CN1196931A - 牛疱疹病毒1型亚单位疫苗的基于含水溶剂的胶囊化 - Google Patents

Abstract

本文公开了得自牛疱疹病毒－1(BHV－1)的微胶囊化的亚单位组分。本文也公开了利用该组分接种牛物种成员的疫苗、试剂盒和方法。

Description

牛疱疹病毒1型亚单位疫苗的基于含水溶剂的胶囊化

本发明涉及微胶囊化的疫苗。更具体地说，本发明涉及新的微胶囊，其具有胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜以及被该盐膜包裹的免疫原性组合物。所说的微胶囊通过含水介质中路易斯酸和碱壁-形成反应物的界面反应制备。更具体地说，本发明涉及如此胶囊化的牛疱疹病毒-1(BHV-1)的亚单位组分。

微胶囊化是一种可以将比较薄的包衣运用于固体小微粒悬液或液体小滴的方法，其提供将液体转化成固体，改变胶体和表面性质，提供环境保护，并且控制所包覆的材料的释放特征或可利用度的一种手段。一些这样的性质可以用微包装技术达到；然而，微胶囊化作用的独特性在于所包覆微粒最小性和它们尔后的用途以及地各种剂量形式与产物应用的适应性。因此，在工业规模上用于产生微胶囊的已知的可行的方法经常包括利用有机溶剂。然而，对有机溶剂的利用可能存在环境和安全问题。此外，经常困难的是从微胶囊除去所有有机溶剂以去掉有机污染物。

已经提出了利用微胶囊作为传送疫苗的一种手段。已研究了两种广泛类型的抗原送递系统提高免疫性的能力：固体(或)多孔微胶囊和具有由物理上明显的壁包裹的核心区的微胶囊。固体微胶囊可以由各种方法制备，包括胶体凝聚(Kwok，K.K.等，1991，药物研究.8：341-344)，物理方法(例如，物理分离)(Santiago，N.等，1993，药学研究.10：1243-1247)，或化学试剂(例如，酸氯化物)(Levy，M.C.等，1991，药学会杂志80：578-585.)，或用聚酯薄膜包裹含水分散体的溶剂蒸发技术(Singh，M.等，1991，药学研究。8：958-961)沉淀蛋白质。表现出对抗原送递有用的壁/核系统包括脂质体(Gerlier，D.等，1983，免疫学杂志.131：490)，ISCOMS(Claassen，I.，和Osterhaus，A.，1992，免疫学研究.143：531-541)和蛋白体(Gould-Fogerite，S.，和Mannino，R.，1992，脂质体技术，Vol.III，Gregoriadis，G.(编者)，CRC出版社，Boca Raton，FL.；Miller，M.D.等，1992，J..Exp.Med.176：1739-1744)。

或许充分研究的抗原送递系统是来源于乳酸和乙醇酸的线型聚合酯(即聚(DL-环二酯-共-glycol ide))(PLCG)的哪些(Edelman，R.等，1993，疫苗11：-155-158；Eldridge，J.H.等，1989，Curr.Top.微生物学免疫学.146：59-66；Eldridge，J.H.等，1990，控制释放杂志11：205-214；Eldridge，J.H.等，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251：191-202；Eldridge，J.H.等，1991，分子免疫学28：287-294；Eldridge，J.H.等，1991，感染免疫学.59：2978-2986；Marx，P.A.等，1993，科学260：1323-1327；Moldoveanu，Z.等，1993，传染病学杂志.167：84-90；O′Hagan，D.T.等，1993，疫苗11：149-154；O′Hagan，D.T.等，1991，免疫学73：239-242；Ray，R.等，1993，传染病学杂志.167：752-755；Reid，R.等，1993，免疫学杂志.150：323A；Reid，R.H.等，1993，疫苗，11：159-167)。推定的抗原胶囊化进PLCG微胶囊提供一些益处。首先，微胶囊容易由水解降解形成乳酸和乙醇酸。第二，大小不到51μm的PLCG微胶囊在小鼠口头接种之后容易穿透Peyer′s片，肠系膜淋巴结以及脾。第三，用PLCG微胶囊化的抗原(包括流感病毒，副流感病毒，猿免疫缺损病毒，金黄色葡萄球菌肠毒素B类毒素以及卵白蛋白)口头，腹膜内，鼻内或皮下接种小鼠诱导出较在用相同剂量的病毒或蛋白质接种的动物中所诱导的免疫反应更强的免疫反应。此外，用灭活的病毒口头接种小鼠在粘膜表面诱导增强的抗原-特异性IgA反应。最后，PLCG微胶囊已口头施用于成年志愿者，没有副作用。

PLCG微胶囊的主要缺点是需要使用有机溶剂。与有机溶剂的接触将灭活病毒和细菌病原体的感染性，此外，其可以改变对诱导体液或细胞免疫反应关键的表面蛋白质的免疫原性。事实上，大量的病毒蛋白质对用PLCG微胶囊诱导抗原-特异性免疫反应是需要的。

在美国专利3,137,631；美国专利4,205,060；美国专利4,606,940；美国专利3,959,457和美国专利5,132,117中一般性地公开了微胶囊化技术。此外，在Lim的比利时专利882,476(1980)；美国专利4,744,933；和Dautzenberg等的英国专利申请2135954(1984)中也教导了微胶囊化技术。然而，这些技术存在弊端，包括使用有机溶剂或热，这些可能导致抗原的灭活或变性。更具体地说，用于以胶囊化的形式(例如，PtGA′s蜗形物，脂质体)制备免疫原(如疫苗)的大多数方法需要多个常常苛刻的加工步骤，例如，引入表面活性剂，由不同的表面能产生液/液界面，分散在反应性有机液态相中，在乳化和/或涡旋期间的机械剪切，为了除去一种或多种易挥发组分的加热。几个加工步骤的各个可以对用于胶囊化的免疫原起始量的部分或全部的功能完整性有不利的影响。在起始荷载的免疫原的某些组分的功能完整性上的这一降低由所形成的配方的降低的稳定性和免疫原性(与胶囊化所追求的所需的免疫反应增强相反)所证明。对低免疫原性的病原体而言，采用多个苛刻的加工步骤所付出的代价可以抵销由采用本领域已知的技术胶囊化所产生的任何益处。相反，国际出版物WO95/28227描述了利用所有含水系统的微胶囊化技术。这一技术基于形成可溶性差的聚阴离子微胶囊(胺)盐。利用这一技术，免疫原性组合物利用试剂的完全的含水系统在室温下胶囊化，而不需要高压。这一方法能够在十分温和的条件下产生均一大小的微粒，可以用于从用于疫苗的传染性病原体微胶囊化免疫原性组合物。

利用以上描述的全含水系统胶囊化的特定兴趣传染性病原体是牛疱疹病毒-1(BHV-1)，也被称为传染性牛rhinotracheitis病毒。BHV-1是α疱疹病毒亚科亚族的成员，其在牛中引起各种临床形式的疾病，包括呼吸和生殖感染，结膜炎，脑炎以及流产。在控制BHV-1感染上，以前的尝试已利用疫苗，包括活的减毒的病毒(Gerber，J.D.等，1978，Am.J.Vet.Res.39：753-760；MitcheIt，D.，1974，Can.Vet.Jour.15：148-151)，灭活的病毒(Frerichs，G.N.等，1982，Vet.Rec.111：116-122)和病毒亚单位，如三种主要BHV-1糖蛋白之一，本领域已将这些糖蛋白命名为gI，gIII和gIV(Babiuk，L.A.等，1987，病毒学159：57-66；van Drunen，S.，ef al.，1993，疫苗11：25-35)。此外，BEV-1重组的截短的形式(本领域命名为BHV-1 tgIV)诱导针对BHV-1的粘膜免疫性的能力已有阐述(van Drunen，S.等，1994，疫苗，12：1295-1302)。然而，针对BHV-1 tgIV的免疫反应性是低的，需要施用大量的免疫原(这可能在商业上是不实际的)或添加有效的佐剂(这可以依次诱导不受欢迎的注射部位反应)。总体上看BHV-1亚单位组分(特别是BHV-1 tgIV)的免疫原性是否可以由微胶囊化明显增强是未知的。

本发明提供了稳定的微胶囊，其具有含水核并包含含有BHV-1亚单位组分的免疫原性组合物。本发明的微胶囊按照基于国际出版物WO95/28227(本文一并参考其全文)中所描述的那些方法产生。这些微胶囊实质上没有非水污染物。本发明进一步提供了制备这种微胶囊的高效方法。

在第一个方面，本发明提供了一种微胶囊，其含有胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，在一个优选的实施方案中，所选择的阴离子聚合物是藻酸(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如藻酸钠)，并且所选择的胺是精胺(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如，精胺盐酸盐)。

所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗BHV-1的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。在一个优选的实施方案中，微胶囊的免疫原性组合物的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白(如，gI、gII、gIII和gIV)或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，微胶囊的免疫原性组合物包含截短的BHV-1糖蛋白，如BHV-1 tgIV(本文命名为BHV-1-gD)。在一个更加优选的实施方案中，微胶囊的免疫原性组合物是BHV-1-gD。

在第二方面，本发明提供了一种增加BHV-1亚单位组分的免疫原性的方法，该方法包括用一种微胶囊胶囊化所说的BHV-1亚单位组分，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜，其实质上是无非水污染物的，其所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，在一个优选的实施方案中，所选择的阴离子聚合物是藻酸(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如藻酸钠)，并且所选择的胺是精胺(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如，精胺盐酸盐)。

