等。此外，传统工程菌株在碳源利用效率、前体供应能力及代谢流调控方面仍存在限制，制约了核黄素产量的进一步提升。因此，开发具有高遗传稳定性、强环境适应性与高效合成能力的新型工业化生产菌株，已成为当前核黄素生物制造领域的重要研究方向。

例如申请日为2024年1月15日，公开号为CN117568433A的中国专利公开了一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，所述重组枯草芽孢杆菌具有MribO区域，并以强启动子调控MribO区域；所述强启动子为pJ23119、PtrnQ或TP2，该发明解除了核黄素合成过程中的反馈抑制，使发酵70 h的核黄素效价提高了54.8%。但此发明仅聚焦于基因表达水平的调控，并未对催化核黄素合成的关键酶本身进行定向进化或改造。

申请日为2022年6月30日，公开号为CN114958693A的中国专利公开了一株枯草芽孢杆菌、一种重组枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RF1-6以核黄素高产菌株RF1作为出发菌株，经过基因改造和诱变，筛选得到的核黄素产量最高的突变株，保藏编号为CCTCCNO：M2022565。与核黄素高产菌株RF1相比，核黄素产量能够提高22.8％。此发明采用传统诱变和部分基因改造，虽然产量有提升，但方法随机性高，遗传背景不清晰。

基于上述背景，围绕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）这一重要工业宿主，开展代谢通路重构与关键酶分子改造研究，构建一株能够高效利用廉价碳源、具备稳定遗传背景与优越发酵性能的核黄素高产工程菌，能够为推进核黄素的绿色生物制造提供新的技术方案与菌种资源。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌工程菌能够以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物高效生产核黄素。

本发明的技术方案如下：

本发明的目的之一在于提供一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO: M 20252077，命名为ZMBSB H-1。

进一步地，枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1的保藏信息如下：

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus subtilis

菌株编号：ZMBSB H-1

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2025年09月22日。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌重组工程菌以敲除spoOA 基因和ccpA 基因的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主细胞，在spoOA 基因位点整合ribBA-ribD 突变基因簇，在ccpA 基因位点整合purF 突变基因。

进一步地，所述ribBA-ribD 突变基因簇由ribBA突变基因与ribD突变基因通过柔性linker (GGGGS)₃通过串联而得到。

进一步地，所述柔性linker (GGGGS)₃的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

进一步地，所述ribBA突变基因来源于枯草芽孢杆菌的ribBA 基因第170位氨基酸Met突变成Ala，第271位氨基酸Pro突变成Glu；所述ribBA突变基因核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

进一步地，所述ribD突变基因来源于枯草芽孢杆菌的ribD 基因第152位氨基酸Ala突变成Phe，第209位氨基酸Asn突变成Arg；所述ribD突变基因核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

进一步地，所述purF 突变基因来源于枯草芽孢杆菌的pur 基因F 第67位氨基酸Asn突变成Ala，第295位氨基酸Ser突变成Gln，所述purF 突变基因核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，利用强启动子P43控制所述ribBA -ribD 突变基因簇和purF 突变基因进行表达，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

进一步地，所述生产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1的构建方法包括如下步骤：

S1、以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主细胞，用敲除质粒经过基因重组方式敲除草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组上的spoOA 基因，解除其对相关代谢产物基因的表达影响；

S2、在spoOA 基因位点插入ribBA-ribD 突变基因簇，强启动子 P43构建共同过表达ribBA 与ribD 的核黄素发酵工程菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③；

S3、以工程菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③为底盘细胞，采用基因重组技术敲除菌株ccpA 基因，缓解由葡萄糖引起的CCR效应，进一步提高菌株的核黄素产量；

S4、对嘌呤合成途径中关键酶PRPP 转酰胺酶编码基因purF 进行定向改造，并在ccpA 基因位点用强启动子 P43表达purF 突变体，最终构建所述高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1。

本发明的目的之二在于提供一种枯草芽孢杆菌重组工程菌在以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物高效生产核黄素中的应用。

