CN1194670C - 用于传染病检测和诊断的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于传染病检测和诊断的方法和组合物。特别是提供了用于活动期分枝杆菌疾病检测的有效和灵敏的方法和组合物，用于区分患有活动期疾病的个体与已经在免疫学上接触过的个体，例如被分枝杆菌感染过但没有活动期疾病的个体或已经进行过BCG疫苗接种的个体。该方法包括将用于透皮释放的抗原组合物局部用药。

Description

用于传染病检测和诊断的方法和组合物

有关申请的交叉引用

本申请要求1998年2月6日提交的美国临时申请60/073911和1998年8月11日提交的美国临时申请60/096140的优先权。

发明领域

本申请涉及用于检测和诊断传染病的方法和组合物。确切地说，本发明涉及包含分枝杆菌抗原的透皮释放系统或装置，其中该系统或装置的用药刺激产生免疫应答，后者对活性分枝杆菌感染的检测和诊断来说是足够的。

发明背景

传染病的检测通常是利用监测免疫应答的试验来完成的。不过在很多情况下，这些试验是麻烦的，经常得出不一致的结果。另外，对生活在不发达地区的个人来说，缺少高级实验室设备，通常降低了试验的有效性，不相称的是在这些地区传染病的发病率可能较高。传染病的准确诊断和检测不仅对于治疗、而且对于预防发病和疾病传播来说也是重要的。对于灵敏和准确的检测方法的需求目前已经变得特别明确，尤其根据由分枝杆菌等引起的感染不断增加来说更是如此。

分枝杆菌感染通常表现为结核等疾病。由分枝杆菌引起的人感染自古已经广为传播，结核在今天仍是一个引起死亡的原因。尽管至少自从十九世纪中叶以来发病率随着生活水平的提高而下降，不过分枝杆菌感染仍然构成医学资源有限的国家一个引起发病和死亡的原因，可导致无免疫应答患者压倒多数的广为传播的疾病。尽管世界上多数卫生组织都作出了努力，也从没有实现分枝杆菌疾病的根除，或者接近根除。世界人口几乎三分之一被结核分枝杆菌复合物感染，普遍称之为结核(TB)，每年新增大约八百万患者，并且每年有三百万患者死于TB。

经过几十年的下降，TB又在上升。在美国，多达一千万人据信被感染。据报道1990年新增近28000例，比1989年增长9.4％。从1985年到1990年增长了16％。生活状况和分享空间过于拥挤更有助于TB的传播，例如在美国观察到在监狱囚犯和大城市的无家可归者当中发病增加。

所有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的大约一半将会感染分枝杆菌，其中TB是尤其具有毁灭性的并发症。AIDS患者临床发展为TB的风险更高，并且抗TB治疗似乎没有对非AIDS患者那么有效。因此，感染通常发展为致命的广为传播的疾病。

在折磨AIDS患者的机会感染中逐渐发现了除结核分枝杆菌以外的分枝杆菌。来自胞内鸟分枝杆菌复合物(MAC)的生物体、尤其是第四和第八血清型，占来自AIDS患者的分枝杆菌隔离种群的68％。发现了庞大数量的MAC(多达10¹⁰个耐酸杆菌每克组织)，因此，感染的AIDS患者预后不良。

世界卫生组织(WHO)继续支持对抗TB的战斗，推荐了主动预防措施，例如“致免疫法的扩展程序”(EPI)，和主动治疗应变性措施，例如“直接观察的短期治疗”(DOTS)。对TB的根除来说，诊断、治疗和预防是同等重要的。活动期TB患者的快速检测有利于早期治疗，而通过早期治疗，治愈率预期为90％。因此，早期诊断对于对抗TB的战斗来说是关键的。另外，治疗应变性不仅确保消除感染，而且减少耐药菌株的出现。

耐药性结核分枝杆菌的出现是极为令人不安的现象。新增TB病例证实耐受至少一种标准药物的速度从二十世纪八十年代的10％增加到1991年的23％。因此，治疗方案的应变性在为消除TB和防止耐药菌株的出现所作的努力中也起决定性作用。

尽管已经鉴别出37种以上的分枝杆菌，不过所有人感染的95％以上都是由六种分枝杆菌引起的：结核分枝杆菌、胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和麻风分枝杆菌。最普遍的人分枝杆菌疾病是结核(TB)，引起结核的分枝杆菌菌种包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌(Merck Manual 1992)。感染通常开始于吸入传染性粒子，它能够到达肺内末端路径。在被肺泡巨噬细胞吞噬后，杆菌能够自由地复制，最后破坏吞噬细胞。继而发生级联效应，其中，吞噬细胞被破坏，导致另外的巨噬细胞和淋巴细胞移行到感染部位，在这里它们也最终被消除了。在最初阶段，疾病通过被感染的巨噬细胞进一步传播，因为被感染的巨噬细胞游走到局部淋巴结，以及进入血流和其他组织，例如骨髓、脾、肾、骨和中枢神经系统(参见Murray等《医学微生物学》The C.V.Mosby Company 219-230(1990))。