在一个优选的实施方案中，BHV-1亚单位组分包含BHV-1糖蛋白(如gI、gII、gIII和gIV)或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，BHV-1亚单位组分包含截短的BHV-1糖蛋白，如，BHV-1-gD。在一个更加优选的实施方案中，所述方法的BHV-1亚单位组分是BHV-1-gD。

在第三方面，本发明提供了一种针对BHV-1免疫牛物种成员的疫苗，该疫苗包含免疫原性量的本发明的微胶囊。该疫苗还可以包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂和可有可无的佐剂。

在第四个方面，本发明提供了一种针对BHV-1接种牛物种成员的方法，该方法包括对所说的动物施用包含免疫原性量的本发明的微胶囊的疫苗。

在第五个方面，本发明提供了一种用于针对BHV-1接种牛物种成员的试剂盒，该试剂盒包括第一个容器和第二容器，所说的第一容器包含免疫原性量的本发明的微胶囊，第二容器包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂。可以也可以不以冻干形式供给试剂盒的微胶囊。试剂盒也可以包含或不包含佐剂。

在第六个方面，本发明提供了一种用于针对BHV-1保护牛物种成员或者还进一步地针对其他疾病或病理状态保护牛物种成员的组合疫苗，该疫苗包含免疫原性量的本发明的微胶囊、免疫原性量的能够诱导抗牛物种成员之疾病或病理状态的保护性反应的第二免疫原性组合物。该组合疫苗还可以包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂和可有可无的佐剂。

图1A，图1B和图1C是编码BHV-1糖蛋白IV(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列，以及它的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。BHV-1-gD(即，tgIV)从氨基酸残基19延伸至残基355。

图2显示形成按照本发明的不溶性盐的胺/聚合物组合，加号(+)标记表示当反应物组合在一起时形成沉淀。零(0)表示没有沉淀形成。

图3显示形成按照本发明的稳定的微胶囊的胺/聚合物。加号(+)标记表示当反应物组合在一起时形成微胶囊。零(0)表示它们不形成。

图4是在优选的方法中用于制造本发明的微胶囊材料的装置的示意性侧面图。

申请人已令人惊奇地发现BHV-1亚单位组分的免疫原性由微胶囊化作用戏剧性地增加。具体地说，申请人已发现，与未胶囊化的对照相比，BHV-1gIV糖蛋白截短形式的精胺-藻酸盐的微胶囊化作用导致很好地增加免疫原性。虽然微胶囊化作用以前已被证明提高其它免疫原的免疫原性，但以前没有报告合理地预言这一BHV-1亚单位组分的免疫原性的可观察的程度的增加从胶囊化形成，如以下所例证的。

因此，本发明提供了一种微胶囊，其含有胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗BHV-1的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。

本发明包括利用任何水溶性阴离子聚合物与任何水溶性胺的组合体，或任何水溶性阴离子聚合物的中性盐与任何水溶性胺的中性盐的组合体，其中组合体反应形成稳定的微胶囊，其可以胶囊化并且提高本发明的免疫原性组合物的免疫原性。

在一个优选的实施方案中，所选择的水溶性阴离子聚合物是藻酸，所选择的水溶性胺是精胺。本发明的免疫原性组合物的胶囊化可以通过直接利用藻酸和精胺进行或，优选地，通过利用藻酸的相应的水溶性中性盐和精胺的相应的水溶性中性盐进行。这样的藻酸和精胺的中性盐包括本领域已知的任何中性盐。在一个优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物的胶囊化通过以精胺中性盐酸盐与藻酸的中性钠盐反应进行。

在一个更优选实施方案中，微胶囊的免疫原性组合物的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白(如，gI、gII、gIII和gIV)或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，微胶囊的免疫原性组合物包含截短的BHV-1糖蛋白，如，BHV-1-gD。在一个更加优选的实施方案中，微胶囊的免疫原性组分是BHV-1-gD。

本发明进一步提供了增加BHV-1亚单位组分的免疫原性的方法，该方法包括用一种微胶囊胶囊化所说的BHV-1亚单位组分，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜，其实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，在一个优选的实施方案中，所选择的阴离子聚合物是藻酸(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如藻酸钠)，并且所选择的胺是精胺(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如，精胺盐酸盐)。

在一个更优选的实施方案中，所说方法的BHV-1亚单位组分包含BHV-1糖蛋白(如，gI、gII、gIII和gIV)或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，BHV-1亚单位组分包含截短的BHV-1糖蛋白，如，BHV-1-gD。在一个更加优选的实施方案中，所说方法的BHV-1亚单位组分是BHV-1-gD。免疫原性组合物：

如本文所使用的，＂BHV-1亚单位组分＂指包含BHV-1外壳或包膜的任何结构组分(肽，蛋白质，糖蛋白，多糖，脂蛋白等)，或其任何片段或衍生物，或编码所说的结构组分或其片段的任何核酸聚合物(DNA或RNA)，其在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够直接或间接诱导抗BHV-1的保护性反应。所说的亚单位组分可以以非糖基化的形式使用，或者可以是部分或全部糖基化的，或者与它的天然形式比较具有不同的糖基化形式。

可以按照已知技术从受传染的动物的组织或器官分离BHV-1，并且以敏感的细胞培养繁殖，参见，例如，von Drunen，1994，同上。此外，BHV-1可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。例如，ATCC列出了几个BHV-1菌株其中包括具有ATCC保藏号VR-631，VR-793，VR-2112以及VR-864的菌株。

BHV-1的各种不同的亚单位组分(包括它们的氨基酸序列和编码它们的核苷酸序列)在本领域是已知的。例如，Babiuk等的美国专利5,151,267公开了BHV-1 gI、gIII和gIV的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。也参见Babiuk等的美国专利5,585,264。此外，Batt等的美国专利5,545,523公开了在BHV-I gI和gIV基因序列的扩增中有用的BHV-1-特异性寡核苷酸。此外，从病毒-感染细胞培养物纯化BHV-1糖蛋白的方法已有描述(Babiuk，L.A.等，1987，同上)。这些专利与出版物本文一并参考。

van Drunen等(1994，同上)描述了BHV-1 tgIV(即BHV-1-gD)的产生方法，这是gIV糖蛋白的截短的形式。BHV-1-gD在转染的Madin Darby牛肾(MDBK)细胞中产生。MDBK细胞由ATCC提供(ATCC保藏号CCL22)。编码完整的BHV-1 gIV糖蛋白(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列与其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)在Babiuk等的美国专利5,151,267中和在Tikoo，S.K.等，1990，病毒学杂志，64：5132-5142中公开，并且在本文图1中显示。BHV-1-gD是BHV-1 gIV的部分，并且由337个氨基酸组成，在gIV的19位氨基酸残基(Leu)开始，以355位氨基酸残基(Pro)结束。

用于在所要求的发明中的BHV-1-gD或其它BHV-1亚单位组分的产生可以按照以上引用的参考文献所描述的重组技术或者如本领域中更一般性地描述的方法进行，参见，例如，Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.；Ausubel等，分子生物学的当前进展，Greene出版社和Wiley Interscience，N.Y.；Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.；和Innis等(编者)，PCR策略，学院的出版公司，SanDiego。所有以上引用的参考文献一并以其整体被本文参考。

对BHV-1亚单位组分的片段和衍生物的利用也在本发明的范围之内，其中这样的片段和衍生物当以按照本发明的胶囊化形式施用时能够诱导抗BHV-1的保护性反应。这样的免疫原性片段和衍生物可以用本领域已知的各种方法产生。导致它们产生的操作可以在基因水平或蛋白质水平上或者在这两种水平上进行。在基因水平，例如，编码BHV-1亚单位组分的克隆DNA分子可以经任何几种已知的策略体外修饰。参见，例如，Maniatis等，1989，同上；Ausubel等，1989，同上；同时Sambrook等，1989，同上。这样的修饰包括但不限于内切核酸酶消化，产生或消除翻译，起始，和/或终止序列的突变，或在编码区中产生变体，或它们的任何组合，由此。可以利用任何本领域已知的诱变技术，包括但不限于向诱变剂暴露，如辐射或化学诱变剂，或体外定点诱变(参见，例如，Hutchinson等，1978，生物化学杂志，253：6551)。

由于基因水平上的改变，与天然分子比较，所表达的多肽可以具有改变，例如，氨基酸的缺失，添加或取代，这种改变可以导致一种或多种序列内的沉默变化，产生免疫原性变体。例如，天然多肽的一个或多个氨基酸可以由类似电荷、大小或极性的氨基酸残基保守取代，所形成的多肽保留其免疫原性。进行这种取代的规则是本领域已知的，包括，例如，由Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，华盛顿，D.C.，Vol.5，Sup.3描述的那些。

BHV-1亚单位组分的操作也可以在蛋白质水平上进行。许多化学修饰的任何一种都可以通过已知技术进行，包括但不限于：用对应的D-氨基酸，氨基酸类似物，或氨基酸模拟物取代天然BHV-1亚单位组分的一种或多种的L-氨基酸，以产生，例如，肼基甲酸(carbazates)或第三(tertiary)中心；或特定的化学修饰，例如，用溴化氰胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH₄，乙酰化，甲酰化，氧化，还原，或者在衣霉素存在下代谢合成等。