进一步地，培养所述枯草芽孢杆菌重组工程菌ZMBSB H-1获得种子液，将种子液接种到发酵培养基中，调控发酵过程中pH为6.8-7.2，发酵温度为40±2℃，发酵时间为36-40h，以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物经反馈补料发酵生产获得核黄素。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明首次公开了高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1及其设计思路。首先，利用CRISPR-Cas9技术精准敲除控制芽孢形成的spo0A 基因，解除其对目的代谢产物基因的表达影响，使代谢流向更集中于核黄素合成；其次，针对核黄素合成途径本身，对核黄素操纵子中的基因ribBA与ribD进行突变，并通过柔性连接肽(GGGGS)3将其串联融合，形成ribBA-ribD 突变基因簇从而减少空间位阻提升融合蛋白的功能活性，同时使用强启动子P43将其作为一个整体整合至spo0A 基因位点进行共表达，显著提高核黄素操纵子组成型高表达合成核黄素的效率；最后，本发明为缓解葡萄糖引发的细胞CCR效应，本发明同步敲除了ccpA 基因，使中心代谢更有利于核黄素合成，协同提高菌株的核黄素产量。此外在此位点再次利用P43启动子过表达定向改造的purF 突变基因编码的PRPP 转酰胺酶，优化枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径，增加核黄素前体GTP的供应，从而进一步促进核黄素的产量。

2、本发明所设计的枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1在核黄素发酵生产中展现出显著的应用优势，主要体现在高产率、高效率和高经济性上。如实施例6及图3的发酵曲线所示，该菌株在100升规模化发酵罐中，以成本低廉的葡萄糖和玉米浆干粉为主要底物，通过反馈补料工艺，仅需36小时发酵，核黄素产量即可高达38 g/L，该产量水平证明了其理想的合成能力。同时，相比传统工艺通常需要70小时的发酵周期，所述菌株在36-40小时即可完成，极大地提升了生产效率并降低了能耗。

3、本发明创新的枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1生产核黄素的应用条件简单，发酵过程控制条件温和，pH和温度调控水平容易实现，且溶氧要求相对宽松，有利于工业放大的稳定控制，利用HPLC对发酵液进行的精准检测进一步验证了产物的有效合成与方法的可靠性。本发明所述枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1成功通过系统的遗传改造实现优良的生产性能，具备生产成本低、绿色环保且易于规模化控制的优势，在饲料、医药及食品工业领域拥有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所构建重组质粒pJOE8999 -spoOA::ribBA-ribD的结构示意图；

图2为本发明所构建重组质粒pJOE8999 -ccpA::purF的结构示意图；

图3为本发明所述枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1在100 L发酵罐的发酵曲线图；

图4为本发明实施例中100L所述枯草芽孢杆菌工程菌ZMBSB H-1发酵液中核黄素含量的液相检测图。

具体实施方式

下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中“密码子优化”指利用偏爱密码子并避免利用率低或稀有的密码子而所进行的基因的重新设计。每种生物都表现出某种程度的密码子利用差异或偏爱，那些最频繁利用的即为偏爱密码子。

下述实施例中的未具体说明的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配置等，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)进行。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。

下述实施例中的全基因合成、引物合成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。宿主菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168购自杭州弘赛生物科技有限公司；下述实施例中的出发载体pJOE8999购自上海海吉浩格生物技术有限公司。

表1 下述实施例中的引物序列

下述实施例中所用到培养基配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，固体培养基需加20g/L琼脂粉，121℃高压灭菌20min。

GM培养基：LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇

RM复苏培养基：LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇+0.5mol/L海藻糖

ETM电转液：LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇+0.5mol/L海藻糖+10%甘油

斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，麦芽糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，118℃高压灭菌15min。

一级种子摇瓶培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，麦芽糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0，118℃高压灭菌15min。

二级种子培养基：玉米浆干粉20g/L，白砂糖40g/L，硫酸镁5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾3g/L，酵母提取物5g/L，pH 7.0，121℃高压灭菌25min。

发酵培养基：玉米浆干粉40g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0.5g/L，甜菜碱1.7g/L，磷酸二氢钾0.73g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，酵母提取物50g/L，硫酸锌0.02g/L，pH 7.0，121℃高压灭菌25min。