对引起分枝杆菌毒性的因素尚不清楚。很多研究暗示，细胞壁脂质和细菌表面是引起菌落形态和毒性的因素。有证据表明，在某些分枝杆菌细胞表面上的C-分枝菌糖苷脂具有重要的促进巨噬细胞内生物体存活的作用。对于其他分枝杆菌，暗示为海藻糖-6，6’-二分枝菌酸酯，它是一种索状因子。

菌落形态与毒性的相互关系在鸟分枝杆菌中特别明显。鸟分枝杆菌以几种显著的菌落形式存在。在常规实验室培养基上长成透明或粗糙菌落的杆菌能够在组织培养物中的巨噬细胞内繁殖，在被注射到易感小鼠体内后是有毒性的，对抗生素是耐受的。保持在实验室培养基上的粗糙或透明杆菌通常自发地呈现不透明的菌落形态，此时它们不能在巨噬细胞内生长，对小鼠是无毒的，对抗生素是高度易感的。透明、粗糙和不透明的鸟分枝杆菌菌株之间的菌落形态差异几乎肯定是由一种糖脂的存在而引起的，该糖脂包被在透明和粗糙生物体的表面上，起到保护荚膜的作用。这种荚膜或包被主要是由C-分枝菌糖苷脂组成的，它显然保护了毒性鸟分枝杆菌生物体不受溶菌酶和抗生素的作用。相形之下，鸟分枝杆菌的无毒的不透明形式在其表面几乎不含有C-分枝菌糖苷脂。对抗生素的耐受性和对被巨噬细胞杀死的耐受性都已被认为是鸟分枝杆菌表面上的糖脂屏障。

分枝杆菌感染的诊断是通过病原体的分离和鉴别而得以确认的，不过常规诊断是基于唾液涂片、胸部X-射线检查(CXR)和临床症状的。培养基上分枝杆菌的分离需要长达四至八周的时间。菌种鉴别进一步需要两周。另有其他若干用于检测分枝杆菌的技术，例如聚合酶链反应(PCR)、结核分枝杆菌直接试验或放大的结核分枝杆菌直接试验(MTD)，以及利用放射性标记物的测定法。

一种广泛用于检测由结核分枝杆菌引起的感染的诊断试验是结核菌素皮肤试验。尽管可以得到多种版本的皮肤试验，不过通常使用这两种结核菌素抗原制剂之一：旧结核菌素(OT)或纯化蛋白衍生物(PPD)。将抗原制剂皮内注射到皮肤内，或者局部用药，然后利用一种多叉接种器侵入性地转运到皮肤内(Tine试验)。皮肤试验诊断方法存在几个问题。例如，Tine试验一般是不被推荐的，因为注射到皮内层的抗原量不能精确地加以控制(参见Murray等《医学微生物学》TheC.V.Mosby Company 219-230(1990))。

尽管结核菌素皮肤试验是广泛使用的，不过它们通常需要2-3天才能产生结果，很多时候结果是不准确的，因为已经接触分枝杆菌但仍健康的受试者有时见到假阳性。另外，经常发生误诊，这是由于不仅活动期TB患者观察到阳性结果，而且BCG-疫苗接种过的人员和已经被分枝杆菌感染但还没有发展为疾病的人员也观察到阳性结果。因此，通过结核菌素皮肤试验难以区分活动期TB患者和其他人，例如家庭TB接触人。此外，结核菌素试验通常引起被除结核分枝杆菌以外的其他分枝杆菌(MOTT)感染的个体的交叉反应。目前可得到的利用皮肤试验所进行的诊断经常引起误差和错误。

需要有效的试验，用于检测分枝杆菌感染的存在。特别是不需要侵入受试者皮肤表面的试验，将减少对受试者体液进行试验的保健人员的接触，减少被可能存在于受试者中的其他传染剂传染的风险。另外，易于进行并且具有易于测定的阳性或阴性结果的试验在监测结核等高传染性疾病治疗方案的应变性时是必要的，特别是针对无家可归者、监狱囚犯、学童和高龄公民等个体。

还需要廉价和准确的方法，用于区分处于疾病活动期的人员和仅在免疫学上接触过传染剂但不处于活动期的人员(例如事先被分枝杆菌感染的人员)，或者已经用BCG进行过疫苗接种的人员。此外，没有已知方法用于监测被分枝杆菌感染的人员中的药物治疗效果，例如能够区分活动期结核和治愈或接触前的其他阶段的试验。而且，还需要能够易于对儿童进行的试验，儿童对目前所用的涉及针头或刺入皮肤的皮肤试验尤其感到害怕。这样的试验对监测AIDS患者来说是特别需要的，他们对分枝杆菌感染是高度易感的。另外，易于进行并且具有易于测定的阳性或阴性结果的试验在监测无家可归者或监狱囚犯的结核等疾病时是必要的。

发明概述

本发明包含用于传染病检测的方法和组合物。按照本发明的一个优选实施方式，提供了透皮释放系统或装置，例如含有分枝杆菌抗原组合物的药贴。将该药贴贴在皮肤上，在预定时间后揭去。然后检查皮肤对药贴内存在的抗原所产生的免疫原性应答。

