CN119331901A - 水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用，本发明利用CRISPR/Cas9技术针对OsNAC113基因设计特定的sgRNA，构建了敲除水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas9基因编辑突变体。对逆境胁迫响应因子OsNAC113进行基因组编辑以获得抗逆性更强的水稻新种质。本发明获得了耐盐性更强的OsNAC113敲除突变体材料。能直接应用于农业生产。

Description

水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用。

背景技术

在全球范围内，超过6％的土地面积正在越来越多地受盐分积累的影响，高盐危害植物生长、作物生产和生态系统平衡，土壤盐渍化已成为世界各地的农业面临的主要非生物胁迫之一。植物在高盐环境下会受到高渗透势的影响，这本质是一种渗透胁迫，会严重影响植物的生长。高盐条件下，即使水分和各种营养都充足，植物也可能枯萎死亡。盐含量的不平衡可能会干扰基本营养素的吸收，进而导致元素之间的竞争(即拮抗作用)。钠离子影响土壤的结构和特性，间接对植物根系造成损害。高盐胁迫下，植物细胞壁会发生组分和结构变化并加强多聚糖合成和相关修饰基因的表达来维持细胞的完整性和提高对盐胁迫的适应性。目前，盐胁迫已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、海马齿(Sesuviumportulacastrum)、大豆(Glycine max)等多种植物中得到广泛研究，这些植物已经进化出各种机制来抵抗盐胁迫，包括渗透调节、活性氧(ROS)清除、离子稳态和以及植物激素的调节。同时，过量的盐也可能使氨基酸合成遭到破坏，从而导致一些如逆境胁迫有关的蛋白质合成量降低。

转录因子的本质是一类调节基因表达的调控基因，它能与靶基因启动子区的顺式作用元件结合激活或抑制靶基因的转录，最终确保所调控的基因在时间和空间上得到准确的表达。转录因子对植物细胞周期的调控、代谢途径的平衡以及逆境胁迫的应答等方面都具有重要的作用。植物中存在大量的逆境胁迫应答转录因子，在水稻中，已经鉴定出56个家族共2408个转录因子。其中AP2/ERF(APETALA2)/(Ethylene responsive elementbinding)、bZIP(basic region/leucine zippermotif)、DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、NAC、MYB(v-myb avianmyeloblastosis viral oncogenehomolog)和WRKY等家族成员众多，已发现在逆境胁迫反应中起到重要作用。

NAC转录因子是植物最大的转录调节因子家族之一，基因家族成员在参与逆境胁迫过程中发挥着重要作用。NAC转录因子参与调节植物对干旱、高盐、低温、病毒和其他胁迫性损害的抵抗力，并参与调节植物形态、根系生长和延伸以及叶片衰老。以目前文献表明，虽然NAC转录因子家族具有重要调控作用，但是其家族成员较多，研究内容不够深入，多数成员生物学功能尚不明确，对于生产实践中应用造成很大困扰。

研究所关注的NAC转录因子是植物中特有的转录因子家族，在不同植物中，其家族成员在逆境胁迫响应中具有重要调控的作用。现阶段，水稻基因组中共注释了158个NAC转录因子家族成员，但已报道明确基因功能的成员数量十分有限。由于突变体材料的缺乏导致大部分NAC家族成员的功能难以解析，并且水稻天然突变体数量非常少且背景不清晰，T-DNA插入以及理化诱变等创制突变体方式周期较长且成本高，并且难以针对目的基因进行准确的突变体创制，因此传统的突变体创制方法已经不足以满足实验的要求。近几年研究的前沿技术CRISPR-Cas9基因组编辑技术可以有效的弥补这一缺陷。其优点在于不但可以快速准确的针对目的序列进行编辑，并且可以在后代扩繁过程中通过分离筛选得到不含外源载体的植株，防止外源基因对于突变体后续研究造成影响。

基因编辑技术利用位点特异性核酸酶切割基因组中的某一特定DNA片段，导致双链断裂(double-strandbreak，DSB)。然后，利用生物体自身的修复系统来删除、插入、替换和突变特定的DNA片段，从而实现靶基因的序列变化，并影响基因的表达和功能。特定蛋白缺失的情况下，检测信号通路运作和异常可以深入了解该蛋白发挥的作用。它可以发挥直接的功能性作用，也可以作为反馈调节过程的一部分。目前，基因编辑技术CRISPR/Cas系统已经广泛应用于研究中。区别于技术既复杂又耗时第一代和第二代的基因编辑技术，CRISPR/Cas可以的轻松、准确和高效改变各种基因组。基因组编辑彻底改变了真核生物的DNA操作，实现了单碱基对的精确突变、插入或缺失、DNA片段替换和核苷酸碱基转换。大大提高了基因编辑的特异性。该技术进一步提高了DNA编辑的潜力。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一方面：本发明提供了水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用，所述水稻OsNAC113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所；其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述应用为降低水稻OsNAC113基因的表达量或减弱所述水稻OsNAC113基因的功能，从而提高水稻耐盐性。