发酵液核黄素检测方法：吸取发酵液，用0.01mol/L NaOH将发酵液稀释到适当的倍数，用磁力搅拌器进行搅拌，待碱溶解结晶后12000rpm 离心2min，取上清液过0.22 μm的滤膜，用高效液相色谱（HPLC）检测核黄素含量，HPLC的参数如下：流动相为100%甲醇和0.12%乙酸水，两者配比为28：72，流速为1mL/min，紫外检测器，检测波长为269nm，色谱柱为C18，柱温30度，进样量10 μL。

实施例1

本实施例提供重组质粒pJOE8999- spoOA ::ribBA-ribD （原始以及突变基因簇）构建方法，包括以下步骤：

一、突变基因簇ribBA -ribD 突变位点的选择

（1）利用HotSpot Wizard 3 网络服务器将ribBA与ribD蛋白质信息提交到网站中进行计算，从蛋白质工程策略中位于催化口袋和/或通道中的高度可变残基表示的功能热点以及由柔性残基表示的结构灵活性的稳定性热点的结果中分别获得评分较高的前两个可选突变位点，其中ribBA分别有其第60位的Ser突变成Thr，170位的Met突变成Ala，252位的Val突变成Ile，271位的Pro突变成Glu；ribD其第18位的Gly突变成Gro，152位的Ala突变成Phe，209位的Asn突变成Arg，210位的Val突变成Ile；

（2）分别从功能性突变和稳定性突变位点中进行组合构建ribBA -ribD 突变基因簇，由生工合成4个基因，ribBA ：①170位的Met突变成Ala，271位的Pro突变成Glu（SEQ IDNO .6核苷酸序列）②60位的Ser突变成Thr，252位的Val突变成Ile；ribD ：③第152位的Ala突变成Phe，209位的Asn突变成Arg（SEQ ID NO .7核苷酸序列）④18位的Gly突变成Gro，210位的Val突变成Ile，用linker连接获得突变基因簇ribBA-ribD ①③、ribBA-ribD ①④、ribBA-ribD ②③以及ribBA-ribD ②④；

二、质粒pJOE8999 骨架与spoOA -up-p43-ribBA-ribD -spoOA -do片段的连接转化

（1）利用CHOPCHOP网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）设计spoOA 基因的特异性靶点20 bp，使用引物spoOA-sgRNA-F/R以pJOE8999质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶DpnI酶切消除模板，按照无缝连接试剂盒（诺微赞）说明书进行同源重组反应转化DH5α感受态细胞，构建敲除质pJOE8999- spoOA ；

（2）以pJOE8999- spoOA 质粒为模板，使用引物JOE-F/R进行PCR扩增获得同源重组线性化载体片段，用天根胶回收试剂盒回收对应的载体骨架片段；

（3）LB液体培养基37℃，220rpm培养Bacillus subtilis 168，用天根细菌基因组提取试剂盒提取Bacillus subtilis 168基因组，以基因组为模板，使用引物spoOA-up-F/R、spoOA-d-F/R扩增spoOA 基因上下游500bp DNA片段，对pcr产物跑核酸电泳并切胶回收spoOA-up与spoOA-d两个DNA片段；

（4）以Bacillus subtilis 168基因组以及上海生工生物分别合成突变的ribBA 与ribD 基因为模板，使用引物ribBA-F/ribBA-linker-R、ribD-linker-F/ribD-R扩增并并用试剂盒回收含有linker并与启动子P43、spoOA-d两个DNA片段进行同源重组的ribBA-linker、ribD-linker片段；