与现有技术方法不同，本文提供的诊断方法和组合物是高度灵敏的和特异性的。最重要的是，本发明的诊断方法和组合物尤其有效地检测活动期结核患者的结核分枝杆菌感染，从而消除误诊已经接种疫苗或者已经接触该生物体而又没有疾病表现的个体的可能性。

本文所述诊断方法包括局部施用包含分枝杆菌抗原的组合物，用于透皮释放和随后的免疫原性应答检测，其中分枝杆菌抗原包含但不限于MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。抗原可以单独使用，也可以组合使用。特别优选的是局部施用包含MPB64的抗原组合物。本发明针对任何具有MPB64特征的抗原，其特征在于在活动期结核疾病的情况下，存在对抗原的迟发型超敏反应，而对没有接触分枝杆菌者、或者通过疫苗接触或其他非活动期结核状态则没有反应。

因此，本发明的一个目的是提供用于传染病检测的方法和组合物。

本发明的另一个目的是提供用于活动期结核检测的方法和组合物。

本发明的另一个目的是提供用于活动期结核检测的方法和组合物，将用于透皮释放的抗原组合物局部用药。

本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌感染检测的方法和组合物。

本发明还有另一个目的是提供用于由分枝杆菌菌种引起的活动期疾病检测的方法和组合物，其中分枝杆菌菌种包括结核分枝杆菌复合物、胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。

本发明的另一个目的是提供用于由结核分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物。

本发明还有一个目的是提供用于由牛分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物。

本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌感染的免疫检测的方法和组合物，利用局部用药而无需侵入操作。

本发明还有另一个目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的灵敏的诊断方法和组合物，其中抗原组合物被局部施用和透皮释放，随后检查皮肤的免疫原性应答。

本发明的另一个目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物，其中局部用药的分枝杆菌抗原组合物包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。

本发明还有一个目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物，其中局部用药的分枝杆菌抗原组合物包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83，其中该抗原是单独或与另一种分枝杆菌抗原组合用药的。

本发明的另一个目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物，其中局部用药的分枝杆菌抗原组合物包含MPB64。

本发明还有另一个目的是提供易于进行的用于传染病诊断的方法和组合物。

本发明另外一个目的是提供用于活动期结核检测的方法和组合物，用于监测治疗功效。

本发明的另一个目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病诊断和检测的试剂盒。

本发明还有一个目的是提供用于家庭TB或分枝杆菌疾病接触人由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的方法和组合物。

本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌感染患者在化疗后的临床状态监测的方法和组合物。

本发明的另一个目的是提供用于活动期结核儿童的灵敏的诊断方法和组合物。

本发明的进一步目的是提供用于由分枝杆菌引起的活动期疾病检测的灵敏的方法和组合物，其中该方法涉及皮肤药贴的使用。

本发明的这些和其他目的、特征与优点在回顾下列对所公开的实施方式和所附加的权利要求书的详细说明之后将变得显而易见。

附图的简要说明

图1显示不同量MPB64抗原通过豚鼠皮肤反应所产生的剂量效应图。

图2是显示接种BCG后的豚鼠对MPB64抗原药贴的迟发型超敏反应的时间过程的图形。

详细说明

参照下列本文所包括的具体实施方式的详细说明可以更易于理解本发明。尽管本发明已经参照某些实施方式的具体细节加以描述，这些细节也不应当被认为是对本发明范围的限制。本文提到的参考文献全文引用在此作为参照，包括1998年2月6日提交的美国临时申请60/073911和1998年8月11日提交的美国临时申请60/096140。

引起结核等的分枝杆菌感染一旦被认为发病率下降，又有反弹并再次对健康构成严重威胁。人员拥挤在一起或者居住环境在标准以下的地区逐渐发现感染了分枝杆菌的人员。无免疫应答的人员有被分枝杆菌感染并死于该感染的巨大风险。另外，分枝杆菌耐药菌株的出现也增加了感染人员的治疗难度。

很多被分枝杆菌感染的人是贫穷的，或者生活在保健设施不完备的地区。这些人不易于进行分技杆菌感染的试验，他们需要廉价和非侵入型感染检测方法。此外，监狱里的人员或无家可归者一般不具有充分的保健条件，身体状况较差，通常也得不到充分或成功的保健介入。

本发明提供了包含抗原组合物的局部用药的方法和组合物，该组合物用于抗原、特别是分枝杆菌抗原的透皮释放。更确切地说，本发明提供了方法和组合物，用于检测活动期结核等疾病，用于区分活动期疾病人员和仅在免疫学上接触过分枝杆菌等传染剂的人员。