BHV-1亚单位组分或其片段可以经一种或多种类型的其化学基团(包括但不限于乙酰基基团，糖基基团，脂类以及磷酸基)的缀合衍生而来，或者利用已知的技术通过缀合到其它BHV-1亚单位组分，其它蛋白质，多氨基酸(例如，聚赖氨酸)，多糖(例如，琼脂糖凝胶，琼脂糖或纤维素)，血清白蛋白，锁眼帽贝血青蛋白或市售的活化的BSA等上衍生而来。这样的缀合优选地是经在多肽的氨基酸侧链和/或在N-端或C-端上的共价键连接。用于进行这样的缀合反应的方法在蛋白质化学领域中是已知的。

在实施所要求的发明中有用的衍生物也包括这样一些，其中水溶性聚合物(如，聚乙烯乙二醇)连结到BHV-1亚单位组分及其片段或衍生物上，以便在保持(至少部分地)胶囊化的亚单位组分的免疫原性的同时，提供附加的理想性质。这些附加的理想性质包括，例如，增加的在水溶液中的溶解性，增加的存储稳定性，增加对蛋白水解降解的抗性，和增加的体内半寿期。缀合到BHV-1亚单位组分上合适的水溶性聚合物包括聚乙烯乙二醇均聚物，聚丙烯乙二醇均聚物，乙烯乙二醇与丙烯乙二醇的共聚物，聚氧乙基化多元醇等，制造蛋白质的水溶性聚合物缀合物的方法是本领域已知的，并且在美国专利4,179,337；美国专利4,609,546；美国专利4,261,973；美国专利4,055,645；和美国专利4,415,665等中有描述，这些专利文献本文一并参考。

在实施所要求的发明中有用的BHV-1亚单位组分的片段和衍生物是当以按照本发明的胶囊化的形式施用时在牛物种成员中能够诱导抗BHV-1的保护性反应的那些。这样的片段和衍生物一旦制备后，就可以仅仅利用本领域已知的常规方法筛选。例如，可以制备试验片段或衍生物，并按照本文的描述胶囊化，施用到牛物种成员中，并且通过例如试验血清中病毒中和抗体的存在，或者接种过的动物抵抗尔后BHV-1攻击的能力试验动物血清转化。这样的用于施用和筛选的方法是本领域所知的。免疫原的微胶囊化：

本发明的路易斯成壁盐含水-核微胶囊按如下所述制备。胶囊膜是离子性稳定化的各向异性路易斯盐膜。胶囊化系统使用阴离子聚合物的水溶液的含免疫原性的小滴和低分子量阳离子胺反应物之间或它们的水溶性盐之间的本来的即时反应，以形成包裹在小滴和免疫原性组合物周围的水不溶性膜。

将免疫原性组合物的水溶液或悬浮液溶解或悬浮在合适的聚阴离子大分子(即，聚合物，例如，藻酸)的水溶液中。然后将所形成的溶液/悬液逐滴分散到合适的水溶性胺(例如，精胺)的水溶液中。此外，这一反应可以利用阴离子聚合物的水溶性中性盐和胺的水溶性中性盐进行。在聚合物小滴与胺溶液的明显的界面处，盐交换反应发生，导致形成十分差的可溶性的盐(在胺和聚合物之间形成)，其沉淀形成或多或少地球形小珠或胶囊，其中包含了免疫原性组合物。然后收集含有包裹的免疫原性组合物的微胶囊的悬液。

阴离子聚合物与反应物胺从这样的组中选择，在相互反应时，其迅速形成差的可溶性沉淀，以便聚合物在小滴中扩散(足以使小滴稍微变形或者将聚合反应物浓度降低到形成膜所需的浓度之下)之前装入小滴，这样，不必使用高粘度的聚合物溶液，但胺能够迅速扩散至由聚合物小滴所限定的假相边界并在此处反应是必要的。聚合物溶液的粘度可以低至2.5-10厘泊。

在胺溶液中分散聚合物溶液小滴(包含在聚合物溶液中免疫原性组合物的溶液或悬液)的一种方便的方法是使得在搅拌时聚合物溶液的气溶胶可以下降在胺溶液上/胺溶液中。使用Bernoulli型雾化器产生气溶胶导致形成具有相对宽(Gaussian)范围的约为平均值(约10-20％的变异系数)的颗粒大小的微胶囊。如果较窄大小范围是所需的，则本文描述的声-脉冲的小滴发生器可以用来提供高度均匀的微胶囊(具有约5％的直径变异系数)。

在一些实例中，当酸不稳定变免疫原性组合物将要口头施用时，用肠衣材料包覆使其免受胃酸作用可以是合乎需要的。合适的肠衣包覆材料包括乙酸纤维素邻苯二甲酸盐和聚氧化乙烯交联的聚异丁烯酸。提供小微粒，片剂以及胶囊的肠衣的技术在药物工业中是已知的。

用于从完整的水溶液制备微胶囊的反应物可以从许多市售商获得，但是本文所描述的所有的都是从Fisher科学公司，F.M.C.总公司，Ruger化学公司，Sigma化学公司和/或Upjohn公司购得的。

通过将微胶囊的含水悬液加入到水溶性盐中完成包裹物质的快速释放，所说的盐可以是这种盐的固体或溶液。不论哪一种情况，所使用的盐必须能够以类似于膜形成的相反方式与不溶性膜反应产生水溶性离子产物。明显的是，膜形成反应是一个可逆的反应。可溶性小分子的缓释通过它们经微胶囊壁的渐进扩散实现。扩散速率取决于扩散的物种的大小与溶解性，并取决于胶囊壁的厚度与密度。这样，除在需要时提供迅速的释放之外，胶囊化过程可以用于提供可溶性胶囊化材料的控制性缓释。

已显示出作为胶囊化试剂有用的阴离子聚合物或大分子选自具有反应性羧化物或硫酸盐基团的可溶性聚合物组，包括藻酸，与荧光团(如荧光素异硫氰酸盐或罗丹明异硫氰酸盐)连接的藻酸，阿拉伯酸，硫酸纤维素，羧甲基纤维素，角叉菜胶，硫酸软骨素，肝素，聚丙烯酸，聚氧化乙烯交联的聚丙烯酸(例如＂，EUDRAGIT L-100，由Rohm PH arma生产)和聚乙烯羧酸(例如，CARBOPOL934^)。在一些优选的实施方案中，阴离子聚合物选自下组：藻酸(Fisher科学公司，Fairlawn，NJ)，聚丙烯酸(Aldrich化学公司，St.Louis，MO)，硫酸纤维素(Aldrich化学公司，St.Louis，MO)，乙酸纤维素邻苯二甲酸盐(Eastman有机化学公司，Rochester，NY)，CarbomerUSP(CARBOPOL934^，B.F.Goodrich，Cleveland，OH)，羧甲基纤维素USP(中等粘度，Ruger化学公司，Irvington，NJ)，肝素USP(Upjohn公司，Kalamazoo，MI)和阿拉伯酸(按照美国专利2,666,759描述的方法分离，本文一并参考)，各种都以钠盐的形式提供。一般来说优选的是，阴离子聚合物以它们与碱金属离子(例如，钠和钾)以及铵的中性盐或三链烷醇胺(例如，三乙醇胺)使用。在一些优选的实施方案中，阴离子聚合物是以其中性盐藻酸钠形式提供的藻酸。

在制备按照本发明的微胶囊中有用的阳离子反应物选自单-，二-，三-和四-氨基化合物组，包括精氨酸，癸胺，月桂基胺，乙二胺，哌嗪，亚甲蓝，十八基胺，三乙胺，三乙基羟化四甲铵以及精胺。在一些优选的实施方案中，胺选自精氨酸(Sigma化学公司，St.Louis，MO)，哌嗪(Sigma化学公司，St.Louis，MO)，乙二胺(Aldrich化学公司，St.Louis，MO)，三乙胺(Aldrich化学公司，St.touis，MO)，三乙烯基四胺(EAldrich化学公司，St.Louis，MO)，亚甲蓝(Fisher科学的公司)，Fairlawn，N.J.)和精胺(各种都可以以其盐酸盐提供)，以及十八烷基胺(Sigma化学公司，St.Louis，MO)(可以以其乙酸盐提供)。一般地优选的是，胺以卤化物盐提供，例如，氯化物，溴化物或碘化物，以及低分子量链烷酸盐提供，例如，有6个碳原子或少于6个的碳原子，或者在水中至少1％(重量)是可溶性的，包括例如，乙酸盐，丙酸盐或环丙酸盐等。在一些优选的实施方案中，胺是精胺，以其中性盐形式精胺盐酸盐提供。

在形成具有包含的免疫原性组合物的微胶囊之前，可以个别地试验阴离子聚合物和胺，以便确定它们对免疫原性组合物的免疫原性的影响。为了确定阴离子聚合物和胺对免疫原性的影响，本领域技术人员可以使用易于获得的起始物质完成常规试验。可以在待估价的组分的各种浓度下确定所选择的免疫原性肽或蛋白质激发免疫反应的能力，以确定所述组分所具有的对所述肽和蛋白质的免疫原性的影响。

因为在一些实施方案中优选的是微胶囊化的疫苗在口头施用时有效，所以，不灭活免疫原性组合物的阴离子聚合物和胺被组合起来进行试验，以确定它们形成抵抗模拟胃酸降解的微胶囊的能力。