（5）使用引物P43-BAD-F/R，以实验室保存的pP43NMK载体为模板进行PCR扩增，获得含有spoOA 基因上游同源臂的P43启动子DNA片段；

（6）将pJOE8999骨架片段与spoOA-up、P43、ribBA-linker、ribD-linker和spoOA-d片段按照无缝连接试剂盒（诺微赞）说明书进行同源重组反应；取重组产物加入到100µL E.coli DH5α 感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上放置30min，42℃水浴热激45s后，立即置于冰上2min，加入500µL液体培养基，37℃震荡培养1h；培养结束后取100µL培养菌液用涂布板在Kan抗性板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12h，挑取单菌落进行菌落PCR进行验证后送往生工进行测序；选取测序正确的菌进行液体摇管过夜培养，用质粒提取试剂盒（天根）提取质粒，得到重组质粒pJOE8999 - spoOA ::ribBA-ribD （原始以及突变基因簇）共5个质粒。

实施例2

本实施例提供枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组spoOA 基因的敲除与ribBA-ribD （原始以及突变基因簇）的共表达方法，包括以下步骤：

一、Bacillus subtilis 168感受态细胞的制备与质粒转化

（1）将-80℃保存的菌株在LB平板划线活化，37℃培养箱培养；

（2）从LB平板上挑取单菌落接种于5mL LB试管，37℃，220rpm培养过夜；

（3）按5%的接种量接种于50mL GM培养基，培养至对数期；

（4）将菌液冰浴30min，用冷冻离心机4℃，4000rpm，10min收集菌体；

（5）分别用预冷的去离子水与ETM先后洗涤菌体两次；

（6）用500uL的ETM重悬菌体，每管50uL进行分装；

（7）50uL感受态中加入1ug pJOE8999 - spoOA ::ribBA-ribD （原始以及突变基因簇）质粒轻轻混匀，转移至预冷的2mm间距电极杯中，冰浴5min；

（8）擦拭电击杯表面水分，设置电转仪参数：2.5kv，200Ω，25uF，电击5ms；

（9）电击结束后，立即加入1mL RM培养基，37℃，150rpm，培养3h，取菌液涂布于含有0.2%甘露糖，5ug/mL 卡那抗性LB平板上，30℃培养箱中倒置培养约2天；

二、spoOA 基因的敲除与ribBA-ribD 突变基因簇的共表达验证

（1）从LB平板上挑取单菌落到10uL的去离子水中，95℃裂解5-10min；

（2）使用交叉引物spoOA-up-F/spoOA-d-R；P43-BAD-F/ribD-R，取以上菌裂解液1uL做为模板，Bacillus subtilis 168基因组为对照模板进行菌落PCR进行DNA扩增；

（3）PCR产物进行电泳初步验证，对条带大小符合的单菌落接种到LB试管中进行过夜培养；

（4）取适量的菌液按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取其基因组，以基因组为模板，再次使用交叉引物进行验证；

（5）电泳验证完毕后将PCR产物送往生工生物进行测序，测序正确的菌株即为spoOA 基因已敲除且ribBA-ribD 基因簇（原始以及突变基因簇）共表达枯草芽孢杆菌工程菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA- ribD、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①④、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ②③以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA- ribD ②④；

三、 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD （原始以及突变基因簇）菌株中质粒的消除

（1）pJOE8999含有来自pE194ts的温度敏感复制起点，在较高温度下复制能力显著降低，导致质粒无法稳定维持；

（2）将Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD 、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①④、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ②③以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ②④菌株分别划线到未含抗性的LB平板中，50℃条件下在培养箱进行过夜培养；

（3）将平板上的单菌落再次点板到无抗性的LB平板上，42℃条件下在培养箱进行过夜培养；

（4）从平板上挑取单菌落平行划线于Kan平板以及无抗性平板上，无抗性平板上有生长对应Kan平板无生长的菌株即为已消除质粒。

实施例3

本实施例提供重组产核黄素枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168spoOA::ribBA- ribD（原始以及突变基因簇）工程菌株筛选方法，包括以下步骤：

（1）将Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD 、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①④、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ②③以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ②④ 5株重组枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基，37℃培养过夜，用7mL无菌水重悬菌体，然后以2％的接种量接种到含有50mL发酵摇瓶培养基中，37℃，180rpm培养16h；