优选地，所述应用为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除水稻中的OsNAC113基因。

本发明的第二方面：本发明提供了靶向突变水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统在构建OsNAC113基因突变体的应用。

本发明的第三方面：本发明提供了靶向突变水稻OsNAC113基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA设计于水稻OsNAC113基因第一个外显子处。

本发明的第四方面：本发明还提供了一种提高水稻耐盐性的方法，通过降低上述水稻OsNAC113基因的表达量或减弱所述水稻OsNAC113基因的功能从而提高水稻的耐盐性。

本发明的第五方面：本发明还提供了一种敲除载体，所述敲除载体为通过goldengate克隆技术构建的包含靶向敲除水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas表达载体。

本发明的第六方面：本发明还提供了一种创制耐盐性提高的水稻突变体的方法，包括以下特征步骤：

以OsNAC113基因为编辑靶基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除OsNAC113基因后通过扩繁获得纯合突变体植株，即为耐盐性提高的水稻突变体；

其中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述OsNAC113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

水稻中被鉴定的NAC转录因子有158个，但被研究过并证明其功能的却很少。本发明对OsNAC113组织特异性及胁迫条件诱导表达特征分析，结合CRISPR/Cas9技术，对靶基因进行定点突变，获得水稻逆境胁迫响应OsNAC113功能缺失突变体，在萌发期与成苗期盐胁迫条件下突变体OsNAC113长势均明显好于野生型。说明敲除OsNAC113后，植株耐盐性增强。对于胁迫处理后的植株进行了生理指标检测，发现相对含水量、叶绿素含量、及氧化还原酶相关活性突变体均高于野生型，MDA及其他有害物质积累均为野生型较多，此结果也说明，敲除OsNAC113后功能缺失突变体能够增强植株高盐胁迫耐受性。因此本发明建立并公开了一种新的提高水稻耐盐性方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中的OsNAC113基因表达以改良水稻耐盐性。并通过CRISPR/Cas基因编辑技术创制敲除OsNAC113基因的水稻定向编辑突变体，得到耐盐性显著性提高的突变植株。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明利用CRISPR/Cas9技术针对OsNAC113基因设计特定的sgRNA，构建了敲除水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas9基因编辑突变体。对逆境胁迫响应因子OsNAC113进行基因组编辑以获得抗逆性更强的水稻新种质。本发明获得了耐盐性更强的OsNAC113敲除突变体材料。能直接应用于农业生产。因此，本发明无论是在理论还是在创制新种质中都具有比较好的成果推广前景。

附图说明

图1为OsNAC113外显子的sgRNA位点的设计图；

图2为重组载体PCR鉴定产物电泳结果；

图3为OsNAC113基因型鉴定结果；

图4为OsNAC113突变体呈现抗盐表型；

图5为突变体在盐胁迫下相对含水量；

图6为突变体在盐胁迫下叶绿素含量；

图7为突变体在盐胁迫下可溶性糖含量；

图8为突变体在盐胁迫下SOD活性；

图9为突变体在盐胁迫下POD活性；

图10为突变体在盐胁迫下MDA含量；

图11为突变体在盐胁迫下CAT活性；

图12为再生植株转基因阳性鉴定结果。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创。

实施例1

1、CRISPR-Cas9编辑表达载体构建

1.1sgRNA引物设计

(1)从数据库网站NCBI下载OsNAC113基因序列；利用在线网站Crispr-P对sgRNA进行设计及筛选，筛选脱靶效率预测较低，GC含量低于50％的sgRNA靶点，进行引物合成，进而用作载体构建。

得到的引物序列为(5’-3’)：

OsNAC113-sgRNA1-F：GTGTGCGGGGAGGAGGGGTGTACGGOsNAC113-sgRNA1-R：AAACCCGTACACCCCTCCTCCCCGC

1.2敲除载体载体构建

(1)退火sgRNA引物

携带sgRNA上下游片段的引物10ul混合，98℃变性5min放置室温冷却。根据pZHY988骨架载体使用，同时完成限制性内切酶BsaI酶切与连接sgRNA。具体的酶切连接反应体系(20ul)如表1所示：