本发明的方法和组合物可用于试验人以及其他动物中分枝杆菌感染的存在。例如，本发明特别可以用于被牛分枝杆菌感染的母牛的疾病检测。

医学上“活动期结核”是通过胸部X-射线(CXR)、唾液试验或其他症状等熟知的医学操作进行诊断的。因为分枝杆菌传染剂的存在的精确鉴别是昂贵的，并且需要较长时间，所以活动期疾病的诊断不必包括分枝杆菌存在的鉴别。因此，结核等活动期疾病的诊断可以依靠检测分枝杆菌感染的其他方面，例如特定免疫应答的产生或某些症状的表现。本文所用的术语“结核”包括通常与感染有关的疾病状态，该感染是由包括结核分枝杆菌复合物在内的分枝杆菌菌种引起的。由除结核分枝杆菌以外的分枝杆菌(MOTT)引起的分枝杆菌感染通常是由包括胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌在内的分枝杆菌菌种引起的。

本发明包括用于局部用药的方法和组合物，局部用药能够实现抗原的透皮释放，抗原引起由分枝杆菌感染引起的结核等活动期疾病人员产生免疫应答，例如迟发型超敏反应。该抗原来源于分枝杆菌，或者与分枝杆菌蛋白质或碳水化合物部分具有交叉反应性。优选的抗原包括但不限于来源于分枝杆菌的MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。特别优选的是抗原MPB64(参见Kawajiri等日本专利申请公报，其全文引用在此作为参考文献)。09206092

另一种优选的抗原组合包括MPB64与MPB59的组合使用。例如，MPB59与MPB64的组合可以指示非典型分枝杆菌的感染，因为被不分泌MPB64的其他种类分枝杆菌感染的受试者将对MPB59显示阳性应答。

MPB64是一种经常与结核分枝杆菌复合物有关的分枝杆菌抗原。Harboe等首先描述其为MPT64(《传染与免疫性》1986；52：293-902，全文引用在此)，此后已经进行了充分的特征化鉴定，并用在各种实验室中(例如参见Yamaguchi等《传染与免疫性》1989；57：283-288，全文也引用在此)。“MPB64”和“MPT64”指同一种抗原：MPT64是从结核分枝杆菌的培养物滤液中分离到的，因此命名为结核分枝杆菌蛋白，MPB64是后来从牛分枝杆菌(或BCG)的培养物滤液中分离到的，因此命名为牛分枝杆菌蛋白。随后发现这两种蛋白质是相同的。MPB64和MPT64指选自分枝杆菌菌种的抗原，所选择的分枝杆菌菌种包括但不限于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG的某些菌株。抗原是在细菌生长过程中分泌出来的，并且是免疫原性的，引起豚鼠和人产生迟发型超敏反应(DTH)。

重组抗原也可以用在本发明所预期的诊断方法和组合物中。例如参见Haga等《白细胞生物学杂志》1995；57：221-225；Roche等《临床与实验免疫学》1996；103(2)226-232；Roche等《传染病杂志》1994；107(5)：1326-30，各自全文引用在此。

本发明抗原通常用于透皮释放到供试者皮肤内。抗原的使用方法是保持包含抗原的组合物与皮肤紧密接触。组合物中抗原的浓度在大约1至150微克/所用剂量的范围内，更确切为10至100微克/所用剂量，最确切为30至75微克/所用剂量。抗原组合物可以包含一种生理学上有效的溶液，溶液中含有表面活性剂、缓冲剂和溶剂，能够实现抗原组合物的透皮释放。优选使用这样的表面活性剂、缓冲剂和溶剂，它们增加抗原的渗透和转运，本身不引发反应或者干扰抗原的免疫原性。优选用于抗原组合物的表面活性剂包括吐温20、吐温40、吐温60和吐温80；各自在磷酸盐缓冲盐水中的使用浓度可以是0.001-10％、0.001-1％，优选为0.005％。一种优选用于用药的实施方式在100微升磷酸盐缓冲盐水中包含30至75微克抗原，进一步包含优选的表面活性剂吐温80。最优选用于用药的实施方式是在100微升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中含有75微克抗原和0.005％吐温80。所制备的抗原组合物可以根据需要量分批或分等份贮藏在适当的无菌玻璃或塑料容器内。

本发明特别涉及抗原组合物到皮肤细胞的透皮释放方法，用于活动期疾病的检测。照此包括所有所预期的能够实现传染剂抗原到皮肤细胞的释放从而进行活动期疾病检测的溶剂和抗原组合物。

本文所用的术语“透皮释放”指组合物到皮肤各层的释放，包括但不限于表皮(角质层、透明层、颗粒层、生发层、基底层)、真皮和皮下层。本文所用的术语“局部用药”指组合物施用或放置在皮肤上，而不用针头等刺穿或侵入性地进入皮肤。

本发明的一种优选实施方式包括透皮释放系统或装置，用于使上述组合物与人皮肤保持密切接触。非常优选的实施方式包括药贴带，例如皮肤药贴带，用于使组合物与皮肤保持密切接触。适合用在用于释放本发明抗原组合物的药贴中的材料包括TORII药贴绷带“Toriiban^TM”(从Torii and Co.，Ltd.，Tokyo得到)、Finn-chamber和Perme-aid S.(Nitto-Denkou Co.Japan)。另外，也可以使用医用橡皮膏或胶带等材料，其中一部分硬膏或胶带包括一部分浸润了抗原组合物的材料，并使该材料固定，使其直接与皮肤接触。适合的医用橡皮膏、胶带和织物由多家厂商制造，例如Nichiban(Japan)、Kimberly-Clark(Neenah，Wisconsin)和3M(St.Paul，Minnesota)。该装置可以用本领域技术人员熟知的各种固定方法固定。例如，可以利用细绳将装置系在受试者手臂上，或者可以利用橡皮膏将装置贴上。优选地，用于固定装置的橡皮膏等材料应当是透气的和防水的，使其不会由于出汗或沐浴而受潮脱落。