将阴离子聚合物的含水的钠盐(优选地为1ml)逐滴加入到含水的胺盐酸盐(或乙酸盐)(优选地1ml)中，以确定形成界面沉淀的能力。将产生固体物质的组合用来制造微胶囊。通过以类似于美国专利4,744,933(本文一并参考)中所描述的制备藻酸钙微胶囊的方式将直径约5μm的阴离子聚合物钠盐小滴分散到胺盐水溶液中来形成微胶囊。可以通过在室温下在水溶液中观察5天试验微胶囊的短期稳定性。在室温下稳定的微胶囊可以在37℃下用模拟胃酸(pH1.2)处理2小时。

不灭活免疫原性组合物并且提供稳定的微胶囊的阴离子聚合物和胺的组合然后用来形成微胶囊化的疫苗。首先将免疫原性组合物与阴离子聚合物组合，然后，将聚合物/免疫原性组合物混合物逐滴分散至胺中。

按照本发明的微胶囊可以用以下描述的装置制造，该装置使得非常窄的大小范围的微胶囊制剂有可选择的中等大小。这在制造用于注射的或者通过肠-相关淋巴组织(经常被称作Peyer′s patches的子集)或呼吸系统的支气管-相关淋巴组织摄取的微胶囊上是重要的。用于静脉内注射的微胶囊直径必须小于大约5微米，小得足以穿过毛细管床。对于吸入施用，微粒必须在可以呼吸的大小范围内，即，小于大约5微米，而对达到深肺泡部位而言，优选的是颗粒的大小范围在2微米以下。Peyer′s片的组织对它们将吞噬的微粒的大小是高度有辨识力的，仅选择大小不到10微米和优选地约5微米的微粒。以下所描述的装置可以产生各种大小的微胶囊群体，在接近5微米的平均体积直径范围内具有不到0.25微米的平均标准偏差。微胶囊形成反应：

依据本发明，两个类型的反应之一可以用于在含水介质中形成微胶囊。它们是酸碱反应和盐交换反应。

酸碱反应：

几个水溶性酸性聚合物在水溶液中与低分子量水溶性单-或寡-胺反应，形成可以沉淀的水溶性差的盐。参与这一反应的水溶性酸性聚合物组包括阿拉伯酸，纤维素硫酸盐，硫酸软骨素，肝素以及上述酸性聚合物的荧光衍生物。在这一反应中产生差的水溶性盐的胺组包括精氨酸，癸胺，月桂基胺，乙二胺，哌嗪，亚甲蓝，十八基胺，哌嗪，精胺，十四胺，三乙胺和三乙基羟化四甲铵。

盐交换反应：

如果以上描述的酸性聚合物或某些水溶性差的酸性聚合物用作它们各自的中性盐(例如，钠，钾，铵，以及三乙醇胺)的溶液，并且以上描述的胺溶解为它们的水溶性盐(例如，盐酸盐，氢溴化物，乙酸盐或丙酸盐等)，则发生形成水溶性差的盐的一种类似的反应。类似的反应可以被认为是盐交换反应，其中一种产物(例如，氯化钠或乙酸钠)是可溶性的，胺-聚合物是溶解性差的。在盐-交换反应中以它们的水溶性盐有用的酸性聚合物组包括以上提到的那些聚合物和下列酸性聚合物(以它们的钠盐或其它水溶性盐形式)：藻酸和荧光衍生物(例如，荧光素异硫氰酸盐和罗丹明异硫氰酸盐)，藻酸和其它酸的衍生物，羧甲基纤维素，乙酸纤维素邻苯二甲酸盐，EUDRAGITL-100^(聚氧乙烯交联的聚丙烯酸)，聚丙烯酸，聚乙烯丙烯酸和这些聚合物的荧光衍生物。在盐交换反应中，这一大组酸性聚合物(以它们的钠盐或其它水溶性盐)将与胺组(以它们的盐酸盐或乙酸盐)的至少一种成员反应，形成水溶性差的胺-聚合物盐。然而，并非所有形成可溶性差的盐的组合都形成按照本发明的微胶囊。参见以下描述的试验，并且比较图2和3。

如本文所使用的术语＂阴离子聚合物＂，＂聚合物链＂和＂阴离子聚合物溶液＂意指参与形成胺聚合物盐的聚合物。这里不特别提及交换反应同时形成的水溶性产物(如氯化钠或乙酸钠)的参照物，除非特别需要提及这些水溶性产物。

这样，可以用作按照本发明的微胶囊-形成剂的阴离子聚合物组包括具有羧酸盐酸性功能基(藻酸的，阿拉伯酸的，羧甲基纤维素，EUDRAGIT L-100^，聚丙烯酸和聚乙烯羧酸，硫酸盐酸性基团(角叉菜胶，硫酸纤维素，硫酸软骨素，肝素)，线型或支链聚亚烷基骨架(聚丙烯酸，聚乙烯羧酸)，线型糖骨架(藻酸，硫酸纤维素，硫酸软骨素，肝素)和支链糖骨架(阿拉伯酸)的聚合物质。

在本发明的微胶囊中，阴离子聚合物构成微胶囊壁的主要结构组分。典型地，选择聚合物，以提供在毗邻阴离子基团之间的所需范围内的间距。这样，在它们的以上延长的形式中，聚合物的θ温度，阴离子间的距离接近等于2个亚甲基基团(在聚丙烯酸中)，6个亚甲基基团(在藻酸，硫酸纤维素，软骨素硫酸盐，以及肝素中)，10个亚甲基基团(在羧甲基纤维素中)以及20和30个之间的亚甲基基团(在高度支链化的阿拉伯酸中)。这使得人们可以有选择地形成具有不同的孔隙率的胶囊壁。参见Sperker等的美国专利3,959,457(具体地说是，第5栏，I.6-20)。

因为所有用于本发明的阴离子聚合物具有远高于10kD的平均分子量，它们是多价的，并可以以宽范围的化学计量与胺反应。实践中，现已发现胺对阴离子聚合物重复单位的优选的化学计量范围是约0.2到约0.6。换句话说，约2-6个胺分子可用以与每一聚合物上的10个阴离子基团组合，形成聚合物的盐。此外，因为一些胺也是多价的，在理论上反应物可以形成复合物网络，其中胺用于交联阴离子聚合物链。基本上在阴离子聚合物和胺的溶液共同搅拌时瞬间形成的沉淀倾向于是无定形的，内聚性的，粘性的，并且经常是丝状的。然而，并非阴离子聚合物和胺的所有组合都产生可溶性差的胺-聚合物盐。图2列出了迄今所试验的两组反应物，并且表示了已成功地形成沉淀(当使这些组合反应时)的组合。阴离子聚合物与胺以胺与聚合物重复单位的增加的近似当量(在括号中显示)列出。

虽然阴离子聚合物和胺的组合的大多数将进行反应，形成水溶性差的胺聚合物盐，但这一组的较小的一个亚组显示出能够形成微胶囊，至少在迄今所试验的条件下是如此。这样，形成水不溶性胺聚合物盐的简单的能力本身不提供微胶囊壁-形成组分的确定的认证，至少在迄今所试验的条件下是如此。

为了确定胺/聚合物对是否形成胶囊和微胶囊，下列方法是有用的。制备胺与聚合物的单独的水溶液，在相等的水体积中包含约1％w/v酸形式的聚合物和化学计量上大约相等量的胺。此外，如果聚合物或胺的可溶性没有达到这样的程度，则制备不同胺的水溶性盐(例如，盐酸盐或乙酸盐)和聚合物的水溶性盐(例如，钠或铵)的溶液。向大约5ml体积的胺溶液中连续添加20-25微升体积的聚合物溶液，从约1厘米的高度逐滴输送聚合物溶液。当一种添加到另一种中去时肉眼观察两种溶液。注意聚合物溶液的小滴是否与胺溶液混合，同时系统是否成为均相的或是否薄膜大约形成聚合物溶液小滴，并保持它们物理上明显的和机械上分离的实体。

如果附加的小滴形成这样一种薄膜，并且不与胺溶液混合产生均相溶液，则它可能可以用来制造微胶囊的反应物对。为了更密切检验这一可能性，必需采用在宽的浓度范围内制备的聚合物小滴和胺溶液重复实验，以确定最佳反应物浓度。

如果聚合物的胺或酸形式可溶性不足以进行以上描述的实验，则反应物对的盐形式可以一起代替它们使用。

图3表明哪一种胺聚合物盐在迄今所实验的条件下有效地形成稳定的微胶囊。

胺与聚合物水溶液组合形成稳定的微胶囊构型的能力要求反应物首先是水溶性的，并且带相反的电荷，以便它们可以组合形成可溶性差的盐。重要地是，与胺分子(离子)扩散能力相比，阴离子聚合物链在溶液中不应该迅速扩散。此外，优选的是阴离子聚合物溶液的小滴以这样一种方式引入到胺溶液中，即使得聚合物小滴不广泛地变形或与大批胺溶液十分迅速地混合。这几个需要比较容易满足。在以下更详细描述的方法的步骤中可以理解这些需要的基础。