表1酶切连接反应体系

设置以下程序进行反应：37℃，5min→16℃，10min)10个循环→37℃，15min→80℃，10min。

(3)大肠杆菌杆菌感受态转化

2μL连接产物加入30μL冰上融化状态下感受态，混匀后冰浴30min；热激42℃，30s，冰浴3-5min；无抗性LB培养基进行复苏，37℃，200rpm孵育1h；部分菌液涂布于LB固体培养基(含有100mg/L Kan)，38℃过夜培养12h。

1.3菌液PCR鉴定和测序

在超净工作台内挑选10个单菌落同时进行1.5ml EP管接菌(加入500μL含Kan的液体LB培养基，37℃，200rpm孵育3-4h)和PCR产物鉴定。取1μL菌液进行PCR检测(表2)，反应体系见表3，反应程序参照表4。选取1-3个阳性条带送sanger测序。

表2应用引物序列

表3PCR体系

表4PCR反应程序

1.4重组质粒鉴定

利用庄盟质粒提取试剂盒提取携带敲除载体质粒，左右两端的pZHY988-F/R为引物进行PCR扩增鉴定，PCR体系和反应程序如表2和3。选择两个有条带的样品送至金唯智进行测序，测序正确的质粒用于进行以下实验。质粒提取的具体步骤如下：

(1)将在摇床过夜培养8mL菌液分批加1.5mL离心管12000rpm，1min离心获得菌体；

(2)将250μL溶液1加入离心管中，旋涡震荡使菌体重悬；

(3)向其中加250μL溶液2，温和的上下颠倒5-6次；

(4)再加350μL溶液3，马上温和颠倒5-6次，12000rpm离心10min；

(5)吸取离心后得到的上清液加到放好的吸附柱中，12000rpm离心1min后倒掉废液；

(6)吸取700μL的漂洗液W2加入吸附柱中，离心20s后倒掉废液；

(7)吸取500μL的漂洗液W2加入吸附柱中，离心20s后倒掉废液；

(8)把吸附柱放好后，相同转数离心2min除去残留的废液；

(9)离心好的柱子放到一个新的1.5mL离心管中，悬空滴加80μL的洗脱缓冲液TE到吸附膜的正中，相同转数离心1min得到质粒并测定浓度以备后续实验使用。

1.5重组质粒转化农杆菌感受态细胞

取1μL构建成功的敲除载体质粒加入EHA105感受态细胞，冰浴30min；放入液氮处理计时5min后37℃水浴5min，结束后再次放置冰上冰浴3min；加入600μL LB无抗性液体培养基，28℃摇床200rpm培养4-5h；8000rpm离心2min收集菌体，弃上清，重悬后LB+50mg/LKan+50mg/L Rif均匀涂布，28℃培养箱倒置培养2-3天后选取单菌落进行PCR验证，保存后以备后续水稻遗传转化。

2、水稻稳定转化步骤

水稻种子剥壳，20mL 75％乙醇清洗90s；无菌水洗涤30s，重复两次；15％NaClO(加一滴吐温)消毒种子15min，清洗一次；15％NaClO溶液消毒种子15min；灭菌后蒸馏水冲洗90s，6次后滤纸晾干；将种子接种在N6D培养基上，32℃光照培养箱连续光照培养7d，获得愈伤后备用转化。农杆菌扩大培养(28℃，200rpm)至OD600＝0.1左右。用无菌离心管收集菌液，常温下6000rpm离心5min收集菌体。将培养7天的愈伤组织，在上述AAM农杆菌重悬液中，侵染约90s，晃动至均匀侵染。侵染后愈伤组织用灭菌的滤纸去除多余的菌液；共培养培养基2N6D-AS上，25℃黑暗培养3-3.5d。侵染后愈伤用适量无菌水洗涤5次，每次90s；含400mg/L羧苄青霉素(Carb)的无菌水洗涤30min；滤纸擦干放置在具有对应抗性的筛选培养基中，32℃连续光照培养2周，更换培养基直至再生植株。分化再生培养基REIII上，培养4周。植株转接到生根培养基HF上，诱导生根。鉴定后转基因阳性的移栽至营养土中，进行温室培养。