本发明一个特别有利的方面涉及本发明使用和实施容易。例如，抗原组合物整体可以通过在适当温度条件下将组合物装运或保持在无菌容器内进行保存。抗原组合物可以分所需量的等份贮藏，例如100或200μl，然后用于纱布、硬膏或胶带等，这对试验患者来说是必要的。进而，组合物的各必要组分和本发明的方法可以一起提供在试剂盒中，有助于使用。

除了药贴型实施方式以外，本发明也可以采取本领域技术人员已知的其他透皮药物释放载体的形式，包括但不限于凝胶、霜剂、液体喷雾剂等。

本发明所预期的优选方法包括包含分枝杆菌抗原的组合物的局部给药，用于人的透皮释放。例如，将含有抗原组合物的药贴施用在人的前臂上，并保持与皮肤的密切接触。药贴留置预定时间，使抗原能够充分地透皮释放。这样一种时间范围可以是1至7天，优选为2至5天，最优选为3天。经过指定时间后，揭去药贴，检查皮肤的免疫原性应答。

本领域已知，响应于某些抗原的存在，在皮肤上观察到迟发型超敏反应。通常，这种反应是在抗原组合物的侵入之后观察到的，这种反应的特征是发红、红斑、硬结(皮肤增厚)、红色水泡的出现或溃疡。在本发明方法中所要寻找的应答类似于用分枝杆菌抗原皮内注射所见到的应答。

本发明人已经惊奇地发现，本发明抗原通过局部用药的透皮释放导致患有结核等活动期分枝杆菌疾病的人员产生免疫原性应答(具体来说是迟发型超敏(DTH)反应)。如本文实施例所示，TB感染的豚鼠对抗原MPB64表现出迟发型超敏皮肤反应，只要该细菌继续生长；相形之下，用BCG-Tokyo致免疫的豚鼠在疫苗接种后一定时间丧失对MPB64的迟发型超敏性。正如发明人所公开的，包含分枝杆菌抗原、特别是MPB64的本发明方法和组合物可用于活动期分枝杆菌疾病的诊断，例如活动期TB。令人惊奇的是，被结核分枝杆菌感染但是还没有发展为结核的个体和预先已经接受过BCG疫苗接种的个体不显示响应于MPB64的阳性皮肤反应。

抗原、特别是MPB64通过局部用药的透皮释放用于诊断结核等活动期分枝杆菌疾病，这一新发现尤其是令人期望的，因为不需要侵入性操作。事实上，MPB64的皮内释放最近已经显示在区分TB患者与健康对照者上是不成功的(Wilcke等《结核与肺疾病》(1996)77：250-256)。分枝杆菌抗原通过局部用药的有效透皮释放迄今是未知的，利用本发明的方法和组合物，本发明人已经成功地研究出诊断操作，用于区分活动期TB患者与健康PPD-阳性对照者。

抗原的皮内注射可能不如透皮用药那么有效的一个原因被认为涉及抗原的溶解度和/或抗原呈递的机会不当，不过并不希望受到该理论的局限。例如，借助皮内注射，抗原可能快速溶解在体液中，免疫系统没有充分的时间识别和/或响应它。相形之下，本发明的新方法能够使抗原逐渐引入到受试者的免疫系统内，由于抗原缓慢地通过皮孔和汗腺渗透到皮内的局部，免疫系统有足够时间封固应答，通常是以迟发型超敏反应的形式。抗原的皮内和透皮引入也可能引起显著的免疫应答。

超敏反应(已知也叫IV型或细胞介导的免疫反应)被认为大部分是由T细胞介导的，并继之以单核细胞的参与，不过并不希望受到该理论的局限。该反应通常具有在经过一段时间后才观察到的应答，即18-24小时，因此称之为迟发型超敏性。抗原呈递细胞被认为向T细胞呈递抗原，在激活后T细胞释放淋巴因子，导致巨噬细胞、单核细胞和非免疫淋巴细胞的蓄积和激活。

本发明也可用于检测以前感染的TB患者的家庭接触人的活动期结核。这可以监测疾病传播到与最初感染人员有密切接触的其他人。因为公众可能患有结核，并通过咳嗽传播，因此本发明可用于监测为公众工作的人员接触，例如飞机乘务员或保健人员。为无家可归者或监狱人群工作的人员也易于监测活动期结核的存在。