在微胶囊制造方法开始时，阴离子聚合物和胺的水溶液是机械地(即，物理地)分离相。在室温下，与聚合物分子相比，阴离子聚合物溶液的水分子预期具有高(0.9+)的热力学活性系数，并且扩散更迅速。聚合物链(分子量高于10kD，100,000AMU)是胶体大小的，并预期其行为如同其它胶粒。尤其是，可以预期阴离子聚合物的胶体溶液将倾向于随相对高的胶体聚合物浓度的微区的发展而结构上不均衡和有其它聚合物空隙。胶体聚合物的这一行为前不久已由Ito等，1994，科学263：66-68用时间消失共焦点激光显微图显示。该显微图显示对非均衡性和空隙结构的趋势。Ito等讨论了有关离子聚合物(如用于本发明的那些，例如聚丙烯酸钠。对比发现，与阴离子聚合物链相比，胺反应物(分子量不到400)是热力学上更加活泼的，比聚合物链扩散的更快(但比水分子慢)，其被认为是在全部溶液中是均匀分布的。

当阴离子聚合物小滴引入到大体积的胺溶液中时，预期原来分离的水相将实质上即刻组合，形成单一的连续水相，对以前分离的含水组分没有可见的相界。另一方面，低扩散系数的阴离子聚合物(对接近10kD质量范围的胶体聚合物典型地低于7×10^-7cm²/sec)限制聚合物分子从它们的起始位置运动(相对于聚合物溶液小滴的剩余物)，并留下胺分子多样性的时间，以接近水分子速度快速移动至靠近聚合物(被静电吸引至它们的)，与聚合物阴离子形成盐。这样，在与各种胺单位的反应期间聚合物分子的相对固定性使得壳(其符合近似的聚合物链的起始位置并保持小滴的形状)沉淀。

通过小心将约20微升约1％w/v羧甲基纤维素钠水溶液的近似球滴加入到约1％w/v癸胺盐酸盐水溶液中可以容易地肉眼观察到包围着小滴的这一壳的发展在包围所加入的小滴的第二个几乎不可见的球形膜的小组分内和在几秒钟期间，所述的膜逐渐变得浓稠和更加乳白。可形成的微胶囊可以用巴氏吸管回收或者在细小网上收集。应当注意，如果这样的聚合物小滴从几厘米的高度输送到胺溶液中，则极有可能小滴可能变形，形成扁圆球或者双凹的类似盘状的结构，其类似地逐渐变成浓稠的和乳白的壳。如果胺溶液被搅拌或迅速流动，则加入的小滴趋向于形成类似浓稠的扁长球状体或者丝状颗粒。如果聚合物溶液小滴更小，则它们可以从较高处分散到/进胺溶液或者到/进流动的胺溶液，具有较小的变形。在实践中，可以从5厘米高度将约5-7微米直径的小滴使用到以每分钟约1厘米的线速度流动的胺溶液表面，仍然产生实质上为球形的微胶囊。

尽管对描述包围聚合物小滴的膜形成和变稠产生微胶囊(仅靠扩散)的方法可能太简单，但这种描述给出了所发生的事情的完全准确的概况。更具体的理解可以通过穿过液-液界面的离子转运机理和动力学的描述获得。Benjamin，I.，1993，科学261：1558-1560已指出，尽管时间平均水-二氯乙烷界面在短的时间间隔内是分子敏锐的，但热波动诱导各液相与其它相的毛细管指状交叉。这些毛细管“指状物”使得离子可以从一相转移到另一相，尽管大部分相是分离的。也可以预期，水相的带胺的部分的类似毛细管闯入到带聚合物水相可以类似地提供这样一种机制，通过该机制，胺聚合物盐离子可以相互作用产生膜或薄膜，而不严重影响聚合物小滴的完整性。

实际上，反应物溶液形成不连续的微胶囊的能力至少部分地取决于聚合物链在含水介质中的相对固定性和胺分子(离子)的相对较高的移动性，并且也可能部分取决于胺和聚合物溶液之间的明显界面界线的短暂热诱导的波动。它不要求高的粘度溶液但是要求一种缓慢扩散的反应物。对微胶囊形成机理的这一解释与在其它全含水胶囊化系统中提出的微胶囊形成的机理很不一致。

导致胺聚合物盐形成的反应可以被看成是一种简单的盐交换，并且其具有可逆反应的特征。通过将在反应中所形成的过量的可溶性盐或者其浓溶液(例如氯化钠或乙酸钠)加入到微胶囊悬液中说明了这一点。提高氯化钠在微胶囊群周围的水介质中的浓度至约4％w/v一般导致它们的迅速分解。然而，以氯化钠或能够产生可溶性聚合物和胺盐的其它电解质(例如磷酸钠至4％w/v溶液)处理也不会完全破坏由水溶性非常差的胺盐(例如，鲸蜡基胺，十八烷基胺)制造的微胶囊，对破坏这样的微胶囊(例如，因为分析目的)，有用的是加入能够耗尽胺的含水浓度的溶剂(例如，环己烷)。

用于形成本发明的微胶囊的一种现在优选的方法是使用为这一目的研制的一种声学小滴-形成装置。这一装置产生阴离子聚合物均一性良好的小滴流，并指导它们到达和通过阳离子反应物溶液(胺)的不断更新的表面上，使得新近到达的小滴不撞击较早传送的小滴。由此装置(1)减少形成微胶囊聚集体的趋势，(2)提供产生大群具有十分狭窄的大小分布范围的微胶囊的方法，通过声脉冲向下垂直流动的聚合物溶液(就在其从狭窄的孔口出现之前)操作该机器，使得声波经过液流传播，开始液流中的一系列压缩，在液体表面张力的影响下，其使液流打碎成一系列均一的小滴。小滴列被同轴指导进一根狭窄的圆柱形管子，其通过以阳离子反应物的连续流侧面打开(或其拓扑等同物)供给。这样，每一新近到达的聚合物小滴遇到阳离子反应物的一个新鲜的表面，并在它开始形成其自身的胶囊壁之前，有最小限度的机会与另一个聚合物小滴撞击和接合，存在于管子的低端。

这一制备微胶囊的声学装置的主要组件也可以最好地按其将两种液流引入到一起形成微胶囊的功能性顺序来描述。在这一装置中，阴离子聚合物和胺(或它们的对应的中性盐)的水溶液存储在不同的贮槽中，并且通过不同的转移管线泵入。胺溶液被供给到和进入改进的T-管的茎干，该管被用作主要的反应容器。安装T-管使得T棒的圆柱形轴垂直地取向。进入T-管的胺溶液在其由重力流出T-管棒的下面的一半部分前水平流动几厘米。(实践上，不是使用一简单的T-管，而是使用在临床化学实验室常称为＂仙人掌形管＂的一类。仙人掌形管具有较低壳体h的总形状，在这一应用中，安装管子以便h形颠倒，仙人掌形管的直线部分约2cm长，并具有约2mm的内直径)。从T-管流出的胺溶液可以回到贮槽中并再循环。

聚合物溶液被泵入滤膜(8微米或更细的)，然后通过玻璃毛细管。其末端被压缩至直径20-25微米，以良好的连续液态喷射形式出现。(被压缩的毛细管易于从可以由实验室供应商(例如A.H.Thomas公司)获得的类型的容积为25，50或100微升玻璃毛细管制造)。当聚合物溶液以每分钟1-2ml的速率被泵入时，压缩使聚合物溶液以每秒4到5米的速度喷射是优选的，但是当然地可以使用这一范围之外的速率。

毛细管以在金属块中浅的V-形沟排列，并且被靠着声学传感器(例如，在40瓦特标称能量输出下操作的实验室超声探针)的轴振动末端的压缩弹簧夹持，使得声学能量通过毛细管壁转移到流动的聚合物溶液中，使聚合物溶液喷射打碎成均一大小的一系列小滴。

安装传感器-毛细管-压缩块装配体，使得出现的一列聚合物溶液小滴通过空气3厘米，并且被轴向引导到T-管棒的上端，补充到从T-管侧面(茎干)进入的胺溶液上。聚合物溶液小滴与胺溶液反应形成微胶囊，其与胺溶液一起流出T-管棒的较低端。

即使在缺少声波刺激的情况下，从毛细管压缩结构出现的这种聚合物溶液的喷射(如以前的描述)通常将自发分解成一列大小不同的小滴，这是因为液流的不同的天然不稳定性和喷射所出现的氛围(所谓液体喷射的Rayleigh裂解)。然而，合乎需要的是超声均一大小的小滴，以制备均一大小的微胶囊。

为此，按照本发明的优选的实施方案，通过周期性地声波扰乱液流开始沿喷射轴的一系列足够强的压缩(声)波来产生均一大小的小滴。一系列音波通过液态介质运动，并且比液体本身更迅速地离开孔口(喷射以每秒4-5米的速度出现)。波列沿喷射的长度的传播产生沿喷射路径在连续的节点处的增加的构成性振辐的干扰模式。在从孔口的一定距离内，与液体的表面张力相比，表面波的振幅变得更大，聚合物溶液的小滴在超声波发生器频率下形成。以这一方式产生均一大小的一系列小滴较详细地由Galley，P.J.和Hieftje，G.M.，1992，应用光谱学45：1460-1463报道。

为了说明以上方法与装置。参考附图4，其中显示＂h＂形管成员10，包括侧边区段14和垂直相交区段12，胺溶液16通过它在管区段14的上端向下泵入，使其进入垂直区段12，并且在区段14和区段12的相交处向下转移至流动部分，从此开始其存在至管区段12的底端。在区段14和12相交处之上，聚合物溶液通过毛细管成员18引入，其底端是在区段14和12相交处之上的间隔的预定的距离(在以上例证性描述中是大约3厘米)。在所说的相交处胺溶液流向下转移，使得逐滴出现的聚合物溶液22的部分在那个点与向下流动的胺溶液组合。