3、水稻CRISPR-Cas9阳性转化再生植株鉴定

再生植株首先提取部分叶片DNA进行转基因阳性鉴定，所用引物为CAS9蛋白部分特异性序列。转基因阳性植株进行目的基因片段扩增sanger测序，具体步骤如下。

3.1提取水稻基因组DNA

取再生植株部分叶片200g以上进行液氮冷冻后进行提取水稻DNA。植物提取DNA详细步骤如下：

(1)取100mg左右的新鲜水稻叶片加入1.5mL离心管中，用液氮充分研磨后，加入400μL BufferLP1和6μL RNase A(10mg/ml)；

(2)旋涡震荡使混匀后，室温静置10min；

(3)加入130μL Bufer LP2震荡混匀后12000rpm离心300s后转移上清液到新离心管中；

(4)加入195μL的Buffer LP3并均匀混合；

(5)把上述离心管里的液体和沉淀都加到放入收集管的柱子里，相同转数离心60s后倒掉废液；

(6)在柱子里加入500μL Buffer GW2，相同转数离心60s后倒掉废液；

(7)重复第六步。

(8)相同转数离心120s后倒掉废液，常温300s晾干；

(9)离心好的柱子放到一个新的1.5mL离心管中，悬空滴加80μL的Buffer GE到吸附膜的正中，常温放置300s后相同转数离心60s获得DNA并测定浓度以备后续实验使用。

3.2针对再生植株PCR转基因阳性检测

检测引物序列如表2。

检测水稻是否为转基因阳性的PCR体系(20μL)如下：PCRMix12.5μL；模板2μL；DCAS9-F 1μL；DCAS9-R 1μL；ddH2O 8.5μL。

PCR反应程序如表4。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳下130V，0.5h左右检测扩增产物，选择条带正确的PCR产物送至sanger测序。

3.3突变体基因型检测

在敲除位点上下游进行引物设计，扩增目的片段送至公司测序，OsNAC113检测引物为：

113-F：AGGAGGAGATGAGTTTCATAGGC

113-R：AAGCCACTCTGCTTCACTTTG

PCR扩增体系(25μL)为：Template 2μL；113-F 1μL；113-R1μL；2×MasterMix 12.5μL；ddH₂0补至25μL。

PCR扩增程序如表3。

本实验中osnac113突变体的检测采取的是Sanger测序法。

3.4萌发期观察

种子消毒后无菌条件下进行操作，放置MS固体培养基中进行培养观察。光照培养箱培养温度为28℃，16h/8h(光照/黑暗)为水稻种子培养条件，在0-7天陆续观察萌发状况差异。

3.5胁迫处理后表型分析

对于野生型与突变体植株进行大田培养，取野生型(WT)和osnac113突变体选择生长8周的水稻植株进行200mM高盐胁迫处理进行表型观察。

4.结果分析

4.1OsNAC113定向编辑突变体创制

OsNAC113-sgRNA01设计在第一个外显子序列，通过golden gate构建定向敲除表达载体(图1)，对于表达载体进行PCR初步鉴定，产物条带大小无误后，进行sanger测序(图2)。将携带目的sgRNA的载体质粒转入农杆菌EHA105中备用，通过水稻遗传转化抗性筛选获得再生植株。利用Cas9相关序列引物对于载体是否转入再生植株进行初步鉴定，确定为转基因阳性植株的进行下一步突变基因型检测(图3)。

4.2水稻再生植株转基因阳性鉴定

经过转化后共获得再生植株7株，经过琼脂糖凝胶电泳检测PCR鉴定转基因阳性结果，发现再生植株全部为转基因阳性(图12)，所以7株转基因植株均可进行突变体基因型分析。

4.3OsNAC113再生植株基因型鉴定

转基因阳性的植株中取叶片提取DNA，扩增敲除相应片段进行sanger测序，分析测序结果进一步分析突变体的基因类型以及是否发生突变切割。经检测，7株转基因阳性植株中有5株突变体，突变率达到71.4％。其中OsNAC113-sgRNA04、05为野生型基因型，未发生突变(图3A、图3B)。OsNAC113-sgRNA01-01、02、03为缺失一个碱基突变体(图3A、图3C)。OsNAC113-sgRNA01-06、07为插入单碱基A的突变体，且为双等位基因基因突变，为后续实验材料筛选奠定了良好的基础(图3A、图3D)。利用基因编辑技术敲除OsNAC113基因后得到的突变体中，翻译的蛋白质序列发生了很大的变化。突变体OsNAC113(-1bp/-1bp)中，其氨基酸序列为：MSFIGMVEARMPPGFRFHPRDDELVLDYLLHKLAAGGRGGGVSAAAAASPSSTSTSTSASHGTFOTRRAWEARSGTSSASATASTPPATAPTAPPAPATGRPPARTAPSPAAPPSPPASPPPPPPPPPSACARRSSSTAAAPPRAARPSGSCTSSGSNRSLSTSRRTGCYAGCSTRPDKQFQAHHLKRPSHCPMS*TCLPRLRSRPSSMPTSPSIAHRRRRHRWSGATSKCP ASPACRHCO*RAPSALGTCWPWTPLORRRPSGYCTTATLOSWSSP OIGDRRVACHRCGTPN；可以看出氨基酸的翻译提前终止，突变体OsNAC113(+A/+A)翻译得到的氨基酸序列为：MSFIGMVEARMPPGFRFHPRDDELVLDYLLHKLAAGGRGGGV*RRRRRRRHRRRRPQQVRAMGPSRRGVRGRQGVVLLQPPRPQVRHRPPHQPRHPLRLLEGHROGPLHHPPLLHLLRRALLLRRRRRRRHAODARLLPRPRPOGPODRVGHARVPARTAASPPOGGLGAMOGVLQDOTNNSKPII*RGRHTAQ*ARPACHAFAPAPHRCLHRLR*RTDDDAIDGRELRASVLLLRPAGIANEGLHOLWGPAGHGHLCREEGHOGTA QQQHCKAGALPRLGTGEWPVTDVEPPI，可以看出氨基酸相较于野生型也有很大的不同。