本发明的一个尤为可取的用途是监测对患有分枝杆菌感染的人员的治疗功效。例如，随着耐药性分枝杆菌的增加，非常需要检测活动期结核患者不再具有活动期TB、即治疗有效的能力。一种优选的方法包括在治疗前将本发明的抗原对具有活动期TB的人员局部用药，经过充分的时间后，观察皮肤反应。在治疗方案的后面的步骤中，将抗原再次用药，观察皮肤反应。没有皮肤反应说明治疗已经有效地改变了活动期结核状态。皮肤的连续反应说明治疗是无效的，或者还没有足够的时间使治疗生效，人员仍具有活动期TB。此时，可以改变治疗，可以测定感染的分枝杆菌的药物敏感性，或者可以继续相同的治疗较长时间。

本发明的一个用途将用于人群的快速筛选，例如调查相邻地区或贫民区的感染率，用于试验入狱人员、收容所或街头的无家可归者。例如，入狱人员在刚入狱时即发给他们含有本发明抗原的药贴。佩带药贴一定时间后，检查囚犯的皮肤反应。阳性反应者将被单独安置。因为本发明检测活动期TB，所以可以将这些囚犯与其他囚犯隔离，并立即开始治疗。其他TB试验能够检测在其生命中的某时接触过TB和也许不能将TB传染给其他人的囚犯。不能将TB传染给其他人的囚犯不需要隔离和治疗。

在世界上的很多地区，人们接种了抗TB疫苗。在这些人身上极难检测活动期TB，因为在标准TB皮肤试验的条件下，所有接触过分枝杆菌的人都呈阳性，而无论存在活动期TB还是疫苗接种的结果。本发明在这种情况下用于检测个体中活动期TB的存在，将他们与预先接种过疫苗的人员区分开来。

给药的简易性是本发明的一个特别有利的方面。例如，儿童对药贴等局部装置用药不感到害怕，不加迟疑地佩带这样的装置一定时间，足以产生皮肤反应。药贴等局部装置易于贮藏和运输到闭塞的地方，那里可能缺乏冷藏条件和净水。本发明可以从廉价材料制成，生产成本低，可以被世界范围内的保健组织使用。

本发明通过下列实施例加以进一步阐述，实施例无论如何不被解释为对发明范围的限制。相反，本领域技术人员在不背离本发明精神的前提下，在阅读说明书之后可以诉诸其他各种实施方式、改进和等价方式。

实施例1

为了试验新颖、简便和快速的活动期结核诊断方法，试验受试者对MPB64的皮肤反应，利用可揭去的药贴进行抗原组合物的局部用药，然后进行透皮释放。

皮肤贴剂

尽管MPB59、MPB70、MPB44、MPB45、MPB51或MPB64等抗原都可以用在本发明的药贴试验中，不过在下例中所用抗原是MPB64，浓度大约为75μg每贴。预期使用大约50至100μg抗原每贴是成功的。优选的抗原溶液包含大约750μg抗原每ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)，其中的PBS由0.005％吐温80组成。

将药贴施用到受试者皮肤上，留置三天，揭去药贴后观察用药部位。存在免疫应答指示阳性结果，例如迟发型超敏(DTH)反应(发红、硬结或小红泡)，也就是存在活动期结核。用药部位没有变化表示阴性反应。

受试者

试验了53名活动期结核患者和43名健康的纯化蛋白衍生物(PPD)阳性对照，以测定对MPB64的反应是否仅在活动期结核患者中是阳性。检查了来自菲律宾马尼拉附近的四个诊所Our Lady of Grace Parish、Sto. Nino de Tondo Parish、Canossa Health and Social Center和Health Care Development Center的结核患者。

53名活动期结核患者中，52名显示对MPB64的阳性反应，而43名PPD-阳性对照中没有一名具有对MPB64的阳性反应。MPB64对活动期结核的特异性为100％，灵敏度为98.1％。试验的效力为98.9％。

MPB64药贴试验是有效和准确的用于活动期结核诊断的方法，区分患者与BCG-疫苗接种过的个体和自然感染但没有发展为结核的个体。用于该发现的实验设计详见实施例2所述。

实施例2

为了测定MPB64作为皮肤药贴法诊断活动期TB的特异性抗原的可靠性，在下列三组不同个体间进行对比试验：

(1)活动期TB患者；

(2)健康的结核菌素-阳性人员；

(3)家庭TB接触人。

观察了人对MPB64的皮肤反应与TB的临床状态之间的相互关系。因为本项研究的目的是测定MPB64作为用于活动期TB的特异性诊断抗原的可靠性，所以活动期TB患者的选择是最重要的。

检查门诊患者的临床记录。将唾液涂片阳性、CXR异常和具有活动期TB临床症状的患者分为活动期TB患者第1组。培养结果在多数情况下是不可得到的。不久前刚开始化疗的患者是优选的，因为长期化疗对MPB64皮肤反应的影响是未知的。不过，第1组中也有一些患者已经治疗了6个月。根据在最近的检查中涂片呈阳性以及症状表现，他们被认为是活动期TB患者。

患者生活在诊所附近，那里的社会经济条件非常差。他们居住的地理位置是重要的，因为他们被安排3天后返回诊所以读取结果。105名试验患者中只有12名没有返回。在返回的患者中，53名可用于最后的分析。分析结果如表1所示。其余患者排除在外，因为他们的药贴在读取结果当天之前已经揭去或脱落了。