（2）吸取发酵液1mL，用0.01mol/L NaOH将发酵液稀释到适当的倍数，用磁力搅拌器进行搅拌，待碱溶解结晶后12000rpm 离心2min，取上清液过0.22 μm的滤膜，用高效液相色谱（HPLC）检测核黄素含量，HPLC的参数如下：流动相为100%甲醇和0.12%乙酸水，两者配比为28：72，流速为1mL/min，紫外检测器，检测波长为269nm，色谱柱为C18，柱温30度，进样量10 μL，摇瓶结果见表2。

表2 重组产核黄素枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168spoOA::ribBA-ribD（原始以及突变基因簇）工程菌株摇瓶发酵16 h后的核黄素含量

实施例4

本实施例提供重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ccpA ::purF （原始以及突变基因）的构建方法，包括以下步骤：

一、purF 突变基因位点的预测

（1）利用HotSpot Wizard 3 网络服务器将purF蛋白质信息提交到网站中进行计算，从蛋白质工程策略中位于催化口袋和/或通道中的高度可变残基表示的功能热点以及由柔性残基表示的结构灵活性的稳定性热点的结果中分别获得评分较高的前两个可选突变位点，purF其第30位的Gly突变成Ser，67位的Asn突变成Ala，295位的Ser突变成Gln，385位的Ser突变成Ala；

（2）从功能性和稳定性突变出发，分别由生工合成2个基因，purF ：⑤67位的Asn突变成Ala，295位的Ser突变成Gln（核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示）⑥30位的Gly突变成Ser，385位的Ser突变成Ala；

二、Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③感受态细胞的制备与质粒转化

（1）根据实施例1的方法用对应的引物构建重组质粒pJOE8999- ccpA ::purF （原始以及突变基因）；

（2）将-80℃保存的菌株LB平板划线活化，37℃培养箱培养；

（3）从LB平板上挑取单菌落接种于5mL LB试管，37℃，220rpm培养过夜；

（4）按5%的接种量接种于50mL GM培养基，培养至对数期；

（5）将菌液冰浴30min，用冷冻离心机4℃，4000rpm，10min收集菌体；

（6）分别用预冷的去离子水与ETM先后洗涤菌体两次；

（7）用500uL的ETM重悬菌体，每管50uL进行分装；

（8）50uL感受态中加入1ug pJOE8999- ccpA ::purF 质粒轻轻混匀，转移至预冷的2mm间距电极杯中，冰浴5min；

（9）擦拭电击杯表面水分，设置电转仪参数：2.5kv，200Ω，25uF，电击5ms；

（10）电击结束后，立即加入1mL RM培养基，37℃，150rpm，培养3h，取菌液涂布于0.2%甘露糖，5ug/mL Kan抗性LB平板上，30℃培养箱中倒置培养；

三、ccpA 基因的敲除与purF （原始以及突变）基因的定点插入；

（1）从LB平板上挑取单菌落到10uL的去离子水中，95℃裂解5-10 min；

（2）使用交叉引物ccpA -up-F/ccpA -d-R；P43-purF-F/purF-R，取以上菌裂解液1uL做为模板，Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③基因组为对照模板进行菌落PCR进行DNA扩增；

（3）PCR产物进行电泳初步验证，对条带大小符合的单菌落接种到LB试管中进行过夜培养；

（4）取适量的菌液按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取其基因组，以基因组为模板，再次使用交叉引物进行验证；

（5）电泳验证完毕后将PCR产物送往生工生物进行测序，测序正确的菌株即为ccpA 基因已敲除且purF 突变基因过表达的枯草芽孢杆菌工程菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ，Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA- ribD ①③ ccpA ::purF ⑤以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑥；

四、重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF （原始以及突变基因）工程菌株中质粒的消除

（1）将Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ，Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑤以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑥菌株划线到未含抗性的LB平板中，50℃条件下在培养箱进行过夜培养；

（2）将平板上的单菌落再次点板到无抗性的LB平板上，42℃条件下在培养箱进行过夜培养；

（3）从平板上挑取单菌落平行划线于kan平板以及无抗性平板上，无抗性平板上有生长对应kan平板无生长的菌株即为已消除质粒。

实施例5

本实施例提供重组高产核黄素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ，Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑤以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑥菌株筛选方法，包括以下步骤：