如上所述，为了提高逐滴向下流动的聚合物溶液22的一致性，毛细管18牢固地由具有V-沟夹持狭线(图中未显示)的金属块24夹持，并间歇地被声刺激。为此目的，声探针20与邻近毛细管底端与毛细管接触。

人们可以估计由超声波发生器的频率所产生每单位时间的小滴的个体的数量。在大多数实例中，使用20kHz频率的超声波发生器。由于例如其中连续的小滴可以相互撞击，并且相互接合或粘结形成聚合的微胶囊，所形成的小滴的数量的评估可能稍微出现差错，在实践上，远小于1％的小滴以融合或接合的形式出现。假定所有小滴单独形成，人们可以从聚合物流速率的知识计算个体小滴大小。在每分钟1ml的标称阴离子聚合物流速率时，小滴个体的量是0.05微升(立方毫米)，与4.57微米的球形小滴直径对应。在流速接近每分钟1毫升和20kHz声频率下形成的微胶囊的直径以从容量直径大小(Coulter原则)估计为约5微米。

此外，实质上任何大小的聚合物溶液小滴都可以引入到阳离子反应物溶液中(例如，通过喷射或从移液管逐滴加入)，以形成微胶囊。在许多应用中理想的是，所形成的微胶囊具有高度均一的大小，这样诱导这一均一性的一些方法(例如以上描述的声学方法)是优选的。这样的应用包括向肠淋巴组织(经常称作Peyer′片)送递。Peyer′s片的M细胞选择性地排斥比约10微米更大的微粒，但吞噬在约10微米以下大小范围内的微粒，并且把它们转移到其它淋巴细胞。

一般来说，本发明的微胶囊在可以在0.1-2,000微米的大小范围内。对通常的口服有用的优选的大小范围是500-1,000微米。在一些实施方案中，范围为100-200微米。在其它实施方案中，例如在预期送递至在肠淋巴组织中的Peyer′s片的物质的施用中，优选的大小范围是1-10微米。

部分地取决于制造液体除去的程度和部分地取决于核心溶质的性质，含水的核心微胶囊可以以自由流动的悬液、粘性的可流动浓缩物、糊状物、易碎的薄片或者通过进一步进行处理后的冻干饼(lyocake)收集。冻干对提供具有高水溶性核心材料的稳定的微胶囊是特别合乎需要的。

一旦胶囊化的，免疫原性组合物就被保护，不受环境影响，但是可以通过将胶囊悬浮在含水介质中从微胶囊中缓慢地释放。免疫原性组合物可以穿过半透微胶囊壁主动地扩散。一般来说，在壁-形成反应物的性质保持恒定时，高水溶性免疫原性组合物与水溶性差的免疫原性组合物相比，观察到更迅速的释放，一般来说，与更高分子量的那些相比，低分子量的免疫原性组合物更迅速释放。在一些实施方案中，微胶囊转变成冻干饼和在含水介质中再悬浮是优选的。疫苗：

按照本发明的疫苗包含至少一种微胶囊化的免疫原性组合物和药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂。疫苗可以也可以不包含附加的组分，包括微胶囊化的和非微胶囊化的免疫原性组合物和/或佐剂。

这样，本发明提供了一种针对BHV-1免疫牛物种成员的疫苗，该疫苗包含免疫原性量的微胶囊以及兽医学上可接受的载体，该微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，在一个优选的实施方案中，所选择的阴离子聚合物是藻酸(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如藻酸钠)，并且所选择的胺是精胺(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如，精胺盐酸盐)。

免疫原性组合物包含BHV-1亚单位组分，其在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗(BHV-1)的保护性反应。在一个优选的实施方案中，免疫原性组合物的疫苗的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白，如，gI、gII、gIII和gIV或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，免疫原性组合物的疫苗包含截短的BHV-1糖蛋白，如，BHV-1-gD。在一个更加优选的实施方案中，免疫原性组合物的疫苗是BHV-1gD。疫苗可以进一步包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂，并且，可以也可以不包含佐剂。如本文所使用的，术语＂牛物种成员＂指母牛和牛。

＂能够诱导保护性反应＂这一词组在这里广泛地用来包括在动物中诱导响应接种的任何基于免疫的反应，包括任何抗体或细胞介导的免疫反应，或者这两种反应，保护对BHV-1的接种。术语＂保护性反应＂如本文所使用的不限于绝对预防BHV-1感染，意欲包括降低任何病毒感染性或者通常由BHV-1感染所引起的疾病或病态的严重程度，包括与未接种的感染动物比较，一种或多种通常由感染所形成的病理作用或症状上可检测的降低或一种或多种这样的病理作用或症状的发展速率上的可检测的降低。

本发明的疫苗可以按照可接受的惯例用标准的缓冲液，载体，稳定剂，稀释剂，防腐剂以及加溶剂配制，并且也可以配制得有利于持续释放。稀释剂可以包括水，盐水，葡萄糖，乙醇，甘油等。等渗性添加剂可以包括氯化钠，葡萄糖，甘露糖醇，山梨醇以及乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。可以使用佐剂，例子包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，明矾，氢氧化铝凝胶，水包油型乳剂，油包水乳剂(如，Freund′s完全佐剂和Freund′s不完全佐剂，块状共聚物(CytRx，亚特兰大GA)，QS-21(剑桥生物技术公司，剑桥MA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，AMPH IGEN^佐剂，Quil A，单磷酰基脂质和Avridine脂-胺佐剂。疫苗可以进一步包含一种或多种其它免疫调节剂，如，白介素-1或其它已知的细胞因子。合适的其它疫苗运载体，载体以及添加剂是已知的或对本领域技术人员是明显的。参见，例如，Remington的药物科学，18版，1990，Mack出版，本文一并参考该文献。疫苗可以保持在溶液中或冻干。冻干疫苗可以方便地存储，并且在施用之前由无菌稀释剂溶液重构。

施用于动物的微胶囊化的免疫原性组合物的量取决于这样一些因素，例如，疫苗的组合物的性质，所接种的动物的物种、年龄、体重和一般的物理特征。对每一参数的最佳剂量的确定参照已出版的研究用常规方法进行。具体地说，关于BHV-1的微胶囊化的亚单位组分的施用，尤其是微胶囊化的BHV-1-gD的施用，施用于牛物种成员的量优选地BHV-1-gD在约100pg-约150μg范围内，更优选地在约250pg-约100μg范围内，最优选地在约400pg-约60μg范围内。疫苗的典型的剂量体积在每只动物每剂约0.5ml-约5ml范围内。

疫苗用药制度也可以基于以上因素选择。动物可以在任何时间接种，包括在断奶时或较小时，或恰好在繁殖时，或在首先发现在牧群中出现感染时。对完全保护而言，辅助施用或强化可能是需要的。确定是否获得充分的免疫保护的方法是测定血清转变。用于确定是否获得充分的免疫保护的这一方法和其它方法是本领域已知的。

本发明也提供了一种针对BHV-1接种牛物种成员的方法，该方法包括对所说的动物施用一种疫苗，该疫苗包含免疫原性量的本发明的微胶囊。按照本发明的疫苗可以经任何适当的路线施用，如，口头，鼻内，肌内，腹膜内，静脉内，动脉内，皮下，直肠，以及阴道施用或通过这些路线的组合。

此外，本发明提供了一种用于针对BHV-1接种牛物种成员的试剂盒，该试剂盒包括第一容器，该容器包含免疫原性量的本发明的微胶囊，所说的试剂盒还包括第二容器，该容器包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步提供了一种用于针对BHV-1保护牛物种成员或者还进一步地针对折磨牛物种的其他疾病或病理状态保护牛物种成员的组合疫苗，该疫苗包含免疫原性量微胶囊，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的第一免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从所选择的水溶性阴离子聚合物和所选择的水溶性胺的界面反应或者从所选择的阴离子聚合物的水溶性中性盐和所选择的胺的水溶性中性盐的界面反应所形成的沉淀，在一个优选的实施方案中，所选择的阴离子聚合物是藻酸(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如藻酸钠)，并且所选择的胺是精胺(以相应的水溶性形式是优选的)，中性盐(如，精胺盐酸盐)。

第一免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗牛疱疹病毒-1(BHV-1)的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。在一个优选的实施方案中，第一免疫原性组合物包含BHV-1糖蛋白，如，gI、gII、gIII和gIV或其免疫原性片段或衍生物。在一个更加优选的实施方案中，第一免疫原性组合物包含截短的BHV-1糖蛋白，如，BHV-1-gD。在一个更加优选的实施方案中，免疫原性组合物是BHV-1-gD。

组合疫苗还包含免疫原性量的第二免疫原性组合物，基于其诱导针对BHV-1或本领域已知的折磨牛物种的其它疾病或病理状态的保护性反应的能力选择该组合物。任何已知的在牛疫苗组合物中有用的免疫原性组合物可以用作本发明的组合疫苗的第二免疫原性组合物。这样的免疫原性组合物包括但不限于提供针对下列病原体的保护作用的哪些：牛呼吸syncitial病毒、牛病毒性腹泻病毒、I，II或III型副流感病毒、Leptospira spp.、胎儿弧菌、轮状病毒、冠状病毒、狂犬病毒、溶血性巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、Clostridia spp.、破伤风类毒素、大肠杆菌以及Neospora spp等。组合疫苗的第二免疫原性组合物可以是用本文描述的方法胶囊化的或用任何其它已知方法胶囊化的，或者可以仍然是非胶囊化的。如果是胶囊化的，第二免疫原性组合物可以与BHV-1亚单位组分在相同的微胶囊中胶囊化或可以分别在不同的微胶囊中胶囊化。