根据临床记录筛选患者，仅选择涂片阳性、CXR异常和具有咳嗽、发烧或体重降低等指示TB的其他症状的患者作为活动期TB患者。培养物阳性的患者是优选的，但是培养物的结果仅有七例可以利用。多数活动期TB患者已经化疗1-4个月。有一些在进行研究时已经治疗了6个月。健康的结核菌素阳性志愿者是不显示任何TB指征的菲律宾人和日本人。在进行试验时，一些家庭成员陪TB患者也来到诊所。他们作为“家庭TB接触人”进行试验。所有受试者都被告知研究的大致情况，并同意进行试验。三组供试者数量如下：第1组活动期TB患者，53；第2组健康对照，43；第3组家庭TB接触人，41。

从东京牛分枝杆菌BCG(从日本东京的日本BCG实验室得到)的8天培养物滤液中分离到MPB64。将纯化蛋白悬浮在PBS中，贮藏在-20℃下。用Lowry法测量蛋白质的量。将从牛分枝杆菌BCG的8天培养物滤液中用硫酸铵沉淀出来的全蛋白命名为PPD-eT，以区分纯化蛋白衍生物结核菌素(PPD)，用作药贴试验的对照。从结核分枝杆菌AoyamaB制备的PPD是从日本BCG实验室(日本东京)得到的。将五个结核菌素单位(TU)的悬浮在0.1ml重建缓冲液中的PPD用于芒图氏皮内注射试验。

药贴试验材料

使用15mm纱布大小的TORII药贴绷带“Toriiban^TM”从Torii andCo.，Ltd.，Tokyo得到)。将抗原溶液(75μg抗原的100μlPBS溶液，含有0.005％吐温80)倒在纱布上，将药贴贴在受试者前臂上，前臂上药贴用药的皮肤区域已经用酒精清洁过。药贴放置在受试者皮肤上，使浸润有抗原溶液的纱布直接与皮肤接触。药贴留置72小时。

药贴试验安排

试验活动期TB患者和结核菌素阳性健康对照对左臂上的MPB64药贴和右臂上的PPD-eT药贴的皮肤反应。每种药贴含有75μg抗原。将PPD皮内注射(5TU/100μl)到右前臂上不同于药贴的位置。PPD-eT药贴用于确认蛋白质抗原没有透皮进入到体内。如果PPD试验阳性而PPD-eT药贴试验阴性，那么透皮给药是不完全的。这种情况排除在试验结果之外。

3天(72小时)后揭去药贴，将反应结果判断为阳性或阴性。用药部位皮肤没有变化为“阴性”，而用药部位出现红斑、硬结或若干小红泡则记录为对抗原呈“阳性”应答。

我们比较了药贴在前臂和上臂的用药。在读取结果当天以前，药贴从上臂脱落(41.2％)比从前臂脱落(17.6％)更为容易。因此，前臂是成人试验所推荐的。

统计学

二乘二偶然性试验用于评价人MPB64药贴试验结果。

活动期TB患者和结核菌素阳性健康对照

表1显示第1组和第2组中对MPB64反应阳性或阴性的实际数目。所有受试者都对PPD芒图氏试验和PPD-eT药贴试验呈阳性。由这些结果计算下列数值：灵敏度98.1％；特异性100％；假阳性率0％；假阴性率1.9％；阳性预期值100％；阴性预期值97.7％；试验效力98.9％。结果说明，MPB64药贴试验是有效区分活动期TB与健康结核菌素阳性人员的方法。

表1

MPB64药贴试验

第1组与第2组之间的二乘二偶然性试验

组	阳性	阴性	总计
				1：TB患者	52	1	53
2：健康对照	0	43	43
				总计	52	44	96

家庭TB接触人

家庭TB接触人(第3组)的数量是41，包括12名男性和29名女性。药贴试验结果如表2所示。有26名受试者显示对PPD-eT和MPB64药贴的阳性反应(63.4％)，九名受试者对PPD-eT阳性而对MPB64阴性(22.0％)。六人(14.6％)对PPD-eT和MPB64阴性。在这些双阴性人员中，三名对PPD芒图氏试验阴性。

第3组受试者在临床上不被记录为TB患者。各人的临床状态是未知的，尽管观察到了某些提示为TB的症状。

表2

家庭TB接触人的MPB64和PPD-eT药贴试验

PPD-eT/MPB64
					受试者	+/+	+/-	-/-	总计
男性	7	3	2	12
					女性	19	6	4	29
总计	26	9	6	41

本项研究强烈地提示，MPB64药贴试验是有希望用于活动期TB的快速诊断的工具。它能够区分活动期TB患者与接种过BCG疫苗的个体或被TB感染但还没有发展为疾病的个体，灵敏度为98.1％，特异性为100％。该药贴试验还具有优于皮内注射的优点，即技术简易和用药安全。该药贴试验据认为能够为患者产生应答而连续地供应抗原，不过并不希望受任何理论的局限。