综上所述，筛选缺失单碱基突变体(-1/-1)及单碱基插入突变体(A/A)进行后续实验，由于本实验采用的基因编辑敲除系统效率较高，所以在T0代即获得双等位基因突变体，为后续表型分析提供了较为可靠的材料基础。

4.4盐胁迫条件下OsNAC113表型分析

分别对正常生长和经盐胁迫处理的水稻幼苗进行拍照观察，如图4A、图4B。正常生长条件下，突变体长势更好；用200mmol/L氯化钠处理OsNAC113突变体与野生型水稻一周后，突变体植株表现出更高的抗性。用200mmol/L氯化钠处理后，对水稻成苗进行拍照观察，如图4C。盐胁迫下，突变体植株表现出更高的抗性。将成熟期野生型和突变体的叶片分别进行盐处理(200mmol/L，3d)，进行拍照观察。如图4D，突变体叶片相对更绿。综上可知，OsNAC113萌发期、成熟期抗盐性增强。

综上所述，本发明构建了OsNAC113基因编辑敲除载体，水稻日本晴为遗传转化受体，经过水稻稳定转化体系转入水稻愈伤组织获得再生植株。经过鉴定筛选，共获得转基因阳性株系7株，转基因阳性转化率为100％。测序结果分析得到5个双等位基因纯合突变体株系，敲除效率为71.4％，经过筛选鉴定获得稳定遗传植株，以备后续功能验证实验。高盐胁迫下突变体生长状态及存活率明显高于野生型，检测发现突变体在盐胁迫下相对含水量、叶绿素含量以及可溶性糖均高于野生型(图5、图6、图7)。

另外，植株经胁迫处理后，出现了植株的损伤。此时，细胞内的ROS清除机制会发挥作用，清除ROS相关的酶包括CAT、POD和SOD等。植株受损伤的程度可以被MDA含量以及氧化还原途径各种酶的活性所直接反映。实验结果如图8-图11所示，可以看出OsNAC113突变体中MDA的含量比野生型含量低了6％，同时OsNAC113的SOD、POD和CAT相关酶的活性分别比野生型高了18.7％、24.5％、22.5％。这说明在盐胁迫下，OsNAC113突变体的氧化损伤更小一些，对盐处理的耐受性显著增强。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.水稻OsNAC113基因在调控水稻耐盐性中的应用，所述水稻OsNAC113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的所述应用为降低水稻OsNAC113基因的表达量或减弱所述水稻OsNAC113基因的功能，从而提高水稻耐盐性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除水稻中的OsNAC113基因。

4.靶向突变水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统在构建OsNAC113基因突变体的应用。

5.靶向突变水稻OsNAC113基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述sgRNA设计于水稻OsNAC113基因第一个外显子处。

6.一种提高水稻耐盐性的方法，其特征在于：通过降低上述水稻OsNAC113基因的表达量或减弱所述水稻OsNAC113基因的功能从而提高水稻的耐盐性。

7.一种敲除载体，其特征在于：所述敲除载体为通过golden gate克隆技术构建的包含靶向敲除水稻OsNAC113基因的CRISPR/Cas表达载体。

8.一种创制耐盐性提高的水稻突变体的方法，其特征在于：包括以下特征步骤：

以OsNAC113基因为编辑靶基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除OsNAC113基因后通过扩繁获得纯合突变体植株，即为耐盐性提高的水稻突变体；

其中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述OsNAC113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。