按照实施例3将Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ，Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑤以及Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑥3株重组枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基，37℃培养过夜，用7mL无菌水重悬菌体，然后以2％的接种量接种到含有50mL发酵摇瓶培养基中，37℃，180rpm培养16h，摇瓶结果见表3。

表3Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF （原始以及突变基因）摇瓶发酵16 h后的核黄素含量

将筛选得到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168 spoOA ::ribBA-ribD ①③ ccpA ::purF ⑤命名为ZMBSB H-1。

ZMBSB H-1于2025年09月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 20252077，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

实施例6

本实施例提供枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1的100 L发酵罐发酵生产核黄素的方法，包括以下步骤：

一、枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1斜面和一级种子摇瓶培养

将枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1单克隆接种于斜面培养基，37℃培养过夜，用7mL无菌水重悬菌体，然后以2％的接种量接种到装有种子摇瓶培养基的种子摇瓶中，37℃，180rpm培养7-16h，得到一级种子液；

二、枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1二级级种子液培养

将一级种子液以8％的移种量接入装有二级种子培养基的3L发酵罐中，控制罐压0.05MPa，溶氧（DO）≥20%，37±0.5℃培养13h，核黄素效价800~1200，得到二级种子液；

三、枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1在100 L发酵罐中发酵生产核黄素

将二级种子液以10％的移种量接入装有发酵培养基的100 L（装液量30L）发酵罐中，40℃±2℃培养，罐压0.05~0.07MPa，通过调节转速和通气量维持DO≥20%。持续监测OD₆₀₀和残糖含量，由发酵罐自动补加600g/L的葡萄糖水溶液，使得发酵体系的葡萄糖含量保持在5g/L-12g/L之间，发酵过程的pH控制在6.8-7.2，发酵过程曲线如图3所示；

四、枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1在100 L发酵罐生产核黄素含量检测

每隔4小时对发酵罐进行取样，用0.01mol/L NaOH将发酵液稀释到适当的倍数，用磁力搅拌器进行搅拌，待碱溶解结晶后12000rpm 离心2min，取上清液过0.22 μm的滤膜，根据核黄素液相检测方法检测发酵稀释液中核黄素含量，液相结果如图4所示。枯草芽孢杆菌ZMBSB H-1在100 L发酵罐中发酵36 h可达38 g/L。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重组工程菌，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO: M 20252077，命名为ZMBSB H-1。

2.根据权利要求1所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌重组工程菌以敲除spoOA基因和ccpA基因的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主细胞，在spoOA基因位点整合ribBA-ribD突变基因簇，在ccpA基因位点整合purF突变基因。

3.根据权利要求2所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述ribBA-ribD突变基因簇由ribBA突变基因与ribD突变基因通过柔性linker (GGGGS)₃通过串联而得到。

4.根据权利要求3所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述柔性linker (GGGGS)₃的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

5. 根据权利要求3所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述ribBA突变基因来源于枯草芽孢杆菌的ribBA基因第170位氨基酸Met突变成Ala，第271位氨基酸Pro突变成Glu；所述ribBA突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

6.根据权利要求3所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述ribD突变基因来源于枯草芽孢杆菌的ribD基因第152位氨基酸Ala突变成Phe，第209位氨基酸Asn突变成Arg；所述ribD突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

7.根据权利要求2所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，所述purF突变基因来源于枯草芽孢杆菌的pur基因F第67位氨基酸Asn突变成Ala，第295位氨基酸Ser突变成Gln，所述purF突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8. 根据权利要求2所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌，其特征在于，利用强启动子P43控制所述ribBA-ribD突变基因簇和purF突变基因进行表达，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

9.一种根据权利要求1至8任一所述生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌在以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物生产核黄素中的应用。

10. 根据权利要求9所述一种生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组工程菌的应用，其特征在于，培养所述枯草芽孢杆菌重组工程菌ZMBSB H-1获得种子液，将种子液接种到发酵培养基中，调控发酵过程中pH为6.8-7.2，发酵温度为40±2℃，发酵时间为36-40 h，以葡萄糖、玉米浆干粉和酵母提取物为底物经反馈补料发酵生产获得核黄素。