实施例3

为了测定MPB64作为利用皮肤药贴法用于活动期TB的特异性诊断抗原的可靠性，在豚鼠上进行了对比试验。

从Japan Laboratory Animals，Inc.，Tokyo购买雌性白化体Hartley豚鼠，在实验开始时重300至400g。动物在日本BCG实验室保持在无特异性病原体的条件下。

抗原

按照实施例2所述方法和材料制备抗原。

豚鼠的致免疫

按照厂商说明书重建活体BCG疫苗(日本BCG实验室，日本东京)，无佐剂方式皮下注射给豚鼠，剂量为0.5mg每只动物。在BCG注射后的4与25周之间对动物进行试验。

药贴试验材料

使用7mm纱布大小的TORII药贴绷带(从Toriiand Co.，Ltd.，Tokyo，Japan得到)。将抗原溶液(75μg抗原的15μlPBS溶液，含有0.005％吐温80)倒在纱布上，将药贴贴在每只豚鼠的去毛部位上。

将MPB64用在药贴上，剂量如图1所示，将药贴贴在BCG-致免疫的豚鼠右侧与左侧胁腹上，其上的毛已被除去。

药贴试验安排

24小时后揭去药贴，立即读取反应结果。用药部位皮肤没有变化为“阴性”，而用药部位出现红斑、硬结或若干小红泡则记录为对抗原呈“阳性”应答。

BCG-致免疫的豚鼠药贴试验中对MPB64的剂量应答

预先用BCG Tokyo致免疫4周的豚鼠用于MPB64药贴试验，抗原剂量各不相同。药贴试验的最高剂量为75μg/贴。用含有2.3至75μg/贴不等的MPB64的药贴对动物进行试验。24小时后揭去药贴，读取反应结果为阳性或阴性。为了确使动物对BCG敏感，皮内注射0.05μgPPD的0.1ml缓冲溶液，在24小时后测量皮肤反应。图1显示剂量-应答实验结果。在4.7μg/贴的剂量或更高浓度下，对MPB64的应答为阳性。在2.3μgMPB64每贴的剂量下没有观察到阳性反应。阴性对照药贴仅含有PBS，PBS含有0.005％吐温80，在BCG-致免疫的豚鼠中没有引起任何皮肤反应。未致免疫的豚鼠未显示出对PPD或MPB64的任何应答。

BCG-致免疫的豚鼠对MPB64的皮肤反应的时间过程

已知在用MPB64的皮内注射进行试验时，BCG-致免疫的豚鼠在BCG致免疫后15周丧失对MPB64的皮肤反应。为了确认这一点在药贴试验中是否也是如此，将豚鼠用BCG Tokyo致免疫，在BCG注射后的不同时间用MPB64药贴进行试验。各动物仅试验一次，以避免加强效应。作为对照，同时对每只动物施用PPD-eT药贴试验。结果如图2所示。DTH以3+、2+等表示，因为反应直径是通过药贴大小来调节的，而不是通过抗原剂量。所有动物对MPB64药贴试验的皮肤反应直到BCG注射后13周还都是阳性。后来变得几乎不可检测，在23周后完全为阴性。相形之下，对PPD-eT药贴试验的反应直到BCG注射后25周实验结束仍然保持阳性。

在BCG注射后不同时间检查对MPB64和PPD-eT的迟发型超敏性(DTH)。图2各点代表3只豚鼠的迟发型超敏性，表示如下：3+：红斑和硬结；2+：红斑；1+：小泡；+/-：颜色模糊(可疑反应)；-：没有反应。

豚鼠药贴试验确认，用于人的抗原剂量的1/16引起阳性反应。

当然，不言而喻的是，前述内容仅涉及本发明的优选实施方式，在不背离本发明精神和范围的前提下可以作出大量改进或变更。

Claims (10)

1、用于诊断传染病的透皮释放装置，包括组合物的局部用药，该组合物包含抗原和生理学上有效的溶液，该装置还包含选自由医用胶带、医用橡皮膏、纱布、TORII绷带、Finn-chamber和Perm-aide S.组成的组中的材料。

2、权利要求1的装置，其中的抗原是来源于分枝杆菌菌种的，包括结核分枝杆菌复合物、胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。

3、权利要求2的装置，其中的抗原包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。

4、权利要求1的装置，其中的抗原包含MPB64，生理学上有效的溶液包含磷酸盐缓冲溶液和吐温80。

5、权利要求4的装置，其中的传染病包括结核。

6、权利要求1的装置，其中的生理学上有效的溶液包含表面活性剂、缓冲剂或溶剂。

7、权利要求6的装置，其中的生理学上有效的溶液包含磷酸盐缓冲溶液，其中包含吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。

8、用于检测传染病的组合物，包含

抗原，和

在局部用药后用于透皮释放的生理学上有效的溶液，

其中的抗原来源于分枝杆菌。

9、权利要求8的组合物，其中的抗原包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。

10、权利要求9的组合物，其中的用于透皮释放的生理学上有效的溶液包含表面活性剂、缓冲剂和溶剂。