第二免疫原性组合物的免疫原性的组分可以也可以不与BHV-1亚单位组分或者其免疫原性片段或衍生物连接(共价的或以其它方式)，产生嵌合的分子。在一个实施方案中，第二免疫原性组合物包含半抗原，其由缀合到第一免疫原性组合物的BHV-I亚单位组分上可检测地增加。

包含以上描述的第一和第二免疫原性组合物组分的嵌合分子可以用一种或多种本领域已知的技术合成。例如，嵌合分子可以利用市售的肽合成仪利用标准化学合成方法(参见，例如，Merrifield，1985，科学232：341-347)合成。此外，嵌合分子也可以用本领域已知的重组DNA技术产生，在此情况下，例如，编码嵌合分子的不同的组分的核苷酸序列符合读框地剪接在一起，并且在合适的转变的宿主细胞中表达，供尔后分离。实行这样的重组技术的充分的指导在以下文献中提供：Maniatis，1989，同上；Ausubel等，1989，同上；Sambrook等，1989，同上；和Innis等(编者)，1995，同上，本文一并参考。

组合疫苗还可以包含药学上或兽医学上可接受的载体或稀释剂，并且，可以也可以不包含佐剂。

下列实施例仅仅是说明性的，不限制本发明的范围。

实施例

测定了微胶囊化作用提高针对BHV-1-gD的病毒-特异性免疫反应的能力。也测定的是两种蛋白质俘获效率的重要性以及在病毒-特异性免疫反应的提高中在微胶囊内的俘获蛋白质的稳定性。材料和方法病毒和病毒蛋白质：

696μg/ml浓度的BHV-1-gD由Pfizer公司提供。按照Drunen S.等，1994，疫苗12：1295-1302(本文一并参考)的描述完成质粒构建、质粒转染、表达、纯化以及BHV-1-gD的定量。微胶囊形成：

利用精胺-藻酸盐或精胺-硫酸软骨素的BHV-I-gD的微胶囊化作用按照以下方法完成。分离高粘度藻酸钠(Fisher科学公司，Fairlawn，NJ或Kelco，Clark，NJ)或硫酸软骨素钠(Sigma化学公司，St.Louis，MO)的1％w/v水溶液，在冰箱温度下使其水合一夜，水合后通过8微米混合纤维素酯膜(Millipore，Bedford，MA)。借助校准的移液管将2.5ml体积的疫苗和0.078ml的连续的一半转移到分别在不同的试剂瓶中的0.6ml体积的1％w/v藻酸钠溶液和5ml体积的硫酸软骨素钠溶液中。将每一种疫苗-聚合物混合物稀释成10ml，通过旋涡混合；利用以前教导的声学小滴-形成装置，以均一的良好小滴流慢慢地灌输至不同的40ml体积含水0.125％w/v精胺(Sigma化学公司，St.Louis，MO)(以盐酸调整pH 7.0+0.1中。

为了最大限度地减少在仙人掌形管中进入精胺盐酸盐溶液的聚合物小滴的机会影响新生胶囊，以每分钟9ml的速率将精胺盐酸盐溶液传送到仙人掌形管中，并且以每分钟lml的速率将硫酸软骨素钠溶液泵入毛细管孔口。精胺藻酸盐微胶囊实质上得到合成。为了获得在5微米的中位值大小范围中的微胶囊，以每分钟2ml的标称速率将藻酸钠溶液传送至毛细管孔口。

利用癸胺-羧甲基纤维素(CMC)的微胶囊化作用按照以下方法完成。使羧甲基纤维素钠N.F，中等粘度，(Ruger化学公司，Fairlawn，N.J.)以及它的溶液在使用之前至少水合24小时。通过用乙酸(Fisher科学公司，匹兹堡，PA)滴定至pH 7.0在水中增溶癸胺(Aldrich化学公司，Milwaukee，WI)。由将梯度体积的疫苗与单独的0.75ml体积1％w/v羧甲基纤维素钠充分混合，加足够量的水至5毫升，并声脉冲所形成的混合物进20ml 0.5％w/v癸胺(用乙酸调节pH 7.0)类似地产生包含BHV-1-gD的癸胺-CMC微胶囊

经离心(20,000gxm)将藻酸钠和癸胺羧甲基纤维素微胶囊制剂洗涤三次；将精胺硫酸软骨素的那些洗涤一次，倾析，在水中再悬浮，并再一次地离心。

为了确定BHV-1-gD的俘获效率，用8M磷酸钠缓冲液破坏由精胺-藻酸盐或癸胺-CMC组成的微胶囊，以1％氯化钠破坏由精胺-软骨素组成的那些。将俘获抗原的数量与开始材料的数量相比较，以确定俘获效率。

为了确定多长的病毒蛋白质包含在微胶囊之内，用精胺-藻酸盐或精胺软骨素硫酸盐微胶囊化BHV-1-gD，并且在4℃下存储42天。微胶囊的等分试样在形成之后放置各种间隔，洗涤，并且经以上描述破坏样品试验俘获抗原的存在。ELISA检测BHV-1-gD

用100μl硼酸钠溶液1∶10,000稀释的兔抗-BHV-1-gD涂布平底96-孔板(MAXISORP^，Nunc，Napervitie，IL)的各孔，并且于40℃下在潮湿的腔室中温育一夜，用300μl含0.5％吐温20的PBS(Sigma，St.Louis，MO.)洗涤孔4次。以每孔100μl体积加入待试的4个系列2倍稀释的样品(用PBST稀释)，在37℃下温育2小时。将实验样品与标准量的BHV-1-gD比较。完成8个系列2倍稀释的BHV-1-gD标准(1∶1,600-1∶204,800)。包含lμg轮状病毒(牛菌株WC3)的孔用作阴性对照。以PBST洗涤孔4次，将100μl用PBST 1∶4,000稀释的小鼠抗-BHV-1-gD腹水液加入到各孔中，并在37℃下温育90分钟。以PBST洗涤孔4次，将100μl用PBST加1％正常兔血清(Sigma)1∶2,000稀释的HRP-标记的绵羊抗-小鼠IgG(Boehringer曼海姆生物化学公司，Indianapolis，IN)加入到各孔中，并在37℃下温育90分钟。以PBST洗涤孔4次，用每孔100μl过氧化物酶底物(ABTS，Kirkegaard&Ferry实验室，Gaithersburg，MD.)培育。在微板ELISA读数计(DynatechMR4000，Dynatech Labs.，Chantilly，VA.)上以405nm的光密度(OD)确定比色变化。当1∶12,800稀释的BHV-1-gD标准是1.0(+/-0.1)OD单位时，反应被认为是完全的。

为了确定几何平均滴度和标准误差，指定具有不可检测的BHV-1-gD-特异性抗体反应的样品的值为10。接种小鼠：

5个成年Swiss-Webster雌性小鼠(Taconic生育实验室，Germantown，N.Y.)的组以每只腿50μl体积肌内(四头肌股间肌)接种各种剂量的BHV-1-gD的微胶囊化的或未微胶囊化的制剂。在接种之后的1个和2个月通过后眼窝毛细管丛小孔用非-肝素化Natelson管(Monject公司，St.Louis，MO.)获得血液，并且如下所述，经ELISA试验BHV-1-gD-特异性抗体的存在。检测BHV-1-aD-特异性IgG的ELISA测定：

用50μl含每孔100ng的BHV-1-gD(用PBS)涂布平底96-孔板(IMMULON^2，Dynatech Labs，Chantilly，VA)的各孔，并且于4℃下在潮湿的腔室中温育一夜，一以dH₂O洗涤平板1次，将300μl 1％聚(乙烯基乙醇)(FVA)(Aldficl化学公司，密尔活基， WI.)加入到各孔中，在37℃下温育2小时。以dH₂O洗涤平板5次，将每孔100μl血清样品(以1％PVA稀释)，将平板在37℃下温育1小时。将来源于BHV-1-gD超免疫的小鼠的血清系列稀释2倍(从1∶200-1∶204,800)，并且用作阳性对照。平板以dH₂O洗涤5次，以每孔100μl加入用1％PVA 1∶10,000稀释的HRF-标记的山羊抗-小鼠IgG(Kirkegaard & Perry实验室，Gaithersburg，MD.)，在37℃下温育1小时。平板以dH₂O洗涤5次。用每孔100μl过氧化物酶底物(ABTS，Kirkegaard & Ferry实验室)培育。温育15分钟后，在微板ELISA读数计上以405nm的OD确定比色变化。通过与已知滴度的超免血清产生的标准曲线比较计算BHV-1-gD-特异性抗体滴度。结果

诱导BHV-1-gD-特异性抗体反应所需的BHV-1-gD的量降低约5,000-倍(精胺-藻酸盐微胶囊化)和3.3-倍(癸-CMC微胶囊化)(表1)。在用精胺-硫酸软骨素微胶囊化后，BHV-1-gD-特异性免疫反应得不到提高。

俘获效率不与抗原特异性免疫反应的提高相关。与包含BHV-1-gD的精胺-藻酸盐微胶囊比较，由癸胺-CMC组成的微胶囊俘获BHV-1-gD的效率高约20倍，但是提高BHV-1-gD-特异性抗体反应的能力低1,500倍(表1和2)。此外，虽然在俘获效率上在精胺-藻酸盐或精胺-硫酸软骨素中的BHV-1-gD制剂之间没有任何区别，但仅包含BHV-1-gD的精胺-藻酸盐微胶囊提高抗原-特异性免疫反应。

BHV-1-gD在精胺-藻酸盐和精胺-硫酸软骨素内俘获和保持至少42天(表3)。因此，在抗原-特异性免疫反应的提高上的区别可以不考虑如体外所观察到的病毒蛋白质从微胶囊的迅速渗漏。

现在已经说明BHV-1亚单位组分(在这种情况下是BHV-1-gD)可以在本发明的微胶囊基质内成功地俘获，并且BHV-1亚单位组分的微胶囊化作用大大地提高它的免疫原性。

所有以上所引用的专利，专利申请以及出版物以其整体一并由本文参考。

本发明不受所描述的特定实施方案的范围的限制，这些实施方案仅用来说明本发明的某些方面。功能上等同的组合物和方法在本发明的范围内。

           表1胶囊化的或未胶囊化的BHV-1-gD制剂在小鼠中的体液免反应免疫原       剂量^a  微胶囊材料    接种后BHV-1-gD-特异性抗体的GMT^b(+/-SE)

                                      1个月               2个月BHV-1-gD     2μg        无             30(+/-400)             10^c

         400ng                         10                  10

         80ng                          10                  10BHV-1-gD     10ng    精胺-藻酸盐       8800(+/-900)       10200(+/-2600)

         2ng                       5800(+/-1600)       5800(+/-1600)

         400pg                     300(+/-500)         200(+/-600)BHV-1-gD     10ng  精胺-硫酸软骨素         10                  10

         2ng                           10                  10

         400pg                         10                  10BHV-1-gD     600ng    癸胺-CMC         2200(+/-500)        30(+/-400)

         60ng                          10                  10

         6ng                           10                  10a每一处理每一剂量从5只小鼠的组收集的数据。bGMT＝几何平均滴度。c为了确定GMT和SE，指定具有不可检测的BHV-1-gD-特异性抗体反应的值为10。

                表2不同的微胶囊材料俘获BHV-1-gD的相对能力抗原          微胺囊材料    可获得的Amt.抗原    俘获的Amt.抗原    俘获效率BHV-1-gD      精胺-藻酸盐         46μg              256ng         0.56％

                            31.5μg              156ng          0.5％

                              18μg              126ng          0.7％

                             9.4μg               34ng         0.36％BHV-1-gD    精胺-硫酸软骨素       63μg              103ng         0.16％

                              31μg              115ng         0.37％

                              15μg               59ng         0.39％

                             7.6μg               41ng         0.54％BHV-1-gD       癸胺-CMC           11μg             1.4μg         12.7％

             表3在微胶囊中的BHV-1-gD的长期稳定性^a抗原         微胶囊材料    形成后在不同的间隔(天)保持在微胶囊中的Amt.抗原

                         0      1       3       7      14        28

                                            42BHV-1-gD    精胺-藻酸盐    12ng   12ng   12ng   10ng   8ng    6ng    4ngBHV-1-gD  精胺-硫酸软骨素  38ng   36ng   38ng   38ng   36ng   35ng   34nga在微胶囊中俘获后，通过破坏微胶囊的等分试样测定在各种间隔保持的抗原的量。

Claims (48)

1.一种微胶囊，其含有胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗牛疱疹病毒-1(BHV-1)的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。

2.权利要求1的微胶囊，其中所说的水溶性精胺中性盐选自卤化物和低分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和链烷醇胺盐。

3.权利要求2的微胶囊，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

4.权利要求1的微胶囊，其中所说的BHV-1的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白或其免疫原性片段或衍生物。

5.权利要求4的微胶囊，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

6.权利要求4的微胶囊，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

7.权利要求1的微胶囊，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

8.一种增加BHV-1亚单位组分的免疫原性的方法，该方法包括用一种微胶囊胶囊化所说的BHV-1亚单位组分，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，其包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀。

9.权利要求8的方法，其中所说的所说的水溶性精胺中性盐选自卤化物和低的分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和三链烷醇胺盐。

10.权利要求9的方法，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

11.权利要求8的方法，其中所说的BHV-1亚单位组分包含BHV-1糖蛋白或其免疫原性片段或衍生物。

12.权利要求11的方法，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

13.权利要求11的方法，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

14.权利要求13的方法，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

15.一种针对BHV-1免疫牛物种成员的疫苗，该疫苗包含免疫原性量的微胶囊以及兽医学上可接受的载体，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗BHV-1的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。

16.权利要求15的疫苗，其中所说的水沉性精胺中性盐选自卤化物和低的分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和三链烷醇胺盐。

17.权利要求16的疫苗，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

18.权利要求15的疫苗，其中所说的BHV-1的亚单位组分包含BHV-I糖蛋白或其免疫原性片段或衍生物。

19.权利要求18的疫苗，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

20.权利要求18的疫苗，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

21.权利要求20的疫苗，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

22.权利要求15的疫苗，该疫苗还包含佐剂。

23.权利要求22的疫苗，其中所说的佐剂选自RIBI佐剂系统，明矾，氢氧化铝凝胶，水包油型乳剂，油包水型乳剂，块状共聚物，QS-21，SAF-M，AMPH IGEN^佐剂，Quil A，单磷酰基脂质以及Avridine脂-胺佐剂。

24.一种针对BHV-1接种牛物种成员的方法，该方法包括对所说的动物施用一种疫苗，该疫苗包含免疫原性量的微胶囊以及兽医学上可接受的载体，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，其实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗BHV-1的保护性反应的BHV-1的亚单位组分。

25.权利要求24的方法，其中所说的水溶性精胺中性盐选自卤化物和低的分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和三链烷醇胺盐。

26.权利要求25的方法，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

27.权利要求24的方法，其中所说的BHV-1的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白或其免疫原性片段或衍生物。

28.权利要求27的方法，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

29.权利要求27的方法，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

30.权利要求29的方法，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

31.权利要求24的方法，其中所说的疫苗还包含佐剂。

32.一种用于针对BHV-1接种牛物种成员的试剂盒，该试剂盒包括第一个容器和第二容器，所说的第一容器包含免疫原性量的微胶囊，该微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗牛疱疹病毒-1(BHV-1)的保护性反应的BHV-1的亚单位组分；所说的第二容器包含稀释剂。

33.权利要求32的试剂盒，其中所说的水溶性精胺中性盐选自卤化物和低分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和三链烷醇胺盐。

34.权利要求33的试剂盒，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

35.权利要求32的试剂盒，其中所说的BHV-1的亚单位组分包含BHV-1糖蛋白或其免疫原性片段或衍生物。

36.权利要求35的试剂盒，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

37.权利要求35的试剂盒，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

38.权利要求37的试剂盒，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

39.权利要求32的试剂盒，其中所说的微胶囊是冻干的。

40.一种用于针对BHV-1保护牛物种成员或者还进一步地针对折磨牛物种的其他疾病或病理状态保护牛物种成员的组合疫苗，该疫苗包含免疫原性量微胶囊、免疫原性量的第二免疫原性组合物以及兽医学上可接受的载体，所说的微胶囊包含胶囊化含水的或实质上含水的核的各向异性路易斯盐膜和被该盐膜包裹的第一免疫原性组合物，所说的微胶囊实质上是无非水污染物的，所说的盐膜包含从精胺和藻酸的界面反应或者从水溶性精胺中性盐和水溶性藻酸中性盐的界面反应所形成的沉淀，所说的第一免疫原性组合物包含在以微胶囊化的形式施用到牛物种成员上时能够诱导抗BHV-1的保护性反应的BHV-1的亚单位组分，所说的第二免疫原性组合物能够诱导抗折磨牛物种的疾病或病理状态的保护性反应。

41.权利要求40的组合疫苗，其中所说的水溶性精胺中性盐选自卤化物和低的分子量链烷酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐选自碱金属盐、铵盐和三链烷醇胺盐。

42.权利要求41的组合疫苗，其中所说的水溶性精胺中性盐是精胺盐酸盐，所说的水溶性藻酸中性盐是藻酸钠。

43.权利要求40的组合疫苗，其中所说的BHV-1亚单位组分包含BHV-1糖蛋白，或其免疫原性片段或衍生物。

44.权利要求43的组合疫苗，其中所说的BHV-1糖蛋白选自gI、gII、gIII和gIV。

45.权利要求43的组合疫苗，其中所说的亚单位组分包含BHV-1-gD。

46.权利要求45的组合疫苗，其中所说的亚单位组分由BHV-1-gD组成。

47.权利要求40的组合疫苗，该疫苗还包含佐剂。

48.权利要求40的组合疫苗，其中所说的第二免疫原性组合物能够诱导抗由选自下组的病原生物体引起的疾病或病理状态的保护性反应：牛呼吸syncitial病毒、牛病毒性腹泻病毒、I，II或III型副流感病毒、Leptospira spp.、胎儿弧菌、轮状病毒、冠状病毒、狂犬病毒、溶血性巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、Clostridia spp.、破伤风类毒素、大肠杆菌以及Neospora spp。

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